Summary
Denne protokollen beskriver calorespirometry, direkte og samtidig måling av både varmespredning og åndedrett, som gir en noninvasive tilnærming for å vurdere energi metabolisme. Denne teknikken brukes til å vurdere bidrag av både aerob og anaerob til å energi ved å overvåke totale cellular energiflyten.
Abstract
Mange linjer brukes i grunnleggende biologisk og biomedisinsk forskning opprettholde energi homeostase gjennom en kombinasjon av både aerob og anaerob åndedrett. Men er omfanget som begge veier bidra til landskapet av mobilnettet energiproduksjon konsekvent oversett. Transformert celler kultivert i mette nivåer av glukose ofte viser en redusert avhengighet oxidative fosforylering for ATP produksjon, som er kompensert av en økning i underlaget nivå fosforylering. Dette skiftet i metabolske likevekt kan cellene til spredning til tross for tilstedeværelsen av mitokondrie giftstoffer. I forsømme den endrede metabolske likevekt transformert celler, resultater fra en farmasøytisk screening kan mistolkes siden den mitotoxic effekter kan ikke oppdages ved hjelp av modellen cellelinjer kulturperler i nærvær av høy glukose konsentrasjoner. Denne protokollen beskriver sammenkoblingen av to kraftige teknikker, respirometry og calorimetry, som tillater kvantitative og noninvasive vurdering av både aerob og anaerob bidrag til mobilnettet ATP produksjon. Både aerob og anaerob respirations genererer varme, som kan overvåkes via calorimetry. I mellomtiden kan måle frekvensen av oksygenforbruk vurdere omfanget av aerobic åndedrett. Når både varmespredning og oksygenforbruk måles samtidig, kan calorespirometric forholdet bestemmes. Eksperimentelt innhentet verdien kan deretter bli sammenliknet med den teoretiske oxycaloric tilsvarende og omfanget av anaerob åndedrett kan bedømmes. Dermed gir calorespirometry en unik metode for å analysere et bredt spekter av biologiske spørsmål, inkludert narkotika utvikling, mikrobiell vekst og grunnleggende bioenergi under både normoxic og hypoxic forhold.
Introduction
I biologiske systemer, varme-release eller entalpi endringen under metabolisme er vanligvis overvåket enten direkte (via direkte calorimetry) eller indirekte via O2 forbruk og/eller CO2 produksjon (via respirometry). Dessverre, når disse teknikkene brukes i isolasjon, kritisk informasjon går tapt som bidrag av anaerob trasé til cellenes stoffskifte. Calorespirometry er en kraftfull teknikk som samtidig måling av både varmespredning og åndedrett. Banebrytende calorespirometric arbeid undersøkt den anaerob metabolismen i fullt oksygenrikt pattedyrceller og vist samtidig bidrag av både aerob og anaerob til energi homeostase tross transformert cellene i en fullt oksygenrikt miljø1. Calorespirometry har siden brukt mot et bredt spekter av biologiske spørsmål. Eksempler er studiet av dyr energi på lavt oksygennivå, effekten av både ugressmiddel og østrogen på gjellene annet muslinger, metabolismen av terrestriske organismer og mikrobiell nedbryting av organisk jord saken2, 3 , 4 , 5 , 6. videre calorespirometry har avslørt hvordan metabolske preconditioning før frysing forbedrer kryonisk bevaring av pattedyr celler7. Hver tilnærming, både calorimetry og respirometry, har uavhengig økt vår kunnskap om mobilnettet og organismebiologi bioenergi. Men fremdeles grunnleggende biologisk spørsmål som kan besvares ved hjelp av calorespirometry lite utforsket.
Hesss lov sier at den totale entalpi endringen av en reaksjon er uavhengig av veien mellom de innledende og avsluttende. Den totale entalpi endringen for en biokjemiske sti er for eksempel summering av endringen i dannelsesentalpien alle reaksjoner i veien. Calorimetry tilbyr en sanntid tilnærming for å måle mobilnettet varmeproduksjon, som ukritisk oppdager både aerob og anaerob trasé. Dette er basert på grunnlaget at ingen energi er byttet i systemet unntatt gjennom vegger av eksperimentell ampule8. En endring i varmespredning er lik endringen i entalpi løslatt fra alle metabolske reaksjoner i ampule. Dermed korrelerer en negativ entalpi til tap av varme fra systemet. Uttømmende forskning de siste fire tiårene har preget termodynamisk landskapet katabolisme og anabolism. Dette representeres av en jevn økning i forskningsartikler funnet under søkeord "biologisk" og "calorimetry" som indekseres av det USA nasjonale bibliotek av medisin (NLM) på National Institutes of Health (PubMed). Søk avslører at før 1970, totalt 27 publikasjoner referanse biologiske calorimetry; i mellomtiden, i 2016 alene, 546 publikasjoner benyttet teknikken.
Calorimetric er godt etablert å bestemme varmeproduksjon. Imidlertid gis mer fleksibilitet for å løse respirometric verdien. Respirometric måling kan bestå av O2, CO2, eller både O2 og CO2. Videre kan måling av O2 eller CO2 oppnås ved ulike teknikker, inkludert optrodes, Clark-type elektroder og tunable diode laser absorpsjon spektroskopi7,9,10 ,11. Mens CO2 produksjon er en verdifull beregning i mange respirometric studier, benytter mediet for kulturperler celler ofte en bicarbonic buffer system for pH kontroll12,13. For å unngå komplikasjoner av CO2 mål i bikarbonat systemet, benytter følgende protokollen for calorespirometry av celler i kultur O2 som eneste respirometric parameter.
Samtidig med måle oksygen flux, visse respirometers (se Tabell for materiale) er utformet for detaljerte vurderinger av mitokondrie funksjon. Substrat-uncoupler-hemmer-titrations (SUIT) protokoller er godt etablert og er kompatible med eksperimenter utviklet for å måle membran potensial eller reaktive oksygen arter (ROS) dannelse14. Presentert protokollen for calorespirometry intakt celler er kompatibel med innføringen av kjemiske uncouplers som karbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) og F0F1-ATP syntase hemmer oligomycin. Gjennom tillegg av FCCP kan oksygenforbruk montert fra ATP produksjon, som er nyttig å vurdere effekten av potensielle therapeutics på mitokondrie peformance15. Videre belyser tillegg av oligomycin omfanget av lekkasje åndedrett. Dermed er respirometric målinger utført under calorespirometry kompatibel med omfattende protokoller for ytterligere belyse mitokondrie fysiologi.
Samtidig måling av både varmespredning og oksygen flux lar for beregning av calorespirometric (CR) forholdet. Dette forholdet er deretter sammenlignet med Thorntons konstant eller den teoretiske oxycaloric tilsvarende, som varierer mellom-430 til-480 kJ mol-1 avhengig av cellen linje eller vev rundt og supplert karbon underlag1, 16. dermed negative CR forholdet avslører økt bidrag fra anaerob trasé til samlede metabolsk aktivitet. For eksempel varierer CR forholdet for rutinemessig muskel vev respirasjon uten aktive ytelsen arbeid fra-448 til-468 kJ mol-1 som er innenfor rekkevidden av den teoretiske oxycaloric tilsvarende17,18. Samtidig pattedyr kreftceller kultivert i medium som er høyt i glukose vise forbedret melkesyre gjæring etter Glykolysen og lav relativt mitokondrie engasjement19. Denne fenotypen resultatene i CR forhold i området av-490 til-800 kJ mol-1, viser en økt engasjement av de anaerob i mobilnettet metabolismen som indikert av negative CR prosenter1,7, 16,20.
Både kommersielle og non-profit celler og vev distributører for øyeblikket tilbyr linjer over 150 arter, med nesten 4000 cellelinjer avledet fra mennesker. Udødeliggjort cellelinjer er praktisk verktøy for å raskt vurdere toksisitet av potensielle therapeutics, mange av dem direkte eller indirekte forstyrre mitokondrie funksjoner. Bruke transformert celler under narkotikarelaterte screening kan skyldes begrenset prediktiv verdi delvis Warburg effekten, et kjennetegn på mange kreft. Ofte kreft generere ATP fra substrat nivå fosforylering og opprettholde redoks balanse gjennom produksjon av laktat uten fullt engasjere mitokondrie under aerobe forhold19. Farmasøytisk utvikling er svært kostbare og ineffektive, og med ca 8 av 9 forbindelser testet i menneskets kliniske forsøk ikke å oppnå markedet godkjenning21. Mens potensielle therapeutics kan passere første screening på grunn av lav cytotoksisitet i linjer, er det mulig at noen av disse forbindelsene er mitotoxic. Uten en egnet metode for å oppdage hvor disse giftstoffene kan svekke energibalansen i primære celler som ikke viser Warburg effekten, er viktig informasjon ofte over så, flaskehalser terapeutiske utvikling i tidlige stadier.
Calorespirometry er en praktisk, noninvasive tilnærming til å analysere metabolsk aktivitet i en rekke biologiske prøver, inkludert celler og vev. Kjernen i presentert protokollen er kompatibel med en rekke applikasjoner. En komplikasjon, men har blitt identifisert. Udødeliggjort celler er ofte kultivert i et glukose-fri medium med galaktose å øke bidraget av oxidative fosforylering (OXPHOS) for energiproduksjon, for å bevisstgjøre cellene til potensielle mitotoxins22, 23. Denne metabolske omprogrammering synes å skjule analyse når prøvene er plassert i rustfritt stål ampuller brukes av de calorimeter15. Celler kultivert i et glukose medium fortsette å engasjere seg i høy metabolsk aktivitet i flere timer. Samtidig redusere celler kultivert i galaktose medium varme produksjonen innen 30 min av deres plassering i ampule, å gjøre målinger begrenset til tidlige eksperimentelle tidspunkt. Denne virkemåten hindrer dessverre mulighet til å vurdere deres cellular spredning. Til tross for denne bestemte begrensninger, de fleste programmer er kompatible med calorespirometric analyse og detaljert metabolske informasjon kan fås gjennom denne tilnærmingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle kultur
- Opprettholde menneskelige hepatocellulært karsinom (HepG2) celler i Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) som inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS) og flere underlag (10 mM glukose, 2 mM glutamin og 1 mM pyruvate) på 37 ° C i en celle kultur inkubator (5% CO2 , 95% luft, 100% luftfuktighet).
Merk: Bruk over DMEM formuleringen når DMEM er referert i senere trinn for respirometry og calorimetry. - Plate cellene på 1 x 106 celler per 100 mm kultur plate og subkultur dem hver 7 dager eller før 90% confluency og fornye mediet hver 3-4 dager.
- Utføre eksperimenter når cellene er 60-80% confluent.
2. forberedelse av Respirometer og Calorimeter
- Pipetter 2,2 mL av DMEM i det respirometer kammeret, sett stopperen fullt, og justere den med disables avstand for å gi optimal oksygen diffusjon fra luften til middels.
- Rør kontinuerlig på 37 ° C til oksygen konsentrasjon (blå trace) og oksygen flux (rød trace) er stabile. Sikre respirometer's programvare er programmert til å redegjøre for oksygen Løseligheten av mediet som brukes i eksperimentet.
Merk: Ulike medier har forskjellige oksygen løselighet koeffisientene (e.g.DMEM = 0,92). - Etter stabilisering av oksygen konsentrasjon i DMEM kammeret er åpen, Velg en stabil del av oksygen konsentrasjon spor og kalibrere det for 100% luft metning.
- Kalibrere for 0% oksygen velge en stabil del av oksygen konsentrasjon spor når uten oksygen finnes i kammeret. Utføre dette trinnet etter 20 µL titrering 230 mM natrium dithionite eller etter alle oksygen er fortært av biologiske utvalget på slutten av et eksperiment.
- Når 100% luft kalibrering av respirometer, lukker stopperen og sikre at er ingen bobler i kammeret.
Merk: en liten økning i oksygen flux vil bli oppdaget i lukket kammer som polarographic oksygen sensor (POS) forbruker oksygen for å måle oksygen delvis trykket. - Etter ~ 10 min av stopperen stengt, bekrefter du at respirometer er klar for HepG2 celler ved å observere en stabil oksygen forandring.
Merk: Calorimeter brukt her benytter rustfritt stål ampuller og krever en ampule som skal brukes som referanse. - Legge til 2,5 mL av H2O (dH2O) [like volum som prøvene (trinn 4)] referanse-ampule av calorimeter og skru av korken, bruker tang om nødvendig. Rengjør den forseglede ampule med luftstrøm og sakte senke ampule posisjon 1 i referanse kanalen av calorimeter. Forbli plassering 1 til biologiske utvalg er forberedt.
3. forberedelse av HepG2 celler til Respirometry og Calorimetry
- Bekrefte at respirometer og calorimeter er forberedt og kalibrert. DMEM og trypsin 37 ° c i et vannbad.
- Legge til DMEM i en fersk 100 mm plate og sted i inkubator å tillate balanse av mediet for både CO2 og temperatur.
Merk: Dette mediet brukes for calorimetry eksperimentet, så det riktige volumet avhenger av ampuller som skal brukes. - Bekreft med en invertert lys mikroskop at cellene er i 60-80% confluent, deretter vaske det 100 mm plate 2 x med 10 mL romtemperatur fosfat-bufret saltoppløsning (PBS).
- Legg 3 mL 37 ° C trypsin til 100 mm plate av celler og ruge dem etter 7-10 min på 37 ° C i celle kultur inkubator. Nøytralisere trypsin med 3 mL 37 ° C DMEM og suspendere ved forsiktig pipettering det ~ 20 ganger med en 5 mL pipetter.
- Overføre den 6 mL av resuspended celler i DMEM og trypsin i et sterilt 15-mL konisk rør og sentrifuge det for 5 min på 175 x g. Fjern væsken uten å forstyrre det cellen pellet.
- Resuspend celle pellet i ~ 5 mL av DMEM og Pipetter det grundig slik cellene er tilstrekkelig avstand fra hverandre.
- Fjern ~ 100 µL av velkomponert utvalget og utføre en grundig celletall utnytte alle 8 felter på en hemocytometer til å bestemme antall celler. Deretter beregne volumet for rørets cellene for å generere ~ 2 x 106 celler per 50 µL.
Merk: Dette vil sikre at 2 x 106 celler er lagt til for respirometer med minimal middels forskyvning. - Sentrifuge celler for 5 min på 175 x g. Resuspend pellets i beregnede mengden DMEM fra trinn 3.7.
- Utføre en celletall for å finne volumet nødvendig å injisere 2 x 106 celler per kammer i respirometer (dette skal være ~ 50 µL). Lagre celler for respirometric målet på is til du er klar.
- Mens konsentrert celle prøven er på is, Bestem fortynning kreves for å produsere en konsentrasjon av 1 x 105 celler/mL for calorimetry.
- Prøven blandingen og forberede ~ 3 mL cellene på 1 x 105 celler/mL i DMEM for hver ampule.
Merk: DMEM brukes for eksempel fortynning skal equilibrated medium i trinn 3.3.
4. calorimetry
- Kontroller at calorimeter er koblet til datamaskinen og calorimetric signalet i µW er observerbare og stabil.
- Legge til 2,5 mL av cellene på 1 x 105 celler/mL (~2.5 x 105 celler) i hver ampule, sikrer tilstrekkelig luft mellom lokket av ampule og medium å tillate gass spredning.
- Umiddelbart skru av korken, bruker tang om nødvendig. Rengjør den forseglede ampule, bruke luftstrømmen for å Fjern eksterne rusk, og sakte senke ampule posisjon 1 av calorimeter. Registrere tiden ampule senkes til posisjon 1.
- Kan ampule sitte ved posisjon 1 i 15 min.
Merk: I denne 15 min perioden celler er skal injiseres i respirometer (trinn 5). Dette sikrer at samme tidsintervallet brukes for både varmeproduksjon og oksygenforbruk når CR forholdet bestemmes. - Etter 15 min plassering 1, sakte senke både referanse og prøve ampuller posisjon 2. Registrere tid ampuller ble senket og mål for minst 30 min.
5. respirometry
- Under 15 minutters intervall der ampule er i posisjon 1 i calorimeter, begynne respirometric studier.
- Grundig blande celle utvalget av pipettering for å sikre en homogen løsning og injisere < 50 µL av cellen utvalget til for respirometer for en siste konsentrasjon av ~ 2 x 106 celler/kammer. Registrere tiden cellene blir injisert i respirometer.
- Etter injeksjon, er HepG2 cellene kontinuerlig rørt på 37 ° C. Vent minst 20-30 min for både en stabilisering av oksygen fluks og en jevn nedgang i oksygen konsentrasjon.
- Velg kategorien O2 flux per V til høyre på skjermen og merke en stabil del av oksygen forandring. Velg merker, deretter statistikk og postdataene for O2 flux per V. Denne registreringen brukes i beregningen av CR forhold.
Merk: Trinn 5.5 og 5.6 er valgfrie. Lekkasjen åndedrett og maksimal montert respirasjon vil bli avslørt av titrations oligomycin og FCCP. - Injisere 1 µL av 4mg/mL oligomycin i hvert kammer og tillate ~ 10 min for oksygen flux stabilisering. Registrere stabil lekkasje pustefrekvens ved å følge trinn utført i 5.4 ved å markere en stabil del av oksygen flux spor etter oligomycin.
- Sjarmere 2-µL injeksjoner av 0.2 mM FCCP i hvert kammer, slik at oksygen flux stabilisering etter hver injeksjon. Fortsett til titrations til maksimal fluks er nådd, som angitt av en liten nedgang i påfølgende FCCP Serine. Spille den stabile pustefrekvens under maksimal fluks.
6. beregning av Calorespirometric forholdet
- Utfører en siste celletall prøvene forberedt på ~ 1 x 105 celler/mL utnytte alle 8 felter av en hemocytometer til å bestemme antall celler til ampule (2.5 mL).
- Bestemme gangen registrere mål fra både calorimeter og respirometer hvor stabil signaler er tilstede på samme tid. Referanse tiden registrert når ampule ble senket posisjon 2 og tidspunktet for injeksjon av celler i respirometer.
- Registrere varme produksjonen ved å plassere markøren over sporingen viser varmeeffekt for den respekterte ampule ved i trinn og i µW/millioner celler. Samle oksygen forbruksdataene og sikre at den uttrykkes som pmol O2 x s-1 x millioner celler.
- Hvis du vil beregne CR forholdet, konvertere µW kJ/s, og deretter dele kJ/s over mol O2/s å få CR forholdet uttrykt som kJ/mol O2. Merk: CR forholdet er presentert i kJ/mol O2.
(se utfyllende fil 1)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reproduserbarhet måleenheter calorespirometric avhenger av en korrekt og konsistent eksempel forberedelse. Prøver forberedt fra cellekultur bør ikke brukes hvis platene er overgrodd, som celletall kan bli unøyaktig på grunn av klumper. Videre, redusert varme flyter på grunn av begrenset substrat spredning i de clumped cellene kan oppstå. Derfor, når bruker tilhenger celler, er det viktig å velge en plate med confluency mellom 60-80% og endre mediet 24 timer før eksperimentet.
Riktig instrumental kalibrering og vedlikehold er også avgjørende for informative og reproduserbar calorespirometric målinger. Ved å følge produsentens etablert rengjøring protokoll for respirometer, omfattende vasker med etanol blir iverksatt for å sikre at gjenværende hydrofobe uncouplers og hemmere fjernes og ikke kompromiss målinger av delvis hemme eller uncoupling mitokondrier. Når respirometer kammeret fungerer før eksempel målingen, skal både oksygen konsentrasjon og oksygen flux spor være stabil som vist i figur 1. Hvis POS trenger sensor tjenesten, vil ikke oksygen fluks stabilisere som vist i figur 2. Mål bør ikke utføres når POS ikke er riktig betjent. I tillegg bør ampuller benyttet i calorimeter være renset sterilisert og tørket før bruk, som biologiske forurensning kan forstyrre varmeproduksjon av prøven.
Cellen prøver tilberedes etter riktig kalibrering og utarbeidelse av både i respirometer og i calorimeter. Først stopperen i på respirometer er lukket og kammeret er kontrollert for å sikre at ingen luftbobler finnes. Deretter er HepG2 celler konsentrert ~ 2 x 106/50 µL for respirometry og umiddelbart lagt på is. For calorimetry, er HepG2 celler fra konsentrert prøven utvannet i equilibrated DMEM ~ 1 x 105 celler/mL. Når cellene er grundig mikset av pipettering, legges 2,5 mL av suspensjon til et sterilt ampule. Ampule er tett forseglet, og noen eksterne rusk fjernes ved å blåse ampule med en strøm av luft fra en luften pumpe. Ampule senkes så sakte posisjon 1, hvor det fortsatt i 15 min. Etter 15 min har gått, både referanse og prøve ampuller er deretter langsomt senket posisjon 2 og målinger kan begynne å spilles når varmen output er stabil (Figur 3).
En siste celletall utføres når cellene er lagt til både calorimeter og respirometer å fastslå nøyaktig antall celler introdusert i calorimeter. Varmeproduksjon uttrykkes deretter per million celler. Hvis de HepG2 cellene er kultivert i fravær av glukose og galaktose suppleres for å øke mitokondrie engasjement, cellene sprer ikke inne calorimeter, men i stedet senke deres metabolsk aktivitet etter ca 30 min i ampule. Dette begrenser i CR beregningen tidligste tidspunktet der varmespredningen ble målt (Figur 4).
Det er viktig å registrere tiden cellene er lagt til i ampule slik at målinger av varme produksjon og oksygen forbruk er samlet på samme tidspunkt. Hvis denne forholdsregel ikke er tatt, kan viktige eksperimentelle feil bli introdusert i fastsettelse av CR forholdet. I 15 minutter perioden, mens ampule er i posisjon 1 i calorimeter, cellene er tilstrekkelig mikset av pipettering dem, og 2 x 106 celler blir injisert i respirometer via en Hamilton sprøyte. Oksygen flux stabiliserer etter ca 15 min og oksygen konsentrasjon stadig synker (figur 5). Igjen, er det avgjørende at tidspunktet for eksempel injeksjon er registrert for dataanalyse. Stabilisert oksygen fluks av cellene fungerer som surrogat for oksygenopptak ved beregning av CR forholdet. Ekstra titrations utføres for å vurdere lekkasje åndedrett (1 µL oligomycin) angitt av en dråpe å en lavere oksygen forandring og maksimal montert åndedrett (3-5 titrations av 2 µL FCCP) angitt av å øke åndedrett etter påfølgende FCCP titrations. En ufullstendig uncoupling eller en hemming av åndedrett kan ikke være observert hvis FCCP aksjen er utløpt (figur 6).
Figur 1:100 % luft kalibrering av respirometer og status for polarographic oksygen sensor (POS). Signalene for oksygen konsentrasjon (blå linjen) og oksygen fluks (rød linje) stabilisere begge før 100% luft kalibreringen. Stabil linjene angir at respirometer er klar for kalibreringen. Kalibreringen bør utføres i DMEM, og ikke i H2O. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: POS trenger tjenesten. Etter stabilisering av oksygen konsentrasjon (blå trace) mislykkes oksygen fluks (rød trace) å stabilisere. POS bør ikke brukes til eksperimentering og tjenesten bør brukes som beskrevet av produsenten. En øket ustabilitet av oksygen fluks korrelerer med økt etterspørsel etter POS-tjenesten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Omtrent 2,5 x 105 HepG2 celler kultivert glukose medium viser tegn til spredning i calorimeter. Lasting ~2.5 x 105 HepG2 celler kultivert i nærvær av glukose per ampule genererer en konstant varmeproduksjon av 20 til-28 µW bruke innstillingen 30-µW på apparatet og en økt varmeproduksjon over tid korrelerer med cellular spredning inne i ampule. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Omtrent 2,5 x 105 HepG2 celler kultivert i galaktose medium ikke sprer og varme produksjonen avtar over tid. Lasting ~2.5 x 105 HepG2 celler kultivert i galaktose per ampule resulterer i en umiddelbar varmeproduksjon av ~-20 µW. Men varmen produksjonen reduseres over tid og begrenser CR-ratio målinger til tidlig tid poeng av eksperimentet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: rutine, uncoupled og lekke åndedrett av HepG2 celler. Når celler ble injisert i respirometer, oksygen konsentrasjon stadig redusert (blå trace). Etter stabilisering av oksygen fluks (rød spor) under rutinemessig åndedrett intakt celler, ble oligomycin lagt til hemme F0F1-ATP syntase. Dette indikeres av stabilisering av oksygen flux etter oligomycin, som avslører lekkasje åndedrett. Ca 3-5 titrations av FCCP skal utføres uncouple åndedrett fra ATP syntese og avsløre elektronet transport (ETS) kapasitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: mislykket uncoupling HepG2 celle ånding. Etter tillegg av celler, oksygen flux stabilisert (rød spor) under rutinemessig åndedrett og oksygen konsentrasjon gått jevnt nedover (blå linjen). Titrering av FCCP resulterte i en ufullstendig uncoupling og eventuell hemming, hindrer maksimal ETS kapasitet fra å være nådd. FCCP var sannsynlig forurenset eller degradert fra langvarig lagring. Hvis observert, må en frisk FCCP lager være forberedt. Også bekrefte at oligomycin ikke hemmer ETS kapasitet under uncoupling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med calorespirometry er å evaluere kvantitativt bidrag av aerob og anaerob metabolsk aktivitet og få en sammensatt visning av celleenergien forandring. Dette oppnås ved en samtidig måling av varmespredning og oksygen flux etterfulgt av en sammenligning av beregnet CR forhold med den teoretiske oxycaloric tilsvarende. Flere kritiske trinn må vurderes for reproduserbare og pålitelige data. Vedlikehold av en steril og sunn cellekultur er avgjørende. Forurensning av bakterier eller sopp kan resultere i databeskyttelsesteknologi varme produksjon eller oksygen forbruk, rendering CR forholdet meningsløst. Ytterligere feil cellen teller, dårlig eksempel miksing, eller klumpet seg celler kan også resultere i et unøyaktig CR forhold. En avgjørende skritt i forhold til respirometer er riktig utvalg forberedelse slik at injeksjon er under 50 µL i volum. Dette volumet sikrer en minimal mengde medium er fordrevet fra kammeret og oksygen forbruket er riktig knyttet til 2 x 106 celler. Når rutinen åndedrett er observert, er foreslåtte protokollen kompatibel med to ekstra titrations (oligomycin og FCCP), som lyser lekkasje åndedrett og ETS antall mitokondrier. For dette programmet, kan overdreven tillegg av FCCP hemme åndedrett og hindre maksimal flux; Derfor bør minst 3-5 titrations utføres før nå maksimal montert åndedrett.
Vedlikehold og riktig kalibrering av både respirometer og calorimeter er avgjørende for calorespirometry. Titrering protokollen for bakgrunnen oksygenopptak anbefales og er utført med step-wise titrations av dithionite til reduserte oksygennivået i kammeret. Dette er et viktig mål å bekrefte tett forseglet kammer og korrigere oksygen tilbake spredning i chambers, spesielt hvis mål er utført på en oksygen spenning. Også en rørestang utføres før addisjon av celler kan gi informasjon om responsen på POS. Hvis respons er dårlig eller oksygen fluks er ikke stabil (figur 2), tjenesten POS kreves. Upassende rensning av respirometer kamre kan etterlate rester mengder hemmere eller uncouplers, som kan påvirke etterfølgende eksperimenter. Luftbobler i forseglet kammer kan også forstyrre målinger og kan bli innført under lukking av kammeret eller under eksempel injeksjon hvis luftbobler i sprøyten. Den calorimeter er mer direkte, men det er også utsatt for eksperimentell feil. For eksempel tillater feil tetting av ampule fordampning oppstår massivt forandrer varme flyt.
En av begrensningene i denne metoden er at ikke alle cellene kan kultivert i suspensjon og mange linjer er tilhenger til celle kultur plate eller substrat. For å utføre eksperimenter, må tilknyttede cellene kobles enzymatisk fra platen ved hjelp av dissosiasjon stoffer som trypsin. Celler i denne tilstanden kan være den logaritmiske vekstfase og fysiologi kan endres. Dermed forstyrret påfølgende analyse via calorimeter og respirometer nylig trypsinized celler kan vurdere mobilnettet aktiviteter. Videre er en begrensning i presentert calorimetric protokollen sedimentering celleområde i de lukkede ampuller, som kan føre til lokal hypoksi rundt cellene på grunn av treg oksygen spredning i vandige løsninger. Vi har funnet ut at ~ 3 x 105 celler er den øvre grensen kompatibel med ampuller brukes i denne protokollen. Økende antall celler kan generere et hypoxic miljø fra sedimentering av celler, at resultatene. Dermed er optimalisering kritiske hvis en annen celle linje er undersøkt og alternative tilnærminger anses for eksempel øke middels tetthet å redusere sedimentering celler24. Ampuller finnes den tillatelsen stirring; Det er imidlertid avgjørende for å sikre et minimalt signal-til-støy-forhold finnes under omrøring. I tillegg kalorimetere foruten en ansatt i denne protokollen er kompatibel med calorespirometry og sine evner kan være utover hva vi har presentert. En annen begrensning calorespirometric analyse via en to-kammer respirometer er udyktigheten for en høy gjennomstrømming analyse, som vil være mest relevant for farmasøytisk utvikling. Denne begrensningen, imidlertid er motvirket av kapasiteten for høyoppløselig karakteristikk av den sammensatte innflytelse på luftveiene kjede og mitokondrie fysiologi.
Kapasitet for både høy oppløsning og samtidig måling av varme produksjon og oksygen forandring fra samme eksempel er en betydelig styrken i denne metoden. En potensiell gullstandarden ved tilhenger celler være både kultur for å analysere celler dyrket på microcarrier perler i suspensjon. Denne metoden ville unngå den negative virkningen av dissosiasjon fra kultur celleoverflaten og tillate for analyse av cellulære funksjoner i forskjellige faser av vekstkurve (logaritmisk fase vs kontakt-hemmet fase7). Dessverre kan bruker microcarrier perler være problematisk grunnet høye omrøring hastigheten i respirometer og potensialet for sliping av perler med cellene under baren rør. Til tross for disse begrensningene, et bredt spekter av programmer er fremdeles kompatibel med calorespirometry. Denne metoden er spesielt klar å bedre lette farmasøytisk utvikling ved å raskt identifisere mitotoxic forbindelser i kulturperler celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis finansiert av National Science Foundation grant CHE-160944 Mary E. Konkle og Michael A. Menze.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum - Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
References
- Gnaiger, E., Kemp, R. B. Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux. Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).
- Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications. Chemistry & Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).
- Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).
- Wadso, L., Hansen, L. D. Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems. Methods. 76, 11-19 (2015).
- Gnaiger, E. Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry. Strategies for Gas Exchange and Metabolism. Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. , Cambridge University Press. London. 149-171 (1991).
- Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism. Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).
- Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation. Cryobiology. 61, 79-88 (2010).
- Webb, P. Human Calorimetry. , ABC-CLIO, LCC. Santa Barbara, CA. In Volume 7 of Endocrinology and Metabolism Series (1985).
- Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism. Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).
- Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis. Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).
- Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry. Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).
- Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry. Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).
- Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues. Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone. Cell and Tissue Research. , (2017).
- Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells. Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).
- Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat. The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).
- Paul, R. J. Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C. Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Kemp, R. B. Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells. Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).
- Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death. Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).
- Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64, 985-993 (2004).
- Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures. Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).
