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Neuroscience

एक Neurosphere परख का मूल्यांकन करने के लिए अंतर्जात तंत्रिका कोशिका सक्रियकरण कम रीढ़ की हड्डी की चोट के एक माउस मॉडल में स्टेम

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/57727
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2,3
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Surgery, University of Toronto, 3Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

Summary

यहां, हम एक वयस्क माउस में एक ंयूनतम रीढ़ की हड्डी की चोट मॉडल है कि केंद्रीय नहर आला आवास अंतर्जात तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) पुर्जों के प्रदर्शन को प्रदर्शित करता है । हम बताते है कि कैसे neurosphere परख के सक्रियकरण और निश्चित और आदिम चोट के बाद एनएससी के प्रवास यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) वयस्क स्तनधारी रीढ़ की हड्डी में periventricular कोशिकाओं है कि neurosphere परख का उपयोग कर इन विट्रो में अध्ययन किया जा सकता है की एक अपेक्षाकृत mitotically quiescent जनसंख्या हैं । इस कॉलोनी बनाने परख एक शक्तिशाली उपकरण एक डिश में exogenous कारकों को एनएससी की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए है; हालांकि, यह भी vivo जोड़तोड़ में ताकत और परख की सीमाओं की उचित समझ के साथ के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है । नैदानिक ब्याज की एक हेरफेर अंतर्जात एनएससी सक्रियण पर चोट के प्रभाव है । रीढ़ की हड्डी की चोट के वर्तमान मॉडल एक चुनौती प्रदान करने के लिए आम contusion, संपीड़न की गंभीरता के रूप में इस अध्ययन, और transection मॉडल चोट के स्थल पर एनएससी आला के विनाश का कारण जहां स्टेम सेल रहते हैं । यहाँ, हम कम वक्ष स्तर की सतही dorsolateral सतह पर स्थानीयकृत क्षति का कारण बनता है एक न्यूनतम चोट मॉडल का वर्णन (T7/8) वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी की. यह चोट मॉडल चोट के स्तर पर केंद्रीय नहर बख्शती है और एनएससी के विश्लेषण परमिट है कि चोट के बाद विभिन्न समय अंक पर घाव के स्तर पर रहते हैं । यहां, हम बताते है कि कैसे neurosphere परख के लिए दो अलग, लाइन से संबंधित है, एनएससी की आबादी है कि रीढ़ की हड्डी periventricular क्षेत्र में रहते है-आदिम और निश्चित एनएससी (pNSCs और dNSCs, क्रमशः) के सक्रियकरण अध्ययन का उपयोग किया जा सकता है । हम प्रदर्शन कैसे अलग और चोट के स्तर पर periventricular क्षेत्र से इन एनएससी संस्कृति और सफेद पदार्थ चोट साइट । हमारे बाद सर्जिकल रीढ़ की हड्डी विच्छेदन pNSC और dNSC की संख्या में वृद्धि हुई है-घायल डोरियों की periventricular क्षेत्र से neurospheres व्युत्पंन दिखाने के लिए, चोट के माध्यम से अपने सक्रियण के लिए बोल रहा । इसके अलावा, चोट के बाद, dNSC-व्युत्पंन neurospheres चोट साइट से अलग किया जा सकता है-एनएससी की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए अपने periventricular आला से चोट की साइटों के लिए पलायन ।

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र स्वयं के एक उपजनसंख्या, नए सिरे से, multipotent स्टेम कोशिकाओं है कि सभी अलग परिपक्व तंत्रिका कोशिका प्रकार1,2,3,4को जंम देने की क्षमता है शामिल हैं । इन तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में विशेष niches में रहते है और पैदा करना के लिए चोट के बाद सक्रिय किया जा सकता है, विस्थापित, और परिपक्व तंत्रिका कोशिकाओं में अंतर । एनएससी और उनकी संतान को cortical चोट मॉडल में चोट साइट के लिए पलायन दिखाया गया है5,6। मस्तिष्क में, एनएससी चोट की साइट के लिए पार्श्व निलय से स्थानांतरित करने के लिए दिखाया गया है, जहां वे astrocytes में अंतर है कि glial निशान गठन7में योगदान । रीढ़ की हड्डी में, तथापि, कुछ अध्ययनों से पूछना किया गया है कि इन एक ही अंतर्जात एनएससी रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद वसूली को बढ़ावा देने के लिए दोहन किया जा सकता है । वास्तव में, वहां वर्तमान में एक बहस के रूप में है कि रीढ़ की हड्डी में स्टेम सेल पूल के सक्रियकरण periventricular आला के एक सीधे शारीरिक क्षति केंद्रीय नहर अस्तर8 या यदि रीढ़ की हड्डी पैरेन्काइमा को नुकसान (स्टेम छोड़ने की आवश्यकता है सेल आला बरकरार) अंतर्जात एनएससी9सक्रिय करने के लिए पर्याप्त है ।

रीढ़ की हड्डी की चोट के एक नंबर (विज्ञान) मॉडल तीव्र और जीर्ण चोट के pathophysiology अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इन मॉडलों को भी संभावित चिकित्सा परीक्षण के लिए neuroprotection, चुहियों के माध्यम से विज्ञान का इलाज इस्तेमाल किया गया है, और कोशिका प्रत्यारोपण के विकास/प्रतिस्थापन रणनीतियां10,11,13। वर्तमान मॉडल संपीड़न और/या contusion चोटों, जो बड़े पैमाने पर कार्यात्मक घाटे के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गर्भनाल14,15में व्यापक घावों और cavitations के कारण शामिल हैं । परिणामी glial निशान चौड़ाई के बहुमत के साथ कई रीढ़ की हड्डी के क्षेत्रों में विस्तार कर सकते है/ इस प्रकार, जबकि इन मॉडलों नैदानिक प्रासंगिक हैं, वे चोट के बाद अंतर्जात एनएससी की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण चुनौतियों का वहन । चोट के रासायनिक मॉडल है कि चोट के मामूली रूपों है कि केंद्रीय नहर17बख्श कर सकते है के कारण अनुकूलित किया जा सकता है । हालांकि, विज्ञान के साथ जुड़े ग्रासलेल्या पर चोट ध्यान के इन प्रकार के और शारीरिक और/या यांत्रिक घाव विज्ञान के साथ जुड़े नुकसान के लिए नैदानिक रूप से प्रासंगिक मॉडल नहीं हैं ।

वर्तमान चोट मॉडलों की सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हम एक वयस्क माउस मॉडल में आवेदन के लिए, मूल रूप से चूहे9में विकसित एक सुई ट्रैक न्यूनतम विज्ञान मॉडल अनुकूलित है. हमारे अनुकूलित चोट मॉडल माउस रीढ़ की हड्डी के dorsolateral क्षेत्र के एक सुसंगत घाव बना सकते है और चोट के स्तर (ओं) पर केंद्रीय नहर स्पेयर । इस मॉडल का लाभ यह है कि यह चोट के बाद एनएससी कैनेटीक्स के अध्ययन के लिए अनुमति देता है और उनके संभावित रेडियल माइग्रेशन चोट की साइट के लिए । एक माउस मॉडल का उपयोग भी ट्रांसजेनिक चूहों के उपयोग की अनुमति है कि अंतर्जात एनएससी के वंश पर नज़र रखने और उनकी संतति चोट के बाद की इजाजत दी । एनएससी के गुणों को आगे इन विट्रो neurosphere परख कि इस प्रोटोकॉल में पेश किया है की एक संशोधित रूप का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है ।

neurosphere परख एक इन विट्रो कॉलोनी-परख है कि mitogens की उपस्थिति में एनएससी के अलगाव परमिट बनाने है । क्लोनिंग चढ़ाना घनत्व में, व्यक्तिगत एनएससी पैदा करना की कोशिकाओं है कि एनएससी की एक छोटी सी आबादी के शामिल है और progenitors18,19के एक विशाल बहुमत के मुक्त अस्थाई गोलाकार कालोनियों को जंम दे । हमारे प्रोटोकॉल में, हम रीढ़ की हड्डी के periventricular क्षेत्र से दो अलग, लाइन से संबंधित एनएससी के अलगाव का प्रदर्शन-आधारभूत शर्तों के तहत और हमारे ंयूनतम विज्ञान मॉडल का पालन । निश्चित तंत्रिका स्टेम सेल (dNSCs) एक्सप्रेस nestin और glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) और एपिडर्मल वृद्धि कारक (EGF), fibroblast वृद्धि कारक (FGF), और हेपरिन (एक साथ EFH)20की उपस्थिति में उगाया जाता है । ये dNSCs भोली स्पाइनल कॉर्ड में दुर्लभ हैं, इन विट्रो मेंबहुत कम neurospheres को जन्म देते हैं । लेकिन, हम बताते है कि dNSCs ंयूनतम विज्ञान के बाद सक्रिय कर रहे हैं, periventricular21क्षेत्र से अलग neurospheres की संख्या का विस्तार । आदिम तंत्रिका स्टेम सेल (pNSCs) तंत्रिका स्टेम कोशिका वंश में dNSCs के ऊपर हैं । pNSCs बेहद दुर्लभ हैं, pluripotency मार्कर Oct4 के कम स्तर व्यक्त करते हैं, और ल्यूकेमिया निरोधात्मक फैक्टर (लिफ) उत्तरदायी22हैं । pNSCs प्राथमिक संस्कृतियों में myelin बुनियादी प्रोटीन (MBP) की उपस्थिति के कारण वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी से अलग जब neurospheres फार्म नहीं; हालांकि, pNSC neurospheres MBP की कमी चूहों से अलग किया जा सकता है और उनकी संख्या के बाद चोट का विस्तार कर रहे है-dNSCs21के समान । अंत में, हम बताते है कि dNSC-व्युत्पंन neurospheres ंयूनतम विज्ञान के बाद जल्दी समय पर चोट की साइट से अलग किया जा सकता है । इन निष्कर्षों को प्रदर्शित करता है कि हमारे चोट मॉडल और परख periventricular एनएससी के सक्रियकरण विशेषताओं का आकलन कर सकते है जैसे उनके पैदा करना और चोट के जवाब में माइग्रेट करने की क्षमता के रूप में ।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल के टोरंटो विश्वविद्यालय में पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और देखभाल और प्रायोगिक जानवरों के उपयोग के लिए "गाइड के साथ अनुसार है (2एन डी संस्करण, पशु देखभाल पर कनाडा परिषद, २०१७) ।

1. न्यूनतम रीढ़ की हड्डी में चोट सर्जरी

नोट: सर्जरी से पहले सुनिश्चित करें कि सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों और सामग्री उचित तरीकों (आंकड़ा 1a) द्वारा निष्फल रहे हैं ।

  1. धुंध के 4-5 चौकों और उंहें बीच में एक साथ टेप धुंध का एक निश्चित रोल प्राप्त करने के रोलिंग द्वारा एक वक्ष समर्थन मेहराब बनाएं ।
  2. प्रेरण कक्ष में माउस प्लेस और 5% isoflurane के साथ संज्ञाहरण आरंभ । आगे बढ़ने से पहले एक पैर की अंगुली चुटकी पलटा के अभाव की पुष्टि, के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रक्रिया भर । के रूप में शल्य चिकित्सा 30 मिनट के ऊपर की ओर ले जा सकते है पूरा करने के लिए, ंयूनतम isoflurane एक्सपोजर के लिए अनुकूलन (5% से कम ५ मिनट और शेष समय पर 2-3%) ।
  3. 2-3% isoflurane रखरखाव खुराक पर संवेदनाहारी मशीन से जुड़ी एक नाक शंकु के लिए माउस स्थानांतरण । बाल कतरनी का प्रयोग करें मध्य से पशु के dorsum से फर को दूर करने के लिए गर्दन के लिए कान के ऊपर वापस या सर्जरी के लिए त्वचा की एक विस्तृत आयताकार क्षेत्र बेनकाब ।
  4. संलग्न नाक शंकु में अपनी नाक रखकर और कान सलाखों के साथ खोपड़ी स्थिर करने के द्वारा एक stereotaxic साधन के लिए माउस स्थानांतरण । कान सलाखों के स्थान के दौरान 5% पर isoflurane बनाए रखने और 2-3% करने के लिए वापस कम एक बार माउस stereotaxic डिवाइस में सुरक्षित है ।
  5. प्रशासन ऑपरेटिव एनाल्जेसिक दवाओं intraperitoneally — Meloxicam (२.० मिलीग्राम/ उदारता से खुले माउस आंखों पर नेत्र स्नेहन लागू corneal सुखाना को रोकने के लिए जब संज्ञाहरण के तहत ।
  6. हल्के से पूंछ के आधार पर खींच कर माउस शरीर और रीढ़ की हड्डी को सीधा करते हुए माउस पेट के नीचे वक्ष समर्थन चाप रखें । एक स्टार की तरह की स्थिति में पूंछ और सभी विस्तारित अंगों को सुरक्षित करने के लिए प्रयोगशाला लेबलिंग टेप का प्रयोग करें । एक बार सुरक्षित, वक्ष समर्थन चाप rostrally पुश, ऊपरी छाती की ओर माउस पेट से-वक्ष रीढ़ की हड्डी (आंकड़ा 1b) को सहारा देने के क्रम में ।
  7. povidone-आयोडीन के बाद ७०% इथेनॉल के साथ कदम १.३ में तैयार फर कतरनी त्वचा क्षेत्र को संक्रमित करके एक बाँझ सर्जिकल क्षेत्र तैयार करें । दोहराएं दो बार । एक व्यापक बाँझ क्षेत्र रखने के लिए एक बाँझ शल्य कपड़ा लागू करें.
  8. एक #10 स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग, वक्ष रीढ़ की वक्रता के लिए दोनों कंधे ब्लेड के मध्य बिंदु से पशु के अनुदैर्ध्य अक्ष के समानांतर एक ऊर्ध्वाधर चीरा बनाते हैं । त्वचा नरम ऊतक और रीढ़ की हड्डी स्तंभ समोच्च (चित्रा 1C) बेनकाब करने के लिए वापस लेना ।
  9. suprascapular वसा पैड के निचले सीमा की पहचान (यह टी-4/demarcates कशेरुका स्तर) । एक ही #10 ब्लेड के साथ, ध्यान से लेकिन बल के साथ, कशेरुका हड्डी T5 के दोनों पक्षों के साथ कट-T8/9 कॉलम से वापस मांसपेशी tendons अलग ।
  10. रीढ़ की हड्डी के दोनों ओर चीरा साइटों में retractor के दांत डालें । retractor मांसपेशी परतों (चित्रा 1 डी) पर बहुत अधिक दबाव डालने के लिए पर्याप्त रूप से रीढ़ की हड्डी तरक्की करने के लिए ट्रैक्टर का विस्तार करके जोखिम को समायोजित करें ।
  11. शल्य माइक्रोस्कोप के तहत, ध्यान से अवशिष्ट मांसपेशी और अन्य नरम ऊतक कशेरुका हड्डी (चित्रा 1E) को बेनकाब करने के लिए रीढ़ के बल पर साफ । कशेरुकाओं कि दांतेदार संदंश के साथ कशेरुकाओं की रीढ़ की प्रक्रिया को पकड़कर हटा दिया जाएगा और यह थोड़ा ऊपर और नीचे की पहचान ।
    नोट: यह intervertebral जोड़ों की पहचान की अनुमति चाहिए और ब्याज की कशेरुकाओं के नीचे छोटे उद्घाटन (intervertebral foramina) बेनकाब ।
  12. उजागर intervertebral फोरमेन के दोनों ओर में घुमावदार कुंद कैंची का एक सिर डालें, caudal कशेरुका लेमिना करने के लिए बाहर उत्पाद किया जा करने के लिए, और जोड़ने intervertebral जोड़ों को द्विपक्षीय रूप से काट दिया ।
  13. लेमिना को ऊपर की ओर उठाएं और हड्डी को अलग करने के लिए लेमिना के ऊपरी अटैचमेंट को काट लें ।
    नोट: यह बरकरार ड्युल स्पाइनल कॉर्ड (चित्रा 1F) युक्त थैली बेनकाब होगा । वहां अत्यधिक खून बह रहा है जो precut 1 सेमी एक्स 1 सेमी धुंध प्रभावित क्षेत्रों पर रखकर नियंत्रित किया जा सकता है और/या बाँझ पंजाबियों के साथ धो सकते हैं ।
  14. पृष्ठीय midline नस एक मील का पत्थर के रूप में सेवारत के साथ, एक 30 जी सुई टिप के ४५ ° तुला शाफ्ट (सुई ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है बेवल के साथ) रीढ़ की हड्डी के dorsolateral सतह में डालने (लगभग 1 मिमी गहरी) लगभग ०.५ mm पार्श्व में दोनों midline के पक्ष में ।
  15. सुई ले जाएँ ~ 2 मिमी caudal से rostral (समानांतर midline करने के लिए) ताकि सुई के बेवल की पूरी लंबाई कॉर्ड में डाला जाता है । प्रविष्टि (चित्रा 1G) के मार्ग के माध्यम से अनुरेखण द्वारा सुई निकालें ।
    नोट: कोई खून बह रहा है लेकिन रीढ़ की हड्डी के ऊतकों की सूजन होना चाहिए इस कदम पर देखा जा सकता है ।
  16. घाव को बंद करने के लिए, पुनः ट्रैक्टर निकालें और एक 6-0 अवशोषित सीवन का उपयोग midline में एक साथ चोट के दोनों ओर पीठ की मांसपेशियों टांका । एक 4-0 बाँझ रेशम सीवन का उपयोग करने के लिए बाद में अधिक त्वचा बंद ।
  17. एक कपास झाड़ू की नोक का उपयोग कर पश्चात संक्रमण को रोकने के लिए सतही टांका त्वचा के शीर्ष करने के लिए एंटीबायोटिक मरहम लागू करें । प्रशासन के बाद ऑपरेटिव एनाल्जेसिक के ०.१ मिलीग्राम/Buprenorphine के तरल पदार्थ के साथ चमड़े के साथ-साथ (1 मिलीलीटर की स्तनपान कराने वाली है घंटी समाधान) ।
  18. isoflurane vaporizer और ऑक्सीजन को बंद कर दें । stereotaxic डिवाइस से माउस निकालें और कोई बिस्तर के साथ एक साफ पिंजरे में जगह है ।
  19. के बारे में 30 सेमी दूर संज्ञाहरण से वसूली के लिए एक गर्मी चिराग से और जागने के बाद व्यवहार की निगरानी पिंजरे में माउस रखें । माउस 5-10 मिनट के भीतर जागना चाहिए और हिंद-संभव केवल पेशियों और/या जागने पर पूंछ कमजोरी के साथ अंग समारोह है ।
  20. अगले कुछ दिनों में माउस व्यवहार की निगरानी और उचित पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल और एनाल्जेसिक प्रदान (यानी, मैश, स्तनपान कराने वाला है घंटी समाधान द्रव चमड़े के नीचे, ०.१ मिलीग्राम/kg buprenorphine 2x दैनिक 2 के लिए चमड़े के नीचे-3 दिन, और उचित वजन की निगरानी ) स्थानीय पशु सुविधा नियमों के अनुसार और एक व्यक्तिगत आधार पर वसूली के रूप में भिंन हो सकते हैं ।

2. Neurosphere परख विच्छेदन

नोट: भर उचित बाँझ ऊतक संस्कृति प्रक्रियाओं का पालन करें ।

  1. एंजाइमी समाधान तयारी
    1. एल्ब्युमिन ovomucoid अवरोधक कांच की बोतल और धीरे भंवर से युक्त जब तक भंग करने के लिए अर्लों की संतुलित नमक समाधान (EBSS) के ३२ मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. भंग करने के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में एक पूर्व भाग papain कांच की शीशी और जगह के लिए EBSS के 5 मिलीलीटर जोड़ें । समाधान (समाधान 1) स्पष्ट हो जाएगा ।
    3. EBSS के ५०० µ एल लो और 1 मिलीग्राम/एमएल (समाधान 2) की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पूर्व भाग DNase मैं कांच की शीशी में जोड़ें । शीशी को आगे पीछे झुकाकर बहुत धीरे से मिलाएं और इस मिश्रण के २५० µ l को 1 समाधान में जोड़ें ।
      नोट: सभी समाधान बनाया (समाधान 1 और 2) ऊतक के दो टुकड़े के प्रसंस्करण के लिए पर्याप्त हैं । यदि ऊतक के अधिक टुकड़े प्रसंस्करण, और अधिक समाधान प्रस्तुत करने के साथ समायोजित ।
  2. ऊतक तैयारी और विच्छेदन
    1. एक प्रयोगशाला माउस पिंजरे में isoflurane में लथपथ पोंछें और anesthetize माउस को पूरी तरह से वाष्प के लिए 2-3 मिनट की अनुमति रखें । नॉकआउट के बाद, पिंजरे से माउस को हटाने और एक पैर की अंगुली-चुटकी पलटा के अभाव की पुष्टि करें ।
    2. पशु euthanize करने के लिए एक कुंद धातु वस्तु (यानी, धातु पिंजरे कार्ड) के साथ गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं । अपनी गर्दन से euthanized जानवर वापस मध्य उदारता से ७०% इथेनॉल के साथ स्प्रे ।
    3. खोपड़ी के आधार पर, सिर को काटने के लिए कैंची का उपयोग करें और एक बायो बैग में छोड़ दें । मांसपेशियों और कशेरुका अस्थि समोच्च (चित्रा 2a) बेनकाब करने के लिए पीठ की पूरी लंबाई के साथ त्वचा में एक midline चीरा बनाओ ।
    4. प्रत्येक ब्लेड के औसत दर्जे का पहलू लिफ्ट (यानी, कंधे ब्लेड-झूठ बोल वसा पैड द्वारा की पहचान) और कैंची का उपयोग करने के लिए दूर कोमल ऊतक काट (scapulae और कशेरुकाओं के बीच) । अंतर्निहित कशेरुका स्तंभ को अरक्षित करने के लिए पूरी तरह अलग है ।
    5. स्पाइनल कॉलम की वक्रता के बाद, ऊपरी वक्ष एपर्चर में कैंची की एक ही जोड़ी डालें और दूर संलग्न पसलियों, मांसपेशियों, और आंतरिक अंगों (चित्रा बी) काटने के द्वारा कशेरुका कॉलम को अलग ।
    6. caudal कशेरुका फोरमेन में कैंची डालें/खोलने और laminae (पृष्ठीय सतह) के दोनों ओर intervertebral जोड़ों में कटौती । बरकरार कॉर्ड को नुकसान न पहुंचाने के लिए विशेष ध्यान रखें । इस प्रक्रिया को इच्छित स्तर तक जारी रखें और/या कॉर्ड की लंबाई उजागर है ।
    7. ध्यान से रीढ़ की हड्डी तंत्रिका (ओं) को काटने के लिए नियमित रूप से कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव के साथ एक पेट्री डिश में रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को स्थानांतरित करने से पहले नाल से बाद में विस्तार । नमूना बर्फ पर रखें (चित्रा 2c).
    8. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, रीढ़ की हड्डी के ऊतकों में कटौती ~ 2 मिमी rostral और चोट साइट के लिए caudal शामिल हैं । संदंश के दो जोड़े का उपयोग करने के लिए धीरे 2 आधा पृष्ठीय और ventral दरारें (चित्रा 2c') के साथ longitudinally में गर्भनाल अलग ।
    9. microscissors के साथ, घायल dorsolateral सफेद मामले में कटौती । एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में टुकड़ा रखें ।
    10. रीढ़ की हड्डी के एक आधा होल्डिंग नीचे संदंश के साथ, चिढ़ाने और सफेद बात को दूर रीढ़ की हड्डी की rostrocaudal हद के साथ ठीक संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग कर वांछित periventricular क्षेत्र को अलग । रीढ़ की हड्डी के दूसरे आधे के लिए दोहराएं ।
    11. periventricular ऊतक के टुकड़ों को एक अलग 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में रखें । microscissors का प्रयोग करें और धीरे शंकु ट्यूबों की दीवारों के खिलाफ ऊतक कीमा ।
      नोट: ऊतक पृथक्करण संशोधनों से कर रहे हैं Papain पृथक्करण सिस्टम प्रोटोकॉल23 और पहले वर्णित ऊतक तैयारी प्रक्रियाओं24.
    12. नए समाधान 1 के २.५ मिलीलीटर जोड़ें (चरण 2.1.3) ऊतक नमूने और जगह के लिए ३७ ° c पर एक झूली कुरसी पर 30 मिनट के लिए ।
    13. धीरे एक १,००० µ एल पिपेट टिप के साथ समाधान में ऊतक triturate । ३०० x g पर 5 मिनट के लिए आरटी पर बादल सेल निलंबन केंद्रापसारक
    14. २.७ के अर्ल है संतुलित नमक समाधान, ३०० µ l के ovomucoid अवरोधक समाधान (कदम 2.1.1) और १५० µ एल के DNase मैं समाधान (कदम 2.1.3) के एल के साथ समाधान 3 तैयार करें ।
    15. चरण (चरण 2.2.13) से supernatant को छोड़ें और समाधान 3 में से १.५ मिलीलीटर को पिछले चरण (चरण 2.2.14) में पुनर्स्थगित करें ।
    16. परत इस नए सेल निलंबन (कदम 2.2.15) ovoimucoid अवरोध करनेवाला समाधान के 5 मिलीलीटर के शीर्ष पर (एक नया 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में कदम 2.1.1) एक सतत घनत्व ढाल बनाने के लिए । ३०० आरटी पर 5 मिनट के लिए एक्स जी में केंद्रापसारक
    17. supernatant त्यागें और neurobasal मीडिया के 2 मिलीलीटर में resuspend । ३०० आरटी पर 3 मिनट के लिए एक्स जी में केंद्रापसारक
    18. supernatant त्यागें और neurobasal मीडिया के 1 मिलीलीटर में resuspend । 5 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए मीडिया के 4 मिलीलीटर के बाद एक 20 µm सेल छलनी का उपयोग कर निलंबन फ़िल्टर ।
  3. चढ़ाना
    1. एपिडर्मल वृद्धि कारक के साथ neurobasal मीडिया का सप्लीमेंट द्वारा neurosphere विकास के लिए संस्कृति मीडिया तैयार (20 एनजी/एमएल)/fibroblast वृद्धि कारक (20 एनजी//हेपरिन (2 µ g/ml) [निश्चित एनएससी के लिए] या leukemina निरोधात्मक फैक्टर (10 एनजी/एमएल) [आदिम एनएससी के लिए] । एक 25 मिलीलीटर ऊतक संस्कृति कुप्पी में या तो मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. (step 2.2.18)25से निलंबन में कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए एक hemocytometer और Trypan ब्लू डाई का प्रयोग करें । एक बार गणना की, ऊतक संस्कृति में तैयार की कुप्पी के लिए कोशिकाओं को जोड़ने के लिए (कदम 2.3.1) 10 कोशिकाओं के एक क्लोनल घनत्व के लिए/µ एल और प्लेस ऊतक संस्कृति कुप्पी के साथ जोड़ा कोशिकाओं के लिए 24 घंटे (३७ ° c, ९५% आर्द्रता, 5% सह2) ।
      नोट: गिनती तकनीक का एक उदाहरण इस प्रकार है: सेल निलंबन के 10 µ एल ले लो और Trypan नीले रंग के 10 µ एल के साथ मिश्रण । इस मिश्रण के 10 µ l को एक hemocytometer में डालें । एक 10x प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत, जीवित कोशिकाओं की संख्या गिनती और सभी 4 x 4 चक्रों के 4 के भीतर गिना कोशिकाओं राशि । सूत्र का उपयोग करें: 100000/[(x cells/4) x 2 x 10 x १,०००] प्रत्येक 25 एमएल ऊतक संस्कृति कुप्पी में चढ़ाया जा करने के लिए सेल निलंबन की मात्रा देने के लिए क्लोनल घनत्व (10 कोशिकाओं/µ एल) सुनिश्चित करने के लिए ।
    3. 24 घंटे के बाद, धीरे कुप्पी और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सामग्री डालना घूमता है । ३०० आरटी पर 5 मिनट के लिए एक्स जी में केंद्रापसारक
    4. supernatant त्यागें और कोशिकाओं को फिर से निलंबित 1-2 ताजा neurobasal मीडिया के मिलीलीटर में ।
    5. दोहराएँ चरण 2.3.2 एक 24-well टिशू कल्चर प्लेट में निलंबन और प्लेट कोशिकाओं में क्लोनिक घनत्व पर कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए ५०० µ एल युक्त प्रत्येक उनके संबंधित mitogen पूरक मीडिया (निश्चित एनएससी वृद्धि के लिए EFH और आदिम एनएससी विकास के लिए लिफ).
      नोट: अनुकूलित सूत्र का प्रयोग करें (5000/[x cells/4) x 2 x 10 x १,०००) सेल निलंबन की मात्रा की गणना करने के लिए एक अच्छी तरह से युक्त ५०० µ एल में चढ़ाया जा मीडिया ।
    6. प्लेस मशीन (३७ डिग्री सेल्सियस, ९५% आर्द्रता, 5% सह2) में कोशिकाओं युक्त प्लेटें 7 दिनों के लिए विकसित करने के लिए ।
  4. गिनती
    1. संस्कृति में 7 दिनों के बाद, एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत प्लेटों और देखने को हटा दें । गोलाकार कालोनियों है कि > dNSCs संस्कृतियों के लिए व्यास में 80 µm और > 50 pNSCs संस्कृतियों के लिए µm व्यास गिनती द्वारा neurospheres यों ।
      नोट: यदि वांछित, neurospheres आगे26 या विभेदित पारित किया जा सकता है । यदि कोशिकाओं की जरूरत नहीं रह रहे हैं, कुओं के लिए त्वरित हाइड्रोजन पेरोक्साइड जोड़कर निपटान (लगभग 1 मिलीलीटर) 20 मिनट के लिए इतना है कि माध्यम का रंग पीला हो जाता है । फिर त्यागें ।

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Representative Results

सर्जरी के बाद, चूहों ंयूनतम मोटर घाटे जो पूंछ और संभव हिंद-अंग केवल पेशियों 24 ज के लिए शामिल हो सकते है अनुभव करना चाहिए । इस समय के बाद, चूहों कोई हिंद अंग पक्षाघात और/या केवल पेशियों और चाल में ंयूनतम परिवर्तन का अनुभव करना चाहिए ।

चित्रा 3 ंयूनतम रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद neurosphere परख 5 दिनों से प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है । dNSC की निरपेक्ष संख्या-व्युत्पंन neurospheres (EFH में उगाया) pNSC की संख्या से अधिक है-neurospheres (लिफ में हो) चोट के बाद (3 ए और बी. ए., क्रमशः) । एक निश्चित neurosphere (चित्रा3 सी) और एक आदिम neurosphere (चित्रा 3d) के उच्च शक्ति छवियों निश्चित neurospheres व्यास में बड़ा किया जा रहा है के साथ इन अलग कालोनियों की उपस्थिति में अंतर प्रकट (≥ ८० µm) और आम तौर पर एक बड़े अंधेरे केंद्र होने. आदिम neurospheres आकार में छोटे होते हैं (≥ ५० µm) और कोशिकाएँ अधिक कसकर पैक हो जाती हैं. घायल गर्भनाल के विभिंन भागों से उत्पंन neurospheres के प्रतिनिधि संख्या चित्रा 3E (निश्चित) और 3F (आदिमयों) में देखा जाता है । चित्रा 3E से पता चलता है कि कम विज्ञान rostral गैर घायल गर्भनाल में एक अपेक्षाकृत मामूली वृद्धि की तुलना में चोट के स्तर पर केंद्रीय नहर से हो neurospheres में एक महत्वपूर्ण वृद्धि का कारण बनता है ।

दिलचस्प है, निश्चित neurospheres घाव, एक क्षेत्र है जो laminectomy अकेले चूहों में neurosphere बनाने कोशिकाओं को शामिल नहीं करता है की साइट से उत्पंन किया जा सकता है । चित्रा 3F घाव साइट पर pNSC neurospheres के अपवाद के साथ pNSCs के बाद चोट में एक समान वृद्धि दर्शाता है । इसलिए, केवल dNSCs इस समय पाठ्यक्रम के बाद चोट की साइट पर स्थानांतरित करने में सक्षम हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: शल्य प्रक्रिया । (क) आवश्यक सब कुछ के लेआउट, संदर्भ के लिए गिने । (ख) एक सीधा शरीर, रीढ़ और अंगों के साथ एक stereotaxic डिवाइस में माउस की एक तस्वीर बाहर फैल और वक्ष समर्थन मेहराब के नीचे रखा साथ टेप । (ग) एक ऊर्ध्वाधर त्वचा के साथ माउस की एक तस्वीर पेशी परत और रीढ़ की हड्डी के स्तंभ समोच्च उजागर चीरा । (घ) पेशी चीरा और जोखिम और retractor के साथ रीढ़ की अलगाव के बाद माउस शरीर की एक तस्वीर । फाड़ की कमी के साथ तना हुआ मांसपेशी परतों नोट । (ङ) मांसपेशी परतों के साथ अलग माउस रीढ़ की एक तस्वीर हटा दिया, बांस (3 क्षेत्रों) के बोनी सतह दिखा । यह भी रीढ़ की हड्डी से पता चलता है और संभवतः intervertebral संयुक्त और मध्य बांस के लेमिना को हटा दिया जाएगा । (च) दिखाई देने वाली स्पाइनल कॉर्ड पोस्ट-laminectomy का चित्र । त्यसपछि पृष्ठीय midline नस । (छ) पृष्ठीय midline नस के दोनों ओर द्विपक्षीय सुई ट्रैक चोटों के साथ माउस की एक तस्वीर । वहां 30 जी सुई के ४५ ° तुला शाफ्ट के एक बंद अप डालने है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: रीढ़ की हड्डी विच्छेदन । (एक) midline त्वचा चीरा के साथ decapitated माउस की एक तस्वीर के लिए पीठ की मांसपेशी और कशेरुका हड्डी समोच्च (खअलग कशेरुका कॉलम की एक तस्वीर का पर्दाफाश, rostral और caudal उंमुखीकरण दिखा । दूसरी तस्वीर गर्भनाल अलगाव से पता चलता है और तीसरे एक पेट्री डिश में अलग रीढ़ की हड्डी से पता चलता है । (ग) रीढ़ की हड्डी के ठीक विच्छेदन की एक चित्रमय प्रतिनिधित्व, जहां विभिंन क्षेत्रों (periventricular, चोट क्षेत्र) और निकाल दिया संवर्धन के लिए अलग कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: neurosphere परख से प्रतिनिधि परिणाम ंयूनतम रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद । (क) dNSC की संख्या-व्युत्पंन neurospheres (EFH में उगाया) घायल रीढ़ की हड्डी से संस्कृति से अधिक है (ख) pNSC की संख्या-neurospheres व्युत्पंन (लिफ में हो) जब समान घनत्व पर चढ़ाया । (सी, डी) उच्च शक्ति की छवियां "ठेठ" में neurospheres (ग) dNSC संस्कृतियों और (घ) pNSC संस्कृतियों । (ङ) चोट के स्तर पर केंद्रीय नहर से dNSC-व्युत्पन्न neurospheres की संख्या में महत्वपूर्ण वृद्धि में न्यूनतम सुई पथ चोट परिणाम के रूप में अच्छी तरह से चोट करने के लिए केंद्रीय नहर rostral, और चोट साइट से. (च) pNSC-व्युत्पन्न neurospheres को घायल नाल से पृथक नहीं किया जा सकता लेकिन मध्य नहर से चोट के बाद पृथक किया जा सकता है (चोट के स्तर पर और rostral मध्य नहर से). त्रुटि पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि दर्शाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

शल्य प्रक्रिया के दौरान, वहां कुछ महत्वपूर्ण कदम जहां शोधकर्ता के लिए विशेष रूप से ध्यान देना चाहिए ताकि इष्टतम परिणाम प्राप्त करने और पशुओं के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए कर रहे हैं । देखभाल सांस संज्ञाहरण के साथ लिया जाना चाहिए (isoflurane) सर्जरी के दौरान के रूप में संवेदनाहारी को लंबे समय तक जोखिम27के साथ न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव है दिखाया गया है । तदनुसार, जब रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद की अपक्षयी क्षमता का अध्ययन, एक के रूप में जल्दी से और कुशलता से चर को रोकने के लिए संभव के रूप में शल्य चिकित्सा प्रदर्शन करने का प्रयास करते हैं । माउस प्रति एक ही isoflurane जोखिम समय को बनाए रखने परिवर्तनशीलता कम हो जाएगी । माउस की श्वास दर शल्य चिकित्सा भर में निगरानी की जानी चाहिए और बहुत धीमी गति से नहीं होना चाहिए (से कम 1 सांस हर 2-3 एस) या भारी परिश्रम (यानी, हांफना) । संज्ञाहरण के रखरखाव खुराक 2 से कम किया जा सकता है-3% चूहों कि कम खुराक प्राप्त की नोट के साथ लंबे समय तक संज्ञाहरण के कारण मौत को रोकने के लिए.

सर्जरी के दौरान, कशेरुका कॉलम के दोनों ओर मांसल चीरा प्रदर्शन करते समय अतिरिक्त सावधानी बरतें । सुनिश्चित करें कि कटौती गहरी हैं, और ब्लेड औसत दर्जे का angled इतना है कि ब्लेड के किनारे पेशी चीरा के दौरान बोनी कशेरुकाओं के खिलाफ टिकी हुई है । यदि ब्लेड बाहर angled है, वहां संवहनी कटौती से अत्यधिक रक्तस्राव की संभावना है । शोधकर्ता भी अतिरिक्त ध्यान देना चाहिए जब laminectomy प्रदर्शन के लिए कैंची जो रीढ़ की हड्डी को नुकसान होगा की गहरी angling से बचने के लिए, अवांछित ऊतक क्षति और कार्यात्मक घाटे के कारण । इन प्रयोगों के लिए उपयुक्त नियंत्रण है एक "laminectomy केवल" समूह (कोई चोट), जो एनएससी के सक्रियण की तुलना सक्षम हो जाएगा करने के लिए विरोध के रूप में सुई ट्रैक चोट के लिए जिंमेदार ठहराया जो laminectomy से ही परिणाम कर सकते हैं । हमें पता चला है कि अकेले laminectomy एक छोटे में परिणाम कर सकते हैं, हालांकि एनएससी सक्रियण में नगण्य वृद्धि के रूप में घाव21के स्तर पर periventricular क्षेत्र से neurosphere संख्या में वृद्धि से पता चला । अकेले Laminectomy periventricular क्षेत्र rostral या caudal को Laminectomy से neurosphere संख्या में वृद्धि का कारण नहीं है और कोई neurospheres सफेद मामले की संस्कृतियों में पाया जाता है Laminectomy के स्तर पर अलग थलग । इसके अतिरिक्त, जब laminectomy प्रदर्शन, एक टुकड़ा में पृष्ठीय लेमिना हटाने के लिए गर्भनाल के व्यापक जोखिम की अनुमति ध्यान रखना । यह (1) dorsolateral रीढ़ की हड्डी की न्यूनतम सुई ट्रैक चोट प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त पहुँच की अनुमति, और (2) पीछे छोड़ दिया जा रहा से हड्डी के क्षेत्रों को रोकने और बंद करने और माउस के बाद वसूली आंदोलन के बाद माध्यमिक क्षति के कारण. यदि पूरे लेमिना एक टुकड़ा के रूप में नहीं लिया है, या laminectomy के दोनों तरफ फैला हुआ तेज हड्डी के क्षेत्रों में मनाया जाता है, उपकरणों का उपयोग करें (जैसे दांतेदार संदंश और घुमावदार कैंची) इन टुकड़ों को हटाने के लिए पहले suturing ।

शल्य चिकित्सा बंद करने के दौरान पेशी परत करने के लिए टांके लागू करते समय शोधकर्ता बेहद सावधान रहना चाहिए । एक टांका (डबल knotted) laminectomy/चोट के स्तर पर caudal रखा जाना चाहिए ताकि सीवन बरकरार कशेरुका हड्डी के शीर्ष पर है । यह किसी भी द्वितीयक क्षति है कि मांसपेशियों को उजागर गर्भनाल के साथ संपर्क में किया जा रहा है जब माउस वसूली के बाद चलता है टांका से हो सकता है रोकने के लिए है । इसके अलावा, पेशी laminectomy के लिए caudal टांका/जहां विज्ञान जब विश्लेषण के लिए रीढ़ की हड्डी को अलग किया गया था के लिए एक मील का पत्थर के रूप में चोट कार्य करता है । जब घायल रीढ़ की हड्डी के क्षेत्र में घायल क्षेत्र के ढांचे से समझौता करने से बचें ताकि यह विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे ठीक विच्छेदन के दौरान पहचानने योग्य बने रह सकें तो देखभाल की जानी चाहिए । neurosphere परख के संबंध में, यह सेल छर्रों के यांत्रिक trituration प्रदर्शन करने के लिए धीरे हवा बुलबुले कि कोशिका मृत्यु को बढ़ा सकते है के उत्पादन से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । pNSC-व्युत्पंन neurospheres भी अधिक भारी मलबे के प्रति संवेदनशील हैं, विकास की स्थिति-अत्यधिक trituration और एंजाइमी समाधान में लंबे समय तक जोखिम-dNSC संस्कृतियों के सापेक्ष । pNSC व्युत्पंन क्षेत्रों और अधिक कॉंपैक्ट और dNSCs से छोटे हैं । pNSCs की दुर्लभ वस्तु को देखते हुए, हम प्रति नमूना कम से २४०,००० कोशिकाओं को अलग करने की सलाह देते हैं ।

ंयूनतम विज्ञान मॉडल चोट के बाद सेलुलर घटनाओं (जैसे अंतर्जात एनएससी के सक्रियकरण के रूप में) का अध्ययन करने के लिए आदर्श है, लेकिन यह कार्यात्मक विकलांगता के अध्ययन की अनुमति नहीं है । जैसा कि पहले उल्लेख किया है, चूहों कि सुई ट्रैक चोट अनुभव से उबरने कोई उल्लेखनीय व्यवहार घाटे कि जारी रहती है और इस तरह के रूप में, चूहों कार्यात्मक परिणामों में सुधार करने के लिए डिज़ाइन चिकित्सीय हस्तक्षेप की प्रभावशीलता के लिए मूल्यांकन नहीं कर सकते. अपक्षयी दवा का एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि एक इलाज केवल ऊतक की मरंमत को बढ़ावा देना नहीं होना चाहिए (जो इस मॉडल का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है, neurosphere परख के साथ संयोजन में, वंश अनुरेखण और immunohistochemistry/इम्यूनोफ्लोरेसेंस) लेकिन भी प्रासंगिक कार्यात्मक व्यवहार मानदंड जहां लागू का उपयोग कर सुधार का प्रदर्शन करना चाहिए । ऐसे पैर गलती परीक्षण और Basso, Beattie, Breshnan (BBB) खुला क्षेत्र हरकत पैमाने28के रूप में चोट के वक्ष मॉडल में कार्यात्मक परिणामों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया व्यवहार कार्यों के एक नंबर, पर्याप्त संवेदनशील हमारे ंयूनतम में औसत दर्जे का घाटा पता लगाने के लिए नहीं कर रहे है विज्ञान मॉडल । इस कमी को दूर करने के लिए, एक और अधिक संवेदनशील डिजिटल स्कोरिंग प्रणालियों (जैसे, कैटवॉक) का उपयोग कर सकते है जो सकल और ललित हिंद के कई मापदंडों के उपाय, चाल विश्लेषण सहित अंग गतिवान मानकों, जो कम से पता लगा सकते है न्यूनतम चोट मॉडल29से जिसके परिणामस्वरूप घाटा.

इस विधि भी ग्रीवा रीढ़ की हड्डी की चोट के मॉडलों में एक संभावित चिकित्सा के रूप में अंतर्जात एनएससी सक्रियण का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । ग्रीवा विज्ञान सबसे नैदानिक प्रासंगिक मॉडल है और हम प्रस्ताव है कि उच्च कशेरुका क्षेत्रों के लिए इस चोट मॉडल अनुकूल है कि वहां एनएससी और उनकी संतान की प्रतिक्रिया में क्षेत्रीय विविधताओं है में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा (कैनेटीक्स, प्रवासन, भेदभाव) और क्या घाव अधिक गहरा और मध्यम श्रेणी का कार्य घाटे में परिणाम होगा । वर्तमान में प्रयुक्त murine ग्रीवा चोट मॉडल (जैसे transection, क्लिप संपीड़न और/या contusion) को मैंयुअल रूप से व्यक्त मूत्राशय और लगातार माउस की सांस लेने की निगरानी की जरूरत सहित गहन पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल की आवश्यकता है । गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी के लिए न्यूनतम चोट मॉडल के अनुकूल है मृत्यु दर, रुग्णता और पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल अन्य ग्रीवा विज्ञान मॉडल के साथ जुड़े कम हो सकता है और साथ ही दवाओं की प्रभावशीलता की जांच करने के लिए एक परमिट/ तंत्रिका वसूली पर परिणाम । हमारी चोट मॉडल भी (यानी, पृष्ठीय या पार्श्व कॉलम) गर्भनाल के विभिंन भागों में एक ंयूनतम चोट बनाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और/या गहरी पैठ और/या बड़ा आकार सुई (छोटे गेज) के उपयोग के साथ बड़ी चोटों । यह शोधकर्ता को नियंत्रित करने के लिए/प्रकार और घाव के आकार में हेरफेर और इस तरह सेलुलर और कार्यात्मक/

चूहों में न्यूनतम चोट मॉडल ट्रांसजेनिक पशु मॉडल के उपयोग की अनुमति देता है. माउस मॉडल अंतर्जात स्टेम कोशिकाओं के लेबलिंग सक्षम और/या progenitors चोट से पहले । यह शोधकर्ता इन पूर्व के भाग्य पर नज़र रखने की अनुमति कर सकते है लेबल की चोट निंनलिखित कोशिकाओं और तंत्रिका अग्रदूत सेल प्रसार, प्रवास का मूल्यांकन, और चोट के बाद भेदभाव-संभावित तंत्रिका मरंमत के लिए योगदान ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम Krembil फाउंडेशन (ऑपरेटिंग ग्रांट सीएमएम) द्वारा वित्तपोषित है । WX Carlton गुलबहार स्मिथ छात्र पुरस्कार के प्राप्तकर्ता था । NL एक ओंटारियो स्नातक छात्रवृत्ति प्राप्त की ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agricola Retractor Fine Science Tools 17005-04
Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) Fine Science Tools 15370-50 Customize when ordering to get blunted tips
Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth) Fine Science Tools 11053-10
Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) Fine Science Tools 11152-10 Or any other forceps for suturing
Hartman Hemostats (Straight) Fine Science Tools 13002-10 Or any other appropriate for suturing
Scalpel Handle #3 Fine Science Tools 10003-12 Or any other appropriate
Hair clippers amazon.ca https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA or any other appropriate
Stereotaxic instrument Stoeling 51500 or any other appropriate
Buprenorphine or any appropirate sanctioned my animal care facility
Meloxicam or any appropriate sanctioned by animal care facility
Tears Naturale P.M. Alcon https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE or any other appropriate
Isoflurane Baxter International Inc DIN 02225875 or any other appropriate for anesthesia
Q-tips Cottom Swabs amazon.ca https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS
Cotton Gauze Fisher Scientific 13-761-52
30 G Needles Becton Dickinson 305106 For Injury
25 G Needles Becton Dickinson 305122 For Drug injections
1 mL Syringes Becton Dickinson 3090659 for drug injections
3 mL Syringes Becton Dickinson 309657 for fluid injections
4-0 Suture uoftmedstore.com 2297-VS881 for skin suturing
6-0 Suture uoftmedstore.com VS889 for muscle suturing
Polysporin ointment amazon.ca 102051
Isoflurane Vaporizer VetEquip 901806
15 mL conical tubes ThermoFisher Any appropriate
Petri Dishes ThermoFisher any appropriate
Trypan Blue ThermoFisher Any
Hemocytometer ThermoFisher Any appropriate
Centrifuge ThermoFisher Any appropriate
Standard Dissection Tools Fine Science Tools
Dissection Microscope Zeiss Stemi 2000
Counting Microscope Olympus CKX41
Neural Basal-A Medium Invitrogen 10888-022
B27 Invitrogen 17404-044
Penicillin- Streptomycin Gibco 15070
L- Glutamine Gibco 25030
DMEM Invitrogen 12100046
F12 Invitrogen 12700075
30% Glucose Sigma G6152 1 M, 9.01 g in 100 mL dH2O
1 M Glucose
7.5% NaHCO3 Sigma S5761 155 mM, 1.30 g in 100 mL dH2O
155 mM NaHCO3
1 M HEPES Sigma H3375 23.83 g in 100 mL dH2O
Apo-Transferrin R&D Systems 3188-AT
Putrescine  Sigma P7505
Insulin Sigma I5500
Selenium Sigma S9133
Progesterone Sigma P6149
Papain Dissociation System  Worthington Biochemical Corporation PDS 1 vial of papain can be used for 2 samples
Epidermal Growth Factor Invitrogen PMG8041 Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer
Fibroblast Growth Factor Invitrogen PHG0226 Powder reconstituted with 0.5 mL Hormone Mix and aliquoted into 20 μL vials to be stored in freezer
Heparin Sigma H3149
Leukemia Inhibitory Factor In House
Trypan Blue
Hemocytometer
24 well Plates NUNC
2 M NaCl Sigma S5886 11.69 g in 100 mL dH2O
1 M KCL Sigma P5405 7.46 g in 100 mL dH2O
1 M MgCl2 Sigma M2393 20.33 g in 100 mL dH2O
108 mM CaCl2 Sigma  C7902 1.59 g in 100 mL dH2O

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तंत्रिका विज्ञान १३९ अंक न्यूनतम रीढ़ की हड्डी की चोट वयस्क माउस तंत्रिका स्टेम सेल periventricular विच्छेदन neurosphere परख स्टेम सेल कैनेटीक्स आदिम तंत्रिका स्टेम सेल निश्चित तंत्रिका स्टेम सेल स्टेम सेल सक्रियण स्टेम सेल प्रवासन तंत्रिका विज्ञान
एक Neurosphere परख का मूल्यांकन करने के लिए अंतर्जात तंत्रिका कोशिका सक्रियकरण कम रीढ़ की हड्डी की चोट के एक माउस मॉडल में स्टेम
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Lakshman, N., Xu, W., Morshead, C. M. A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (139), e57727, doi:10.3791/57727 (2018).

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