Summary
Här visar vi prestanda för en minimal ryggmärgen skadan modell i en vuxen mus som skonar den centrala kanal nischen bostäder endogena neurala stamceller (Karolina). Vi visar hur neurosphere analysen kan användas för att kvantifiera aktivering och migration av definitiv och primitiva Karolina efter skada.
Abstract
Neurala stamceller (Karolina) i vuxna däggdjur ryggmärgen är en relativt mitotiskt quiescent befolkning periventrikulär celler som kan studeras in vitro- med neurosphere analys. Denna kolonibildande analys är ett kraftfullt verktyg att studera Karolina svar på yttre faktorer i en skål; Detta kan dock också användas för att studera effekten av in-vivo manipulationer med korrekt förståelse av styrkor och begränsningar i analysen. En manipulation av den kliniska intressen är effekten av skada på endogena NSC aktiveringen. Aktuella modeller av ryggmärgsskada ger en utmaning att studera detta eftersom svårighetsgraden av gemensamma kontusion, komprimering och transection modeller orsaka förstörelse av NSC nisch på platsen för skadan där stamcellerna finns. Här beskriver vi en minimal skada modell som orsakar lokaliserad skada på ytliga dorsolaterala ytan av lägre bröstkorg (T7/8) av vuxen mus ryggmärgen. Denna skada modell reservdelar den centrala kanalen i nivå med skada och tillåter analys av de Karolina som finns på nivån av lesionen vid olika tidpunkter efter skada. Här visar vi hur neurosphere analysen kan utnyttjas för att studera aktivering av de två distinkta, lineally-relaterade, populationerna av Karolina som är bosatta i regionen periventrikulär ryggmärgen - primitiva och slutgiltiga Karolina (pNSCs och dNSCs, respektive). Vi visar hur du isolera och kultur dessa Karolina från regionen periventrikulär skada och Vit hjärnsubstans skadan webbplats. Vår postoperativa ryggmärgen dissektioner visar ökade antalet pNSC och dNSC-derived neurospheres från regionen periventrikulär av skadade sladdar jämfört med kontroller, talar till deras aktivering via skada. Dessutom efter skada, dNSC-derived neurospheres kan isoleras från skadan webbplats — visar Karolina förmåga att migrera från sin periventrikulär nisch till platser av skada.
Introduction
Det centrala nervsystemet innehåller en subpopulation av själv förnya, multipotenta stamceller som har förmåga att ge upphov till alla olika mogen neurala cell typer1,2,3,4. Dessa neurala stamceller (Karolina) bosatta i specialiserade nischer i hjärnan och ryggmärgen och kan aktiveras efter skadan skall föröka, migrera och differentieras till mogna neurala celler. Karolina och deras avkomma har visat att migrera till skadan webbplats i kortikala skadan modeller5,6. I hjärnan, har Karolina visat att migrera från de laterala ventriklarna till platsen för skadan där de differentieras till astrocyter som bidrar till gliaceller ärr bildas7. I ryggmärgen, men har få studier gjorts för att be om dessa samma endogena Karolina kan utnyttjas för att främja återhämtningen efter ryggmärgsskada. Faktiskt finns det för närvarande en debatt om huruvida aktivering av stamceller poolen i ryggmärgen kräver en direkt fysisk skada av periventrikulär nisch foder den centrala kanal8 eller om skadan till spinal cord parenkymet (lämnar stammen cell nisch intakt) är tillräcklig för att aktivera endogena Karolina9.
Ett antal ryggmärgen skadan (SCI) modeller har använts för att studera patofysiologin av akuta och kroniska skador. Dessa modeller har också använts för att testa potentiella terapier för att behandla SCI genom neuroprotektion, immunmodulering och utveckla cell transplantation/ersättning strategier10,11,13. Nuvarande modeller inkluderar komprimering eller kontusion skador, som orsakar storskaliga funktionella underskott och omfattande lesioner samt kavitation i sladd14,15. Resulterande gliaceller ärr kan spänna över flera spinal segment tillsammans med majoriteten av bredd/omkretsen av ryggmärgen16. Således, medan dessa modeller är kliniskt relevanta, de råd betydande utmaningar för studera svaret av endogena Karolina efter skada. Det finns kemiska modeller av skada som kan anpassas för att orsaka lindrigare former av skada som kan avvara den centrala kanal17. Men dessa typer av skador fokusera på den demyelinisering som är associerad med SCI och är inte kliniskt relevanta modeller för den fysiska och/eller mekanisk skada i samband med traumatiska SCI.
För att hantera begränsningar i nuvarande skada modeller, har vi anpassat en nål spår minimal SCI modell, utvecklades ursprungligen i råtta9, för tillämpning i en vuxen musmodell. Våra anpassade skada modell kan skapa en konsekvent lesion av den dorsolaterala regionen mus ryggmärgen och skona den centrala kanalen på marknadsnivå(er) ingår skada. Fördelen med denna modell är att den tillåter studier av NSC kinetik efter skada och deras potentiella radiella migration till platsen för skadan. Användning av en musmodell tillåter även användning av transgena möss som tillåter härstamning spårning av endogena Karolina och deras avkomma efter skada. Egenskaperna för Karolina kan vidare bedömas med hjälp av en modifierad form av in vitro- neurosphere analysen som introduceras i detta protokoll.
Den neurosphere analysen är en in vitro- kolonibildande analysen som tillåter isolering av Karolina i närvaro av mitogena substanser. Vid klonal plätering tätheter föröka enskilda Karolina för att ge upphov till friflytande sfäriska kolonier av celler som består av en liten subpopulation av Karolina och en stor majoritet av föräldraparets18,19. I våra protokoll, visar vi isolering av två distinkta, lineally-relaterade Karolina från regionen periventrikulär av ryggmärgen — baslinjen villkor och efter vår minimala SCI-modell. Slutgiltig neurala stamceller celler (dNSCs) express nestin och glial fibrillary sura protein (Fredsgenomförande) och odlas i närvaro av epidermal tillväxtfaktor (EGF), fibroblast tillväxtfaktor (FGF) och heparin (tillsammans kallas EFH)20. Dessa dNSCs är sällsynta i naiva ryggmärgen, ger upphov till mycket få neurospheres in vitro. Vi visar dock att dNSCs aktiveras efter minimal SCI, expanderande numrerar av neurospheres isolerade från periventrikulär regionen21. Primitiva neurala stamceller (pNSCs) är uppströms dNSCs i neurala stamceller härstamning. pNSCs är ytterst sällsynt, express låga nivåer av pluripotency markören Oct4, och leukemi hämmande faktor (LiF) lyhörd22. pNSCs utgör inte neurospheres när isolerade från vuxen mus ryggmärgen på grund av myelin grundläggande protein (MBP) i primära kulturer; dock pNSC neurospheres kan isoleras från MBP bristfällig möss och deras antal är utökad följande skada — liknar dNSCs21. Slutligen visar vi att dNSC-derived neurospheres kan isoleras från platsen för skadan på tidigt tider efter minimal SCI. Dessa resultat visar att vår skada modell och analyser kan bedöma de aktivering som kännetecknar periventrikulär Karolina såsom deras förmåga att föröka sig och migrera svar till skada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll godkändes av Animal Care kommitté vid University of Toronto och är i enlighet med den ”Guide till the hand och användningen av försöksdjur” (2nd Edition, kanadensiska rådet på Animal Care, 2017).
1. Minimal ryggmärgen skadan kirurgi
Obs: Före operation se till att alla kirurgiska instrument och material är steriliserade med lämpliga metoder (figur 1A).
- Bygga en bröstkorg stöd båge genom att rulla upp 4 – 5 rutor av gasväv och tejpa dem tillsammans i mitten för att få en fast rulle av gasväv.
- Placera musen i induktion kammaren och initiera anestesi med 5% isofluran. Bekräfta avsaknaden av en tå nypa reflex innan du fortsätter, liksom under hela förfarandet. Eftersom operationen kan ta uppemot 30 minuter att slutföra, optimera för minimal isofluran exponeringen (5 min vid 5%) och återstående tid på 2 – 3%.
- Flytta musen till en Kona bifogas bedövningsmedel maskinen på 2 – 3% isofluran underhållsdos. Använda hårklippningsmaskiner att ta bort päls från dorsum av djuret från mitten av ryggen upp till hals/öron att exponera ett stort rektangulärt område av huden för kirurgi.
- Flytta musen till ett stereotaxic instrument genom att placera sin näsa i bifogade näsan konen och stabilisera skallen med örat barer. Upprätthålla isofluran på 5% under placering av örat barer och lägre tillbaka till 2 – 3% när musen är säkrad i stereotaxic enheten.
- Administrera preoperativ smärtstillande mediciner intraperitonealt — meloxikam (2,0 mg/kg). Applicera generöst ögat smörjning på öppna mus ögon att förebygga korneal uttorkning när under narkos.
- Placera bröstkorg stöd bågen under musen buken medan räta ut musen kropp och ryggraden genom att lätt dra på basen av svansen. Använda laboratorium märkning tejp för att säkra svansen och alla utökade lemmar i en stjärnliknande position. När säker push bröstkorg stöd bågen rostrally, från mus buken mot övre bröstkorgen — för att stötta upp bröstkorgens ryggrad (figur 1B).
- Förbereda en steril operationsområdet genom desinfektion päls-klippt hudområdet som bereddes i steg 1.3 med 70% etanol, följt av povidonjod. Upprepa två gånger. Applicera en steril kirurgiska draperi för att hålla en bred sterila fältet.
- Använda en #10 skalpell blad, göra ett vertikalt snitt parallellt med den längsgående axeln av djur från mittpunkten av båda skulderbladen till krökning av bröstkorgens ryggrad. Dra tillbaka huden för att exponera mjuk vävnad och ryggraden kontur (figur 1 c).
- Identifiera den nedre gränsen av suprascapular fett pad (detta avgränsas T4/5 vertebrala nivån). Med samma #10 blad, försiktigt men med kraft, skär längs båda sidor av ryggraden ben T5 – T8/9 att lossa back-muskel senor från kolumnen.
- Sätt tänderna av upprullningsdon i områdena snitt på vardera sidan av ryggraden. Justera exponeringen genom att utvidga upprullningsdon för att höja tillräckligt ryggraden utan att sätta alltför stor påfrestning på de indragna muskellager (figur 1 d).
- Under det kirurgiska mikroskopet, ren försiktigt resterande muskler och andra mjukdelar överliggande ryggraden för att exponera vertebrala benet (figur 1E). Identifiera de kotor som kommer att tas bort genom knäpper fast den spindelkrabba processen av Kotor med tandad tång och flytta den lite upp och ner.
Obs: Detta bör möjliggöra identifiering av intervertebral lederna och exponera de små öppningarna (intervertebral foramina) under kotorna av intresse. - Infoga en chef för böjda trubbiga saxen i vardera sidan av den utsatta intervertebral foramen, caudal till den vertebrala lamina att vara censurerade ute, och skär anslutande intervertebral lederna bilateralt.
- Lyft lamina uppåt och avskurna övre infästningen av lamina att isolera och ta bort benet.
Obs: Detta kommer att utsätta den intakt dural sac innehåller ryggmärgen (figur 1F). Det kan vara överdriven blödning som kan styras genom att placera hyvlades 1 x 1 cm gasbinda på de drabbade områdena och/eller tvätta med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. - Den dorsala mittlinje ven tjänstgör som ett landmärke, sätt en 45° vridet skaft av en 30 G nålspetsen (med nål avfasningen uppåt) i den dorsolaterala ytan av ryggmärgen (cirka 1 mm djup) på cirka 0,5 mm i sidled på vardera sida om mittlinjen.
- Flytta nålen ~ 2 mm från kaudala rostralt (parallellt med mittlinjen) så att hela längden av avfasningen på nålen sätts in sladden. Ta bort nålen genom retracing via sökvägen till posten (figur 1 g).
Obs: Bör det finnas ingen blödning men svullnad av spinal vävnad kan ses i detta steg. - För att stänga såret, ta bort upprullningsdonet och sutur ryggmusklerna på vardera sidan av skadan som grupp i mittlinjen med en 6-0 resorberbar sutur. Använd en 4-0 sterila silk sutur därefter stänga den överliggande hud.
- Tillämpa antibiotisk salva till toppen av ytliga sys huden för att förhindra postoperativ infektion med spetsen på en bomullstuss. Administrera postoperativa smärtstillande 0,1 mg/kg av buprenorfin subkutant tillsammans med vätskor (1 mL ringer-laktat lösning).
- Stäng av isofluran spridare och syre. Ta bort musen från den stereotaxic enheten och placera det i en ren bur. inga sängkläder.
- Placera musen i buren ca 30 cm från en värmelampa för återhämtning från anestesi och övervaka beteendet efter vakna. Musen ska vakna upp inom 5 – 10 min och har bakben funktionen med möjlig pares eller svans svaghet på att vakna.
- Övervaka mus beteende under de närmaste dagarna och ge postoperativ vård och analgetika (dvs, mosar, laktat Ringers lösning vätska subkutan, 0,1 mg/kg buprenorfin 2 x dagligen subkutant för 2 – 3 dagar, och korrekt vikt övervakning ) i enlighet med lokala djuranläggningen förordningar och på individuell basis som återvinning kan variera.
2. Neurosphere Assay dissektion
Obs: Följ rätt sterila vävnadsodling procedurer i.
- Enzymatisk lösning förberedelse
- Lägg till 32 mL av Earle's Balanced Salt lösning (EBSS) till albumin ovomucoid hämmare innehållande glasflaska och försiktigt vortex tills upplöst.
- Tillsätt 5 mL av EBSS till en pre portionde papain glasflaska och placera i 37 ° C vattenbad att upplösa. Lösningen blir klar (lösning 1).
- Ta 500 µL EBSS och lägga till de pre portionde DNAS I glas injektionsflaska för att få en koncentration av 1 mg/mL (lösning 2). Blanda mycket försiktigt genom att luta injektionsflaskan fram och tillbaka och tillsätt 250 µL av denna blandning till lösning 1.
Obs: Alla lösningar gjort (lösning 1 och 2) är tillräckligt för behandling av två bitar av vävnad. Om bearbetning fler bitar av vävnad, rymma med mer lösning prep.
- Vävnad förberedelse och dissektion
- Plats en laboratorium torka indränkt i isofluran in i musen buren och Tillåt 2-3 min för ångor till helt söva mus. Följande knockout, ta bort musen från buren och bekräfta avsaknaden av en tå-nypa reflex.
- Utföra cervikal dislokation med en trubbig metallföremål (dvs, metall bur kort) att avliva djuret. Spraya generöst euthanized djuret från sin hals till mitten av ryggen med 70% etanol.
- På basen av skallen, använd sax att avskurna huvudet och kasta in en bio-väska. Göra en mittlinjen snitt i huden längs hela längden på baksidan för att exponera den muskel och vertebrala ben kontur (figur 2A).
- Lyft den mediala aspekten av varje skulderbladet (dvs., skulderbladet — identifieras av överliggande fett pad) och använda sax för att klippa bort mjuk vävnad (mellan scapulae och kotorna). Separat helt att exponera underliggande kotpelaren.
- Efter krökning av ryggraden, in samma par sax i den övre bröstkorg öppningen och isolera ryggraden genom att skära bort bifogade revben, muskler och inre organ (figur 2B).
- Infoga sax i den kaudala vertebrala foramen/öppningen och skär intervertebral lederna på vardera sidan av bladskivan (dorsala ytan). Var försiktig att inte skada intakt sladden. Fortsätt med detta tills önskad nivå och/eller längden på sladden utsätts.
- Skär försiktigt den spinal nerve(s) som sträcker sig sidled från sladden innan överföra ryggmärgen vävnaden i en petriskål med regelbundna konstgjorda cerebrospinalvätska. Förvara provet på is (figur 2 c).
- Under en dissektion skär Mikroskop, ryggmärgen vävnaden att inkludera ~ 2 mm rostralt och stjärtfenan till skadan webbplats. Använd två par pincett att försiktigt separera sladden i 2 halvor längdriktningen längs rygg- och ventrala sprickor (figur 2 c').
- Med microscissors, skära ut den skadade dorsolaterala vit substansen. Placera pjäsen i en 15 mL koniska rör.
- Hålla en hälften av ryggmärgen ner med pincett, retas och ta bort vit substans med ett annat par fina tången längs rostrocaudal omfattningen av ryggmärgen för att isolera önskad periventrikulär regionen. Upprepa för den andra hälften av ryggmärgen.
- Placera bitar av periventrikulär vävnad i en separat 15 mL koniska rör. Använd microscissors och försiktigt finhacka vävnaden mot väggarna i koniska rören.
Obs: Vävnad Dissociation ändringar är från Papain Dissociation System protokoll23 och tidigare beskrivna vävnad förberedelse förfaranden24. - Tillsätt 2,5 mL ny lösning 1 (steg 2.1.3) till vävnadsprov och placera på en rocker vid 37 ° C i 30 min.
- Försiktigt pulverisera vävnaden i lösning med en 1000 µL pipettspetsen. Centrifugera grumlig cellsuspension vid 300 x g i 5 min på RT.
- Förbereda lösning 3 med 2,7 mL Earle balanserad saltlösning, 300 µL ovomucoid hämmare lösning (steg 2.1.1) och 150 µL av DNAS jag stopplösningen (steg 2.1.3).
- Avlägsna supernatanten från steg (steg 2.2.13) och återsuspendera i 1,5 mL lösning 3 från föregående steg (steg 2.2.14).
- Lager för denna nya cellsuspension (steg 2.2.15) ovanpå 5 mL ovoimucoid hämmare lösning (steg 2.1.1) i en ny 15 mL koniska rör skapa en diskontinuerlig täthetlutning. Centrifugera vid 300 x g i 5 min på RT.
- Kassera supernatanten och återsuspendera i 2 mL av neurobasal media. Centrifugera vid 300 x g under 3 minuter vid RT.
- Kassera supernatanten och återsuspendera i 1 mL av neurobasal media. Filtrera suspensionen med hjälp av en 20 µm cell SIL följt av 4 mL av media för en total volym på 5 mL.
- Plätering
- Förbered kultur för neurosphere tillväxt genom att komplettera neurobasal media med epidermal tillväxtfaktor (20 ng/mL) / fibroblast tillväxtfaktor (20 ng/mL) / heparin (2 µg/mL) [för slutgiltig Karolina] eller leukemina hämmande faktor (10 ng/mL) [för primitiva Karolina]. Tillsätt 10 mL av antingen media i en 25 mL vävnadsodling kolv.
- Använda en hemocytometer och Trypan blått färgämne för att beräkna antalet celler i suspension från (steg 2.2.18)25. När beräknas, lägga till celler i vävnadsodling kolvar bereddes i (steg 2.3.1) till en klonal täthet av 10 celler/µL och plats vävnadsodling kolv med extra celler in i inkubatorn för 24 h (37 ° C, 95% luftfuktighet, 5% CO2).
Obs: Ett exempel på den räknande tekniken är följande: ta 10 µL cellsuspension och blanda med 10 µL Trypan blått färgämne. Tillsätt 10 µL av denna blandning i en hemocytometer. Under en 10 X ljusmikroskop, räkna antalet levande celler och summera alla celler räknas inom 4 i 4 x 4 kvadranterna. Använd formeln: 100.000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1,000] att ge volymen av cellsuspensionen att vara klädd i varje 25 mL vävnadsodling kolv att säkerställa klonal täthet (10 celler/µL). - Efter 24 h, försiktigt snurra kolven och häll innehållet i en 15 mL koniska rör. Centrifugera vid 300 x g i 5 min på RT.
- Avlägsna supernatanten och Slamma upp cellerna i 1 – 2 mL färsk neurobasal media.
- Upprepa steg 2.3.2 att räkna antalet celler i suspension och platta celler med klonal täthet i en 24-väl vävnadsodling tallrik innehållande 500 µL varje av deras respektive mitogen kompletteras media (EFH för slutgiltig NSC tillväxt) och LIF för primitiva NSC tillväxt.
Obs: Använd anpassad formel (5000 / [X celler/4) x 2 x 10 x 1 000) att beräkna volymen av cellsuspensionen att vara klädd i varje brunn innehållande 500 µL av media. - Placera plattor som innehåller celler i inkubatorn (37 ° C, 95% luftfuktighet, 5% CO2) för att växa i 7 dagar.
- Räkna
- Efter 7 dagar i kultur, ta bort tallrikar och Visa under ett ljusmikroskop. Kvantifiera neurospheres genom att räkna sfäriska kolonier som är > 80 µm i diameter för dNSCs kulturer och > 50 µm diameter för pNSCs kulturer.
Obs: Om så önskas, neurospheres kan vara ytterligare anpassade26 eller differentierade. Om cellerna inte längre behövs, ta tillvara genom att lägga till accelererad väteperoxid till brunnarna (ca 1 mL) i 20 min så att färgen på mediet blir gul. Sedan kasta.
- Efter 7 dagar i kultur, ta bort tallrikar och Visa under ett ljusmikroskop. Kvantifiera neurospheres genom att räkna sfäriska kolonier som är > 80 µm i diameter för dNSCs kulturer och > 50 µm diameter för pNSCs kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter operation, bör möss uppleva minimal motor underskott som kan innehålla svans och möjliga bakbenen pares för upp till 24 h. Efter denna tid, bör möss upplever ingen bakbenen förlamning eller pares och minimala förändringar i gång.
Figur 3 visar representativa resultat från neurosphere-analysen 5 dagar efter den minimala ryggmärgsskada. Det absoluta antalet dNSC-derived neurospheres (odlade i EFH) är större än antalet pNSC-derived neurospheres (odlade i LIF) efter skada (figur 3A och 3B, respektive). Bilder med högre makt en slutgiltig neurosphere (figur 3 c) och en primitiv neurosphere (figur 3D) avslöja skillnader i utseendet på dessa separata kolonier med slutgiltiga neurospheres att vara större i diameter (≥80 µm) och oftast att ha ett stort mörkt centrum. Primitiva neurospheres är mindre i storlek (≥ 50 µm) och cellerna är mer tätt packade. Representanten numrerar av neurospheres som härrör från olika delar av skadade sladden ses i figur 3E (definitives) och 3F (primitiver). Figur 3E visar att minimal SCI orsakar en betydande ökning av neurospheres vuxit från den centrala kanalen i nivå med skada jämfört med en relativt blygsam ökning på rostralt icke-skadade sladden.
Intressant, kan slutgiltig neurospheres genereras från platsen för lesionen, en region som inte innehåller neurosphere bilda celler i laminektomi ensam möss. Figur 3F visar en liknande ökning av pNSCs efter skada med undantag för pNSC neurospheres på webbplatsen lesion. Därför är endast dNSCs kan migrera till platsen för skadan över denna tid kursen efter skada.
Figur 1: operationsmetod. (A) utformningen av allt krävs, numrerade för förhandsavgörande. (B) en bild av musen i en stereotaxic enhet med ett uträtat organ, rygg och armar och ben utspridda och tejpade tillsammans med bröstkorg stöd arch förläggas under. (C), en bild av musen med en vertikal huden snitt utsätta den muskulösa lagret och ryggraden kontur. (D) ett bild av mus kroppen efter muskulös snitt och exponering och isolering av ryggraden med upprullningsdon. Observera spända muskeln skikten med brist på Riva. (E) A bild av isolerade mus ryggraden med muskellager bort, visar den beniga ytan av kotan (3 segment). Detta visar också den spindelkrabba processen eventuellt intervertebral och solidariska lamina av mellersta kotan avlägsnas. (F), A bild av den synligt ryggmärgen efter laminektomi. Märkt är den dorsala mittlinje ven. (G), A bild av musen med bilaterala nål spår skador på vardera sidan av dorsala mittlinjen ven. Det finns en närbild infoga av 45° vridet skaft av 30 G nål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: ryggmärgen dissektion. (A) A bild av decapitated musen med mittlinjen hud snittet att exponera ryggmuskeln och vertebrala ben kontur (B), en föreställa av isolerade kotpelare, visar rostralt och stjärtfenan orientering. Den andra bilden visar sladd isolering och tredje visar isolerade ryggmärgen i en petriskål. (C), en grafisk representation av fina dissektion av ryggmärgen, där olika segment (periventrikulär, skada området) är bort och separeras för odling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa resultat från neurosphere assay efter minimal ryggmärgsskada. (A) numrerar av dNSC-derived neurospheres (odlade i EFH) odlade från den skadade ryggmärgen är större än (B), antalet pNSC-derived neurospheres (odlade i LIF) när pläterade med lika täthet. (C, D) Bilder med högre ström av ”typiska” neurospheres i (C) dNSC kulturer och (D) pNSC kulturer. (E) Minimal nål tarmkanalen skada resulterar i betydande ökningar i antalet dNSC-derived neurospheres från den centrala kanalen i nivå med skada samt den centrala kanalen rostralt om skadan och skadan webbplats. (F) pNSC-derived neurospheres kan inte isoleras från oskadd sladden men kan isoleras efter skada från den centrala kanalen (på nivån på skadan och från den rostralt centrala kanalen). Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under det kirurgiska ingreppet finns det några kritiska steg där forskaren bör ägna särskild uppmärksamhet åt för att få optimala resultat och minimera variabiliteten mellan djur. Vara måste försiktig med den inhalerade anestesi (isofluran) under operation eftersom bedövningsmedlet har visat sig ha neuroprotektiva effekter med långvarig exponering27. Följaktligen, när man studerar regenerativ kapacitet av ryggmärgen efter skada, göra en insats att utföra operationen så snabbt och effektivt som möjligt för att förhindra störande variabler. Underhålla samma isofluran exponeringstiden per mus kommer att minska variationen. Andning av musen ska övervakas under hela operationen och bör inte vara för långsam (mindre än 1 andetag varje 2-3-s) eller kraftigt ansträngd (dvskippar). Underhållsdosen av anestesi kan sänkas från 2 – 3% att förhindra dödsfall till följd av långvarig anestesi med noteringen av möss som fick den lägre dosering.
Under operationen, var extra försiktig när du utför muskulös snitt på vardera sidan av ryggraden. Säkerställa att nedskärningarna är djupa och bladet är vinklat medialt så att kanten på bladet vilar mot beniga ryggraden under muskulös snitt. Om bladet är vinklad utåt, finns det möjlighet till kraftig blödning från vaskulär nedskärningar. Forskaren bör också ägna extra uppmärksamhet när du utför den laminektomi Undvik djupa mete den sax som skadar ryggmärgen, orsakar oönskade vävnadsskada och funktionella brister. Lämplig kontroll för dessa experiment är en ”endast laminektomi” grupp (ingen skada), som kommer att möjliggöra en jämförelse av aktiveringen av Karolina tillskrivs nål spår skadan i stället för som som kan resultera från laminektomi endast. Vi har visat att enbart laminektomi kan resultera i en liten, om än obetydlig ökning NSC aktivering som framkommit vid en ökning av neurosphere nummer från periventrikulär regionen på nivå av lesion21. Laminektomi ensam orsakar inte ökar i neurosphere nummer från regionen periventrikulär rostralt eller stjärtfenan till laminektomi och ingen neurospheres finns i kulturer av vit substans isolerade på nivån för laminektomi. Dessutom när du utför laminektomi, var noga med att ta bort den dorsala lamina i ett stycke att tillåta bred exponering av sladden. Detta (1) ge tillräcklig tillgång till utföra den minimala nål spår skadan av dorsolaterala ryggmärgen, och (2) förhindra segment av ben från att hamna på efterkälken och orsaka sekundära skador efter stängning och efter återställningen rörelse av musen. Om den hela lamina tas inte som ett stycke, eller segment av vassa ben sticker ut på båda sidor av laminektomi observeras, använda instrument (såsom tandad tång och böjd sax) för att ta bort dessa fragment före suturering.
Forskaren bör vara ytterst försiktig när du tillämpar suturer på den muskulösa lagret under kirurgiska stängning. En sutur (dubbel-knuten) bör placeras stjärtfenan till nivån på laminektomi/skada så att suturen ligger ovanpå intakt vertebrala benet. Detta är att förebygga sekundära skador som kan resultera från muskulös suturen vara i kontakt med utsatta sladden när musen flyttas efter återhämtning. Dessutom fungerar muskulös suturen stjärtfenan till den laminektomi/skadan som ett landmärke för där SCI utfördes när isolera ryggmärgen för analys. Man bör vara försiktig när dissekera ut det skadade ryggmärgen-området att undvika att äventyra strukturen i regionen skadade så att det kan förbli igenkännligt under fina dissektion under mikroskopet dissekera. När det gäller neurosphere analysen är det viktigt att utföra den mekanisk sönderdelning av cell pellets varsamt för att undvika produktion av luftbubblor som kan öka celldöd. pNSC-derived neurospheres är ännu mer känsliga för skräp tung, tillväxt villkorar — överdriven sönderdelning och långvarig exponering i enzymatisk lösningar — i förhållande till dNSC kulturer. pNSC härrör sfärer är mer kompakt och mindre än dNSCs. Med tanke på sällsynthet av pNSCs, rekommenderar vi isolera minst 240.000 celler per prov.
Den minimala SCI-modellen är idealisk för att studera de cellulära händelser efter skada (t.ex. aktivering av endogena Karolina) men det tillåter inte studien av funktionsnedsättningar. Som nämnts tidigare, möss att återhämta sig från nålen spår skadan upplever inga anmärkningsvärda beteende brister som kvarstår och som sådan, mössen inte kan utvärderas för effektiviteten av terapeutiska interventioner för att förbättra funktionella resultat. En viktig aspekt av regenerativ medicin är att en behandling bara inte bör främja vävnad reparera (som kan utvärderas med hjälp av denna modell, i kombination med neurosphere assay, lineage tracing och immunohistokemi/immunofluorescens) men bör också visa relevanta funktionell förbättring med beteendemässiga paradigm tillämpliga. Ett antal beteendemässiga uppgifter används för att testa funktionella utfall i bröstkorg modeller av skada såsom foten fel testet och Basso, Beattie, Breshnan (BBB) öppna Fältskalan rörelseapparaten28, är inte tillräckligt känslig för att upptäcka mätbara underskott i vår minimala SCI-modellen. För att övervinna denna brist, en kan göra användningen av mer känsliga digitala scoring system (t.ex., CatWalk) som mäter flera parametrar av brutto- och fina bakben locomotion parametrar inklusive gait analyser, som kan upptäcka den minimala underskott som härrör från den minimal skadan modell29.
Denna metod kan också anpassas för att studera endogena NSC aktivering som en potentiell behandling i modeller av cervikal ryggmärgsskada. Cervikal SCI är den mest kliniskt relevant modellen, och vi föreslår att anpassa denna skada modell till högre vertebrala segment skulle ge insikt om det finns regionala variationer i svaret av Karolina och deras avkomma (kinetik, migration, differentiering) och huruvida lesionen skulle leda till mer djupgående och mätbara funktionella underskott. För närvarande används murina cervikal skada modeller (såsom transection, klipp komprimering eller kontusion) kräver intensiv postoperativ vård inklusive behovet av att manuellt express urinblåsor och ständigt övervaka andningen av musen. Anpassa modellen minimal skada på cervikala ryggmärgen kan minska dödlighet, sjuklighet och postoperativ vård är associerad med andra livmoderhalscancer SCI-modeller som tillåter en att undersöka effektiviteten av droger/små molekyler och/eller rehabilitering utfall på neurala återhämtning. Vår skada modell kan också anpassas till skapa en minimal skada i olika delar av sladd (dvs, dorsal eller laterala kolumner) eller större skador med djupare penetration och/eller användning av större storlek nålar (mindre spårvidd). Detta gör det möjligt för forskaren att kontroll/manipulera typ och storlek av lesionen och därmed utvärdera cellulära och funktionella/beteendevetenskaplig återhämtning med detta.
Minimal skada modellen hos möss tillåter användning av transgena djurmodeller. I musmodeller aktivera märkning av kroppsegna stamceller eller stamfäder före skadan. Detta kan göra det möjligt för forskaren att spåra dessa pre märkta celler efter skada öde och utvärdera neurala föregångare cellproliferation, migration och differentiering efter skada – potentiellt bidragande till neurala reparation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansieras av stiftelsen Krembil (driftsbidrag CMM). WX var mottagare av utmärkelsen Carlton Marguerite Smith student. NL fick en Ontario Graduate stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30 G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25 G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1 mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3 mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1 M, 9.01 g in 100 mL dH2O |
| 1 M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155 mM, 1.30 g in 100 mL dH2O |
| 155 mM NaHCO3 | |||
| 1 M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100 mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5 mL Hormone Mix and aliquoted into 20 μL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2 M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69 g in 100 mL dH2O |
| 1 M KCL | Sigma | P5405 | 7.46 g in 100 mL dH2O |
| 1 M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g in 100 mL dH2O |
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g in 100 mL dH2O |
References
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H.
- Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
- Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
- Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
- Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
- Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports - UK. 7, (2017).
- Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
- Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
- Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
- Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
- Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
- Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
- Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
- Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
- Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/PDS/default.html (2018).
- Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
