Summary
여기, 예비 중앙 운하 틈새 주택 내 인 성 신경 줄기 세포 (NSCs) 성인 마우스에서 최소한의 척수 상해 모델의 성능을 보여 줍니다. 우리는 활성화 및 마이그레이션 고 원시적인 NSCs 부상 다음의 척도를 neurosphere 분석 실험을 사용 하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
성인 포유류 척수에서 신경 줄기 세포 (NSCs)는 공부 생체 외에서 neurosphere 분석 결과 사용 하 여 될 수 있는 뇌 세포의 상대적으로 mitotically 무부하 인구. 이 식민지 형성 분석 결과 접시;에 외 인 요인 NSCs의 반응을 하는 강력한 도구 그러나,이 또한 힘의 적당 한 이해 및 분석 결과의 한계 vivo에서 조작의 효과 연구를 사용할 수 있습니다. 임상 관심의 한 조작 생 NSC 활성화에 상해의 영향 이다. 척수 상해의 현재 모델 제공이 줄기 세포가 있는 상해의 사이트에 NSC 틈새의 파괴를 일으킬 하는 일반적인 타 박상, 압축, 및 transection 모델의 심각도 공부에 대 한 도전. 여기, 우리는 성인 마우스 척수의 낮은 흉부 수준 (t 7/8)의 표면 dorsolateral 표면에 지역화 된 손상을 초래 하는 최소한의 부상 모델을 설명 합니다. 이 부상 모델 상해의 수준에서 중앙 운하를 예비 하 고 부상에 따라 다양 한 시간 지점에서 병 변의 수준에 있는 NSCs의 분석 합니다. 여기, 우리가 어떻게 neurosphere 분석 결과 척수 뇌 영역-기본 및 최종 NSCs에 있는 NSCs의 두 개의 별개, 직계-관련, 인구의 활성화 연구에 이용 될 수 있다 표시 (pNSCs와 dNSCs, 각각). 상해 및 백색 질 부상 사이트의 수준에서 뇌 영역에서 이러한 NSCs 문화를 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 수술 후 척수 해 우리의 pNSC 및 부상된 코드 컨트롤, 상해를 통해 그들의 활성화를 말하기에 비해 뇌 영역에서 dNSC에서 파생 된 neurospheres의 증가 수 보여줍니다. 또한, 부상, 다음 dNSC에서 파생 된 neurospheres 격리 될 수 있습니다 부상 사이트에서-상해의 사이트에 그들의 뇌 틈새에서 마이그레이션할 NSCs의 능력을 보여주는.
Introduction
중앙 신 경계 모든 다른 성숙한 신경 세포 유형1,2,,34를 수 있는 자체 갱신, multipotent 줄기 세포의 부분 모집단을 포함 되어 있습니다. 이러한 신경 줄기 세포 (NSCs) 뇌와 척수에서 전문된 틈새에 있으며 증식, 마이그레이션, 성숙한 신경 세포로 분화 하는 부상에 따라 활성화 될 수 있다. NSCs 및 그들의 자손 대뇌 피 질의 부상 모델5,6부상 사이트로 마이그레이션할 표시 되었습니다. 두뇌에 있는 NSCs 측면 심에서 그들은 이다 glial 흉터 대형7을에 분화 상해의 사이트에 마이그레이션할 표시 되었습니다. 그러나 척수,, 몇 가지 연구 수행 되었습니다 다음 척수 상해 회복을 촉진 하이 같은 생 NSCs를 다룰 수 있습니다 경우에 게. 실제로, 현재 논쟁이 있다 활성화는 척수에 줄기 세포 수영장의 중앙 운하8 안 감 뇌 틈새의 직접적인 물리적 손상에 필요한 지 여부 또는 경우는 척추에 손상을 코드 실질 (줄기를 떠나 그대로 셀 틈새)은 생 NSCs9활성화 충분 합니다.
척수 상해 (SCI) 모델의 수는 급성과 만성 부상의 병 태 생리학을 공부 하 이용 되었다. 이 모델 또한 neuroprotection, immunomodulation, 개발 세포 이식/대체 전략10,,1113를 통해 SCI를 치료에 잠재적인 치료를 테스트에 사용 되었습니다. 현재 모델에는 코드14,15에서 대규모 기능적인 적자 뿐 아니라 광범위 한 병 변 및 현상을 일으킬 압축 및 타 박상 부상 포함 됩니다. 결과 glial 흉터는 대부분 척수16의 너비/둘레의 함께 여러 척추 세그먼트를 확장할 수 있습니다. 따라서, 이러한 모델은 임상 관련, 그들은 줄 부상 다음 생 NSCs의 응답을 공부 하 고 중요 한 과제. 중앙 채널17을 마련할 수 있는 상해의 온화한 형태를 적용할 수 있습니다 부상의 화학 모델을 확인 하 고 있습니다. 그러나, 이러한 유형의 부상 demyelination SCI와 관련 된에 초점을 하 고 하지 임상 관련 모델 외상 문화와 관련 된 물리적 또는 기계적 손상에 대 한
현재 부상 모델의 한계를 해결 하기 위해 우리는 바늘 트랙 최소한의 과학 모델, 원래는 쥐9, 성인 마우스 모델에서 응용 프로그램에 대 한 개발을 적응 시켰다. 우리의 적응된 부상 모델 마우스 척수의 dorsolateral 지역의 일관 된 병 변을 만들 수 있으며 상해의 수준에 중앙 운하 예비. 이 모델의 장점은 NSC 속도 론 연구 허가 상해 및 그들의 잠재적인 방사형 마이그레이션 상해의 사이트에 다음. 마우스 모델의 사용 또한 생 NSCs와 부상에 따라 그들의 자손의 혈통 추적을 허용 하는 유전자 변형 마우스의 사용을 허용 합니다. 생체 외에서 neurosphere 분석 결과이 프로토콜에 도입의 수정 된 양식을 사용 하 여 NSCs의 속성 평가 추가 수 있습니다.
Neurosphere 분석 결과 생체 외에서 식민지 형성 분석 결과 mitogens 존재 NSCs의 격리를 허용 하는. 클론 도금 밀도에서 개별 NSCs NSCs의 작은 부분 모집단 및 창시자18,19의 대부분의 구성 하는 셀의 부동성 구형 식민지를 확산. 우리의 프로토콜에서 척수의 뇌 영역에서 두 개의 별개, 직계 관련 NSCs의 설명-초기 조건 하에서 그리고 우리의 최소한의 과학 모델에 따라. 확실 한 신경 줄기 세포 (dNSCs) 익스프레스 nestin 및 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP)와 표 피 성장 인자 (EGF), 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF) 및 헤 파 린 (함께 불리 EFH)20의 성장 된다. 이러한 dNSCs 거의 neurospheres에 시험관에게 상승을 주는 순진한 척수에 드물다. 그러나, 우리는 dNSCs 다음 최소한의 과학, 뇌 지역21에서 분리 된 neurospheres의 숫자를 확대 활성화 됩니다 보여줍니다. 기본 신경 줄기 세포 (pNSCs)은 신경 줄기 세포 계보에서 dNSCs의 업스트림. pNSCs의 pluripotency 마커 Oct4, 상당히 드문, 익스프레스 저급 고 백혈병 금지 요인 (LiF) 응답22. pNSCs neurospheres 주 문화;에 있는 myelin 기본적인 단백질 (MBP)의 존재로 인해 성인 마우스 척수에서 격리 때 형성 하지 않는다 그러나, pNSC neurospheres MBP 결핍 생쥐에서 격리 될 수 있습니다 및 그들의 숫자는 확장된 다음 부상-dNSCs21비슷합니다. 마지막으로, 우리 보여 dNSC에서 파생 된 neurospheres 일찍 최소한의 영향은 다음 번에 상해에의 사이트에서 고립 될 수 있다 이러한 결과 우리의 부상 모델 및 분석 실험 그들의 능력을 확산 하 고 부상에 대 한 응답에서 마이그레이션할 같은 뇌 NSCs의 활성화 특성을 평가할 수 있습니다 보여 줍니다.
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Protocol
이 프로토콜 토론토 대학에서 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었다 하 고 "가이드에는 관리 및 사용의 실험 동물"은 (2차 버전, 동물 관리에 캐나다 위원회 2017).
1. 최소한의 척수 상해 수술
참고: 수술 전에 있는지 확인 하십시오 모든 수술 기구와 자료 (그림 1A)는 적절 한 방법으로 살 균 된다.
- 거 즈의 4-5 사각형을 고를 거 즈의 고정된 롤 중간에 그들을 함께 찍고 여 흉부 지원 아치를 구축 합니다.
- 유도 챔버에 마우스를 놓고 5 %isoflurane 마 취를 시작 합니다. 진행 하기 전에, 뿐만 아니라 절차 전체 발가락 핀치 반사의 부재를 확인 합니다. 으로 수술 완료 하는 데 30 분 이상 걸릴 수 있습니다, 5% (5 분)와 남은 시간 2-3%에서 최소 isoflurane 노출에 대 한 최적화.
- 코 콘 2-3 %isoflurane 유지 보수 복용량 마 취 기계에 연결 된 마우스를 전송 합니다. 발기를 사용 하 여 중간 다시 목/귀 수술에 대 한 피부의 넓은 직사각형 영역을 노출 하에서 동물의 등에서 털을 제거 하.
- 연결 된 원뿔에 그것의 코를 놓고 귀 바 두개골 안정화 stereotaxic 악기를 마우스를 전송. 마우스 stereotaxic 장치에 고정 되 면 5%에서 isoflurane 귀 바 및 2-3%를 다시 배치 하는 동안 유지 합니다.
- Intraperitoneally 수술 전 진통 약물 관리-Meloxicam (2.0 mg/kg). 아낌없이 눈 윤 활 때 취 각 막 건조 방지 하기 위해 오픈 마우스 눈에 적용 됩니다.
- 꼬리의 기지에 가볍게 당겨서 마우스 신체 및 척추 교정 하는 동안 마우스 복 부 아래 흉부 지원 아치를 놓습니다. 실험실 라벨 테이프를 사용 하 여 꼬리와 스타 같은 위치에 모든 확장된 사지. 일단 보안, 흉부 지원 아치 rostrally,에서 밀어 위쪽 흉부 쪽으로 마우스 복 부-소품 흉부 척추 (그림 1B)를 위해.
- Povidone-요오드 뒤 70% 에탄올, 단계 1.3에서에서 준비 모피 잘린 피부 영역을 소독 하 여 무 균 수술 필드를 준비 합니다. 두 번 반복 합니다. 넓은 살 균 분야를 유지 하는 불 임 수술 드 레이프를 적용 합니다.
- #10 메스 블레이드를 사용 하 여, 수직 절 개를 두 어깨에 날개의 중간 지점에서 동물의 종 축에 평행 하 게 흉부 척추의 곡률. 피부 연 조직와 척추 컨투어가 (그림 1C)을 철회.
- (이 정하는 T4/5 척추 수준) suprascapular 지방 패드의 아래쪽 테두리를 식별 합니다. 동일한 #10 블레이드, 신중 하 게 하지만 강제로 잘라 양쪽 열에서 다시 근육 힘 줄을 분리 하려면 척추 뼈 T5-T8/9.
- 척추의 양쪽에 절 개 사이트에 견인 기의 치아를 삽입 합니다. 충분히 끌어 넣어진된 근육 층 (그림 1D)에 너무 많은 부담을 주지 않고 척추를 상승 견인 기를 확장 하 여 노출을 조정 합니다.
- 수술 현미경 잔여 근육과 척추 뼈 (그림 1E) 노출를 overlying 다른 부드러운 조직 청소 신중 하 게. 이빨된 집게와 척추의 spinous 프로세스 clasping 약간 최대 그것을 이동 하 여 제거 되 고 아래로 척추를 식별 합니다.
참고:이 척추 관절의 id를 허용 하 고 관심의 척추 아래 작은 구멍 (척추 foramina)을 노출 해야 합니다. - 곡선 무딘가 위 한 머리, excised를 척추 lamina에 꼬리 노출된 척추 구멍의 양쪽에 삽입 하 고 양측 연결 척추 관절을 잘라.
- lamina를 위쪽으로 들어올리고 격리 하 고 뼈를 제거 lamina의 위 첨부 파일을 차단 합니다.
참고:이 그대로 듀 럴 색 들어 있는 척수 (그림 1 층)을 노출 합니다. 과도 한 있을 수 있습니다 영향을 받는 지역에 1 cm x 1cm 거 즈 precut를 배치 하 여 통제 될 수 있다 출혈 또는 살 균 PBS로 세척. - 랜드마크 역할 등 중간 정 맥 (바늘 베벨 위쪽으로 향하게)와 30 G 바늘 팁의 45 ° 구부러진된 샤프트는 중간의 어느 한쪽에 약 0.5 m m 측면에서 척수 (대략 1 밀리미터 깊은)의 dorsolateral 표면으로 삽입.
- 이동 ~ 2 m m 바늘 꼬리에서 rostral는 중간에 (병렬로) 바늘의 베벨의 전체 길이 코드에 삽입 됩니다. 항목 (그림 1G)의 경로 통해 되돌아 바늘을 제거 합니다.
참고: 아무 출혈 해야 하지만이 단계에서 척추 조직의 붓기를 볼 수 있습니다. - 상처를 닫으려면 견인 기를 제거 하 고 6-0 흡수 봉합 사를 사용 하 여 중간에 함께 상해의 양쪽에 다시 근육을 봉합 합니다. 4-0 살 균 실크 봉합 사를 사용 하 여 이후에 overlying 피부를 닫습니다.
- 면봉의 끝을 사용 하 여 수술 후 감염을 방지 하기 위해 표면 sutured 스킨의 상단에 항생제 연 고를 적용 합니다. 0.1 mg/kg 피하 체액 (lactated 벨의 솔루션의 1 mL)을 함께 Buprenorphine의 수술 후 진통제를 관리 합니다.
- Isoflurane 기화 기 및 산소를 해제 합니다. 없는 침구와 깨끗 한 장에 장소와 stereotaxic 장치에서 마우스를 제거 합니다.
- 케이지 마 취와 모니터 동작을 보 니 다음에서 복구에 대 한 열 램프에서 약 30 ㎝에에서 마우스를 놓습니다. 마우스 해야 5-10 분 이내 그리고 가능한 paresis 또는 깨어 있는 시 꼬리 약점 뒷 다리-다리 기능.
- 앞으로 몇 일 동안 마우스 동작을 모니터링 하 고 적절 한 수술 치료 및 진통제 제공 (즉, 매 시, 벨의 솔루션 유체 피하, 0.1 mg/kg buprenorphine 2 lactated 매일 피하 2-3 일, 그리고 적절 한 무게 모니터링에 대 한 x )에 따라 현지 동물 시설 규정을 개별적으로 복구로 다를 수 있습니다.
2. Neurosphere 분석 결과 해 부
참고: 적절 한 무 균 조직 문화 프로시저를 따릅니다.
- 효소 솔루션 준비
- 알 부 민 ovomucoid 억제제 포함 하 유리 병 및 부드럽게 녹아 때까지 소용돌이를 32 mL의 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS)를 추가 합니다.
- 미리 나누어진된 papain 유리 유리병에 EBSS의 5 mL을 추가 하 고 해산 하는 37 ° C 물 목욕에. 솔루션이 될 것 이다 (솔루션 1) 취소.
- EBSS의 500 µ L 고 나 유리 유리병 (솔루션 2) 1 mg/mL의 농도를 미리 나누어진된 DNase를 추가. 유리병을 앞뒤로 기울이기로 아주 부드럽게 혼합 하 고 추가이 혼합물의 250 µ L 솔루션 1.
참고: 모든 솔루션 만든 (솔루션 1과 2) 조직의 두 가지의 처리를 위해 충분 하다. 조직의 처리 하는 경우 더 많은 솔루션 준비와 수용.
- 조직 준비 및 해 부
- 실험실 정리 마우스 케이지에 isoflurane에 배어 장소와 완전히 마우스 anesthetize에 증기에 대 한 2-3 분을 허용. 다음 녹아웃, 케이지에서 마우스를 제거 하 고 발가락 핀치 반사의 부재를 확인.
- 자 궁 경부 전위 무딘 금속 개체 (즉, 금속 케이지 카드) 동물 안락사를 수행 합니다. 스프레이 70% 에탄올과 넉넉한 중반 뒤로 그것의 목에서 안락사 동물.
- 두개골의 기지에서가 위를 사용 하 여 머리를 잘라와 바이오 가방에 삭제. 다시 근육과 척추 뼈 윤곽 (그림 2A) 노출의 전체 길이 따라 피부에 절 개를 중간 선을 확인 합니다.
- 각 견 갑 골의 중간 부분을 리프트 (즉., 어깨 블레이드-지방 패드를 overlying 식별)가 위를 사용 하 여 부드러운 조직 (견과 척추) 사이 버려야 하 고. 기본 척추 열을 노출 하는 완전히 별도.
- 척추의 곡률에 따라 상부 흉부 조리개가 위의 동일한 쌍을 삽입 하 고 연결 된 늑 골, 근육, 및 내부 장기 (그림 2B) 멀리 절단 하 여 척추 열을 격리.
- 꼬리 척추 구멍/오프닝으로가 위를 삽입 하 고 하기 (등 쪽 표면)의 양쪽에 척추 관절을 잘라. 그대로 코드를 손상 하지을 특정 주의 분리 했습니다. 원하는 수준까지이 과정을 계속 하거나 코드의 길이 노출 합니다.
- 조심 스럽게 잘라 옆으로 척수 조직 일반 인공 척수와 페 트리 접시에 전송 하기 전에 코드에서 확장 하는 spinal nerve(s). 얼음 (그림 2C)에 샘플을 유지.
- 해 부 현미경 척수 조직 포함 ~ 2 mm rostral와 부상 사이트에 꼬리를 잘라. 집게의 두 쌍을 사용 하 여 부드럽게 경도 등 쪽과 복 부 균열을 따라 2 반으로 코드를 분리 (그림 2C').
- Microscissors, 부상된 dorsolateral 백색 질 밖으로 잘라. 15 mL 원뿔 튜브에 조각을 넣으십시오.
- 들고 겸,으로 아래로 척수의 절반 애타게 하 고 원하는 뇌 영역을 분리 하는 척수의 rostrocaudal 범위에 따라 미세 집게의 다른 쌍을 사용 하는 백색 물질을 제거. 척수의 나머지 절반에 대 한 반복 합니다.
- 별도 15 mL 원뿔 튜브로 뇌 조직의 조각을 놓으십시오. Microscissors를 사용 하 고 조심 스럽게 말하다 원뿔 관의 벽에 대 한 조직.
참고: 조직 분리 수정 Papain 분리 시스템 프로토콜23 , 앞에서 설명한 조직 준비 절차24에서 있습니다. - 조직 샘플을 새로운 솔루션 1 (2.1.3 단계)의 2.5 mL을 추가 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 로커에.
- 부드럽게 1000 µ L 피 펫 팁 솔루션에서 조직 triturate. 실시간에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 흐린 세포 현 탁 액을 원심
- 얼의 균형 소금 솔루션, ovomucoid 억제제 솔루션 (2.1.1 단계)의 300 µ L의 2.7 mL 솔루션 3 준비와 DNase의 150 µ L 내가 솔루션 (2.1.3 단계).
- 단계 (단계 2.2.13)에서 상쾌한 삭제 하 고 이전 단계 (단계 2.2.14)에서 솔루션 3의 1.5 ml resuspend.
- 이 새로운 세포 현 탁 액 (단계 2.2.15) 불연속 밀도 그라디언트를 만들 새로운 15 mL 원뿔 튜브에 ovoimucoid 억제제 솔루션 (2.1.1 단계)의 5 mL 위에 레이어. 실시간에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기
- 상쾌한 삭제 하 고 neurobasal 미디어의 2 mL에 resuspend. 실시간에서 3 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기
- 상쾌한 삭제 하 고 neurobasal 미디어의 1 mL에 resuspend. 서 스 펜 션 뒤에 5 mL의 전체 볼륨에 대 한 미디어의 4 mL 20 µ m 셀 스 트레이너를 사용 하 여 필터링 합니다.
- 도금
- 표 피 성장 인자 (20 ng/mL)와 neurobasal 미디어를 보완 하 여 문화 미디어 neurosphere 성장을 위한 준비 / 섬유 아 세포 성장 인자 (20 ng/mL) / 헤 파 린 (2 µ g/mL) [대 한 확실 한 NSCs] 또는 [기본 NSCs]에 대 한 leukemina 억제 요소 (10 ng/mL). 25 mL 조직 배양 플라스 크에 10 mL의 어느 미디어를 추가 합니다.
- Hemocytometer 고 Trypan blue 염료를 사용 하 여 (단계 2.2.18)25에 셀의 수를 계산 하. 일단 계산 하 고, 조직 배양 플라스 크 (2.3.1 단계)에서 준비에 셀을 추가 (37 ° C, 습도 95%, 5% CO2) 24 h에 대 한 인큐베이터에 추가 셀 10 셀 / µ L 및 장소 조직 문화 술병의 클론 밀도.
참고: 계산 방법의 예는 다음과 같습니다: 10 µ L Trypan blue 염료와 세포 현 탁 액 및 혼합의 받아 10 µ L. hemocytometer로이 혼합물의 10 µ L를 추가 합니다. 가벼운 현미경 X 10에서 라이브 셀의 숫자를 계산 하 고 모든 셀 4 x 4 사분면의 4에서 계산 합계 합니다. 수식을 사용 하 여: 100000/2 x 10 x 1000 x [(X cells/4)] 클론 밀도 (10 셀 / µ L) 되도록 각 25 mL 조직 배양 플라스 크에 도금을 셀 서 스 펜 션의 볼륨 주고. - 24 h 후 부드럽게 플라스 크를 소용돌이 고 15 mL 원뿔 튜브에 내용을 붓는 다. 실시간에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기
- 상쾌한 삭제 하 고 다시 1-2 ml 신선한 neurobasal 미디어의 세포를 중단.
- 2.3.2 펜션과 플레이트 세포 클론 밀도 500 µ L 각 그들의 각각 물질 보충 미디어 (확실 한 NSC 성장 위한 EFH) 및 기본 NSC 성장 위한 LIF의를 포함 하는 24-잘 조직 문화 접시에서에 있는 셀의 수를 세 단계를 반복 합니다.
참고: 2 x 10 x 1000 x 적응된 수식을 (5000 / [셀/4 X) 사용 하 여) 계산 잘 포함 하는 미디어의 500 µ L 각 도금을 셀 서 스 펜 션의 볼륨을. - 7 일 동안 인큐베이터 (37 ° C, 습도 95%, 5% CO2) 성장에 세포를 포함 하는 접시를 놓습니다.
- 계산
- 7 일 문화에서 다음 접시를 제거 하 고 가벼운 현미경 아래를 볼. Neurospheres는 구형 식민지를 계산 하 여 계량 > dNSCs 문화에 대 한 직경 80 µ m 및 > 50 µ m 직경 pNSCs 문화에 대 한.
참고: 원하는 경우 neurospheres passaged26 추가 될 수 또는 분화. 셀은 더 이상 필요한 경우, 매체의 색깔 노란색을 20 분 대 한 웰 스 (약 1 mL)을 가속된 과산화 수소를 추가 하 여 삭제 합니다. 다음 삭제 합니다.
- 7 일 문화에서 다음 접시를 제거 하 고 가벼운 현미경 아래를 볼. Neurospheres는 구형 식민지를 계산 하 여 계량 > dNSCs 문화에 대 한 직경 80 µ m 및 > 50 µ m 직경 pNSCs 문화에 대 한.
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Representative Results
수술, 다음 쥐 꼬리와 최대 24 h에 대 한 가능한 뒷 다리 사지 paresis 포함할 수 있는 최소 모터 적자를 경험 한다. 이 시간 후 쥐 뒷 다리 사지 마비 또는 paresis 없고 걸음 걸이에서 최소한의 변화를 경험 한다.
그림 3 에서 5 일 최소한의 척수 상해 neurosphere 분석 결과에서 대표적인 결과 보여줍니다. DNSC에서 파생 된 neurospheres (EFH 성장)의 완전 한 숫자 보다 크면 pNSC에서 파생 된 neurospheres (LIF 성장)의 숫자 부상 후 (그림 3A 와 3B, 각각). 결정적인 neurosphere (그림 3C)와 기본 neurosphere (그림 3D)의 높은 전원 이미지 하 고 더 큰 직경 (≥80 µ m)에서 일반적으로 확실 한 neurospheres와 이러한 독특한 식민지의 모양이 다른 공개 데 큰 어두운 센터. 기본 neurospheres는 더 작은 크기 (50 µ m)에 고 셀 더 긴밀 하 게 포장 된다. 부상된 코드의 다른 부분에서 발생 하는 neurospheres의 대표 번호 그림 3E (definitives) 및 3 층 (기본)에서 볼 수 있습니다. 최소한의 과학 neurospheres 상해의 수준에서 중앙 운하에서 성장에 크게 증가 하면 그림 3E 쇼 rostral 아닌 부상 코드에서 상대적으로 겸손 한 증가에 비해.
흥미롭게도, 확실 한 neurospheres 병 변, laminectomy 혼자 쥐에서 neurosphere 형성 세포를 포함 하지 않는 지역의 사이트에서 생성할 수 있습니다. 그림 3 층 pNSCs pNSC neurospheres 병 변 사이트에서 제외한 후 부상에 유사한 증가 보여 줍니다. 따라서, dNSCs만이 시간 과정 후 상해에 상해의 사이트로 마이그레이션할 수 있습니다.
그림 1: 수술. (A) 모든 레이아웃 필요한 참조 번호. 곧은 몸, 척추와 사지 stereotaxic 장치에서 마우스의 (B) 그림 밖으로 확산 하 고 흉부 지원 아치 아래 배치 함께 녹화. 근육 층과 척추 컨투어가 노출 수직 피부 절 개를 가진 마우스의 (C) 그림. (D) A 마우스 몸 근육 절 개 및 노출 및 척추 견인 기를 분리 후의 사진입니다. 찢 어의 부족으로 긴장 된 근육 층 note (E) A (3 세그먼트) 척추 골의 뼈 표면 보여주는 근육 레이어 제거, 격리 된 마우스 척추의 그림. 이 또한 spinous 프로세스와 아마도 척추 관절 및 제거할 중간 척추의 lamina를 보여줍니다. (F) A 표시 척수 후 laminectomy의 그림. 라는 등 중간 정 맥이 이다. (G) A 등 중간 정 맥의 양쪽에 양국 바늘 트랙 부상으로 마우스의 사진. 30g 바늘의 45 ° 구부러진된 샤프트의 근접 삽입이 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 척수 해 부. 다시 근육과 척추 뼈 윤곽 (B) 그림 rostral와 꼬리 방향을 보여주는 격리 된 척추 칼럼의 폭로 중간 피부 절 개를 가진 잘린된 쥐의 (A) A 그림. 두 번째 사진은 보여줍니다 코드 격리 하 고 세 번째 페 트리 접시에 격리 된 척수를 보여줍니다. (C) A 척수, 다른 세그먼트 (뇌, 상해 지역)은 제거 하 고 경작에 대 한 분리의 미세 해 부의 그래픽 표현입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 대표 neurosphere 분석 결과 다음과 같은 최소한의 척수 상해에서에서 유래한. (A) dNSC에서 파생 된 neurospheres (EFH 성장) 부상된 척수에서 경작의 숫자 보다 크면 (B) pNSC에서 파생 된 neurospheres (에서 재배 LIF)의 수 동일 밀도에서 도금 할 때. (C, D) (C) dNSC 문화 및 (D) pNSC 문화에서 "일반적인" neurospheres의 높은 전원 이미지. (E) 최소한의 바늘으로 부상 dNSC에서 파생 된 neurospheres 상해의 수준에서 중앙 운하 뿐만 아니라, 부상을 rostral 중앙 운하와 부상 사이트의 숫자에 있는 상당한 증가 발생합니다. (F) pNSC에서 파생 된 neurospheres 손상 되지 않은 코드에서 격리 된 될 수 없습니다 하지만 (수준에서 상해의 rostral 중앙 운하에서) 중앙 운하에서 상해 다음 격리 될 수 있습니다. 오차 막대는 뜻의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
외과 절차 동안 어디 연구원 동물 사이 가변성을 최소화 하 고 최적의 결과 얻기에 특히 주의 기울여야 한다 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 해야 합니다 주의 (isoflurane) 흡입된 마 취와 수술 중 마 취 장기간된 노출27와 신경 보호 효과를 표시 되었습니다로. 따라서, 부상에 따라 척수의 재생 능력, 공부를 할 때 신속 하 고 혼란 변수를 방지 하기 위해 가능한 한 효율적으로 수술을 수행 하기 위해 노력을 확인 합니다. 마우스 당 동일한 isoflurane 노출 시간 유지 가변성을 줄일 것입니다. 마우스의 호흡 속도 수술 내내 모니터링 해야 하 고 너무 느린 해서는 안됩니다 (1 호흡 매 2-3 s) 또는 무 겁 게 보람 (즉, 허 걱). 마 취의 유지 보수 복용량은 낮은 주입 받은 쥐의 메모와 함께 장시간된 마 취 때문에 죽음을 방지 하기 위해 2-3%에서 낮출 수 있습니다.
수술 중 주의 추가 척추 칼럼의 양쪽에 근육 절 개를 수행할 때. 상처는 깊은, 근육 절 개 하는 동안 뼈 척추에 대하여 휴식 하는 잎의 가장자리는 칼 날 medially 각도입니다 확인 합니다. 잎은 바깥쪽으로 직각 경우 과도 한 혈관 상처에서 출혈의 가능성이 있다. 연구원 한다 또한 주의 여분의 깊은 낚시 척수를 손상 것 이다가 위를 피하기 위해 laminectomy 수행할 때 원치 않는 조직 손상과 기능 적자 발생. 이러한 실험에 대 한 적절 한 제어 "laminectomy만" 그룹 (상해 없음), 그 반대로 laminectomy에서 발생할 수 있는 바늘 트랙 부상에 기인 하는 NSCs의 활성화의 비교 있도록 이다. 우리는 병 변21의 수준에서 뇌 영역에서 neurosphere 숫자의 증가 의해 밝혀 그 laminectomy 혼자 NSC 정품 인증에서 이라도 하 찮은 작은 증가가 발생할 수 있습니다 나타났습니다. Laminectomy 혼자 않습니다 하지 증가 neurosphere 숫자에서 뇌 영역 rostral 또는 꼬리에서 laminectomy에 원인과 아무 neurospheres 화이트 문제는 laminectomy의 수준에서 고립의 문화에서 찾을 수 있습니다. 또한,는 laminectomy 수행할 때 알아서 한 조각 코드의 넓은 노출 허용 등 lamina를 제거. 이것은 (1) 수행 dorsolateral 척수의 최소한의 바늘 트랙 부상에 대 한 충분 한 액세스를 허용 하 고 (2) 남겨진 되 고 폐쇄 하 고 복구 후 마우스의 움직임에 따라 보조 손상에서 뼈의 세그먼트 방지 합니다. 경우 전체 lamina 한 조각으로 촬영 되지 않습니다 또는 세그먼트는 laminectomy의 양쪽에 날카로운 뼈 돌기의 관찰, 악기 (이빨된 집게 곡선된가 위 등)를 사용 하 여 봉합 전에 이러한 조각을 제거.
연구원은 외과 폐쇄 동안 봉합 근육 레이어를 적용할 때 매우 조심 해야 한다. (더블 매듭) 한 봉합 봉합 그대로 척추 뼈의 위에 속 인 다 그래서 꼬리 laminectomy/상해의 수준에 배치 되어야 합니다. 이것은 복구 후 마우스를 이동 하면 노출된 코드 접촉 되 고 근육 봉합에서 발생할 수 있는 어떤 이차 손상을 방지 하기 위해. 또한, 근육 봉합 laminectomy/부상에 꼬리는 SCI 분석에 대 한 척수를 분리 하는 때를 수행 했다 랜드마크 역할을 합니다. 한다 주의 때 부상된 척수 영역을 해 부 해 현미경 미세 절 개 하는 동안 인식할 수 있는 유지 수 있도록 부상 영역의 구조를 손상 시 키 지 않으려면. Neurosphere 분석 결과 관해서는 그것은 세포 죽음을 증가 시킬 수 있는 기포의 생산을 방지 하려면 부드럽게 펠 릿 세포의 기계적 분쇄를 수행 하는 것이 중요. pNSC에서 파생 된 neurospheres 파편 무거운, 성장 조건에 더욱 민감합니다-과도 한 분쇄 및 효소 솔루션에 장기간된 노출-dNSC 문화를 기준으로. 파생 하는 pNSC 분야는 더 콤팩트 하 고 dNSCs 보다 작은. PNSCs의 희귀 한을 감안할 때, 샘플 당 240000 이상 세포를 고립 시키기 좋습니다.
최소한의 문화 모델은 셀룰러 이벤트 (예: 생 NSCs의 활성화) 상해 다음 공부 하지만 기능 장애의 연구를 허용 하지 않습니다. 앞에서 설명 했 듯이, 바늘 트랙 부상에서 재기 하는 쥐 없는 주목할 만한 행동 적자 지속 경험과 같은 기능적인 결과 개선 하도록 하는 치료 내정간섭의 효과 대 한 쥐를 평가할 수 없습니다. 재생 의학의 한 가지 중요 한 측면은 치료만 조직 복구 (neurosphere 분석 결과, 계보 추적 및 immunohistochemistry/면역 형광 검사와 함께이 모델을 사용 하 여 평가 될 수 있다)는 홍보 하지 해야 하지만 해당 되는 행동 패러다임을 사용 하 여 관련 기능 개선 또한 보여주어야 합니다. 다양 한 기능 성과 발 오류 테스트 등 바소, 비 티, Breshnan (BBB) 오픈 필드 운동 규모28, 상해의 흉부 모델에서 테스트 하는 데 사용 하는 행동 작업 우리의 최소한의 측정 적자를 검출 하기 위하여 충분히 구분 하지 않습니다. SCI 모델입니다. 이 단점을 극복 하기 위해 하나를 만들 수 있는 총 및 뒷 다리 사지 운동의 매개 변수는 최소한의 검출할 수 있는 걸음 걸이 분석을 포함 한 여러 매개 변수를 측정 하는 더 민감한 디지털 채 점 시스템 (예를 들어, CatWalk)의 사용 최소한의 상해 모델29인 적자.
이 방법은 자 궁 경부 척수 상해의 모델에 잠재적인 치료로 내 생 NSC 활성화 연구 또한 적응 수 있습니다. 자 궁 경부 SCI 가장 임상적으로 관련 모델 이며 우리가 더 높은 척추 세그먼트에이 부상 모델 적응 여부에 대 한 통찰력을 제공할 것 이라고 제안 NSCs (속도 론, 마이그레이션, 그들의 자손의 응답에 있는 지역 변이가 있다 차별화) 병 변 더 심 오 하 고 측정 가능한 기능적인 적자 발생 여부와. (Transection, 클립 압축 타 박상 등) 현재 사용 된 murine 경부 부상 모델 필요가 수동으로 방광을 표현 하 고 끊임없이 마우스의 호흡을 모니터링을 포함 하 여 집중적인 수술 치료를 필요 합니다. 경부 척수에 최소한의 부상 모델을 적응 수 있습니다 사망률, 병 적 상태와 연관 된 다른 자 궁 경부 SCI 모델 수술 치료를 줄일 뿐 아니라 약물/작은 분자 및 재활의 효과 검사 한 허용 신경 회복에 대 한 결과 우리의 부상 모델 코드 (즉, 등 쪽 또는 측면 열) 깊은 침투와 더 큰 상해의 다른 부분 또는 더 큰 크기의 바늘 (작은 게이지)를 사용 하 여 최소한의 상해를 만들에 맞게 수 있습니다. 제어/조작 유형 및 병 변의 크기 및 따라서 세포 및 기능/행동 복구를 따라 평가 연구원 수 있습니다.
최소한의 부상 모델 쥐에 유전자 변형 동물 모델의 사용을 허용합니다. 마우스 모델 생 줄기 세포는 부상 이전 창시자의 라벨을 사용 합니다. 부상에 따라 이러한 미리 표시 셀의 운명을 추적 하 고 평가 하는 신경 선구자 세포 증식, 마이그레이션, 부상에 따라 차별화 하 연구원 수-잠재적으로 신경 복구에 기여.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 Krembil 재단 (운영 보조금 CMM)에 의해 자금을. WX 칼튼 마가렛 스미스 학생 상 받는 했다. NL는 온타리오 대학원 장학금을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30 G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25 G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1 mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3 mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1 M, 9.01 g in 100 mL dH2O |
| 1 M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155 mM, 1.30 g in 100 mL dH2O |
| 155 mM NaHCO3 | |||
| 1 M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100 mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5 mL Hormone Mix and aliquoted into 20 μL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2 M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69 g in 100 mL dH2O |
| 1 M KCL | Sigma | P5405 | 7.46 g in 100 mL dH2O |
| 1 M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g in 100 mL dH2O |
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g in 100 mL dH2O |
References
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