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Biology

Sistema de proteína verde fluorescente Split Visualizar efetores entregue de bactérias durante a infecção

doi: 10.3791/57719 Published: May 24, 2018

Summary

Abordagens de baseados em proteína fluorescentes para monitorar efetores secretadas pelas bactérias em células hospedeiras são desafiadores. Isto é devido à incompatibilidade entre proteínas fluorescentes e o sistema de secreção do tipo III. Aqui, é utilizado um sistema GFP de superfolder de separação otimizada para visualização de efetores secretada pelas bactérias para a célula da planta hospedeira.

Abstract

Bactérias, dentre os mais importantes agentes causadores de várias doenças de planta, secretam um conjunto de proteínas efetoras em célula de planta hospedeira para subverter o sistema imunológico de planta. Durante a infecção efetores citoplasmáticos são entregues para o citosol de anfitrião através de um tipo sistema do secretion de III (T3SS). Após o parto para a célula da planta, o effector(s) alveja o compartimento específico para modular processos de célula do host para a sobrevivência e replicação do patógeno. Embora tenha havido algumas pesquisas sobre a Localização subcellular das proteínas efetoras nas células hospedeiras para entender sua função na patogenicidade usando proteínas fluorescentes, investigação da dinâmica dos efetores injetados diretamente de bactérias tem sido um desafio devido à incompatibilidade entre o T3SS e proteínas fluorescentes.

Aqui, descrevemos nosso método recente de um sistema de proteína verde fluorescente de superfolder divisão otimizado (sfGFPOPT) para visualizar a localização de efetores entregadas via o T3SS bacteriana na célula hospedeira. O sfGFP11 (11th β-vertente de sfGFP)-etiquetado effector secretada através o T3SS pode ser montado com uma organela específica alvejada sfGFP1-10OPT (1-10th β-vertente de sfGFP) líder para emissão de fluorescência no local. Este protocolo fornece um procedimento para visualizar o sinal de fluorescência sfGFP reconstituído com um proteínas efetoras de Pseudomonas syringae em uma organela especial nas instalações de Arabidopsis e Nicotiana benthamiana .

Introduction

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As plantas são organismos sésseis que encontram inúmeros patógenos invasores, incluindo bactérias, fungos, vírus, insetos e nematoides em todo seu ciclo de vida. Entre as phytopathogens, os patógenos bacterianos Gram-negativos tais como Pseudomonas spp. e Ralstonia spp., infectar suas plantas hospedeiras, inserindo-se através de feridas ou aberturas naturais, como os estomas e Hidatódio1. Para colonizar com sucesso plantas hospedeiras, patógenos bacterianos evoluíram para desenvolver uma variedade de fatores de virulência2. Quando as bactérias invadem uma planta hospedeira, eles injetam uma série de proteínas de virulência — conhecido como efetores — diretamente para as células da planta para promover sua patogenicidade. Esses efetores suprimem ou modulam a imunidade inata da planta e manipulam os processos celulares do anfitrião para resultar em sobrevivência bacteriana3.

Bactérias patogênicas utilizam principalmente um T3SS entregar proteínas efetoras diretamente no hospedeiro células4. O T3SS se assemelha a uma seringa molecular com um canal de agulha, conectando a partir de uma estrutura de proteína do andaime em todo o interior e as exteriores membranas bacterianas para o local da injeção do anfitrião célula5. Esse mecanismo de secreção mediada por T3SS effector (T3E) é bem conservado em vários patógenos bacterianos Gram-negativos da planta, bem como humano. Dentre os patógenos vegetais representativos, o p. syringae pv. Tomate DC3000 hrcC mutante, que geralmente tem um T3SS defeituoso, restringiu o crescimento em plantas, provavelmente devido a incapacidade do mutante para suprimir totalmente a planta imunidade (através da injeção de proteínas efetoras)6. Após translocação nas células do hospedeiro, efetores alvo várias proteínas do hospedeiro que são importantes para o sistema de célula de host, incluindo respostas de defesa vegetal, da transcrição do gene, morte celular, Proteassoma, tráfico de vesículas e hormônio vias7 , 8 , 9 , 10. portanto, o rastreamento da localização celular de proteínas efetoras nas células hospedeiras é um destino atraente para entender suas funções com relação a modulação da imunidade da planta.

A maioria dos estudos de localização do T3Es ter empregado Agrobacterium -mediada superexpressão com uma proteína grande fluorescência do anfitrião planta9. No entanto, o método de expressão heteróloga de genes que são introduzidos em outras espécies tem demonstrado ser mis localizadas ou ocasionalmente não-funcional11,12,13. Além disso, vários estudos revelaram que efetores bacterianas sofrem alteração para o direcionamento adequado no anfitrião células14,15,16,17. Portanto, transitoriamente expressa efetores no citosol da planta as células não podem ser funcionalmente ou quantitativamente idênticas para os efetores que são entregues pelo T3SS ao patógeno infecção18. Além disso, a fusão de grandes marcas fluorescentes para proteínas efetoras pode perturbar o efetor adequada visualização e entrega18,19. Portanto, essas abordagens a ensaiar a T3E função podem não totalmente refletir a localização nativa dos efetores T3SS-secretado.

Uma proteína verde fluorescente (GFP) é composta por um 11-hélice β-barril delimitador uma vertente central que inclui um cromóforo20. Waldo et al relatou um sistema de divisão-GFP romance que consiste de um pequeno componente (GFP β vertente 11; GFP11) e um fragmento complementar (vertente β GFP 1-10; GFP1-10)21. Os fragmentos não fluorescem sozinhos mas fluorescem em cima de sua própria associação, quando ambos os fragmentos estão em estreita proximidade com o outro. Para a otimização da eficiência dobramento da proteína, robustas variantes de dobramento da GFP, i.e., sfGFP e sfGFPOPT, desenvolveram-se posteriormente para a divisão GFP sistema20,21,22. Recentemente, o único aminoácido mutado variantes de sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT e sfCFP1-10OPT- que pode reconstituir com um fragmento de sfGFP11 e mostrar fluorescência de ciano e amarelo, respectivamente, foram gerados23 . Além disso, o sfCherry, um derivado do mCherry, pode ser dividido em fragmentos sfCherry1-10 e sfCherry11 da mesma maneira como sfGFP23.

Este sistema foi adaptado para rotular e rastrear os efetores T3SS em células HeLa durante a infecção usando os efetores de Salmonella24. No entanto, ele foi anteriormente não otimizado para o sistema host de patógeno vegetal-bacteriana. Recentemente, nós aperfeiçoamos o sistema GFP divisão baseado o sfGFP1-10 melhoradoOPT para monitorar a Localização subcellular do T3Es entregado a partir de p. syringae em planta células25. Para facilitar os estudos de localização da T3Es para diferentes compartimentos subcellular nas células vegetais, um conjunto de transgénicos Arabidopsis thaliana plantas foram geradas para expressar sfGFP1-10OPT nos vários compartimentos subcellular 25. Além disso, o plasmídeo que carreg uma variedade de organela-alvo sfGFP1-10OPT para o Agrobacterium-mediada superexpressão transitória e os vetores de sfGFP11-marcados para a entrega baseada em T3SS effector também foram gerados. As sementes de várias linhas de Arabidopsis transgênicas e os plasmídeos para expressar a T3Es de interesse podem ser obtidas de fontes mencionadas na Tabela de materiais26,27.

O seguinte protocolo, descrevemos um sistema otimizado para monitorar a dinâmica de efetores entregados por bactérias nas células hospedeiras usando o sistema de sfGFP de separação. Infecção de plantas expressando sfGFP1-10OPT com transgénicos Pseudomonas carregando o plasmídeo recombinante sfGFP11 resulta em uma entrega do efetor sfGFP11-tag de Pseudomonas na célula hospedeira. Em consequência, estas proteínas são reconstituídas e translocar para o compartimento de alvo específico effector. A Pseudomonas syringae pv. tomate Tensão de CUCPB5500, no qual 18 efetores são excluídos, foi usado porque esta estirpe mostrou pouca ou nenhuma morte celular em ambos a. thaliana e s. benthamianas28. No entanto, todos os materiais e os passos descritos aqui podem ser substituídos ou modificados para adaptar o sistema de sfGFP de separação para investigação de outras questões biológicas ou otimização das condições de determinado laboratório.

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Protocol

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Nota: Todas as etapas são realizadas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário.

1. preparação de materiais vegetais (4 semanas)

  1. Preparação para as plantas de N. benthamiana
    1. Semeie 2 sementes de s. benthamiana na superfície do solo de cada pote, cubra a bandeja com uma cúpula de plástico e permitir que as sementes germinar em um 25 ° C, 60% câmara de crescimento de umidade com um ciclo de 16/8-h claro/escuro fotoperíodo.
    2. Depois de duas semanas, escolher e descartar a menor mudas em cada vaso e continuar a crescer plantas sob as mesmas condições de crescimento como aplicado para a germinação na etapa 1.1.1. Adicione 1 litro de água pela bandeja a cada dois dias.
      Nota: As condições de crescimento de plantas podem variar entre laboratórios. Portanto, segue o protocolo regando regular para o cultivo da planta em uma condição saudável.
    3. Em uma semana, transferir as plantas para uma bandeja nova e organizá-los com espaço adequado para mais crescimento. Continuam crescendo as plantas nas condições descritas na etapa 1.1.1 até que estejam prontos para estar infiltrados em 4 semanas de idade.
      Nota: O crescimento das plantas pode diferir dependendo da condição de crescimento através de laboratórios. Geralmente, nós encontramos que as 4 semanas de idade N. benthamiana plantas suportar cerca de seis folhas.
  2. Preparação para a. thaliana plantas transgênicas
    1. Consulte a Tabela de materiais e ordenar as sementes transgênicas de Arabidopsis .
    2. Embeber as sementes transgênicas de Arabidopsis ~ 50-100 em 1 mL de água destilada e armazená-los em 4 ° C por 3 dias no escuro para sincronizar o início da germinação.
    3. ~ 2-3 semear na superfície do solo de uma bandeja de planta de plug e cubra a bandeja com uma cúpula de plástico. Permitir que as sementes germinar a 23 ° C, umidade de 60%, com um ciclo de 10/14-h claro/escuro fotoperíodo.
      Nota: As sementes devem ser homozigotos. No entanto, recomendamos confirmar a presença do transgene no lote. Neste caso, esterilizar as sementes por lavagem com etanol 70% por 2 min, 50% de alvejante (cerca de 2% de hipoclorito) contendo 0.05% triton X-100 5 min. siga por 5 - 6 vezes de lavagem com água bidestilada estéril (ddH2O). Após a esterilização, estratificar a 4 ° C por 3 dias e placa-los na mídia de germinação de plantas contendo 25 µ g/L de hptII B para selecionar as plantas transgénicas.
    4. Depois de uma semana, deixar apenas uma planta por ficha e continuar a crescer plantas sob as mesmas condições de crescimento utilizadas para etapa 1.2.3.
      Nota: Plantas de quatro semanas de idade foram utilizadas para a infecção p. syringae . Regar plantas todos os dias para manter as plantas saudáveis.

2. preparação da cultura de Pseudomonas (~ 1 semana)

  1. Construção do plasmídeo para transformação de Pseudomonas
    1. Consulte a Tabela de materiais e pedir o vector(s) desejado do sistema de entrega baseada em T3SS effector vetor25.
    2. Inserir o gene effector do interesse do vetor de entrega effector utilizando recombinação site-specific clonagem25.
      Nota: Quando a Localização subcellular das proteínas efetoras completos de monitoramento, colocar o gene completo em pBK-GW-1-2 ou pBG-GW-1-2. Também é possível escolher pBK-GW-1-4... ou pBG-GW-1-4 contem 2 x sfGFP11 para aumentar o sinal de fluorescência. No caso de um efetor parcial falta de peptídeo sinal, use pBK-GW-2-2 ou pBK-GW-2-4. Consulte Park et al . para obter informações detalhadas sobre effector entrega vetores25.
  2. Transforme o plasmídeo carregando um efetor fundido para a marca de sfGFP11, p. syringae PV. Tomate (Pst) CUCPB5500 usando o padrão electroporation29.
    Nota: Outras estirpes de Pseudomonas podem ser usados, se necessário. O sistema de tag de sfGFP11 é construído para uma ampla gama de vetores30 e a expressão de gene do efetor é regulada pelo promotor AvrRpm1, que é comparável com, por exemplo, Pseudomonas fluorescens (EthAn)31.
  3. Espalhe as células bacterianas transformadas suavemente sobre a superfície das placas de ágar do rei B contendo 100 rifampicina µ g/mL e 25 canamicina µ g/mL ou 25 µ g/mL gentamicina. Incube a 28 ° C por 2 dias.
  4. Inocular uma colônia em meio líquido do rei B com antibióticos adequados para o vetor usado e crescem as células durante a noite a 28 ° C, com agitação a 200 rpm.
  5. Fazer um estoque de glicerol. Adicionar o glicerol esterilizado para uma concentração final de 50% e loja a-80 ° C.

3. transiente expressão de sfGFP1-10 organela-alvejadoOPT em s. benthamiana (4 dias)

  1. Preparação da cultura de Agrobacterium
    1. Ordem a vector(s) desejada da organela-alvo sfGFP1-10OPT plasmid(s) (consulte a Tabela de materiais).
    2. Transforme o plasmid(s) em Agrobacterium tumefaciens cepa de células GV310132. Crescem as células em ágar-ágar Luria-Bertani (LB) suplementado com 50 µ g/mL canamicina e a rifampicina 50 µ g/mL a 28 ° C durante 2 dias.
    3. De uma única colônia no ágar-ágar LB, inocule as células em 5 mL de meio líquido de LB suplementado com 50 µ g/mL canamicina e 50 rifampicina µ g/mL. Crescem as células durante a noite a 28 ° C, com agitação a 200 rpm.
    4. Colheita as células por centrifugação a 3.000 x g por 10 min. decantar a sobrenadante mídia e resuspenda o pellet em 1 mL de recém feito buffer de infiltração.
    5. Medir a quantidade de Agrobacterium , obtendo o valor de densidade óptica (OD) em uma absorvância de 600 nm (Abs 600 nm). Ajuste o OD600 das bactérias a 0,5 com buffer de infiltração.
      Nota: 1 mL de suspensão é suficiente para se infiltrar em dois pontos.
    6. Deixa a cultura à temperatura ambiente em um roqueiro suave para 1-5 h antes de infiltração.
    7. Fazer um buraco no centro das folhas para ser infiltrado com uma ponta de 10 µ l. Use uma seringa de 1 mL auto-injeções para infiltrar as suspensões de Agrobacterium . Cuidadosa e lentamente injete cerca de 500 µ l das suspensões preparadas a partir de passo 3.1.5 para o lado adaxial da folha através da seringa. Repeti a infiltração em pelo menos três diferentes plantas para repetições experimentais.
      Nota: Por razões de saúde e de segurança, óculos de proteção devem ser usados durante a infiltração.
    8. Limpe a restante suspensão bacteriana nas folhas e marca o limite da região infiltrada.
    9. Mantenha as plantas infiltradas nas mesmas condições de crescimento utilizada para etapa 1.1.1 por 2 dias.

4. inoculação de Pseudomonas (4 dias)

  1. Raia a estirpe Pseudomonas transformada partir do estoque de glicerol na etapa 2.5 na mídia de agar B do rei com os antibióticos apropriados a 28 ° C, durante 2 dias.
    Nota: A saúde dos Pseudomonas é muito crítica. Se não formam colônias bem, marcam as células novamente ou propagar as células em meio líquido do rei antes de prosseguir.
  2. Inocule uma loopful de células de Pseudomonas em meio líquido manitol-glutamato (MG) a 28 ° C, com agitação a 200 rpm por uma noite.
  3. Colheita as células por centrifugação a 3.000 x g por 10 min. decantar a sobrenadante mídia, resuspenda o pellet em 10 mM MgCl2e ajustar o OD600 a 0,02 (1 x 107 UFC/mL) para s. benthamiana folhas e 0,002 (1 x 10-6 UFC/mL) de Arabidopsis deixa.
  4. Para o s. benthamiana, infiltre a suspensão de Pseudomonas na área das folhas onde o Agrobacterium carregando sfGFP1-10OPT construção foi infiltrada 2 dias anteriormente (como na etapa 3.1.7). Para o sfGFP1-10OPT transgénicos Arabidopsis, infiltre a suspensão de Pseudomonas dois 4 semanas curtas dia-crescido folhas.
    Nota: pelo menos três plantas são necessárias para repetições experimentais.

5. a observação de sfGFP sinal via microscopia Confocal (1 dia)

  1. Cortar o disco de folha da Pseudomonas-inoculados folhas. Nos pontos de tempo específico após infiltração de Pseudomonas, dois discos de folha de 2 cm2 da planta usando um laser confocal sistema com 40 X de digitalização de imagem / 1.2 objectivo de imersão de água at C-Apochromat ou 63 X / 0,8 imersão de óleo at C-Apochromat objetivo. Para evitar as células mortas, mortas por ferimento, observe as células longe do buraco de infiltração.
  2. Inicie a observação em uma configuração de baixa energia do laser do argônio 488 nm. Aumente a potência do laser para detectar sfGFP.
    Nota: Normalmente usamos 2-15% da intensidade do laser para detectar o sinal de fluorescência. No entanto, o poder do laser e a deteção configuração devem ser ajustados com base no sistema de microscopia do usuário. Aqui, os filtros de emissão foram criados para 520-550 nm. As células mortas, muitas vezes, emitir autofluorescência sob a excitação de 488 nm laser. Portanto, como um controle negativo, o efetor mesmo sem a marca de sfGFP11 deve ser infiltrado e observado sob as mesmas condições de observação. Além disso, a excitação do laser de alta pode induzir autofluorescência de clorofila. Portanto, ajuste a intensidade do laser, usando as células de plantas de controle para não induzir a clorofila autofluorescência.
    1. Para um counterstaining da parede celular, infiltrar-se iodeto de propidium 20mm (PI) para o disco de folha em 5-10 min antes da observação.
    2. Para o núcleo de coloração, mergulhe os discos de folha paraformaldeído 0,1% por 5 min, seguido por lavagem com água. Então, se infiltre a 10mm de PI para o disco de folha em 5-10 min antes de observação microscópica. Repeti os experimentos de pelo menos três vezes.
      Nota: Este passo não é crítica, mas útil para definir a localização de efetoras na membrana plasmática ou o núcleo. Se o efetores de interesse mostraram sua localização em uma organela específica, use um marcador para a organela determinado para confirmar a localização do efetor.

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Representative Results

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A estrutura do β-tambor de GFP é composta por onze β fios e pode ser dividida em dois fragmentos, a vertente deth (GFP11) 11 e de 1-10th strand (GFP1-10OPT). Embora nenhum dos dois fragmentos fluorescentes por si, Self montado sfGFP pode emitir fluorescência quando os dois fragmentos existem nas proximidades (figura 1A). Neste sistema, sfGFP1-10OPT-expressando Arabidopsis ou N. benthamiana plantas são inoculadas com Pseudomonas carregando um efetor sfGFP11 marcados. O sfGFP11 com a tag effector entregue por Pseudomonas no citosol da célula hospedeira é reconstituído para o sfGFP1-10OPT expressa no citosol e então juntos translocar no compartimento do alvo (figura 1B). Figura 2 representa o processo global, desde a preparação dos materiais de planta e Pst para a detecção do sinal de fluorescência na célula da planta.

Como um exemplo do nosso método, usamos a proteína de efetor p. syringae , AvrB, que é entregue para as células de plantas hospedeiras completa o T3SS durante a infecção. Em Arabidopsis, AvrB é reconhecido por uma proteína de resistência correspondente, RPM1 e respostas imunes disparadores, incluindo hipersensibilidade celular morte33. No estudo anterior, o ensaio da repórter GFP e o ensaio bioquímico revelaram que AvrB e RPM1 estão localizadas na membrana plasmática do planta célula33,34,35. Para examinar a localização do AvrB usando nosso método, Agrobacterium , abrigando o geneOPT cito sfGFP1-10 foi infiltrada em s. benthamiana. Em dois dias, AvrB-sfGFP11-transformadas Pseudomonas células foram inoculadas no Agrobacterium-invadiu a região. A fluorescência complementado sfGFP sinais foram observados em CUCPB5500 o Pst contendo AvrB-sfGFP11 na membrana plasmática (Figura 3B). Em contraste, sem sinais foram encontrados na célula infectada pelo Pst carregando AvrB nativo (Figura 3A).

Figure 1
Figura 1. O sistema GFP de separação otimizada. (A) a estrutura do β-tambor de GFP é feita de onze β-filamentos e pode ser dividida em 11th β-strand (GFP11) e de 1-10th β-strand (GFP1-10). (B) neste método, os fragmentosOPT sfGFP1-10 foram expressos em pilhas da planta, enquanto foi fundido ao AvrB e transformada em PseudomonassfGFP11 strand. Somente células de plantas infectadas por Pseudomonas contendo sfGFP11 mostrará a fluorescência de sfGFP (onde se localiza o efetor). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Visão geral do processo. Os transgênicos Arabidopsis ou o sfGFP1-10OPT-se infiltrou N. benthamiana planta estão infectados com Pst CUCPB5500 carregando um efetor sfGFP11-marcados através de infiltração de seringa. A fluorescência do sfGFP montado pode ser detectada através de um sistema de microscopia confocal no local da localização effector. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Detecção de AvrB-sfGFP em s. benthamiana deixa 3 h após a infecção. O Pst CUCPB5500 abrigando que um gene AvrB sfGFP11-tag foi infiltrado no 5th ou 6th folha de s. benthamiana, que foi infiltrada por Agrobacterium carregando o sfGFP1-10OPT 2 dias antes. Parede celular foi manchada por iodeto de propidium. Enquanto as células expressando sfGFP1-10 OPT com somente AvrB não mostram qualquer sinal de fluorescência (A). Os sinais GFP (seta amarela) foram observados em células infectadas pelo Pst contendo o gene AvrB-sfGFP11 na post-infiltração de h 3 (B). Este resultado representa que só AvrB-sfGFP11, não AvrB, é reconstituída com sfGFP1-10OPT no citosol e então o sfGFP montado é translocada para a membrana plasmática. Cor magenta pseudo representa a parede celular e clorofila autofluorescência. Verde representa a fluorescência sfGFP montado. Escala de barras = 40 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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O protocolo descrito aqui é usado para monitorar a localização exata das proteínas efetoras injetado pelo T3SS bacteriana em célula de planta hospedeira ao ser infectado. Anteriormente, o sistema GFP de separação foi usado como uma ferramenta para estudar a Localização subcellular das proteínas de mamíferos23,36, Salmonella T3E localização e entrega de Agrobacterium VirE2 através da T4SS para o planta células37. Para aplicar este sistema nas células vegetais, estudos anteriores usado uma milho de plantas transgênicas que constitutivamente expressa o GFP1-10 citoplasmática e fungos transgénicos, Ustilago maydis, que expressa a proteína GFP11-tag effector. No entanto, o milho -U. maydis sistema não teve êxito porque os níveis de expressão das proteínas efetoras translocados eram fracos e elevado nível de fundo autofluorescência impedia a deteção da GFP reconstituído sinal38. Para resolver esse problema, usamos um sfGFP1-10 variante, sfGFP1-10OPT, que melhora significativamente a solubilidade e fluorescência intensidade21,22.

Apesar das vantagens do sistema de sfGFP de separação, existem algumas limitações para o estudo da localização de efetoras e dinâmica. Primeiro, o sinal fluorescente observados sfGFP reconstituído é relativamente fraco. Isto pode ser devido a uma pequena quantidade de moléculas efetoras entregado diretamente do p. syringae. Este sinal fraco pode ser melhorado usando a marca de sfGFP11 de multimerizing. Os vetores carregando 2 x sfGFP11 marca também estão disponíveis as fontes listadas na Tabela de materiais. Em segundo lugar, o sfGFP1-10 citosólica OPT falhou ao ser reconstituído com sfGFP11 direcionados para Golgi, ER e plastídeo25. Expressão co de sfGFP11 orientada para a mitocôndria e citosol sfGFP1-10OPT resultou em mislocalization do sfGFP reconstituída para o citoplasma e núcleo de25. Portanto, localização do efetor de interesse deve ser re-validada aplicando o apropriado organela-alvo sfGFP1-10OPT. Quando qualquer sinal GFP não é detectada nas células infectadas expressando citosólica sfGFP1-10OPT, recomendamos usar s. benth expressando Golgi, ER, e plastídeo alvejadoOPT sfGFP1-10 ou usando a correspondente organela alvejada sfGFP1-10OPT transgénicos Arabidopsis25.

Este método demonstrou que a utilização do sistema de proteína fluorescente dividida como uma ferramenta útil para examinar a dinâmica espacial e temporal de efetores em plantas de anfitrião25. Futura investigação incidirá sobre os avanços em imagem de único-molécula, que lhe permitam estudos detalhados da dinâmica da membrana plasmática-localizada efetores. Além disso, um ensaio de secreção usando um sistema bacteriano pode ser uma alternativa útil para estudar a localização de fungos efetores; previne a agregação de efetores e autofluorescência alta no local da penetração de fungos.

Deve notar-se que existem alguns pontos-chave neste método. Em primeiro lugar, ambos os materiais de planta e bactérias devem ser saudável e fresca. Para garantir a visualização do sinal effector, tanto o sfGFP1-10OPT de plantas e o sfGFP11 de Pseudomonas devem ser fortemente expressos. Portanto, é importante crescer plantas sob as condições de crescimento ideal e protegê-los de estressores ambientais, como as pragas. Recomendamos também que todas as bactérias, usadas para infiltração ser tomado as 2 células dia-crescido nas placas de ágar e não de estoques de glicerol. Em segundo lugar, no caso de expressão transiente em s. benthamiana, o período de tempo necessário para a maturação de sfGFP1-10 organela-alvejadoOPT pode variar para cada proteína de marcador organela. Por exemplo, a maturação de PM-sfGFP1-10OPT requer mais de 48 h após a infiltração. Por último, o ponto do tempo e os níveis de expressão dos sinais de sfGFP reconstituído dependem do tipo de proteínas efetoras que são necessários para otimizar algumas condições experimentais.

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Disclosures

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência, TIC e planejamento futuro (NRF-2018R1A2A1A05019892) para DC e por uma concessão do centro de criação de Molecular de plantas ( PMBC) do programa próxima geração Biogreen 21 do governo de Desenvolvimento Rural (PJ013201) com o EP. Agradecemos o centro de imagem do centro nacional de instrumentação para a gestão ambiental fornecer um microscópio confocal para as filmagens.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis transgenic lines Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10 ABRC CS69831
NU-sfGFP1-10 ABRC CS69832
PT-sfGFP1-10 ABRC CS69833
MT-sfGFP1-10 ABRC CS69834
PX-sfGFP1-10 ABRC CS69835
ER-sfGFP1-10 ABRC CS69836
GO-sfGFP1-10 ABRC CS69837
PM-sfGFP1-10 ABRC CS69838
Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10 Addgene 97387
NU-sfGFP1-10 Addgene 97388
PT-sfGFP1-10 Addgene 97389
MT-sfGFP1-10 Addgene 97390
PX-sfGFP1-10 Addgene 97391
ER-sfGFP1-10 Addgene 97392
GO-sfGFP1-10 Addgene 97393
PM-sfGFP1-10 Addgene 97394
ER-sfCherry1-10 Addgene 97403
ER-sfYFP1-10 Addgene 97404
CYTO-sfCFP1-10 Addgene 97405
sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2 Addgene 98250 pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4 Addgene 98251 pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2 Addgene 98252 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4 Addgene 98253 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2 Addgene 98254 pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4 Addgene 98255 pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2 Addgene 98256 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4 Addgene 98257 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
Bacterial strains
Agrobacterium tumefaciens GV3101 Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml)
Media components
Plant germination media Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve.
Murashige & Skoog medium including vitamins Duchefa Biochemie M0222 Store at 4 °C.
Sucrose Duchefa Biochemie S0809
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
LB media Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave.  Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed.
Tryptone BD Bioscience 211705
Yeast extract BD Bioscience 212750
NaCl Duchefa Biochemie S0520
Micro agar Duchefa Biochemie M1002
King's B media 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed.
Proteose peptone BD Bioscience 212120
Anhydrous K2HPO4 Sigma-Aldrich 1551128 USP
Glycerol Duchefa Biochemie G1345
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506
Bacto Agar BD Bioscience 214010
Mannitol-Glutamate (MG) liquid media Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7
Mannitol Duchefa Biochemie M0803
L-glutamic acid Duchefa Biochemie G0707
KH2PO4 Sigma-Aldrich NIST200B
Infiltration buffer 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use.
MES Duchefa Biochemie M1503 Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize.
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Prepare 100 mM stock in water. Autoclave.
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406 Prepare 150 mM stock in DMSO.
Confocal microscope equipments/materials
710 laser scanning confocal system Carl Zeiss
Axio observer Z1 inverted microscope Carl Zeiss
Propidium iodide ThermoFisher P1304MP

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References

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Sistema de proteína verde fluorescente Split Visualizar efetores entregue de bactérias durante a infecção
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Lee, H. Y., Lee, S. E., Woo, J., Choi, D., Park, E. Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection. J. Vis. Exp. (135), e57719, doi:10.3791/57719 (2018).More

Lee, H. Y., Lee, S. E., Woo, J., Choi, D., Park, E. Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection. J. Vis. Exp. (135), e57719, doi:10.3791/57719 (2018).

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