Summary
Burada, biz orta kanal niş konut endojen sinir kök hücreleri (NSCs) yedek bir yetişkin fare en az omurilik yaralanma modelinde performansını göstermek. Neurosphere tahlil harekete geçirmek ve yaralanma takip kesin ve ilkel NSCs geçirilmesi ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Abstract
Sinir kök hücreleri (NSCs) Yetişkin memeli spinal kord nispeten mitotically sakin bir nüfus okudu vitro neurosphere tahlil kullanarak olabilir periventriküler hücre vardır. Bu koloni oluşturan tahlil NSCs cevaben bir tabak içinde eksojen faktörleri incelemek için güçlü bir araçtır; Ancak, bu aynı zamanda vivo içinde manipülasyonlar etkisi güçlü doğru anlayış ve tahlil sınırlamaları ile eğitim için kullanılabilir. Klinik ilgi bir manipülasyon yaralanma endojen NSC etkinleştirme üzerinde etkisi olduğunu. Medulla Spinalis Yaralanmalarında güncel modelleri ortak kontüzyonu, sıkıştırma ve transeksiyon modelleri şiddeti neden olarak kök hücre bulunduğu sitesinde yaralanma NSC niş imha bu çalışma için bir meydan okuma sağlar. Burada, Yetişkin fare omurilik alt torasik düzeyi (T7/8) Yüzeysel dorsolateral yüzeyde yerelleştirilmiş hasara neden olur en az yaralanma modeli açıklar. Bu yaralanma modeli yaralanma düzeyde merkezi kanal yedek ve yaralanma takip çeşitli zaman noktalarda lezyon düzeyinde bulunan NSCs analizine izin verir. İşte, nasıl neurosphere tahlil omurilik periventriküler bölge - ilkel ve kesin NSCs ikamet NSCs iki farklı ve lineally ilgili nüfus aktivasyonu çalışma için kullanılması gereken göstermektedir (pNSCs ve dNSCs, sırasıyla). Nasıl saptamak ve bu NSCs yaralanma ve beyaz madde yaralanma site düzeyinde periventriküler bölge kültür göstermektedir. Bizim ameliyat sonrası omurilik diseksiyonlarının artan sayıda pNSC ve dNSC elde edilen neurospheres periventriküler bölge yaralı iplerden denetimleri, onların harekete geçirmek yolu ile yaralanma konuşan göre göster. Ayrıca, yaralanma, dNSC elde edilen neurospheres yaralanma sitesinden ayrılmış olabilir — NSCs onların periventriküler niş yaralanma sitelere geçirme yeteneği gösteren.
Introduction
Merkezi sinir sistemi kendi kendini yenileyerek, multipotent kök hücrelerin tüm farklı olgun sinir hücre türleri1,2,3,4' e çıkmasına kapasitesine sahip bir subpopulation içerir. Bu sinir kök hücreleri (NSCs) beyin ve omurilik özel niş yer alır ve çoğalırlar, göç ve olgun sinir hücrelerine ayırt etmek için yaralanma takip etkinleştirilebilir. NSCs ve onların Döl kortikal hasar modelleri5,6yaralanma sitedeki geçirilecek gösterilmiştir. Beyinde, NSCs nerede gliyal yara oluşumu7' ye katkıda astrocytes içine ayırt sitesine yaralanma lateral ventrikül geçirilecek gösterilmiştir. Omurilik, ancak, bu aynı endojen NSCs Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip kurtarma tanıtmak için harnessed olabilir eğer sormak kaç çalışmalar yapılmıştır. Nitekim, şu anda bir tartışma olup doğrudan fiziksel zarar merkezi kanal8 astar periventriküler niş omurilik kök hücre havuzda aktivasyonu gerektirir veya spinal hasar (kök bırakarak parankimi kordon hücre niş olduğu gibi) endojen NSCs9etkinleştirmek yeterli olur.
Omurilik yaralanma (SCI) modeller bir dizi akut ve kronik yaralanması Patofizyoloji eğitim için kullanılmaktadır. Bu modeller de neuroprotection, immunomodulation ve gelişmekte olan hücre nakli/değiştirme stratejileri10,11,13SCI tedavisinde potansiyel tedaviler test etmek için kullanılmıştır. Geçerli modelleri büyük ölçekli fonksiyonel açıkları yanı sıra geniş lezyonlar ve kavite kordon14,15' te neden sıkıştırma ve/veya kontüzyonu yaralanmaları içerir. Sonuç gliyal izleri genişliği/çevresi omurilik16çoğunluğu ile birlikte birkaç spinal segmentler yayılabilir. Böylece, bu modeller klinik olmakla birlikte, endojen NSCs yaralanma aşağıdaki yanıt eğitimi için önemli sorunlar paraları. Daha hafif formların merkezi kanal17yedek yaralanma neden için uyarlanmış yaralanma kimyasal modellerdir. Ancak, bu tür yaralanma SCI ile ilişkili demiyelinizasyon odaklanmak ve travmatik bilimleri ile ilişkili fiziksel ve/veya mekanik hasar klinik modeli değildir
Geçerli yaralanma modellerin sınırlarını adrese, orijinal fare9, bir yetişkin fare modeli uygulama için gelişmiş bir iğne parça en az SCI modeli, adapte olması. Adapte yaralanma modelimiz tutarlı bir lezyon fare omurilik dorsolateral bölgesinin oluşturabilir ve merkezi canal yaralanma seviyelerine adlı yedek. Bu modelin avantajı bu NSC kinetik çalışma ruhsatı mı yaralanma ve onların potansiyel radyal geçiş yaralanma siteye aşağıdaki. Bir fare modeli kullanımı da soy izleme endojen NSCs ve yaralanma takip onların Döl izin transgenik fareler kullanımına izin verir. NSCs özelliklerini daha da bu protokol için tanıttı vitro neurosphere tahlil değiştirilmiş bir formu kullanarak tespit edilebilir.
Neurosphere tahlil NSCs yalıtım mitogens huzurunda izin veren bir vitro koloni oluşturan tahlil olduğunu. Klonal kaplama yoğunlukları bireysel NSCs NSCs küçük bir subpopulation ve ataları18,19büyük bir çoğunluğu oluşan hücre serbest yüzer küresel sömürgelerine çıkmasına çoğalırlar. Bizim iletişim kuralında, spinal kord periventriküler bölgesinden iki farklı ve lineally ilgili NSCs yalıtım göstermek — temel koşullar altında ve ardından en az SCI modelimiz. Kesin sinir kök hücreleri (dNSCs) hızlı testin ve gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) ve epidermal büyüme faktörü (EGF), fibroblast büyüme faktörü (FGF) ve heparin (birlikte olarak adlandırdığı EFH)20huzurunda yetiştirilmektedir. Bu dNSCs için çok az neurospheres vitrosebebiyet veren saf spinal kord nadirdir. Ancak, biz dNSCs en az SCI, periventriküler bölge21kimden izole neurospheres sayıda genişleyen takip etkinleştirilir gösterir. İlkel sinir kök hücreleri (pNSCs) ters yönde nöral kök hücre soy dNSCs. pNSCs pluripotency işaretçiyi Oct4 düşük düzeyde son derece nadir, hızlı ve lösemi inhibitör faktörü (LIF) duyarlı22. pNSCs ne zaman yetişkin fare spinal kord miyelin temel protein (MBP) birincil kültür varlığı nedeniyle gelen izole neurospheres oluşturmaz; Ancak, pNSC neurospheres MBP eksik fareler izole olabilir ve genişletilmiş aşağıdaki yaralanma onların sayılardır — dNSCs21benzer. Son olarak, biz dNSC elde edilen neurospheres erken kez en az bilm takip yaralanma siteden izole olabilir göstermek Bu bulgular bizim yaralanma modeli ve deneyleri periventriküler NSCs yeteneklerini çoğalırlar ve yaralanma yanıt olarak göç gibi etkinleştirme özellikleri değerlendirebilir göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu iletişim kuralı Toronto Üniversitesi, hayvan bakımı Komitesi tarafından kabul edildi ve "Kılavuzu için bakım ve kullanım, deneysel hayvan uygun olarak" (2nd Edition, hayvan bakımı, Kanada Konseyi 2017).
1. en az omurilik yaralanma cerrahi
Not: ameliyat öncesi tüm cerrahi aletler ve malzemeler uygun yöntemlerle (Şekil 1A) sterilize emin olun.
- Gazlı bez 4 – 5 karelerinin haddeleme ve onları birlikte gazlı bez sabit bir rulo elde etmek için ortada taping tarafından bir göğüs destek kemer oluşturmak.
- İndüksiyon odasında fareyi getirin ve anestezi ile %5 isoflurane işlemini başlatın. Devam etmeden önce yanı sıra prosedürü boyunca ayak çimdik refleks yokluğu onaylayın. Ameliyat-ebilmek almak 30 dk dan fazla tamamlamak için en az isoflurane maruz kalma (%5 5 dk) ve kalan zamanda da % 2-3 en iyi şekilde.
- % 2 – 3 isoflurane idame dozu, anestezik makineye bağlı bir burun konisi için fareyi aktarın. Saç kesme makineleri kürk deri ameliyat için geniş dikdörtgen bir alan ortaya çıkarmak için boyun/kulakları çok orta yedeklemek hayvandan patolojisi kaldırmak için kullanın.
- Fare burnu bağlı burun konisi yerleştirip kafatası kulak çubuklarla sabitleme stereotaksik bir araç olarak aktarın. Fare stereotaksik aygıtı güvenli bir kez isoflurane % 5 yerleşim kulak çubuklarının ve başa % 2 – 3 alt sırasında korumak.
- Ameliyat öncesi analjezik ilaçlar intraperitoneally yönetmek — Meloksikam (2.0 mg/kg). Cömertçe göz yağlama anestezi ne zaman altında kornea kuruma önlemek için açık fare gözleri üzerine uygulayın.
- Torasik destek kemer fare karın altında fare vücut ve omurga kuyruk temel alınarak hafifçe çekerek düzleştirme sırasında yerleştirin. Teyp etiketleme laboratuvar kuyruğu ve bir yıldız gibi pozisyon tüm genişletilmiş bacaklarda güvenliğini sağlamak için kullanın. Güvenli bir kez torasik destek kemer rostrally, üst toraks doğru fare karın üzerinden itmek — torasik omurga yukarı (Şekil 1B) desteklemek için.
- Steril Cerrahi alan povidone-iyot tarafından takip adım %1,3 70 etanol ile hazırlanan deri kürk Kırpılan alanı dezenfekte tarafından hazırlayın. İki kez tekrarlayın. Bir geniş steril tutmak bir steril cerrahi örtüsü uygulanır.
- #10 neşter bıçak kullanmadan, bir dikey kesi torasik omurga eğriliği için paralel hayvanın boyuna ekseni olarak her iki kürek kemikleri orta noktasından olun. Yumuşak doku ve omurga dağılımı (Şekil 1 c) duyurmak cilt geri çek.
- Supraskapular yağ yastığı (T4/5 vertebra düzeyi demarcates) alt kenarını tanımlamak. Aynı #10 bıçakla geri-kas tendon sütundan ayırmak için vertebra kemik T5-T8/9 her iki tarafında boyunca dikkatle ama bir güçle, kesin.
- Ekartör diş omurganın her iki tarafında kesi siteleri ekleyin. Yeterince omurga retrakte kas tabakaları (Şekil 1 d) üzerinde çok fazla yük koymadan yükseltmesine ekartör genişleterek pozlamayı ayarlayın.
- Cerrahi mikroskop altında kalan kas ve diğer yumuşak doku vertebra kemik (Şekil 1E) ortaya çıkarmak için omurga örten dikkatle temizleyin. Vertebra spinöz proses ile dişli forseps clasping ve biraz yukarı hareket ettirerek kaldırılacak ve aşağı omurga tanımlayın.
Not: Bu kimlik intervertebral eklemlerin izin ve faiz vertebra altında küçük açıklıklar (intervertebral foramina) ortaya çıkarmak. - Maruz intervertebral deliği, eksize için vertebra lamina için kaudal her iki tarafındaki eğri körelmenin makas bir kafa yerleştirin ve çift taraflı bağlantı intervertebral eklem kesti.
- Lamina yukarı kaldırın ve lamina yalıtmak ve kemiği kaldırmak için üst eki kesti.
Not: Bu omurilik (Şekil 1F) içeren sağlam dural kese geçirecek. Aşırı olabilir hangi-ebilmek var olmak güdümlü yanında duvar ilanı kanama 1 cm x 1 cm tül üzerine etkilenen bölgelere precut ve/veya yıkama ile steril PBS. - Bir dönüm noktası hizmet veren dorsal orta hat ven ile orta çizgi her iki tarafında dorsolateral spinal kord (yaklaşık 1 mm derin), yaklaşık 0,5 mm lateral yüzeyine 45 ° bükülmüş şaft (ile iğne eğim yukarı bakacak şekilde) 30 G iğne ucu yerleştirin.
- Kablosunu iğneyi eğimi tüm uzunluğu eklenir böylece ~ 2 mm iğne kaudal rostral (paralel) orta hat olarak taşıyın. İğne girişi (Şekil 1G) yolu ile retracing tarafından kaldırın.
Not: Kanama olmalı ancak spinal dokusunun şişmesi bu adımda görülebilir. - Yarayı kapatmak için Retraktörü kaldırmak ve yaralanma 6-0 absorbe dikiş kullanarak midline birlikte her iki tarafında sırt kasları dikiş. 4-0 steril ipek dikiş örten cilt daha sonra kapatmak için kullanın.
- Antibiyotikli bir krem ameliyat sonrası enfeksiyon bir pamuklu çubukla ucu kullanarak önlemek için yüzeysel dikilmiş deri uygulamak. Post-operatif analjezik 0.1 mg/kg buprenorfin subkutan sıvı (1 mL lactated zil'ın çözeltisi) birlikte yönetmek.
- İsoflurane Buharlaştırıcı ve oksijen kapatın. Stereotaksik aygıt ve yer yok yatak takımları ile temiz bir kafeste fareyi kaldırın.
- İçinde belgili tanımlık kafes yaklaşık 30 cm uzakta a ısı lamba Kurtarma uyanma takip anestezi ve monitör çalışma biçiminden için fareyi getirin. Fare 5-10 dk içinde uyanıyorum ve hind-ekstremite fonksiyonu ile mümkün taraflidir ve/veya kuyruk zayıflık uyanma üzerine.
- Önümüzdeki birkaç gün içinde fare davranışı izlemek ve uygun ameliyat sonrası bakım ve analjezikler (yani, püre, lactated zil'ın çözüm sıvı subkutan, 0.1 mg/kg buprenorfin 2 x 2 – 3 gün ve uygun ağırlık kontrolü için subkutan günlük ) uygun olarak yerel hayvan tesisi düzenlemeleri ve bireysel olarak kurtarma olarak değişebilir.
2. Neurosphere tahlil diseksiyon
Not: uygun steril doku kültürü yordamları izleyin.
- Enzimatik solüsyona hazırlık
- 32 mL, Earle ün dengeli tuz çözüm (EBSS) albümin ovomucoid inhibitörü içeren cam şişe ve yavaşça eriyene kadar girdap ekleyin.
- EBSS 5 mL önceden alakart papain cam şişe ekleyin ve çözülmeye 37 ° C su banyosu içinde yer. Çözüm olacak (Çözüm 1) temizleyin.
- EBSS 500 µL alıp önceden alakart DNaz konsantrasyonu 1 mg/mL (Çözüm 2) elde etmek için şişe cam ekleyin. Şişeyi ileri geri eğerek hafifçe karıştırın ve bu karışımı 250 µL çözüm 1'e ekleyin.
Not: tüm çözümleri (Çözüm 1 ve 2) yapılan doku iki adet işlenmesi için yeterlidir. Eğer daha fazla doku parçaları işleme, daha fazla çözüm hazırlık ile karşılamak.
- Doku hazırlık ve diseksiyonu
- Yer laboratuvar mendil isoflurane fare kafes içine batırılmış ve 2-3 dk buharlar tamamen fare anestezi için izin verir. Aşağıdaki nakavt, fare kafesinden çıkarmak ve bir ayak parmağı-çimdik refleks yokluğu onaylayın.
- Metal körelmiş (yani, metal kafes kartı) Hayvan ötenazi yapmak ile servikal çıkığı gerçekleştirin. Sprey cömertçe % 70 etanol ile orta arka için onun boynundan hayvan euthanized.
- Kafatası tabanında makas kafasını kesti ve bir biyo torbaya atmak için kullanın. İçinde belgili tanımlık deri kas ve vertebra kemik dağılımı (Şekil 2A) ortaya çıkarmak için geri tüm uzunluğu boyunca bir ensizyon olun.
- Her kürek kemiği medial yönünü kaldırın (i.e., kürek kemiği — yağ yastığı örten tarafından tanımlanan) ve uzak (arasında scapulae ve omurga) yumuşak doku kesmek için makas kullanın. Ayrı tamamen temel vertebral sütunun ortaya çıkarmak için.
- Omurga eğriliği, makas aynı çifti üst göğüs diyafram yerleştirin ve vertebral sütunun uzakta ekli kaburga, kas ve iç organlarda (Şekil 2B) keserek ayırmak.
- Makas kaudal vertebra deliği/ataşını ve lamina (dorsal yüzeyi) her iki tarafında intervertebral eklem kesti. Sağlam kablonun zarar vermemesi için belirli kendine iyi bak. İstenen seviyeye kadar bu işleme devam edin ve/veya kablonun uzunluğunu maruz kalmaktadır.
- Dikkatle yanal kordon spinal kord doku içine bir petri düzenli yapay serebrospinal sıvı ile aktarma önce uzanan spinal nerve(s) kesin. Örnek buz (Şekil 2C) üzerinde tutun.
- Diseksiyon mikroskop altında ~ 2 mm rostral ve kaudal yaralanma siteye eklemek omurilik doku kes. Forseps iki çift yavaşça kordon boyuna dorsal ve ventral çatlaklar boyunca 2 yarıya içine ayırmak için kullanın (Şekil 2C').
- Microscissors ile yaralı dorsolateral beyaz madde kesmek. 15 mL konik tüp içine yerleştirin.
- Bir tane tuttuğunu forseps ile omurilik yarısı alay ve beyaz madde istenen periventriküler bölge yalıtmak için spinal kord rostrocaudal ölçüde bir çift daha iyi forseps kullanarak kaldırın. Spinal kord diğer yarısı için yineleyin.
- Periventriküler doku parçaları ayrı 15 mL konik tüpler içine yerleştirin. Hafifçe konik tüpler duvara karşı doku kıyma ve microscissors kullanın.
Not: Doku ayrılma değişiklikler Papain ayrılma sistemi Protokolü23 ve yukarıda açıklanan doku hazırlık işlemleri24vardır. - Yeni çözüm 1 (adım 2.1.3) 2.5 mL için doku örneği ekleyin ve bir rock'çı 30 dk 37 ° C'de yerleştirin.
- Yavaşça 1.000 µL pipet ucu ile çözümde doku triturate. 300 x g RT., 5 min için de bulutlu hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi
- Earle ün dengeli tuz solüsyonu, ovomucoid inhibitörü çözüm (adım 2.1.1) 300 µL 2.7 mL ile çözüm 3 hazırlamak ve 150 µL DNaz, ben çözüm (adım 2.1.3).
- Süpernatant adım (adım 2.2.13) iptal et ve önceki adımdaki (adım 2.2.14) çözüm 3 1.5 ml resuspend.
- Bu yeni hücre süspansiyon (adım 2.2.15) 5 mL ovoimucoid inhibitörü çözeltisi (adım 2.1.1) kesintili yoğunluğu gradyan oluşturmak için yeni bir 15 mL tüp konik üst katman. Dik, 5 min için 300 x g , santrifüj
- Süpernatant atın ve 2 mL neurobasal medya resuspend. 3 dk RT. az için 300 x g , santrifüj
- Süpernatant atın ve 1 mL neurobasal medya resuspend. 4 mL 5 mL toplam hacmi için medyanın ardından 20 µm hücre süzgeç kullanarak süspansiyon filtre.
- Kaplama
- Neurobasal medya ile epidermal büyüme faktörü (20 ng/mL) ilave tarafından neurosphere büyüme için kültür ortamı hazırlamak / fibroblast büyüme faktörü (20 ng/mL) / heparin (2 µg/mL) [için kesin NSCs] veya [için ilkel NSCs] leukemina inhibitör faktörü (10 ng/mL). Her iki medya 10 mL 25 mL doku kültürü şişesi ekleyin.
- Bir hemasitometre ve Trypan mavi boya süspansiyon (adım 2.2.18)25hücrelerde sayısını hesaplamak için kullanın. Bir kez hesaplanır, doku kültürü şişeler (adım 2.3.1) hazırlanan hücreleri eklemek klonal yoğunluğunun eklenen hücreleri ile 10 hücre/µL ve yer doku kültürü şişesi içine kuluçka makinesi 24 h (37 ° C, % 95 nem oranı, % 5 CO2) için.
Not: Sayım tekniği örneği aşağıdaki gibidir: Trypan mavi boya 10 µL ile hücre süspansiyon ve mix al 10 µL. Bu karışımdan 10 µL bir hemasitometre ekleyin. 10 X ışık mikroskobu altında canlı hücreleri sayı ve 4 / 4 x 4 çeyrek dairelerin içinde sayılan tüm hücreleri toplayın. Formülünü kullanın: 100.000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1.000] hücre süspansiyon her 25 mL doku kültürü şişeye klonal yoğunluğu (10 hücre/µL) sağlamak için kaplama hacmi vermek. - 24 h sonra yavaşça şişeye girdap ve içeriği 15 mL konik tüp içine dökün. Dik, 5 min için 300 x g , santrifüj
- Süpernatant atın ve 1-2 mL taze neurobasal medya hücrelerde yeniden askıya alma.
- 2.3.2 500 µL her onların anılan sıraya göre mitojenle takıma medya (EFH kesin NSC büyüme için) ve ilkel NSC büyüme için LIF içeren bir 24-iyi doku kültürü plaka klonal yoğunluğu, süspansiyon ve plaka hücrelerde hücre sayısını saymak için adımları yineleyin.
Not: x 2 x 10 x 1.000 adapte formülü (5000 / [hücre/4 X) kullanın) her şey 500 µL medya içeren kaplama için hücre süspansiyon hacmi hesaplamak için. - 7 gün boyunca da kuluçka (37 ° C, % 95 nem oranı, % 5 CO2) büyümeye hücreleri içeren tabak koyun.
- Sayma
- 7 gün içinde kültür plakaları kaldırmak ve ışık mikroskop altında görüntüleyin. Neurospheres olan küresel kolonileri sayarak ölçmek > dNSCs kültürler için çapı 80 µm ve > 50 µm çapı pNSCs kültürler için.
Not: arzu edilirse, neurospheres daha fazla pasajlı26 olabilir veya Ayrıştırılan. Hücreleri artık gerekiyorsa, orta renk sarı döner böylece hızlandırılmış hidrojen peroksit wells (yaklaşık 1 mL) 20 dk için ekleyerek atın. Sonra atın.
- 7 gün içinde kültür plakaları kaldırmak ve ışık mikroskop altında görüntüleyin. Neurospheres olan küresel kolonileri sayarak ölçmek > dNSCs kültürler için çapı 80 µm ve > 50 µm çapı pNSCs kültürler için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ameliyat, kuyruk ve olası hind-bacak taraflidir için en fazla 24 saat içeren en az motor açıkları fareler deneyim gerekir. Bu saatten sonra fareler hiçbir hind-felç ve/veya taraflidir ve minimal değişiklikler yürüyüş deneyim gerekir.
Şekil 3 5 gün en az Medulla Spinalis Yaralanmalarında temsilcisi neurosphere tahlil sonuçlarını gösterir. DNSC elde edilen neurospheres (EFH içinde yetiştirilen) kesin rakamlar yaralanma sonra pNSC elde edilen neurospheres (LIF içinde yetiştirilen) sayıda büyüktür (Şekil 3A ve 3B, sırasıyla). Kesin neurosphere (Şekil 3 c) ve ilkel neurosphere (şekil 3D) daha yüksek güç görüntülerini kesin neurospheres çapı (≥80 µm) ve genellikle daha büyük olmak bu farklı koloniler görünümünü farklılıkları ortaya büyük bir karanlık merkezi olan. İlkel neurospheres asgarî içinde büyüklük (≥50 µm) ve hücreleri daha sıkı paketlenmiş. Yaralı kord farklı bölgelerinden gelen doğan neurospheres temsilcisi sayıda Şekil 3E (definitives) ve 3F (ilkel) görülür. Çok az bilim önemli bir artış yaralanma düzeyde merkezi kanaldan yetiştirilen neurospheres neden olan 3E yolunu gösterir rostral sigara yaralı kord, nispeten mütevazı bir artış ile karşılaştırıldığında.
İlginçtir, kesin neurospheres lezyon, laminektomi yalnız farelerde neurosphere oluşturan hücreleri içermeyen bir bölge sitesinden oluşturulabilir. Şekil 3F pNSCs sonrası yaralanma pNSC neurospheres lezyon sitesinde dışında benzer bir artış gösterir. Bu nedenle, sadece dNSCs bu saat ders sonrası yaralanma yaralanma siteye geçirmek mümkün.
Şekil 1: cerrahi müdahale. (A) her şeyi yerleşimini gerekli, numaralandırılmış referans için. (B) A resim fareyi düzleştirdiğiniz bir vücudu, omurga ve bacaklarda stereotaksik bir cihazın dağılın ve torasik destek kemer altına yerleştirilen birlikte bantlanmış. (C) A resim kas katmanı ve omurga kontur ortaya bir dikey cilt kesi ile fare. Fare vücut kas insizyon ve pozlama ve yalıtım traktör ile omurga sonra (D) A resim. Gergin kas tabakaları yırtılma bir eksikliği ile unutmayın. (E) A resim izole fare omurga omur (3 parça) kemik yüzeyine gösterilen kaldırıldı, kas tabakaları ile. Bu da spinöz proses ve muhtemelen intervertebral ortak ve kaldırılacak orta omur lamina gösterir. (F) A resim görünür omurilik sonrası laminektomi. Etiketli dorsal orta hat damar var. Fare ile ikili iğne parça yaralanmaları dorsal orta hat ven her iki tarafında (G) A resim. 30 G iğne 45° bükülmüş milinin bir yakın çekim eklemek vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: omurilik diseksiyon. Üç fare ile sırt kas ve rostral ve kaudal yönünü gösteren izole vertebral sütun vertebra kemik kontur (B) A resmi ortaya çıkarmak için cilt ensizyon (A) A resim. İkinci resim kordon yalıtım gösterir ve üçüncü bir kabında izole spinal kord gösterir. (C) A spinal kord, nerede farklı kesimleri (periventriküler, yaralanma alan) kaldırılır ve kültür için ayrılmış ince diseksiyon grafik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: temsilcisi en az Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip neurosphere tahlil sonuçları. (A)(EFH içinde yetiştirilen) dNSC elde edilen neurospheres yaralı omurilik kültürlü numaralarını büyüktür ne zaman eşit yoğunluğuna kaplama (B) pNSC elde edilen neurospheres (yetişen LIF) sayısı. (C, D) (C) dNSC ve (D) pNSC kültürler içinde "tipik" neurospheres daha yüksek güç görüntüleri. (E) en az iğne yolu yaralanma dNSC elde edilen neurospheres merkezi kanal yaralanma düzeyde yanı sıra merkezi kanal için yaralanma rostral ve yaralanma sitesi sayısında önemli artışlar sonuçlanır. (F) pNSC elde edilen neurospheres zarar görmemiş kablosunu izole olamaz ama yaralanma (düzeyinde yaralanma ve rostral merkezi kanaldan) Merkezi kanaldan takip ayrılmış olabilir. Hata çubukları standart hata ortalamaya temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cerrahi işlem sırasında nerede araştırmacı belirli en iyi sonuçları elde etmek ve hayvanlar arasında değişkenlik en aza indirmek için özen birkaç önemli adımlar vardır. Anestezi nöroprotektif etkileri uzun süre maruz27olduğu gösterildiği gibi (isoflurane) inhale anestezi ile ameliyat sırasında özen göstermelidir. Buna göre omurilik yaralanma takip yeniden üretim kapasitesini okurken kadar hızlı ve verimli karıştırıcı değişkenleri önlemek için mümkün olduğunca ameliyat için çaba göster. Aynı isoflurane çekim hızı fare başına Bakımı değişkenliği azaltır. Fare solunum hızı çok yavaş olmamalı ve ameliyat takip edilmelidir (1 nefes her 2-3 s) veya ağır zahmetli (yani, nefes nefese). İdame dozu anestezi % 2-3 Not alt dozaj alınan farelerin uzun süreli anestezi nedeniyle ölüm önlemek için indirdi.
Ameliyat sırasında kas insizyon vertebral sütunun her iki tarafında yaparken ekstra bakım katın. Derin kesikler ve böylece sırasında kas kesi kemikli vertebra karşı bıçak kenarına dayanmalıdır bıçak da açılı emin olun. Bıçak dışa doğru açılı ise aşırı kanama vasküler kesim imkanı. Araştırmacı Ayrıca ilave spinal kord zarar verir makas derin olta balıkçılığı önlemek için laminektomi gerçekleştirirken istenmeyen doku hasarı ve fonksiyonel açıkları neden önem vermelisiniz. Bu deneyler için uygun denetimi sadece laminektomi yol açabilir iğne parça yaralanma bu aksine atfedilen NSCs aktivasyonu karşılaştırmasını sağlayacak bir "sadece laminektomi" (hiçbir yaralanma), grubudur. Biz yalnız bu laminektomi NSC harekete geçirmek küçük, önemsiz de olsa bir artış neurosphere numaraları periventriküler bölge lezyon21düzeyinde bir artış ortaya neden olabilir göstermiştir. Laminektomi yalnız artar neurosphere sayılarda periventriküler bölge rostral veya kaudal laminektomi için neden olmaz ve hiçbir neurospheres kültürleri beyaz laminektomi düzeyinde izole madde bulunur. Ayrıca, laminektomi gerçekleştirirken, dorsal lamina kablosunun geniş maruz kalma izni için tek parça halinde kaldırmak için özen gösterin. Bu (1) en az iğne parça yaralanma, dorsolateral spinal kord gerçekleştirmek yeterli erişim izin ve (2) kemik parçalarını yaptı ve fare kapanması ve sonrası kurtarma hareket takip ikincil zarar önlemek. Tüm lamine tek parça olarak alınmaz veya keskin kemik laminektomi her iki tarafındaki çıkıntılı kesimleri gözlenir, aletleri (örneğin dişli forseps ve eğri makas) dikiş önce bu parçaları kaldırmak için kullanın.
Araştırmacı dikiş cerrahi kapatılması sırasında kas katmana uygularken son derece dikkatli olmalıdır. Böylece dikişi sağlam vertebra kemik üstüne yatıyor bir dikiş (çift düğümlü) laminektomi/yaralanma seviyeye kaudal yer almalıdır. Bu kurtarma sonra fare hareket ettiğinde maruz kablosu ile temas halinde olmak kas dikiş neden olabilir herhangi bir ikincil hasarı önlemek içindir. Ayrıca, kas dikiş laminektomi/yaralanma kaudal nerede SCI omurilik analiz için izole zaman gerçekleştirildi için bir dönüm noktası olarak görür. Yaralı omurilik bölgeyi dissekan zaman diseksiyon mikroskop altında ince diseksiyon sırasında kadar tanınabilir kalabilmeniz yaralı bölgesinin yapısını ödün önlemek için özen gösterilmelidir. Neurosphere tahlil açısından hafifçe hücre ölümü artırabilir hava kabarcıkları üretimini önlemek için hücre Pellet mekanik toz gerçekleştirmek önemlidir. pNSC elde edilen neurospheres enkaz ağır, büyüme koşullarına daha da hassas — aşırı toz ve enzimatik çözümlerinde uzun süre maruz — dNSC kültürler göre. pNSC türetilmiş küreler daha kompakt ve dNSCs daha küçük. PNSCs nadir göz önüne alındığında, örnek başına en az 240.000 hücreleri izole öneririz.
En az SCI modeli yaralanma (gibi endojen NSCs aktivasyonu) takip hücresel olaylar eğitim için ideal olmakla beraber işlev bozuklukları çalışma izin vermez. Daha önce belirtildiği gibi iğne parça sakatlıktan kurtarmak fareler kalıcı hiçbir önemli davranış açıkları deneyim ve bu nedenle, fareler fonksiyonel sonuçları artırmak için tasarlanmış tedavi müdahalelerin etkinliğini için değerlendirilemez. Rejeneratif tıp bir önemli yönü olan bir tedavi sadece (Bu neurosphere tahlil, soy izleme ve immünhistokimya/ayirt ile birlikte bu modeli kullanarak değerlendirilebilir) doku onarımı teşvik etmelidir değil ki ama Ayrıca davranışsal paradigmalar kullanarak ilgili fonksiyonel iyileşme göstermelidir. Davranışsal görevleri fonksiyonel sonuçları ayak hatası test ve Basso, Beattie, Breshnan (BBB) açık alan lokomotor ölçeği28, gibi yaralanma göğüs modelleri sınamak için kullanılan bir dizi ölçülebilir açıkları bizim en az algılamak için duyarlı değildir SCI modeli. Bu eksiklik üstesinden gelmek için bir yapabilirsiniz birden çok parametre asgari algılayabilir yürüyüş analizleri de dahil olmak üzere brüt ve ince hind-bacak hareket parametreleri ölçen daha hassas dijital skorlama sistemleri (Örneğin, podyum) kullanımı en az sakatlıktan kaynaklanan açıkları29modeli.
Bu yöntem aynı zamanda endojen NSC etkinleştirme servikal Medulla Spinalis Yaralanmalarında modellerinin potansiyel bir tedavi olarak çalışmaya adapte. Servikal SCI en klinik bir model ve önerdiğimiz bu yaralanma modeli yüksek vertebra kesimine adapte olup olmadığını görmemizi sağlayacak NSCs ve onların Döl (kinetik, geçiş, yanıt olarak bölgesel varyasyon vardır farklılaşma) ve lezyon daha derin ve ölçülebilir fonksiyonel açıkları neden olur. Şu anda kullanılan fare servikal yaralanma modeller (örneğin transeksiyon, küçük resim sıkıştırma ve/veya kontüzyonu) el ile mesane hızlı ve sürekli nefes fare izlemek için gereken de dahil olmak üzere yoğun ameliyat sonrası bakım gerektirir. Servikal spinal kord en az yaralanma modeline adapte mortalite, morbidite ve ameliyat sonrası bakım servikal diğer SCI modelleri ile ilişkili azaltmak gibi bir uyuşturucu/küçük moleküller ve/veya rehabilitasyon etkinliğini incelemek için izin Sinirsel kurtarma sonuçlar. Bizim yaralanma modeli de en az bir yaralanma kordon (yani, dorsal veya yan sütun) ve/veya daha büyük yaralanmalar daha derin penetrasyon ile farklı parçaları ve/veya daha büyük ölçekli iğneler (daha küçük ölçer) kullanımı oluşturmak için adapte edilebilir. Bu denetim/lezyon boyutunu ve türünü işlemek ve böylece hücresel ve fonksiyonel/davranış kurtarma buna göre değerlendirmek araştırmacı sağlar.
Fareler en az yaralanma modelinde transgenik hayvan modelleri kullanımına izin verir. Fare modelleri endojen kök hücre ve/veya yaralanma önce ataları etiketlerine göre etkinleştirin. Bu araştırmacı yaralanma takip bu önceden etiketli hücreleri kaderi izlemek ve sinirsel habercisi hücre çoğalması, geçiş ve yaralanma takip farklılaşma değerlendirmek izin verebilirsiniz — potansiyel olarak katkıda bulunan sinir onarımı için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser (çalışma hibe CMM) Krembil Vakfı tarafından finanse edilmektedir. WX Carlton Marguerite Smith Öğrenci Ödülü alıcı oldu. NL bir Ontario lisansüstü öğrenim bursu aldım.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30 G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25 G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1 mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3 mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1 M, 9.01 g in 100 mL dH2O |
| 1 M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155 mM, 1.30 g in 100 mL dH2O |
| 155 mM NaHCO3 | |||
| 1 M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100 mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5 mL Hormone Mix and aliquoted into 20 μL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2 M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69 g in 100 mL dH2O |
| 1 M KCL | Sigma | P5405 | 7.46 g in 100 mL dH2O |
| 1 M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g in 100 mL dH2O |
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g in 100 mL dH2O |
References
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
- Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
- Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
- Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
- Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
- Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports - UK. 7, (2017).
- Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
- Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
- Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
- Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
- Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
- Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
- Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
- Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
- Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/PDS/default.html (2018).
- Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
