Summary
Aqui, vamos demonstrar o desempenho de um modelo de lesão medular mínima em um rato adulto que poupa o nicho central canal habitação endógena células tronco neurais (NSCs). Mostramos como o ensaio de neurosphere pode ser usado para quantificar a ativação e migração de NSCs definitivos e primitivos, após lesão.
Abstract
Células-tronco neurais (NSCs) na medula espinhal dos mamíferos adulta são uma população relativamente mitotically quiescente de periventriculares células que podem ser estudados em vitro usando o ensaio de neurosphere. Este ensaio formadoras é uma poderosa ferramenta para estudar a resposta de NSCs para fatores exógenos em um prato; no entanto, isto também pode ser usado para estudar o efeito de manipulações na vivo com a compreensão apropriada dos pontos fortes e limitações do ensaio. Uma manipulação do interesse clínico é o efeito da lesão na ativação endógena do NSC. Modelos atuais de lesão da medula espinhal fornecem um desafio para estudar isto como a gravidade dos modelos comuns de contusão, compressão e transecção causar a destruição do nicho NSC no local da lesão onde residem as células-tronco. Aqui, descrevemos um modelo de lesão mínima que causa danos localizados na superfície dorsolateral superficial do piso inferior torácica (T7/8) da medula espinhal rato adulto. Este modelo de lesão poupa o canal central ao nível da lesão e permite a análise de NSCs que residem no nível da lesão em vários pontos de tempo após lesão. Aqui, nós mostramos como o ensaio de neurosphere pode ser utilizado para estudar a ativação de duas populações distintas, relacionadas com lineally, de NSCs que residem na região periventricular da medula espinhal - NSCs primitivos e definitivos (pNSCs e dNSCs, respectivamente). Demonstramos como isolar e cultura estes NSCs da região ao nível da lesão e o local da lesão de substância branca periventricular. Nossas dissecações pós-cirúrgica da medula espinhal mostram aumento do número de pNSC e neurospheres dNSC-derivado da região periventricular das cordas feridas comparados aos controles, falando de sua ativação através de lesão. Além disso, após lesão, neurospheres dNSC-derivado pode ser isolado do local da lesão — demonstrando a capacidade de NSCs para migrar do seu nicho periventricular para locais de ferimento.
Introduction
O sistema nervoso central contém uma subpopulação de células-tronco multipotentes, auto renovadora que têm a capacidade de dar origem a todas as células nervosas maduro diferentes tipos1,2,3,4. Essas células-tronco neurais (NSCs) residem em nichos especializados do cérebro e da medula espinhal e pode ser ativadas após lesão para proliferar, migrar e se diferenciar em células maduras neurais. NSCs e seus descendentes foram mostrados para migrar para o local da lesão, em lesão cortical modelos5,6. No cérebro, NSCs foram mostrados para migrar dos ventrículos laterais para o local da lesão, onde eles se diferenciar em astrócitos que contribuem para a formação de cicatriz glial7. Na medula espinhal, no entanto, poucos estudos foram feitos para perguntar se esses mesmos NSCs endógenos podem ser aproveitados para promover a recuperação após a lesão da medula espinhal. De fato, atualmente há um debate sobre se a ativação da pilha de haste piscina na medula espinhal exige um dano físico direto do nicho periventriculares revestem o canal central8 ou se os danos para a coluna vertebral cabo parênquima (deixando o tronco nicho de célula intacto) é suficiente para ativar endógena NSCs9.
Um número de modelos de lesão (SCI) da medula espinhal têm sido utilizado para estudar a fisiopatologia da lesão aguda e crônica. Estes modelos também tem sido usados para testar potenciais terapias para tratar SCI através de neuroproteção, imunomodulação e desenvolvimento celular transplante/substituição estratégias10,11,13. Modelos atuais incluem compressão e/ou contusão lesões, que causam déficits funcionais em grande escala, bem como lesões extensas e cavitações no cabo14,15. Cicatrizes gliais resultantes podem abranger diversos segmentos da coluna vertebral juntamente com a maioria de largura/circunferência do16da medula espinhal. Assim, enquanto estes modelos são clinicamente relevantes, arranjaram um desafio significativo para estudar a resposta de NSCs endógenas após lesão. Existem modelos de químicos da lesão que pode ser adaptado para causar formas mais leves de lesão que pode poupar o canal central17. No entanto, esses tipos de lesão focar a desmielinização associada com SCI e não são modelos clinicamente relevantes para o dano físico e/ou mecânico associado com Sci traumático.
Para lidar com as limitações dos modelos de lesão atual, nós adaptamos um agulha faixa mínima SCI modelo, originalmente desenvolvido no rato9, para a aplicação em um modelo do rato adulto. Nosso modelo de lesão adaptado pode criar uma lesão consistente na região dorsolateral da medula espinhal do mouse e poupar o canal central para o nível da lesão. A vantagem desse modelo é que ele permite o estudo da cinética de NSC após lesão e sua potencial migração radial para o local da lesão. O uso de um modelo de mouse também permite o uso de ratos transgénicos que permitem o monitoramento de linhagem de NSCs endógenos e seus descendentes após lesão. As propriedades do NSCs mais podem ser avaliadas usando uma forma modificada do ensaio em vitro neurosphere que é introduzida no presente protocolo.
O ensaio de neurosphere é um em vitro formadoras ensaio que permite o isolamento de NSCs na presença de mitógenos. Em densidades de chapeamento clonal, NSCs individuais proliferam para dar origem a colônias esféricas flutuantes de células que são compostas por uma pequena subpopulação de NSCs e uma grande maioria dos progenitores18,19. Em nosso protocolo, demonstramos o isolamento de duas distintas, relacionadas a lineally NSCs da região periventricular da medula espinhal — sob condições de linha de base e seguir nosso modelo SCI mínimo. Definitiva neural da haste nestin expressa de células (dNSCs) e a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e são cultivados na presença de fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento fibroblástico (FGF) e heparina (juntos denominada EFH)20. Estes dNSCs são raros na medula espinhal ingênuo, dando origem a muito poucas neurospheres em vitro. No entanto, mostramos que os dNSCs são ativados mínimo SCI, expandindo os números dos neurospheres isolada da região periventricular21a seguir. Células-tronco neurais primitivas (pNSCs) estão a montante do dNSCs na linhagem de células-tronco neurais. pNSCs são excessivamente raros, expressos níveis baixos do marcador pluripotência Oct4 e leucemia responsivo de fator inibitório (LiF)22. pNSCs não formam neurospheres quando isoladas de rato adulto medula espinhal devido à presença de proteína básica de mielina (MBP) em culturas primárias; no entanto, pNSC neurospheres pode ser isolado de ratos deficientes de MBP e seus números são lesões seguintes expandida — semelhantes a dNSCs21. Finalmente, mostramos que neurospheres dNSC-derivado pode ser isolado do local da lesão em cedo vezes seguindo mínimo Sci. Estes resultados demonstram que o nosso modelo de lesão e ensaios podem avaliar as características de ativação de periventriculares NSCs tais como sua capacidade de proliferar e migrar em resposta a lesões.
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Protocol
Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de cuidado Animal da Universidade de Toronto e está em conformidade com o "guia para o cuidado e uso de animais experimentais" (2nd Edition, conselho canadense no cuidado Animal, 2017).
1. cirurgia de lesão medular mínima
Nota: Antes da cirurgia certifique-se de que todos os materiais e instrumentos cirúrgicos são esterilizados por métodos apropriados (figura 1A).
- Construa um arco de apoio torácico, acumulando 4 – 5 quadrados de gaze e gravando-os juntos no meio para obter um rolo fixo de gaze.
- Posicione o mouse na câmara de indução e iniciar a anestesia com isoflurano 5%. Confirme a ausência de um reflexo de pitada de dedo do pé antes de prosseguir, bem como ao longo do processo. Como a cirurgia pode demorar mais de 30 min para completar, otimize para a exposição mínima de isoflurano (5 min a 5%) e o tempo restante de 2 – 3%.
- Transferi o mouse para um cone de nariz ligado à máquina anestésica em dose de manutenção de isoflurano de 2 – 3%. Use a máquina de cortar cabelo para remover a pele do dorso do animal do meio da costas até as pescoço/orelhas para expor uma área retangular ampla da pele para a cirurgia.
- Transferi o mouse para um instrumento estereotáxica colocando seu nariz do cone de nariz anexada e estabilizando o crânio com barras de orelha. Manter o isoflurano em 5% durante a colocação das barras de orelha e inferior para 2-3%, quando o mouse é segura no dispositivo estereotáxica.
- Administrar medicações analgésicas pré-operatório intraperitonealmente — Meloxicam (2,0 mg/kg). Aplica generosamente lubrificação do olho para os olhos de rato aberto para evitar a dessecação da córnea quando sob anestesia.
- Coloque o arco de apoio torácica debaixo do abdômen do mouse enquanto endireitar o corpo do rato e espinha puxando levemente a base da cauda. Use fita de etiquetagem de laboratório para proteger a cauda e pernas estendidas todos em uma posição de estrela, como. Uma vez seguro, empurre o arco de apoio torácica rostral, do abdome para o tórax superior do mouse — para sustentar a coluna torácica (figura 1B).
- Prepare um campo cirúrgico estéril, desinfecção a superfície de pele pele-recortado preparada na etapa 1.3 com etanol a 70%, seguida de iodo-povidona. Repita duas vezes. Aplica um pano cirúrgico estéril para manter um campo largo esterilizado.
- Usando uma lâmina de bisturi de #10, faça uma incisão vertical paralelo ao eixo longitudinal do animal do ponto médio de ambas as lâminas do ombro para a curvatura da coluna torácica. Retrai a pele para expor o tecido mole e o contorno da coluna vertebral (Figura 1).
- Identifica a borda inferior da almofada gorda supraescapular (isto demarca o nível vertebral T4/5). Com a mesma lâmina #10, com cuidado, mas com força, corte ao longo de ambos os lados do osso T5-T8/9 para desanexar os tendões de costas-musculares da coluna vertebral.
- Introduza os dentes de afastadores os locais de incisão de cada lado da coluna vertebral. Ajuste a exposição expandindo retractores para elevar suficientemente a espinha sem colocar demasiada pressão sobre as camadas de músculo retraído (Figura 1).
- Sob o microscópio cirúrgico, limpe cuidadosamente o residual músculo e outros tecidos moles sobrejacentes a espinha para expor o osso vertebral (Figura 1E). Identifica as vértebras que serão removidas por apertando o processo espinhoso das vértebras com fórceps dentado e movê-lo ligeiramente até e para baixo.
Nota: Isto deve permitir a identificação das articulações intervertebrais e expor as pequenas aberturas (Forame intervertebral) por baixo das vértebras de interesse. - Inserir uma cabeça da tesoura curva cega em ambos os lados do Forame intervertebral exposto, caudal para a lâmina vertebral para ser extirpado e cortar as ligação articulações intervertebrais bilateralmente.
- Levantar a lâmina para cima e corte a fixação superior da lâmina para isolar e remover o osso.
Nota: Isto irá expor o saco dural intacto que contém a medula espinhal (Figura 1F). Pode haver excessivo sangramento que pode ser controlado, colocando pré-cortados gaze de 1 x 1 cm para as áreas afetadas e/ou lavagem com PBS estéril. - Com a veia de linha média dorsal, servindo como um marco, insira uma haste de 45° dobrados de uma ponta de agulha 30G (com agulha bisel voltado para cima) na superfície dorsolateral da medula espinhal (aproximadamente 1 mm de profundidade) em aproximadamente lateral de 0,5 mm para cada lado da linha média.
- Mova a agulha ~ 2 mm de caudal para rostral (paralelo à linha média) para que toda a extensão do bisel da agulha é inserida no cordão. Remova a agulha, refazendo via o caminho de entrada (Figura 1).
Nota: Não deve haver nenhum sangramento mas inchaço do tecido espinhal pode ser visto neste passo. - Para fechar o ferimento, remover o retractor e suturar os músculos das costas em ambos os lados da lesão junto na linha média usando uma sutura de 6-0. Use uma sutura de seda 4-0 estéril para posteriormente fechar a pele sobrejacente.
- Aplique pomada antibiótica para o topo da pele para prevenir infecção pós-operatória, usando a ponta de um cotonete de algodão suturado superficial. Administre analgésicos no pós-operatório de 0,1 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea, juntamente com fluidos (1 mL de solução de Ringer lactato).
- Desligue o isoflurano vaporizador e oxigênio. Remova o mouse o local em uma gaiola limpa com nenhum fundamento e dispositivo estereotáxica.
- Coloque o rato na gaiola cerca de 30 cm de uma lâmpada de calor para a recuperação da anestesia e monitor comportamento após acordar. O rato deve acordar dentro de 5 a 10 min e têm a função de membro posterior com possível paresia e/ou fraqueza de cauda ao acordar.
- Monitorar o comportamento do mouse ao longo dos próximos dias e fornecer cuidados pós-operatórios adequados e analgésicos (i.e., mash, lactato de solução fluido subcutâneo, 0,1 mg/kg a buprenorfina Ringer 2 x diariamente por via subcutânea para 2-3 dias e peso adequado acompanhamento ) em conformidade aos regulamentos de instalações de animais locais e a nível individual como recuperação podem variar.
2. Neurosphere do ensaio dissecação
Nota: Siga os procedimentos de cultura de tecido estéril adequada em todo.
- Preparação da solução enzimática
- Adicione 32 mL de Earle está equilibrado sal solução (EBSS) à albumina ovomucoid inibidor contendo o frasco de vidro e suavemente vórtice até dissolver.
- Adicionar 5 mL de EBSS para um frasco de vidro previamente repartidas papaína e coloque em banho-maria 37 ° C para dissolver. A solução se tornará claro (solução 1).
- Tomar 500 µ l de EBSS e adicionar para o pre-repartida DNase que eu vidro frasco para obter uma concentração de 1 mg/mL (solução 2). Misture-os muito delicadamente inclinando-se o frasco e para trás e adicionar 250 µ l desta mistura a solução 1.
Nota: Todas as soluções feitas (solução 1 e 2) são suficientes para processamento de duas peças de tecido. Se o processamento mais peças de tecido, acomodar com mais preparação da solução.
- Dissecação e preparação do tecido
- Lugar uma limpeza de laboratório embebido em isoflurano na gaiola do rato e permitir que 2-3 min para vapores anestesiar completamente do mouse. Eliminatória seguinte, remover o rato da gaiola e confirmar a ausência de um dedo do pé-pitada reflexo.
- Execute o deslocamento cervical com um objeto pontiagudo de metal(ou seja, cartão de gaiola de metal) para abater o animal. Pulverize o animal euthanized meados de volta de seu pescoço generosamente com etanol a 70%.
- Na base do crânio, use uma tesoura para cortar a cabeça e descartar em um saco de bio. Fazer uma incisão na pele ao longo de todo o comprimento da parte traseira para expor o músculo e contorno ósseo vertebral (Figura 2A).
- Levantar o aspecto medial de cada escápula (IE., omoplata — identificado por sobrejacente do tecido) e usar tesouras para cortar tecidos moles (entre a escápula e vértebras). Separado inteiramente para expor a coluna vertebral subjacente.
- Seguindo a curvatura da coluna vertebral, insira o mesmo par de tesouras da abertura torácica superior e isolar a coluna vertebral, cortando-se anexada costelas, músculos e órgãos internos (Figura 2B).
- Insira uma tesoura no caudal forame vertebral/abertura e corte as articulações intervertebrais em ambos os lados das lâminas (superfície dorsal). Tome especial cuidado para não danificar o cabo intacto. Continue esse processo até o nível desejado e/ou o comprimento do fio é exposto.
- Corte com cuidado a spinal nerve(s) estendendo-se lateralmente da medula antes de transferir o tecido da medula espinhal em uma placa de Petri com fluido cerebrospinal artificial regular. Manter a amostra em gelo (Figura 2).
- Sob um microscópio de dissecação, corte o tecido da medula espinhal para incluir ~ 2 mm rostral e caudal para o local da lesão. Usar dois pares de pinças para separar com cuidado o cabo em 2 metades longitudinalmente ao longo das fissuras dorsais e ventrais (Figura 2').
- Com micro-tesouras, corte matéria branca dorsolateral ferida. Coloque a peça em um tubo cônico de 15 mL.
- Segurando uma metade da medula espinhal para baixo com fórceps, provocar e remover matéria branca usando um outro par de pinças bem ao longo da extensão rostrocaudal da medula espinhal para isolar a região periventricular desejado. Repita para a outra metade da medula espinhal.
- Coloque pedaços de tecido periventricular em um tubos cónicos 15ml separado. Use micro-tesouras e picar delicadamente o tecido contra as paredes dos tubos cónicos.
Nota: As modificações de dissociação de tecido são de papaína dissociação sistema protocolo23 e de procedimentos de preparação de tecido descrito anteriormente24. - Adicionar 2,5 mL de nova solução 1 (passo 2.1.3) a amostra de tecido e coloque sobre um roqueiro a 37 ° C por 30 min.
- Triture levemente o tecido na solução com uma ponta de pipeta de 1.000 µ l. Centrifugar a suspensão de célula nublado x g durante 5 min à RT
- Preparar a solução 3 com 2,7 mL de equilibrada solução Earle está de sal, 300 µ l de solução de inibidor ovomucoid (etapa 2.1.1) e 150 µ l do DNase eu solução (etapa 2.1.3).
- Descartar o sobrenadante da etapa (etapa 2.2.13) e ressuspender em 1,5 mL de solução 3 da etapa anterior (etapa 2.2.14).
- Esta nova suspensão de célula (etapa 2.2.15) em cima de 5 mL de solução de inibidor de ovoimucoid (etapa 2.1.1) em um novo tubo cônico de 15 mL para criar um gradiente descontínuo de densidade da camada. Centrifugar x g por 5 min à RT.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender em 2 mL de mídia neurobasal. Centrifugar x g por 3 min em RT.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender em 1 mL de mídia neurobasal. Filtre a suspensão usando um coador de célula 20 µm seguido de 4 mL de mídia para um volume total de 5 mL.
- Chapeamento
- Preparar meios de cultura para o crescimento de neurosphere, completando neurobasal mídia com fator de crescimento epidérmico (20 ng/mL) / fator de crescimento fibroblástico (20 ng/mL) / heparina (2 µ g/mL) [para NSCs definitivos] ou leukemina fator inibitório (10 ng/mL) [para NSCs primitivos]. Adicione 10 mL de qualquer mídia para um balão de cultura de tecidos de 25 mL.
- Use um hemocytometer e corante Trypan azul para calcular o número de células em suspensão (etapa 2.2.18)25. Uma vez calculado, adicionar células para frascos de cultura de tecidos preparados (etapa 2.3.1) para uma densidade clonal de 10 células / µ l e lugar frasco de cultura de tecidos com células adicionados em incubadora para 24 h (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO2).
Nota: Um exemplo da técnica da contagem é a seguinte: Tome 10 µ l de suspensão de células e misture com 10 µ l de corante azul de Tripan. Adicione 10 µ l desta mistura em um hemocytometer. Sob um microscópio óptico de 10x, contar o número de células vivas e soma todas as células contadas dentro 4 dos 4 x 4 quadrantes. Use a fórmula: 100.000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1.000] para dar o volume da suspensão de células para ser banhado em cada frasco de cultura de tecidos de 25 mL para garantir densidade clonal (10 células / µ l). - Após 24h, suavemente agite o frasco e despeje o conteúdo em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar x g por 5 min à RT.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 a 2 mL de mídia neurobasal fresco.
- Repita a etapa 2.3.2 para contar o número de células em suspensão e placa células em densidade clonal em uma placa de cultura de tecido de 24-poço contendo 500 µ l cada de seus meios respectivos mitógeno complementado (EFH para crescimento de NSC definitivo) e LIF para crescimento de NSC primitivo.
Nota: Usar a fórmula adaptada (5.000 / [X células/4) x 2 x 10 x 1.000) para calcular o volume de suspensão de célula para ser banhado em cada bem contendo 500 µ l de mídia. - Coloque placas contendo células na incubadora (37 ° C, umidade de 95%, 5% CO2) para crescer por 7 dias.
- Contando
- Após 7 dias em cultura, remover placas e ver os sob um microscópio de luz. Quantificar neurospheres pela contagem de colônias esféricas que são > 80 µm de diâmetro para culturas dNSCs e > 50 µm de diâmetro para culturas de pNSCs.
Nota: Se desejar, neurospheres pode ser ainda mais passadas26 ou diferenciadas. Se as células não são mais necessários, elimine adicionando peróxido de hidrogênio acelerado aos poços (cerca de 1 mL) por 20 min para que a cor do meio fica amarela. Em seguida, descarte.
- Após 7 dias em cultura, remover placas e ver os sob um microscópio de luz. Quantificar neurospheres pela contagem de colônias esféricas que são > 80 µm de diâmetro para culturas dNSCs e > 50 µm de diâmetro para culturas de pNSCs.
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Representative Results
Após a cirurgia, os ratos devem experiência mínimos déficits motor, que podem incluir a cauda e possível paresia do membro posterior para até 24 h. Após este tempo, os ratos não devem experimentar nenhuma paralisia do membro posterior e/ou paresia e alterações mínimas na marcha.
A Figura 3 mostra resultados representativos de ensaio de neurosphere 5 dias após a lesão mínima da medula espinhal. Os números absolutos de neurospheres dNSC-derivado (crescido em EFH) são maior do que os números do pNSC-derivado neurospheres (crescido em LIF) após a lesão (Figura 3A e 3B, respectivamente). Imagens de maior poder de um neurosphere definitivo (Figura 3) e um neurosphere primitivo (Figura 3D) revelam diferenças no aparecimento destas colónias distintas com neurospheres definitiva, sendo maior em diâmetro (≥ 80 µm) e geralmente tendo um grande centro escuro. Neurospheres primitivas são menores em tamanho (≥ 50 µm) e as células são mais hermeticamente embaladas. Números representativos de neurospheres decorrentes de diferentes partes da medula ferida são vistos na Figura 3E (definitivos) e 3F (primitivos). Mostra Figura 3E que SCI mínimo provoca um aumento significativo no neurospheres crescido a partir do canal central ao nível da lesão em comparação com um aumento relativamente modesto, o cabo não-ferida rostral.
Curiosamente, neurospheres definitivo pode ser gerado do local da lesão, uma região que não contém neurosphere formando células em camundongos sozinho laminectomia. Figura 3F demonstra um aumento similar em pNSCs pós-lesão, com excepção do pNSC neurospheres no local da lesão. Assim, apenas dNSCs são capazes de migrar para o local da lesão ao longo desta pós-lesão curso de tempo.
Figura 1: procedimento cirúrgico. (A), o layout de tudo necessário, numeradas para referência. (B) A imagem do mouse em um dispositivo estereotáxica com um corpo esticado, coluna e membros espalhe-se e gravou juntamente com o arco de apoio torácico colocado por baixo. (C) A imagem do mouse com uma incisão vertical da pele, expondo a camada muscular e o contorno da coluna vertebral. (D) A imagem do corpo do mouse após incisões musculares e exposição e isolamento da coluna vertebral com afastadores. Note-se camadas de músculo tenso com a falta de rasgar. (E), A imagem da coluna vertebral de rato isolado com camadas de músculo removido, mostrando a superfície óssea da vértebra (3 segmentos). Isso também mostra o processo espinhoso e possivelmente a articulação intervertebral e lâmina da vértebra média a ser removido. (F) uma foto a pós-laminectomia visível da medula espinhal. Rotulado é a veia da linha mediana dorsal. (G), uma foto do rato com lesões de faixa agulha bilateral em ambos os lados da veia da linha mediana dorsal. Há uma inserção de close-up do eixo de 45° dobrados de agulha 30G. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: medula espinhal dissecação. (A), A imagem do mouse decapitada com a incisão de pele para expor a muscular costas e a imagem de (B) um contorno ósseo vertebral da coluna vertebral isolada, apresentando orientação rostral e caudal. A segunda foto mostra o cordão de isolamento e o terceiro mostra a medula espinhal isolada em uma placa de Petri. (C) A representação gráfica da dissecação bem da medula espinhal, onde os diferentes segmentos (periventricular, área de lesão) são removidos e separados para cultivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: representante resulta de neurosphere ensaio após lesão medular mínima. (A) os números de dNSC-derivado neurospheres (crescido em EFH) cultivada da medula espinhal lesada são maior que (B) o número de neurospheres pNSC-derivado (crescido em LIF) quando banhado em densidade igual. (C, D) Imagens de maior poder de neurospheres "típico" em culturas de pNSC (D) e (C) dNSC culturas. Lesão de trato de agulha mínima (E) resulta em um aumento significativo do número de neurospheres dNSC-derivado de canal central ao nível da lesão, bem como o canal central rostral da lesão e do local da lesão. (F) pNSC-derivado neurospheres não pode ser isolado da medula ileso, mas pode ser isolado após lesão do canal central (no nível da lesão e do canal central rostral). Barras de erro representam o erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Durante o procedimento cirúrgico, existem alguns passos críticos onde o pesquisador deve prestar particular atenção a fim de obter resultados óptimos e minimizar a variabilidade entre os animais. Deve ter cuidado com a anestesia inalada (isoflurano) durante a cirurgia como anestésico foi mostrado para ter efeitos neuroprotective com exposição prolongada27. Nesse sentido, ao estudar a capacidade regenerativa da medula espinhal após lesão, fazer um esforço para realizar a cirurgia, mais rapidamente e eficientemente quanto possível para evitar variáveis de confundimento. Manter o mesmo tempo de exposição de isoflurano por rato irá reduzir a variabilidade. A taxa de respiração do mouse deve ser monitorada durante a cirurgia e não deve ser demasiado lenta (menos de 1 respiração cada 2-3 s) ou pesadamente com dificuldade (i.e., ofegante). A dose de manutenção da anestesia pode ser reduzida de 2 – 3%, para evitar a anestesia prolongada com a nota de ratos que receberam a dosagem mais baixa mortalidade.
Durante a cirurgia, tenha muito cuidado ao realizar incisões musculares em ambos os lados da coluna vertebral. Certifique-se de que os cortes são profundos, e a lâmina é angulada medialmente, para que a borda da lâmina repousa contra as vértebras ósseas durante a incisão muscular. Se a lâmina está inclinada para o exterior, há a possibilidade de sangramento excessivo de cortes vasculares. O pesquisador deve também prestar atenção extra ao executar a laminectomia para evitar a pesca profunda da tesoura que irá danificar a medula espinhal, causando dano tecidual indesejado e déficits funcionais. O controle apropriado para estes experimentos é um grupo de "laminectomia somente" (sem lesão), que permitirá uma comparação da ativação de NSCs atribuída para o prejuízo de faixa de agulha em oposição à que pode resultar da laminectomia somente. Mostramos que a laminectomia sozinha pode resultar em um aumento pequeno, embora insignificante na ativação do NSC, como revelado por um aumento do número de neurosphere da região periventricular no nível da lesão21. Laminectomia sozinha não causa aumentos nos números de neurosphere da região periventricular rostral ou caudal para a laminectomia e não neurospheres são encontrados em culturas de substância branca isolada no nível da laminectomia. Além disso, ao executar a laminectomia, cuide para remover a lâmina dorsal inteiro para permitir ampla exposição da medula. Isto (1) permitirá acesso suficiente executar o prejuízo de faixa mínima agulha medular dorsolateral e (2) impedir que segmentos do osso sendo deixado para trás e causando danos secundários após o encerramento e pós-recuperação movimento do mouse. Se a lâmina inteira não é tido como uma peça, ou segmentos de osso afiado salientes em ambos os lados da laminectomia são observados, use instrumentos (tais como fórceps dentado e tesouras curvas) para remover estes fragmentos antes da sutura.
O pesquisador deve ser extremamente cuidadoso ao aplicar suturas para a camada muscular durante o encerramento cirúrgico. Uma sutura (nó duplo) deve ser colocada caudal ao nível de laminectomia/lesão para que a sutura encontra-se em cima do osso vertebral intacto. Isso é para evitar quaisquer danos secundários que podem resultar da sutura muscular estar em contato com o cabo exposto quando o mouse se move após a recuperação. Além disso, a sutura de caudal para a laminectomia/lesão muscular atua como um ponto de referência para onde o SCI foi executado quando isolando a medula espinhal para análise. Tenha cuidado quando dissecando a área lesada da medula espinhal para evitar comprometer a estrutura da região lesada, para que ele possa permanecer reconhecível durante a dissecção bem sob o microscópio de dissecação. No que se refere o ensaio de neurosphere, é importante realizar a trituração mecânica de célula pelotas suavemente para evitar a produção de bolhas de ar que pode aumentar a morte celular. pNSC-derivado neurospheres são ainda mais sensíveis às condições de crescimento pesado, detritos — trituração excessiva e exposição prolongada em soluções enzimáticas — em relação a culturas dNSC. pNSC derivado esferas são mais compactos e menor que dNSCs. Dada a raridade da pNSCs, recomenda-se isolar pelo menos 240.000 células por amostra.
O modelo mínimo do SCI é ideal para estudar os eventos celulares após lesão (como a ativação de NSCs endógenos), mas não permite o estudo de perturbações funcionais. Conforme observado anteriormente, os ratos que recuperar de uma lesão de faixa a agulha experimentam sem défices comportamentais notáveis que persistem, e como tal, os ratos não podem ser avaliados para a eficácia das intervenções terapêuticas destinadas a melhorar os resultados funcionais. Um aspecto importante da medicina regenerativa é que um tratamento deve não só promover o reparo do tecido (que pode ser avaliado usando este modelo, em combinação com o ensaio de neurosphere, rastreamento de linhagem e imuno-histoquímica/imunofluorescência) mas deve também demonstrar relevante melhoria funcional usando paradigmas comportamentais, quando aplicável. Um número de tarefas comportamentais, usado para testar os resultados funcionais em modelos torácicos da lesão, como o teste de culpa do pé e o Basso, Beattie, Breshnan (BBB) aberto campo escala locomotora28, não é suficientemente sensível para detectar déficits mensuráveis em nosso mínimo Modelo SCI. Para superar esta lacuna, pode-se fazer uso dos mais sensíveis sistemas digitais de Pontuação (por exemplo, passarela) que mede vários parâmetros de parâmetros de locomoção de membro posterior bruta e bem, incluindo análises de marcha, que podem detectar a mínima os déficits resultantes da lesão mínima modelo29.
Esse método também pode ser adaptado para estudar activação NSC endógena como uma terapia potencial em modelos de lesão medular cervical. SCI cervical é o modelo mais clinicamente relevante e propomos que adaptar este modelo de lesão aos segmentos vertebrais superiores proporciona insight se existem variações regionais na resposta de NSCs e seus descendentes (cinética, migração, diferenciação) e se a lesão resultaria em déficits funcionais mais profundos e mensuráveis. Os modelos atualmente usados murino lesão cervical (tais como a transecção, compressão de clip e/ou contusão) exigem cuidados intensivos no pós-operatório, incluindo a necessidade de manualmente express bexigas e constantemente monitorar a respiração do rato. Adaptar o modelo mínima lesão da medula espinhal cervical pode reduzir a mortalidade, morbidade e cuidados pós-operatórios, associado a outros modelos SCI cervicais bem como permitir uma para examinar a eficácia das moléculas de drogas/pequenas e/ou reabilitação resultados na recuperação neural. Nosso modelo de lesão também pode ser adaptado para criar uma lesão mínima em diferentes partes da medula (ou seja, colunas dorsais ou laterais) e/ou lesões maiores com penetração mais profunda e/ou a utilização de agulhas de tamanhos maiores (menor calibre). Isso permite que o pesquisador controlar/manipular o tipo e tamanho da lesão e, portanto, avaliar a recuperação celular e funcional/comportamental em conformidade.
O modelo de lesão mínima em ratos permite o uso de modelos animais transgénicos. Os modelos do mouse permitem rotulagem de células-tronco endógenas e/ou progenitores antes da lesão. Isso pode permitir que o investigador controlar o destino dessas células pre-etiquetados após lesão e avaliar a proliferação de células precursoras neurais, migração e diferenciação após lesão — potencialmente contribuindo para reparação neural.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é financiado pela Fundação Krembil (subvenção de funcionamento CMM). WX foi o destinatário do prêmio estudante Carlton Marguerite Smith. NL recebeu uma bolsa de pós-graduação de Ontário.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30 G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25 G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1 mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3 mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1 M, 9.01 g in 100 mL dH2O |
| 1 M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155 mM, 1.30 g in 100 mL dH2O |
| 155 mM NaHCO3 | |||
| 1 M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100 mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5 mL Hormone Mix and aliquoted into 20 μL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2 M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69 g in 100 mL dH2O |
| 1 M KCL | Sigma | P5405 | 7.46 g in 100 mL dH2O |
| 1 M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g in 100 mL dH2O |
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g in 100 mL dH2O |
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