Summary
Her viser vi ytelsen til en minimal ryggmargen skaden modell i en voksen mus som sparer sentrale kanalen nisje bolig endogene nevrale stamceller (NSCs). Vi viser hvordan neurosphere analysen kan brukes å kvantifisere aktivisering og migrering av definitive og primitive NSCs etter skade.
Abstract
Nevrale stamceller (NSCs) i voksen pattedyr ryggmargen er relativt mitotically quiescent innbyggere periventricular celler som kan bli studert i vitro med neurosphere analysen. Denne colony-forming analysen er et kraftig verktøy for å studere svaret av NSCs ytre faktorene i en rett; men kan dette også brukes til å studere effekten av i vivo manipulasjoner med riktig forståelse av styrker og begrensninger av analysen. En manipulering av klinisk interessen er effekten av skade på endogene NSC aktivisering. Aktuelle modeller for ryggmargsskade gir en utfordring å studere dette alvorlighetsgraden av felles contusion, komprimering og transection modeller forårsake ødeleggelse av NSC nisje på området av skaden stamceller ligger. Her beskriver vi en minimal skade modell som forårsaker lokaliserte skade på overfladisk dorsolateral overflaten av lavere thorax nivå (T7/8) i ryggmargen voksen mus. Skade modellen deler det sentrale kanalen på nivå med skade og tillater analyse av NSCs som finnes på nivået av lesjonen på ulike tidspunkt etter skade. Her viser vi hvordan neurosphere analysen kan benyttes for å studere aktivering av to forskjellige, lineally-relatert, befolkningen i NSCs som ligger i ryggmargen periventricular regionen - primitive og definitive NSCs (pNSCs og dNSCs, henholdsvis). Vi viser hvordan å isolere og kultur disse NSCs fra periventricular regionen på skade og hvit substans skade området. Vår post-kirurgiske ryggmargen disseksjoner viser økte antall pNSC og dNSC-avledet neurospheres fra periventricular regionen skadet ledninger sammenlignet med kontroller, taler til deres aktivisering via skade. Videre etter skade, dNSC-avledet neurospheres kan isoleres fra skade området-demonstrere evnen til NSCs å migrere fra deres periventricular nisje områder for skade.
Introduction
Sentralnervesystemet inneholder en subpopulasjon av selv fornyende, multipotent stamceller som har kapasitet til å gi opphav til alle forskjellige modne nevrale cellen typer1,2,3,4. Disse nevrale stamceller (NSCs) bor i spesialiserte nisjer i hjernen og ryggmarg og kan aktiveres etter skade sprer, overføre og skille ut modne neural celler. NSCs og deres avkom har vist å migrere til skade området i kortikale skader modeller5,6. I hjernen, har NSCs blitt vist å migrere fra laterale ventriklene til webområdet for skade der de differensieres til astrocyttene som bidrar til glial arr formasjon7. I ryggmargen, men har noen studier vært gjort for å spørre om disse samme endogene NSCs kan bli brukt til å fremme utvinningen ryggmargsskade. Faktisk er det for tiden en debatt om aktivisering stamcelletransplantasjon bassenget i ryggmargen trenger en direkte fysisk skade på periventricular nisje lining den sentrale kanal8 eller hvis skaden til spinal cord parenchyma (forlater stammen cellen nisje intakt) er tilstrekkelig for å aktivere endogene NSCs9.
En rekke ryggmargen skaden (SCI) modeller har blitt brukt til å studere i Patofysiologien ved akutt og kronisk personskade. Disse modellene har også blitt brukt til å teste potensielle terapi for å behandle SCI gjennom neuroprotection, immunomodulation og utvikle cellen transplantasjon/utskifting strategier10,11,13. Modellene inkluderer komprimering og/eller contusion skader, som forårsake store funksjonelle underskudd samt omfattende lesjoner og cavitations i ledningen14,15. Resulterende glial arr kan omfatte flere spinal segmenter med fleste bredde/omkretsen av ryggmargen16. Således, mens disse modellene er klinisk relevante, de råd betydelige utfordringer å studere responsen av endogene NSCs etter skade. Det er kjemisk modeller for skade som kan tilpasses for å forårsake mildere former for skade som kan spare de sentrale kanal17. Men disse typer skader fokus på demyelinisering knyttet til SCI og er ikke klinisk relevante modeller for fysisk og/eller mekaniske skader forbundet med traumatisk SCI.
For å løse begrensningene for skade modellene, har vi tilpasset en nål spor minimal SCI modell, opprinnelig utviklet i rotte9, for programmet på en voksen musemodell. Våre tilpasset skade modellen kan opprette en konsekvent leksjonen i dorsolateral regionen i ryggmargen musen og spare canal central på nivåer av skade. Fordelen med denne modellen er at den tillater studiet av NSC kinetics etter skade og potensielle radial flytting til området av skade. Bruk av en musemodell tillater også bruk av transgene mus at linjen sporing av endogene NSCs og deres avkom etter skade. Egenskapene for NSCs kan videre vurderes bruker en modifisert form for i vitro neurosphere analysen som er innført i denne protokollen.
Neurosphere analysen er i vitro colony-forming analysen som gir isolasjon av NSCs i nærvær av mitogens. På klonal plating tettheter sprer personlige NSCs for å gi opphav til frittflytende sfærisk kolonier som består av en liten subpopulasjon av NSCs og et stort flertall av progenitors18,19. Våre protokollen, vi viser isolering av to forskjellige, lineally-relaterte NSCs fra periventricular regionen i ryggmargen, under grunnlinjen forhold og følge vår minimal SCI-modell. Definitive nevrale stilk celler (dNSCs) express nestin og glial fibrillary Sure protein (GFAP) og dyrkes i nærvær av epidermal vekstfaktor (EGF), fibroblast vekstfaktor (FGF) og heparin (sammen kalt EFH)20. Disse dNSCs er sjeldne i ryggmargen naiv, gir opphav til svært få neurospheres i vitro. Vi viser imidlertid at dNSCs er aktivert etter minimal SCI, utvide antall neurospheres isolert fra periventricular regionen21. Primitive nevrale stamceller (pNSCs) er over dNSCs i nevrale stamceller avstamning. pNSCs er svært sjelden, uttrykke lave nivåer av pluripotency merket Oct4, og leukemi hemmende faktor (LiF) forståelsesfull22. pNSCs utgjør ikke neurospheres når isolert fra voksen mus ryggmargen av myelin basic protein (MBP) i primære kulturer; men pNSC neurospheres kan isoleres fra MBP mangelfull mus og tallene er utvidet følgende skade-ligner dNSCs21. Endelig viser vi at dNSC-avledet neurospheres kan være isolert fra stedet av skader på tidlig ganger etter minimal SCI. Disse funnene viser at våre skade modellen og analyser kan vurdere aktivisering kjennetegner periventricular NSCs som deres evne til å spre og overføre svar på skader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen ble godkjent av dyr omsorg komiteen på University of Toronto og er "Guide til det vare og bruk av forsøksdyr" (2nd Edition, kanadiske Rådet for dyr omsorg, 2017).
1. Minimal ryggmargen skaden kirurgi
Merk: Før kirurgi Kontroller at alle kirurgiske instrumenter og materialer er sterilisert av egnede metoder (figur 1A).
- Bygg en thorax støtte bue ved å rulle opp 4-5 ruter med gasbind og taping dem sammen i midten for å få en fast rull med gasbind.
- Plasser musen i induksjon kammeret og starte anestesi med 5% isoflurane. Bekreft fraværet av en tå knipe refleks før du fortsetter, så vel som gjennom prosedyren. Som kirurgi kan ta opp 30 min å fullføre, optimalisere for minimal isoflurane eksponering (5 min på 5%) og gjenstående tid på 2-3%.
- Overføre musen til en forpart knyttet til anestesi maskinen på 2-3% isoflurane vedlikehold dose. Bruk hårklippere fjerne pels fra dorsum av dyr fra midt bak til hals/ører å avsløre et bredt rektangulært område av huden for kirurgi.
- Overføre musen til et stereotaxic instrument ved å plassere sin nese i vedlagte nesen kjegle og stabilisere skallen med øret barer. Opprettholde isoflurane på 5% under plassering av øret barer og lavere tilbake til 2-3% når musen er sikret stereotaxic enheten.
- Administrere preoperativ smertestillende medikamenter intraperitoneally, har meloksikam (2,0 mg/kg). Sjenerøst gjelde øye smøring på åpne mus øynene å hindre hornhinnen uttørking når under narkose.
- Plass thorax støtte buen under musen magen mens rette ut musen kropp og ryggraden ved å lett trekke på foten av halen. Bruk laboratorium merking tape for å sikre halen og alle utvidede lemmer i en stjerne-lignende posisjon. Når det er sikker, trykk thorax støtte buen rostrally, fra mus magen mot øvre thorax – for å støtte opp torakale ryggraden (figur 1B).
- Klargjør et sterilt kirurgisk felt ved desinfisering pels-kuttet hud området i trinn 1.3 med 70% etanol, etterfulgt av povidon-jod. Gjenta to ganger. Bruk en steril kirurgisk drapere å holde en bred sterile feltet.
- Bruke en #10 skalpell blad, lage en loddrett snitt parallelt med den langsgående aksen av dyr fra midtpunktet av både skulderbladene rundt torakale ryggraden. Trekke huden for å avsløre bløtvev og ryggsøylen konturen (figur 1 c).
- Identifisere nedre del av suprascapularis fett pad (dette demarcates T4/5 ryggvirvel nivået). Med samme #10 blad, forsiktig, men med kraft, Skjær langs begge sider av ryggvirvel benet T5-T8/9 koble tilbake-muskel sener kolonnen.
- Sett inn tennene av retractors i webområdene snitt på hver side av ryggraden. Juster eksponering ved å utvide retractors for å heve tilstrekkelig ryggraden uten å legge for mye press på trukket inn muscle lagene (figur 1 d).
- Under kirurgisk mikroskopet, rengjør den gjenværende muskler og annet bløtvev overliggende ryggraden for å utsette ryggvirvel benet (figur 1E). Identifisere ryggvirvlene som fjernes av slår spinous prosessen av ryggsøylen med tenner tang og flytte det litt opp og ned.
Merk: Dette bør tillate identifikasjon av intervertebral ledd og avsløre de små åpningene (intervertebral foramina) under ryggvirvlene rundt. - Sette inn en leder av buet avstumpet saksen i hver side av den utsatte intervertebral foramen, caudal til ryggvirvel lamina til kreditert, og kutte koble intervertebral leddene bilateralt.
- Løft lamina oppover og kuttet av øvre feste lamina å isolere og fjerne benet.
Merk: Dette vil utsette den intakt dural sac inneholder ryggmargen (figur 1F). Det kan være overdreven blødning som kan kontrolleres ved å plassere etikettpapir 1 cm x 1 cm gasbind på de berørte områdene og/eller vask med sterilt PBS. - Med dorsal midtlinjen venen som et landemerke, setter du inn en 45° bøyd aksel på en 30 G pinne-spissen (med nål skråkant vendt oppover) i dorsolateral overflaten av ryggmargen (ca 1 mm dyp) på ca 0,5 mm lateral på hver side av midtlinjen.
- Flytte nålen ~ 2 mm fra caudal til rostral (parallell til midtlinjen) slik at hele lengden av skråkant nålen settes inn i ledningen. Fjerne nålen ved tilbakelegge via banen til oppføring (figur 1G).
Merk: Det skal ingen blødninger men hevelse av spinal vev kan sees på dette trinnet. - For å lukke såret, Fjern festepunkt og Sutur ryggmuskulaturen på hver side av skaden sammen utviklet med en 6-0 absorberbare Sutur. Bruk en 4-0 sterilt silke Sutur senere lukke overliggende huden.
- Bruke antibiotika sårsalve til toppen av overfladiske sutured huden for å hindre postoperativ infeksjon med spissen av en bomullspinne. Administrere postoperativ smertestillende 0,1 mg/kg av buprenorfin subcutaneously sammen med væsker (1 mL av lactated Ringer i løsning).
- Slå av isoflurane fordamper og oksygen. Fjerne musen fra stereotaxic enhet og sted i en ren bur med ingen sengetøy.
- Plass musen i buret ca 30 cm fra en varmelampe for utvinning fra anestesi og overvåke oppførsel etter våkne. Musen skal våkne innen 5-10 min og baklem funksjonen med mulig vc6 og/eller hale svakhet ved våkne.
- Overvåker museinnstillinger de neste dagene og gir riktig postoperativ pleie og analgetika (dvs.mos, lactated Ringer i løsningen væske subkutan, 0,1 mg/kg buprenorfin 2 x daglig subcutaneously for 2-3 dager, og riktig vekt overvåking ) i henhold til lokale dyr anlegget forskrifter og enkeltvis som utvinning kan variere.
2. Neurosphere analysen disseksjon
Merk: Følg riktig sterilt vev kultur prosedyrer i.
- Enzymatisk løsning forberedelse
- Legge til 32 mL av Earle balansert Salt løsning (EBSS) til albumin ovomucoid hemmer inneholder glassflaske og forsiktig vortex til oppløst.
- Legge til 5 mL av EBSS en pre Porsjonskaffe papain hetteglass og plasser i en 37 ° C vannbad å oppløse. Det blir klart (løsning 1).
- Ta 500 µL av EBSS og legge til den pre Porsjonskaffe DNase jeg glass hetteglass for å få en konsentrasjon av 1 mg/mL (løsning 2). Bland svært forsiktig ved å vippe ampullen frem og tilbake og legge til 250 µL av denne blandingen i løsning 1.
Merk: Alle løsninger gjort (løsning 1 og 2) er nok for behandling av to stykker av vev. Hvis behandlingen flere biter av vev, ta med flere løsning prep.
- Vev forberedelse og disseksjon
- Stedet laboratorium tømming dynket i isoflurane inn i musen bur og Tillat 2-3 minutter til damp til å bedøve helt mus. Følgende knockout, fjerne musen fra buret og bekrefte fraværet av en tå-klype refleks.
- Utføre cervical forvridning med en stump metallgjenstand (dvs., metall bur kort) å avlive dyrene. Spray euthanized dyret fra halsen til midt bak sjenerøst med 70% etanol.
- Ved foten av skallen, bruk saks til å kutte hodet og kast i en bio-bag. Foreta en midtlinjen snitt i huden langs hele lengden av tilbake til avsløre muskel- og ryggvirvel bein kontur (figur 2A).
- Løft den mediale aspekten av hver skulderblad (dvs., skulderblad-identifisert ved overliggende fat pad) og bruke saks til å klippe bort bløtvev (mellom scapulae og ryggvirvlene). Separat fullt å utsette underliggende virvelsøylen.
- Etter krumning av ryggraden, sette inn samme par saks i øvre thorax blenderåpning og isolere virvelsøylen ved å klippe bort vedlagte ribbeina, muskel og indre organer (figur 2B).
- Saks inn caudal ryggvirvel foramen/åpningen og kuttet intervertebral leddene på hver side av laminae (dorsal overflaten). Ta spesielt vare å ikke skade intakt ledningen. Fortsett denne prosessen inntil ønsket og/eller lengden på ledningen er utsatt.
- Klippe spinal nerve(s) utvide sidelengs fra ledningen før du overfører ryggmargen vevet i en Petriskål med vanlig kunstig Cerebrospinalvæske. Holde prøven på is (figur 2C).
- Under en disseksjon kuttet mikroskop, ryggmargen vevet med ~ 2 mm rostral og caudal til skade området. Bruk to par tang forsiktig skille ledningen i 2 halvdeler langs langs dorsal og ventrale sprekker (figur 2C').
- Med microscissors, kuttet ut den skadde dorsolateral hvit substans. Plassere brikken i en 15 mL konisk rør.
- Holder en halvparten av ryggmargen ned med tang, erte og fjerne hvit substans med et par fine tang langs rostrocaudal omfanget av ryggmargen isolere regionen ønsket periventricular. Gjenta for den andre halvparten av ryggmargen.
- Plasser stykker av periventricular vev i en separat 15 mL konisk rør. Bruk microscissors og forsiktig hakke vevet mot veggene av koniske rørene.
Merk: Vev dissosiasjon modifikasjoner er fra Papain dissosiasjon protokoll23 og beskrevet tidligere vev forberedelse prosedyrer24. - Legge til 2,5 mL av ny løsning 1 (trinn 2.1.3) til vev prøven og plasser på en rocker på 37 ° C i 30 min.
- Forsiktig triturate vevet i løsning med 1000 µL pipette tips. Sentrifuge skyet celle suspensjon på 300 x g i 5 min på RT.
- Forberede løsning 3 med 2,7 mL Earle balansert Salt, 300 µL ovomucoid hemmer løsning (trinn 2.1.1) og 150 µL av DNase jeg stoppløsningen (trinn 2.1.3).
- Forkast nedbryting fra trinn (trinn 2.2.13) og resuspend i 1,5 mL løsning 3 fra forrige trinn (trinn 2.2.14).
- Laget denne ny cellen suspensjon (trinn 2.2.15) på 5 mL av ovoimucoid hemmer stoppløsningen (trinn 2.1.1) i en ny 15 mL konisk rør lage en usammenhengende tetthet gradering. Sentrifuger 300 x g i 5 min på RT.
- Forkast nedbryting og resuspend i 2 mL av neurobasal media. Sentrifuger 300 x g i 3 minutter på RT.
- Forkast nedbryting og resuspend i 1 mL av neurobasal media. Filtrere suspensjon med en 20 µm celle sil etterfulgt av 4 mL medier for et totalvolum på 5 mL.
- Plating
- Forberede kultur medier neurosphere vekst ved supplere neurobasal media med epidermal vekstfaktor (20 ng/mL) / fibroblast vekst faktor (20 ng/mL) / heparin (2 µg/mL) [for endelig NSCs] eller leukemina hemmende faktor (10 ng/mL) [for primitive NSCs]. Legge til 10 mL enten medier i en 25 mL vev kultur kolbe.
- Bruke hemocytometer og Trypan blå farge for å beregne antallet celler i suspensjon (trinn 2.2.18)25. Når beregnet, legge celler til vev kultur flasker i (trinn 2.3.1) til en klonal tetthet av 10 celler/µL og sted vev kultur kolbe med ekstra celler i inkubator 24 h (37 ° C, 95% fuktighet, 5% CO2).
Merk: Et eksempel på telling teknikken er som følger: ta 10 µL av cellen suspensjon og bland med 10 µL Trypan blå fargestoff. Legge til 10 µL av denne blandingen i en hemocytometer. Under en 10 X lys mikroskop, teller antallet lever celler og summere alle celler som telles i 4 av 4 x 4 quadrants. Bruk formel: 100.000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1000] gi volumet av cellen suspensjon å være belagt i hver 25 mL vev kultur kolbe å sikre klonal tetthet (10 celler/µL). - Etter 24 timer, forsiktig swirl kolbe og hell innholdet i en 15 mL konisk rør. Sentrifuger 300 x g i 5 min på RT.
- Forkast nedbryting og å suspendere cellene i 1-2 mL av fersk neurobasal media.
- Gjenta trinn 2.3.2 å telle antall celler i suspensjon og plate celler på klonal tetthet i en 24-og vev kultur plate inneholder 500 µL hver av deres respektive mitogen supplert media (EFH for definitive NSC vekst) og LIF for primitive NSC vekst.
Merk: Bruke tilpasset formelen (5000 / [X celler/4) x 2 x 10 x 1000) til å beregne volumet av cellen suspensjon å være belagt i hver også inneholder 500 µL av media. - Sett platene som inneholder cellene i inkubator (37 ° C, 95% fuktighet, 5% CO2) å vokse i 7 dager.
- Teller
- Etter 7 dager i kultur, fjerne plater og vise under lys mikroskop. Kvantifisere neurospheres ved å telle sfærisk kolonier som > 80 µm i diameter for dNSCs kulturer og > 50 µm diameter for pNSCs kulturer.
Merk: Dersom du ønsker neurospheres kan være mer passaged26 eller differensiert. Hvis celler er ikke lenger nødvendig, kast ved å legge til akselerert hydrogenperoksid brønnene (ca. 1 mL) for 20 min slik at fargen på mediet gulner etterhvert. Deretter Forkast.
- Etter 7 dager i kultur, fjerne plater og vise under lys mikroskop. Kvantifisere neurospheres ved å telle sfærisk kolonier som > 80 µm i diameter for dNSCs kulturer og > 50 µm diameter for pNSCs kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter operasjonen, skal musene oppleve minimal motor underskudd som kan inkludere halen og mulig hind-lem vc6 opptil 24 h. Etter denne tid, bør musene opplever ingen baklem lammelse og/eller vc6 og minimale endringer i gangart.
Figur 3 viser representant resultater fra neurosphere analysen 5 dager etter minimal ryggmargen skaden. Den absolutte antallet dNSC-avledet neurospheres (vokst i EFH) er større enn antall pNSC-avledet neurospheres (vokst i LIF) etter skade (figur 3A og 3B, henholdsvis). Høyere makt bilder av en definitiv neurosphere (Figur 3 c) og en primitiv neurosphere (figur 3D) avslører Kjønnsforskjeller i utseendet av disse forskjellige koloniene med definitive neurospheres blir større i diameter (≥80 µm) og vanligvis har en stor mørk center. Primitive neurospheres er mindre i størrelse (≥50 µm) og cellene er mer tett pakket. Representant antall neurospheres som oppstår fra ulike deler av skadde ledningen er sett i figur 3E (definitives) og 3F (primitiv). Finne 3E viser at minimal SCI fører til en betydelig økning i neurospheres vokst fra det sentrale kanalen på nivå med skader i forhold til en relativt beskjeden økning på rostral ikke-skadde ledningen.
Interessant, kan definitiv neurospheres genereres fra stedet av lesjon, et område som ikke inneholder neurosphere danner celler i laminectomy alene mus. Figur 3F demonstrerer en liknende økning i pNSCs etter skade med unntak av pNSC neurospheres på webområdet lesjon. Derfor kan bare dNSCs migrere til området av skade over denne tiden kurs etter skade.
Figur 1: kirurgiske prosedyren. (A) oppsettet for alt nødvendig, nummerert for referanse. (B) en bilde av musen i en stereotaxic enhet med en utbrettet kropp, ryggraden og lemmer spredt og tapet med thorax støtte bue plassert under. (C) en bilde av musen med en loddrett huden snitt utsette muskel laget og ryggsøylen konturen. (D) en bilde av selve musen etter muskel incisions og eksponering og isolasjon av ryggraden med retractors. Merk stram muskelgrupper lag med mangel på rive. (E) A bilde av isolerte musen ryggraden med muskel lag fjernet, viser benete overflaten av vertebra (3 segmenter). Dette viser også spinous prosessen og muligens intervertebral felles og lamina av midtre vertebra fjernes. (F) A bilde av synlig ryggmargen etter laminectomy. Merket er dorsal midtlinjen venen. (G) A bilde av musen med bilaterale nål spor skader på hver side av dorsal midtlinjen blodåre. Det er et nærbilde setter på 45° bøyd skaftet av 30 G nål. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: ryggmargen disseksjon. (A) A bilde av decapitated musen med den midtlinjen hud snittet til å avsløre rygg muskelen og ryggvirvel bein kontur (B) en bilde av isolerte virvelsøylen, viser rostral og caudal. Det andre bildet viser ledningen isolasjon og tredje isolert ryggmargen i en Petriskål. (C) en grafisk fremstilling av den fine Disseksjon av ryggmargen, hvor ulike segmenter (periventricular, skade området) er fjernet og atskilt for dyrking. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant resultater fra neurosphere analysen etter minimal ryggmargsskade. (A) antall dNSC-avledet neurospheres (vokst i EFH) kultivert fra skadet ryggmargen er større enn (B) antall pNSC-avledet neurospheres (dyrket i LIF) når belagt på samme tetthet. (C, D) Høyere makt bilder av "typisk" neurospheres (C) dNSC kulturer og (D) pNSC kulturer. (E) Minimal nål tarmkanalen skade resultater i betydelig økning i antall dNSC-avledet neurospheres fra det sentrale kanalen på nivå med skade samt det sentrale kanalen rostral til skaden og skade området. (F) pNSC-avledet neurospheres kan ikke isoleres fra uskadet ledningen, men kan være isolert etter skade fra central canal (på nivå av skaden og rostral sentrale kanalen). Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under den kirurgiske prosedyren finnes det noen viktige trinn der forskeren bør være spesielt oppmerksom på for å få optimale resultater og minimere variasjon mellom dyr. Hensyn må tas med i inhalert anestesi (isoflurane) under operasjonen som anesthetic har vist seg å ha neuroprotective effekter med langvarig eksponering27. Følgelig når studere regenerative kapasiteten i ryggmargen etter skade, gjøre en innsats for å utføre kirurgi så raskt og effektivt som mulig for å unngå forvirrende variabler. Opprettholde samme isoflurane eksponeringstid per mus reduserer variasjon. Puste musen bør overvåkes gjennom kirurgi og bør ikke være for treg (mindre enn 1 pusten hver 2-3-s) eller tungt arbeidet (dvs., gisper). Den vedlikehold dosen av anestesi kan senkes fra 2-3% å forhindre dødsfall på grunn av langvarig anestesi med merke til mus som fikk lavere dosering.
Under operasjonen, ta ekstra forsiktighet når du utfører muskel snitt på hver side av virvelsøylen. Kontroller at kuttene er dyp, og bladet er vinklet medialt slik at kanten av bladet sideføreren benete ryggvirvlene under muskel snitt. Hvis bladet er vinklet utover, er det mulighet for overdreven blødning fra vaskulær kutt. Forskeren bør også betale ekstra oppmerksomhet når laminectomy for å unngå dype fisking av saksen som vil skade ryggmargen, forårsaker uønskede vevsskade og funksjonelle underskudd. Den aktuelle kontrollen for disse eksperimentene er en "bare laminectomy" gruppe (ingen skade), som gjør en sammenligning av aktivering av NSCs tilskrevet nål spor skaden i motsetning til det som kan følge laminectomy bare. Vi har vist at laminectomy alene kan resultere i en liten, men ubetydelig økning i NSC aktivisering idet avsløre av en økning i neurosphere tall fra periventricular regionen på nivå med lesjon21. Laminectomy alene forårsaker ikke økning i neurosphere tall fra periventricular regionen rostral eller caudal til laminectomy og ingen neurospheres er funnet i kulturer av hvit substans isolert på nivå med laminectomy. I tillegg når du utfører laminectomy, ta vare for å fjerne det dorsal lamina i ett stykke å tillate bred eksponering av ledningen. Dette (1) tillater tilgang til utføre minimale nål spor skaden i dorsolateral ryggmargen, og (2) hindre segmenter av bein fra blir igjen og forårsaker sekundære skade etter nedleggelse og etter gjenoppretting bevegelsene til musen. Hvis hele lamina tas ikke i én del eller deler av skarpe bein stikker på hver side av laminectomy er observert, bruke instrumenter (som tenner tang og buede saks) å fjerne disse fragmentene før suturing.
Forskeren bør være svært forsiktig når du bruker suturer på muskel laget under kirurgisk nedleggelsen. En Sutur (dobbel-knyttede) bør plasseres caudal til nivået av laminectomy/skade slik at suture ligger på intakt ryggvirvel benet. Dette er sekundær skader som kan oppstå fra det muskuløse suture å være i kontakt med utsatte ledningen når musen flyttes etter utvinning. Videre fungerer det muskuløse suture caudal til laminectomy/skaden som et landemerke for hvor SCI ble utført ved isolere ryggmargen for analyse. Omsorg bør tas når dissekere den skadde ryggmargen området å unngå å svekke strukturen i regionen skadet slik at det kan være gjenkjennelig under fine disseksjon under dissecting mikroskop. I forhold til neurosphere analysen er det viktig å utføre den mekaniske føden av cellen pellets forsiktig for å unngå produksjon av luftbobler som kan øke celledød. pNSC-avledet neurospheres er enda mer følsomme rusk tung, vekst forhold-overdreven føden og langvarig eksponering i enzymatisk løsninger-i forhold til dNSC kulturer. pNSC avledet kuler er mer kompakt og mindre enn dNSCs. Gitt sjeldenhet av pNSCs, anbefaler vi isolere minst 240 000 celler per prøve.
Minimal SCI modellen er ideell for å studere mobilnettet hendelsene etter skade (for eksempel aktivering av endogene NSCs), men det tillater ikke studiet av funksjonelle impairments. Som nevnt tidligere, musene som gjenopprette fra nålen spor skaden erfaring ingen kjente atferdsmessige underskudd som vedvarer og slik mus kan ikke evalueres for effektiviteten av terapeutiske tiltak for å forbedre funksjonelle resultater. Et viktig aspekt for regenerativ medisin er at en behandling ikke skal bare fremme tissue reparasjon (som kan evalueres ved hjelp av denne modellen, sammen med neurosphere analysen, avstamning sporing og immunohistochemistry/immunofluorescence), men også vise relevante funksjonell forbedring med atferdsdata paradigmer der det er aktuelt. Mange opptreden aktiviteter brukes til å teste funksjonelle resultater i thorax modeller av skader fot feil testen og Basso, Beattie, Breshnan (BBB) åpne Locomotor Feltskalaen28, er ikke sensitive nok til å oppdage målbare underskudd i vår minimal SCI modell. For å overvinne dette brist, man kan gjøre bruk av mer følsomme digitale scoring systemer (f.eksCatWalk) som måler flere parametere av brutto- og baklem bevegelse parametere inkludert gangart analyser, som kan oppdage den minimal underskudd som følge av minimal skade modell29.
Denne metoden kan også tilpasses for å studere endogene NSC aktivisering som potensielle terapi i modeller av cervical ryggmargsskade. Cervical SCI er mest klinisk relevante modellen og foreslår vi at tilpasse denne skade modellen høyere ryggvirvel segmenter ville gi innsikt om det er regionale variasjoner i svaret NSCs og deres avkom (kinetikk, migrasjon, differensiering) og om lesjonen resulterer i dypere og målbare funksjonelle underskudd. For øyeblikket brukes murine cervical skade-modeller (som transection, klipp komprimering og/eller contusion) krever intensiv postoperativ pleie inkludert måtte manuelt express blærer og overvåker konstant pust av musen. Tilpasse minimal skade modellen i cervical ryggmargen kan redusere dødelighet og sykelighet postoperativ pleie forbundet med andre cervical SCI-modeller som tillater en å undersøke effektiviteten av narkotika/små molekyler og/eller rehabilitering resultater på neural utvinning. Våre skade modellen kan også tilpasses til å opprette en minimal skade i ulike deler av ledningen (dvs., rygg eller sideveis kolonner) eller større skader med dypere penetrasjon og/eller bruk av større størrelse nåler (mindre gauge). Dette gjør forskeren kontroll/manipulere type og størrelse av lesjonen og dermed evaluere mobilnettet og funksjonell/atferdsmessige tilsvarende.
Minimal skade modellen i mus tillater bruk av transgene dyremodeller. Musen modeller aktivere merking av endogene stamceller og/eller progenitors før skaden. Dette kan tillate forskeren spore skjebnen til disse forhåndsinnstilte merket cellene etter skade og evaluere nevrale forløper celle spredning, migrasjon og differensiering etter skade, potensielt bidra til nevrale reparasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er finansiert av Krembil Foundation (drift grant CMM). WX var Carlton Marguerite Smith student pris. NL mottatt en Ontario Graduate Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30 G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25 G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1 mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3 mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1 M, 9.01 g in 100 mL dH2O |
| 1 M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155 mM, 1.30 g in 100 mL dH2O |
| 155 mM NaHCO3 | |||
| 1 M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100 mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5 mL Hormone Mix and aliquoted into 20 μL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2 M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69 g in 100 mL dH2O |
| 1 M KCL | Sigma | P5405 | 7.46 g in 100 mL dH2O |
| 1 M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g in 100 mL dH2O |
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g in 100 mL dH2O |
References
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H.
- Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
- Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
- Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
- Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
- Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports - UK. 7, (2017).
- Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
- Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
- Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
- Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
- Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
- Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
- Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
- Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
- Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/PDS/default.html (2018).
- Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
