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Bioengineering

Dibromomaleimide-डाइसल्फ़ाइड रसायन विज्ञान द्वारा विकार-प्रेरित फ्लोरोसेंट PEGylated वायरस-कणों की तरह बनाना

Published: May 27, 2018 doi: 10.3791/57712
Automatic Translation
1, 2, 3, 4
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Texas at Dallas, 2Undergraduate Biology, University of Texas at Dallas, 3Undergraduate Healthcare Studies, University of Texas at Dallas, 4Departments of Chemistry & Biochemistry and Biomedical Engineering, University of Texas at Dallas

Summary

यहां, हम dibromomaleimide के साथ Qβ VLP पर फ्लोरोसेंट functionalize disulfides के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं । हम Qβ अभिव्यक्ति और शुद्धि, dibromomaleimide के संश्लेषण कार्यात्मक अणुओं का वर्णन है, और dibromomaleimide और Qβ के बीच विकार प्रतिक्रिया । परिणामस्वरूप पीली फ्लोरोसेंट संयुग्मित कण कोशिकाओं के अंदर एक प्रतिदीप्ति जांच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

वायरस में हाल ही में वृद्धि-कणों की तरह (VLPs) बायोमेडिकल और सामग्री अनुसंधान में जैव संश्लेषण, असतत आकार, आनुवंशिक programme, और biodegradability के अपने आसानी के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । जब वे अत्यधिक अपनी सतह पर सिंथेटिक लाइगैंडों जोड़ने के लिए bioconjugation प्रतिक्रियाओं के लिए उत्तरदाई हो, इन जलीय capsids पैदा पर bioconjugation के तरीके में सीमा अपेक्षाकृत सीमित है । कार्यात्मक भौतिक अनुसंधान की दिशा की सुविधा के लिए गैर पारंपरिक bioconjugation प्रतिक्रियाओं पर विचार किया जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रतिक्रिया भोजी Qβ पर आधारित एक VLP के विलायक उजागर डाइसल्फ़ाइड बांड में नई कार्यक्षमता लागू करने के लिए dibromomaleimides का उपयोग करता है । इसके अलावा, अंतिम उत्पाद फ्लोरोसेंट है, जो इन विट्रो एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फिल्टर का उपयोग कर जांच में एक ट्रैक उत्पादन का जोड़ा लाभ है सेट ।

Introduction

नैनो के आकार का उपयोग कर वायरल capsids एक रोमांचक क्षेत्र है, जो जैव चिकित्सा अनुसंधान1,2,3में आवेदनों की गुंजाइश व्यापक करना है के रूप में उभरा है । Recombinantly वायरस-कणों की तरह व्यक्त (VLPs) संरचनात्मक रूप से वायरस से प्राप्त कर रहे हैं, लेकिन वे मूल वायरल आनुवंशिक सामग्री की कमी उंहें गैर संक्रामक proteinaceous नैनोकणों बना । के रूप में सतह सुविधाओं आनुवंशिक रूप से programed रहे है और प्रत्येक कैप्सिड से पहले और उसके बाद, यह स्थान और atomistic परिशुद्धता के साथ एमिनो एसिड की प्रतिक्रियाशील पक्ष श्रृंखला की संख्या पता है संभव है के लिए हूबहू व्यक्त की है । कई मामलों में, दोनों बाहरी और आंतरिक सतहों विलायक उजागर एमिनो एसिड अवशेषों के कई प्रकार के अधिकारी, जो bioconjugation प्रतिक्रियाओं के माध्यम से कार्यात्मक किया जा feasibly कर सकते हैं-प्रतिक्रियाओं कि एक और एक कृत्रिम के बीच आबंध बांड फार्म अणु४,५.

Bioconjugation प्रतिक्रियाओं मदद ब्याज के अणुओं एक अपेक्षाकृत सरल फैशन में और अधिक विविध कार्यक्षमताओं है । ऐसे चिकित्सीय दवाओं के रूप में ब्याज के अणुओं,6, फ्लोरोसेंट टैग7 और पॉलिमर8,9 पूर्व किया जा सकता है संश्लेषित और इससे पहले कि वे VLPs की सतह पर संलग्न कर रहे है विशेषता । बायोमेडिकल और जैव भौतिक अनुसंधान में एक विशेष रूप से आम VLP भोजी Qβ, जो, के रूप में व्यक्त recombinantly पर आधारित VLP गया है, एक 28 एनएम icosahedral वायरल कैप्सिड10। Qβ पर सबसे आम प्रतिक्रिया साइटों को एक व्यापक मार्जिन से lysines हैं, हालांकि हम हाल ही में कम disulfides है कि लाइन एक Qβ-बेकर प्रतिक्रिया के माध्यम से Haddleton के pores के लिए dibromomaleimide यौगिकों के सफल विकार11 संवाद । प्रतिक्रिया अच्छी उपज के साथ आगे बढ़ना है और, समान रूप से महत्वपूर्ण है, कणों के थर्मल स्थिरता खोने के बिना । एक ही समय में, यह प्रतिक्रिया विकार प्रेरित प्रतिदीप्ति, जो कोशिकाओं में इन कणों की अधिकता को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता उत्पन्न करता है । इस काम में, हम Haddleton के माध्यम से Qβ की सतह पर पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) के विकार-बेकर प्रतिक्रिया, जो एक चमकदार पीले fluorophore में परिणाम प्रदर्शित करता है । इन कणों के रूप में वे कोशिकाओं में लिया जाता है तो ट्रैक किया जा सकता है । इस के साथ साथ प्रोटोकॉल में मदद मिलेगी शोधकर्ताओं ने नई फ्लोरोसेंट PEGylated proteinaceous नैनोकणों उत्पंन Qβ पर आधारित है, हालांकि इसके सिद्धांतों कई अंय विलायक उजागर VLPs युक्त disulfides में से एक को लागू कर रहे हैं ।

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Protocol

1. तैयारी

  1. Lysogeny शोरबा बनाने के लिए (पौंड) आगर और12प्लेटें डालो ।
  2. wtQβ कोट प्रोटीन अनुक्रम युक्त एक pET28 प्लाज्मिड के साथ BL21 (DE3) रूपांतरण ।
    1. गल ई. कोलाई BL21 (DE3) एक बर्फ स्नान में सक्षम कोशिकाओं । एक microcentrifuge ट्यूब में कोशिकाओं के ५० μL प्लेस ।
    2. एक ट्यूब में प्लाज्मिड के 2 μL जोड़ें और धीरे ट्यूब झटका । तो 30 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
    3. गर्मी सदमे में ४५ एस के लिए कोशिकाओं को एक पानी में स्नान है कि ठीक ४२ डिग्री सेल्सियस पर है । बर्फ स्नान में तुरंत गर्मी के बाद ट्यूब वापस प्लेस-चौंकाने वाला है, और 5 मिनट के लिए मशीन ।
    4. पौंड मीडिया के ९५० μL जोड़ें जिनमें कोई एंटीबायोटिक नहीं है ।
    5. २०० rpm पर ६० मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति हिला ।
    6. प्लेट १०० पौंड पर संस्कृति के μL (कनमीसिन के साथ) प्लेटें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर थाली मशीन । जरूरत पड़ने पर सफेद कालोनियों का चयन करें ।
  3. सुपर इष्टतम शोरबा (सिसकी) मीडिया बनाओ ।
    1. आटोक्लेव दो 2 एल एक superdry चक्र पर Erlenmeyer कुप्पी चकित ।
    2. एक अपूतित वातावरण में, बाहर वजन और tryptone के २०.० जी जोड़ने, खमीर निकालने के ५.० जी, निर्जल मैग्नीशियम सल्फेट के २.४६९ ग्राम, सोडियम क्लोराइड के ०.५८४ ग्राम और प्रत्येक कुप्पी के लिए पोटेशियम क्लोराइड के ०.१८६ जी ।
    3. प्रत्येक कुप्पी और तरल चक्र पर आटोक्लेव में ultrapure पानी के साथ 1 एल के लिए मात्रा लाओ ।
    4. एक बार सिसकी मीडिया autoclaving के बाद कमरे के तापमान तक पहुंच गया है, 4 डिग्री सेल्सियस पर कनमीसिन (१०० मिलीग्राम/एमएल) मीडिया और स्टोर के प्रत्येक लीटर के लिए 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  4. ०.१ एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर (पीएच ७.००) बनाओ ।
    1. ultrapure पानी के ५०० मिलीलीटर में पोटेशियम monobasic के ६८.०४५ ग्राम को भंग करके 1 मीटर पोटेशियम monobasic समाधान करें ।
    2. ultrapure पानी के ५०० मिलीलीटर में पोटेशियम dibasic के ८७.०९ ग्राम को भंग करके 1 मीटर पोटेशियम dibasic समाधान करें ।
    3. पोटेशियम monobasic के ३८.५ मिलीलीटर और पोटेशियम dibasic के ६१.५ मिलीलीटर एक 1 एल बोतल जोड़ें ।
    4. ७.०० के लिए पीएच समायोजित अगर जरूरत है, और 1 के एक खंड के लिए ले आओ L
  5. ०.१ एम पोटेशियम फास्फेट बफर (पीएच ७.००) में 5-40% सुक्रोज ढाल बनाओ ।
    1. ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में, 5 के साथ समाधान तैयार-40% (5% की वृद्धि में वृद्धि) ०.१ एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर (पीएच ७.००) में भंग सुक्रोज ।
    2. जमा ३.३ एक ३८ मिलीलीटर के तल पर 5% सुक्रोज समाधान के एमएल गोल नीचे पाली कार्बोनेट एक लंबी सुई सिरिंज का उपयोग कर ट्यूब और पांच अंय ट्यूबों के लिए इस दोहराने ।
    3. ध्यान से ३.३ मिलीलीटर जमा 10% सुक्रोज ट्यूब के तल पर समाधान, और ध्यान से सुई के रूप में ढाल को परेशान नहीं करने के लिए निकालें । अंय पांच ट्यूबों के लिए दोहराएं ।
       
  6. सुक्रोज समाधान के ३.३ मिलीलीटर परतों जमा करने के लिए जारी रखें, 15% से प्रत्येक ट्यूब में ४०% से बढ़ रही है, जबकि परेशान ढाल नहीं करने के लिए सतर्क किया जा रहा है ।
  7. पूरा होने पर, पन्नी और स्टोर पर-८० डिग्री सेल्सियस के साथ ढाल के सबसे ऊपर कवर.

2. Qβ की अभिव्यक्ति

  1. 1:1 ब्लीच के साथ बेंच क्षेत्र पोंछ/
  2. एक अपूतित वातावरण में दो 3 मिलीलीटर स्टार्टर संस्कृतियों बनाओ एक अपूतित वातावरण में सिसकी मीडिया के 3 मिलीलीटर में ई. कोलाई BL21 (DE3) की एकल कालोनियों जोड़कर ।
  3. एक शेखर पर २५० rpm में एक ३७ डिग्री सेल्सियस और 0% सापेक्ष आर्द्रता (आरएच) कमरे में रातोंरात हो जाना ।
  4. Inoculate स्टार्टर सिसकी मीडिया में संस्कृति:
    1. दोनों 3 मिलीलीटर स्टार्टर संस्कृतियों से दूर ले जाओ और, एक अपूतित वातावरण में, दो 2 एल में से एक में प्रत्येक स्टार्टर संस्कृति डालो 1 के साथ Erlenmeyer कुप्पी भ्रमित प्रत्येक में ताजा सिसकी मीडिया के एल ।
    2. एक शेखर पर एक ३७ डिग्री सेल्सियस और 0% आरएच कमरे में २५० rpm पर inoculated मीडिया प्लेस ।
  5. २५० rpm पर एक शेखर पर बैक्टीरिया बढ़ने एक ३७ ° c और 0% आरएच कमरे में ओडी६०० तक पहुंच 0.9 – 1.0 ।
  6. प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए एक P1000 पिपेट का उपयोग कर 1 M isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  7. एक ३७ डिग्री सेल्सियस और 0% आरएच कमरे में रात भर २५० rpm पर शेखर पर मीडिया छोड़ दें ।
  8. शेखर से मीडिया को निकालें निंनलिखित सुबह और यह १००० मिलीलीटर की बोतलें २०,६२१ × जी में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को फसल का उपयोग कर केंद्रापसारक ।
  9. supernatant त्यागें और सेल गोली इकट्ठा ।
    1. के बारे में 5 ब्लीच के मिलीलीटर के साथ एक कुप्पी में supernatant डालो जीवाणुओं को मारने के लिए । यह बेकार है ।
    2. एक रंग का प्रयोग करें केंद्रापसारक बोतल के नीचे से सेल गोली परिमार्जन और एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में गोली डाल दिया ।

3. Qβ का शुद्धिकरण

  1. ०.१ एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर (पीएच ७.००) के ~ 20-30 मिलीलीटर के साथ सेल गोली reसस्पेंड ।
  2. सुनिश्चित करें कि निलंबन का कोई हिस्सा नहीं है, और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार microfluidizer प्रोसेसर का उपयोग करके कक्षों को लाइसे है ( सामग्री की तालिकादेखें) । कणों की पैदावार को बढ़ाने के लिए कम से दो बार कोशिकाओं को लाइसे ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 hr के लिए २०,६२१ x g पर २५० मिलीलीटर केंद्रापसारक बोतलों में lysate केंद्रापसारक ।
  4. गोली त्यागें और एमएल में supernatant की मात्रा को मापने । ०.२६५ द्वारा उस मूल्य गुणा और supernatant के लिए अमोनियम सल्फेट के जी की है कि राशि जोड़ें ।
  5. २०० rpm पर एक हलचल थाली पर कम 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर हिलाओ करने के लिए बाहर प्रोटीन हाला ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए २०,६२१ एक्स जी में २५० मिलीलीटर की बोतलों में केंद्रापसारक ।
  7. supernatant त्यागें और ०.१ एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर (पीएच ७.००) के बारे में 10 मिलीलीटर के साथ गोली reसस्पेंड ।
  8. 1:1 क्लोरोफॉर्म/n-ब्यूटानॉल के बराबर मात्रा में कच्चे नमूने और मिश्रण करने के लिए कुछ सेकंड के लिए भंवर द्वारा जोड़ें ।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए २०,६२१ × जी में ३८ मिलीलीटर ट्यूबों में केंद्रापसारक ।
  10. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर शीर्ष जलीय परत पुनर्प्राप्त करें । हो परत कि जलीय और कार्बनिक परत के बीच का गठन किया है की तरह जेल के किसी भी लेने के लिए सतर्क नहीं ।
  11. गल छह 5-40% पूर्व बनाया सुक्रोज ढाल और प्रत्येक पर निकालने के 2 मिलीलीटर के बारे में लोड ।
  12. Ultracentrifuge पर 16 ज के लिए ९९,५८२ x g पर 4 ° c के साथ नि: शुल्क मंदी ।
  13. प्रत्येक ट्यूब के नीचे एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) प्रकाश चमक और एक नीले रंग की बैंड दिखाई जानी चाहिए । एक लंबी सुई सिरिंज के साथ इन कणों को ठीक.
  14. Ultrapellet 4 ° c पर २.५ h के लिए ३७०,५४१ x g पर कणों को ।
  15. supernatant त्यागें और ०.१ एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर (पीएच ७.००) के साथ शुद्ध कणों की पारदर्शी गोली reसस्पेंड ।

4. ठहराव और उत्पाद की पुष्टि

  1. ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग करने के लिए उत्पाद13मात्रा बढ़ाता है ।
  2. भागो कम करने और गैर कम सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-पृष्ठ) उत्पाद की पुष्टि करने के लिए14।
    नोट: एसडीएस-पृष्ठ को कम करने कोट प्रोटीन के आणविक वजन की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है; गैर कम एसडीएस-पृष्ठ को उच्च क्रम संरचना की पुष्टि है ।

5. Qβ पर Conjugating डीबी कंपाउंड

  1. Qβ पर disulfides कम करें ।
    1. tris के ०.००२० जी भंग (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) ultrapure पानी की 1 मिलीलीटर में एक 100x स्टॉक समाधान करने के लिए ।
      नोट: कटौती से पहले ताजा TCEP तैयार करें ।
    2. जोड़ें २०० µ Qβ के एल (5 मिलीग्राम/एमएल) एक microcentrifuge ट्यूब में ।
    3. 100x TCEP स्टॉक सॉल्यूशन के 20 µ l को जोड़कर फ़ॉलो करें.
    4. 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  2. री-ब्रिज घटाए डाइसल्फ़ाइड का उपयोग कर dibromomaleimide पॉलीथीन ग्लाइकोल (डीबी-खूंटी) ।
    1. DMF के १०० µ l में dibromomaleimide-पॉलीथीन ग्लाइकोल (डीबी-खूंटी) का ०.००१७ ग्राम भंग.
    2. 10 मिमी सोडियम फॉस्फेट समाधान (पीएच ५.००) के ६८० µ एल जोड़ें ।
    3. डीबी-खूंटी के समाधान में कम Qβ जोड़ें और एक ३६५ एनएम यूवी लैंप के तहत मिश्रण प्रक्रिया का पालन करें । चमकीले पीले प्रतिदीप्ति तुरंत मिश्रण पर एक ३६५ एनएम handheld यूवी चिराग के साथ visualized किया जा सकता है ।
    4. प्रतिक्रिया एक rotisserie पर कमरे के तापमान (आरटी) पर रात भर गुजार दें ।
  3. केंद्रापसारक फ़िल्टर द्वारा प्रतिक्रिया मिश्रण शुद्ध (COMW = 10 केडीए) तीन बार 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ३,२८३ x g पर 1x पंजाबियों का उपयोग कर ।
  4. गैर-कम एसडीएस-पृष्ठ और देशी agarose जेल ट्रो द्वारा विकार की निगरानी ।
    नोट: VLPs देशी agarose जेल में बरकरार कणों के रूप में चलाने के लिए, और वे अपने चार्ज, आकार और आकार के आधार पर अलग कर रहे हैं ।

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Representative Results

dibromomaleimide डेरिवेटिव dibromomaleimide एनहाइड्राइड और प्राथमिक अमीन15के बीच संघनित्र प्रतिक्रिया के माध्यम से संश्लेषित किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, एक हल्के सिंथेटिक विधि16 का उपयोग कर N-methoxycarbonyl सक्रिय 3, 4-dibromomaleimide methoxypolyethylene ग्लाइकोल (खूंटी) के साथ प्रतिक्रिया द्वारा यहां का दोहन करने के लिए DB-खूंटी (चित्रा 1) उपज थी । एनएमआर यौगिक संरचना (चित्रा 2) की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । Qβ VLP एक 28 एनएम icosahedral proteinaceous nanoparticle है, जो १८० समान कोट प्रोटीन से बना है । कोट प्रोटीन के लिए अपने α-पेचदार डोमेन के माध्यम से noncovalent इंटरलॉकिंग dimers के रूप में करते है β-संनिकट कोट प्रोटीन से चादरें17। VLPs उच्च तापमान, चरम पीएचएस पर अपने स्थिरता के लिए चयनित हो जाते हैं, और विभिंन विलायक रचनाओं में18। इस मामले में, Qβ VLP १८० अंतर-किनारा डाइसल्फ़ाइड बांड के कारण में अंय आरएनए phages से अधिक स्थिर है पांच और छह कैप्सिड 19 (चित्रा 3) पर समरूपता के अक्ष गुना पर स्थित है । ये hexameric और pentameric संरचनाएं disulfides द्वारा लिंक की गई हैं, जो गैर-घटते एसडीएस-पृष्ठ19के द्वारा विज़ुअलाइज़ की जा सकती हैं । TCEP के दस समकक्ष (tris (2-carboxyethyl) phosphine) (०.७० µmol), disulfides के सापेक्ष 1 मिलीग्राम में Qβ (०.०७० µmol कोट प्रोटीन, ०.०७० µmol disulfides), एक में कमरे के तापमान पर कम disulfides Qβ (capsids) उत्पन्न करने के लिए सभी rQβ को कम करने के लिए उपयोग किया गया घंटा, और गैर-कम एसडीएस-पृष्ठ से पता चलता है कि सभी उच्च क्रम संरचनाओं monomeric कोट प्रोटीन (चित्रा 4 और चित्र 5) को कम किया गया । उन्हें पुनः पुल करने की प्रतिक्रिया एक पॉट संश्लेषण के रूप में किया गया था, क्रूड rQβ मिश्रण के रूप में एक घंटे की कमी प्रतिक्रिया11के बाद एक डीबी-खूंटी (१.४ µmol) में सोडियम फॉस्फेट (10 मिमी, पीएच ५.००, 10% DMF) के एक समाधान के 20 समकक्षों के लिए सीधे जोड़ा गया था । वहां ३६५ एनएम यूवी लैंप के तहत चौकस उज्ज्वल पीला प्रतिदीप्ति था (चित्रा 5d) तुरंत DB-खूंटी के अलावा के बाद । मिश्रण तो एक rotisserie पर रात के आरटी में तैयार किया गया था, केंद्रापसारक फ़िल्टर का उपयोग कर शुद्धि के बाद (MWCO = 10 केडीए) वांछित बफर के साथ धोने तीन बार छोटे अणुओं की अधिक मात्रा में हटाने के लिए । Qβ-malemide conjugates को photostability को बढ़ावा देने के लिए 10 एमएम सोडियम फास्फेट सॉल्यूशन (पीएच ५.००) में reसस्पैंड कर दिया गया । विकार यूवी और coomassie नीले दाग (चित्रा 5 ए) के तहत गैर-कम एसडीएस-पृष्ठ द्वारा पुष्टि की गई थी । सभी बैंड यूवी के तहत प्रतिदीप्ति (चित्रा 5) दिखाया जो coomassie नीले दाग के साथ colocalized, एक सफल विकार का प्रतिनिधित्व । Qβ-खूंटी conjugates की अखंडता देशी agarose जेल ट्रो और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) (चित्रा 5B, सी) द्वारा पुष्टि की गई.

प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी ने Qβ-maleimide (Qβ-Μ) और Qβ-खूंटी के उत्तेजना और उत्सर्जन maxima को क्रमशः ४०० एनएम और 540 – 550 एनएम का क्रमश: (figure 6) दिखाया । यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध GFP-यूवी फिल्टर सेट, जिसका उत्तेजना तरंग दैर्ध्य ४०५ एनएम है और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य है 500-540 एनएम के साथ संरेखित करता है । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फिल्टर सेट के साथ conjugates के photophysical गुणों के सुविधाजनक संरेखण Qβ का उपयोग कर की अनुमति-खूंटी के रूप में एक इन विट्रो जांच, जो किया गया था और चित्रा 7में imaged । Qβ-खूंटी (२०० एनएम) माउस रॉ-सीरम मुक्त DMEM माध्यम, नाभिक धुंधला द्वारा पीछा में २६४.७ कोशिकाओं के साथ मशीन था । चित्रा 7 में Colocalization छवियां पता चलता है कि पीली फ्लोरोसेंट कणों कच्चे-२६४.७ कोशिकाओं द्वारा उठाए गए थे और मशीन के चार घंटे के बाद ट्रैक किया जा सकता है । जो Qβ VLPs शो नगण्य प्रतिदीप्ति.

Figure 1
चित्रा 1: डीबी-खूंटी की सिंथेटिक योजना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एनएमआर लक्षण वर्णन. (क) 1 H एनएमआर और (ख) डीबी-खूंटी के 13ग. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: Qβ VLP कैप्सिड के Crystallographic संरचना के रूप में कल्पना में संसाधित (PDB ID: 1QBE) । संतरे में दो cysteine अवशेष (Cys ७४ और Cys ८०) दर्शाए गए हैं ।

Figure 4
चित्रा 4: विकार योजना of Qβ-maleimide (Qβ-M) conjugates. Qβ (०.०७ µmol of disulfides) µmol यौगिकों (db और db-खूंटी) (१.४ dibromomaleimide) के 20 समकक्षों के अलावा एक घंटे के लिए RT पर TCEP (०.७ µmol) के 10 समकक्षों का उपयोग कम किया गया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: Qβ, rQβ, Qβ-एम और Qβ-खूंटी के लक्षण वर्णन । (क) गैर-कम एसडीएस-पृष्ठ और (ख) Qβ, rQβ, Qβ-एम और Qβ-खूंटी का देशी agarose जेल (ऊपर) यूवी के नीचे और coomassie नीले दाग (नीचे) । (ग) उनि micrograph ऑफ Qβ-M (ऊपर) और Qβ-खूंटी (नीचे) । (घ) Qβ की तस्वीर-३६५ एनएम यूवी रोशनी के तहत खूंटी प्रतिक्रिया मिश्रण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा. प्रतिदीप्ति उत्तेजना (क) और उत्सर्जन (बी) स्पेक्ट्रा के Qβ-एम और Qβ-खूंटी के ०.१ मीटर में पोटेशियम फॉस्फेट बफर (पीएच ७.००). उत्तेजना अधिकतम ४०० एनएम के आसपास है और उत्सर्जन अधिकतम 540-550 एनएम के आसपास है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: मैक्रोफेज २६४.७ कोशिकाओं में Qβ-खूंटी संयुग्मी के फोकल प्रतिदीप्ति छवियाँ. नीला: NucRed लाइव ६४७ ReadyProbes रिएजेंट । पीला: Qβ-खूंटी । शीर्ष छवियां: विलय नीले और पीले चैनल । नीचे छवियां: उज्ज्वल फील्ड छवियां । फ़िल्टर सेट: यूवी-GFP (λex = ४०५ एनएम, λem = 500 – 540 एनएम), Cy5. मशीन का समय 4 एच था इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

छोटे प्रोटीन शुद्धि की तुलना में, शुद्ध भोजी Qβ में एक अनूठा कदम सुक्रोज ढाल केंद्रापसारक है । क्लोरोफॉर्म/n-ब्यूटानॉल निष्कर्षण चरण के बाद, Qβ आगे 5-40% सुक्रोज ग्रैडिएंट का उपयोग कर शुद्ध है । केंद्रापसारक के दौरान, कणों उनके आकार के आधार पर अलग कर रहे हैं । बड़े कणों उच्च घनत्व क्षेत्र के लिए यात्रा करते हैं, जबकि छोटे कणों कम घनत्व क्षेत्र में रहते हैं । Qβ ढाल के निचले तीसरे करने के लिए यात्रा और वहां रहता है, जबकि छोटे प्रोटीन दोष केंद्रापसारक ट्यूब के शीर्ष पर फंस रहे हैं । Qβ के कोलाइडयन निलंबन सुक्रोज ढाल है, जो एक नीले रंग की बैंड के रूप में देखा जा सकता है जब एक एलईडी प्रकाश नीचे से चमकता है में मजबूत टिण्डल बिखरने से पता चलता है । इस बैंड तो एक लंबी सिरिंज सुई का उपयोग कर निकालने के लिए आसान है. सुक्रोज में Qβ तो ultracentrifugation द्वारा गोली, एक स्पष्ट गोली उपज है । गोली वांछित बफर में reसस्पैंड किया जा सकता है या आगे तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) द्वारा शुद्ध । परिणामस्वरूप कण की शुद्धता की पुष्टि एसडीएस-पृष्ठ द्वारा की जा सकती है.

TCEP फॉस्फेट बफर में स्थिर नहीं है, तो एक 100x TCEP स्टॉक समाधान ताजा पानी में कटौती से पहले सही तैयार किया जाना चाहिए । इसके अलावा, TCEP न तो नि: शुल्क thiol शामिल है और न ही अंय अमीनो एसिड के प्रति प्रतिक्रिया करता है, तो यह आवश्यक नहीं है TCEP की अधिकता को हटाने के लिए विकार रिएक्शन प्रदर्शन करने से पहले । Dibromomaleimide यौगिकों पीएच ५.०० सोडियम फॉस्फेट समाधान में भंग कर रहे हैं, कम Qβ जोड़ने के बाद. पर पीएच ५.००, cysteine (कम डाइसल्फ़ाइड) protonated है, जो dibromomaleimide के साथ विकार प्रतिक्रिया को बढ़ावा देने के पुनः ऑक्सीकरण एक डाइसल्फ़ाइड को वापस रोकने के द्वारा । ३६५ एनएम यूवी रोशनी के तहत, प्रतिक्रिया मिश्रण तुरंत कम Qβ DB यौगिकों में जोड़ा गया था के बाद पीले प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है । अलग से Qβ पर पूर्व संश्लेषित fluorophores संलग्न से, इस प्रतिदीप्ति विकार प्रतिक्रिया द्वारा प्रेरित है । fluorophore का गठन होते ही सल्फर और maleimide रिंग के बीच नए बांड बनाए जाते हैं । प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा से पता चलता है कि उत्तेजना (४०० एनएम) और उत्सर्जन (५५० एनएम) maxima एक फोकल माइक्रोस्कोप में यूवी GFP फिल्टर सेट फिट (λपूर्व = ४०५ एनएम, λem = 500 − 540 एनएम) । Qβ-खूंटी तो सीरम मुक्त DMEM में मैक्रोफेज रॉ २६४.७ के साथ मशीन था । गर्मी के चार घंटे के बाद, Qβ-खूंटी और कबरा पीले फ्लोरोसेंट डिब्बों कोशिकाओं के अंदर visualized किया जा सकता है । एक तथ्य यह है कि उल्लेख किया जाना चाहिए है प्रतिदीप्ति कुछ हद तक lysosomes या कोशिकाओं की देर endosomes अंदर सीरम या अन्य cysteine-अमीर पदार्थों में गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है । समय के साथ, यह सेल ट्रैकिंग अनुप्रयोगों के लिए सेल के अंदर प्रतिदीप्ति कमजोर होगा; हालांकि, यह दवा वितरण प्रणालियों के लिए एक नए डिजाइन के लिए एक अवसर भी प्रदान करता है ।

अंत में, हम dibromomaleimide-thiol रसायन विज्ञान के माध्यम से Qβ VLP पर conjugating DB-खूंटी का प्रदर्शन किया है । सभी में एक विकार प्रतिक्रिया ही खूंटी के साथ VLP पर pores के साथ disulfides functionalizes नहीं है, लेकिन यह भी एक फ्लोरोसेंट लेबल proteinaceous nanoparticle बनाता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

J.J.G. अपने समर्थन के लिए नेशनल साइंस फाउंडेशन (DMR-१६५४४०५) और कैंसर प्रिवेंशन रिसर्च इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्सास (CPRIT) (RP170752s) को स्वीकार करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth (Miller)  EMD Millipore 1.10285.0500
Tryptone, Poweder Research Products International T60060-1000.0
Yeast Extract, Poweder Research Products International Y20020-1000.0
Anhydrous magnesium sulfate P212121 CI-06808-1KG
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) Fisher Scientific S271-10
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System Fisher Scientific 4474524
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific BP362-1
Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific P288-500
Sucrose Fisher Scientific S25590B
Ethanol Fisher Scientific BP2818500
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I6758-1G
Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor  Fisher Scientific 096-041053
Ammonium Sulfate P212121 KW-0066-5KG
Chloroform Alfa Aesar 32614-M6
1-Butanol Fisher Scientific A399-4
SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum Beckman Coulter 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set
Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, Beckman Coulter 337922
Coomassie (Bradford) Protein Assay Fisher Scientific PI23200
TRIS Hydrochloride Research Products International T60050-1000.0
Tetramethylethylenediamine Alfa Aesar J63734-AC
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706-2G
2 3-Dibromomaleimide 97% Sigma Aldrich 553603-5G
Polythylene Glycol Alfa Aesar 41561-22
Sodium Phosphate Fisher Scientific AC424375000
Acrylamide/bis-Acrylamide P212121 RP-A11310-500.0
Sodium dodecyl sulfate Sigma Aldrich L3771-100G
Ammonium Persulfate Fisher Scientific BP179-100
FV3000 confocal laser scanning microscope Olympus  FV3000 
Labnet Revolver Adjustable Rotator  Thomas Scientific  1190P25 
1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap  Thermo Scientific 010-1459
Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer Thermo Scientific 3141-0250
Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC Thermo Scientific 3117-0380
2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim Pyrex 4980-2L
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units Millipore Sigma UFC801024
M-110P Microfluidizer Materials Processor Microfluidics M-110P
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes Thermo Scientific 3117-0380PK
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate Beckman Coulter 41121703
Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL PolyLab 80005
533LS-E Series Steam Sterilizers Getinge 533LS-E
TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid LabSource D36-313-CS
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube Fisher Scientific 14-959-53A
Microcentifuge Tube: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-129
VWR Os-500 Orbital Shaker VWR Scientifc Products 14005-830
Tetra Handcast systems Bio-Rad 1658000FC
Polypropylene, 250 mL Beckman Coulter 41121703
Spectrofluorometer NanoDrop Thermo Fisher Scientific 3300
Long Needle  Hamilton  7693
Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock Fisher Scientific 14-841-46
P1000 Pipetman Gilson F123602
P200 Pipetman Gilson F123601
P100 Pipetman Gilson F123615
P20 Pipetman Gilson F123600
P10 Pipetman Gilson F144802
Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance Intelligent Weighting Technology IWT_PM100
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube Fisher Scientific 14-432-22
4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl Bio-Rad 456-1084

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References

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अनइंजीनियरिंग इश्यू १३५ मैटीरियल्स वायरस-जैसे कण भोजी Qβ (Qbeta) functionalizing capsids प्रतिदीप्ति bioconjugation रिएक्शन dibromomaleimide डेरिवेटिव्स पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी)
Dibromomaleimide-डाइसल्फ़ाइड रसायन विज्ञान द्वारा विकार-प्रेरित फ्लोरोसेंट PEGylated वायरस-कणों की तरह बनाना
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Chen, Z., Detvo, S. T., Pham, E.,… More

Chen, Z., Detvo, S. T., Pham, E., Gassensmith, J. J. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (135), e57712, doi:10.3791/57712 (2018).

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