Summary
Aquí, demostramos el funcionamiento de un modelo de lesión mínima de la médula espinal de un ratón adulto que repuestos el nicho central canal vivienda endógeno las células madre neurales (NSC). Mostramos cómo se puede utilizar el ensayo desarrolló para cuantificar la activación y migración de NSCs definitivos y primitivo después de lesión.
Abstract
Las células madre neurales (NSC) en la médula mamífera adultos son una población mitotically relativamente quieta de periventricular células que pueden ser estudiados en vitro usando el ensayo desarrolló. Este ensayo de formación de colonias es una poderosa herramienta para estudiar la respuesta de NSCs a factores exógenos en un plato; sin embargo, esto puede también usarse para estudiar el efecto de manipulaciones en vivo con la correcta comprensión de las fortalezas y limitaciones del ensayo. Una manipulación de interés clínico es el efecto de la lesión en la activación endógena del NSC. Modelos actuales de la lesión de la médula espinal proporcionan un reto estudiar esto ya que la severidad de modelos comunes de contusión, compresión y corte transversal de la destrucción del nicho de la NSC en el sitio de la lesión donde residen las células madre. Aquí, describimos un modelo de lesión mínima que produce daños localizados en la superficie dorsolateral superficial del nivel torácico inferior (T7/8) de la médula espinal de ratón adulto. Este modelo de lesión repuestos del canal central en el nivel de la lesión y permite el análisis de la NSC que residen en el nivel de la lesión en varios puntos del tiempo después de lesión. A continuación, os mostramos cómo puede utilizarse el ensayo desarrolló para estudiar la activación de las dos poblaciones distintas, relacionadas linealmente de NSCs que residen en la región periventricular de médula espinal - NSCs primitivos y definitivos (pNSCs y dNSCs, respectivamente). Demostramos cómo aislar y cultura estos NSC de la región periventricular a nivel de la lesión y el sitio de la lesión de materia blanca. Nuestras disecciones post quirúrgica de la médula espinal muestran mayor número de sus y neuroesferas dNSC deriva de la región periventricular de cuerdas heridas comparado con controles, hablando su activación a través de lesiones. Además, tras lesión, neuroesferas derivó dNSC pueden aislarse desde el sitio de lesión, demostrando la capacidad de NSC para migrar desde su nicho periventricular a sitios de lesión.
Introduction
El sistema nervioso central contiene una subpoblación de células multipotentes, renueva a sí misma que tiene la capacidad para dar lugar a todas las diferentes células neuronales maduros tipos1,2,3,4. Estas células madre neurales (NSC) residen en nichos especializados en el cerebro y la médula espinal y puede ser activadas después de lesión para proliferar, migrar y diferenciarse en células nerviosas maduras. NSC y su progenie ha demostrado a migrar hacia el sitio de lesión en lesión cortical modelos5,6. En el cerebro, ha demostrado NSC para migrar desde los ventrículos laterales en el sitio de la lesión donde se diferencian en astrocitos que contribuyen a la formación de cicatriz glial7. Sin embargo, en la médula espinal, se han realizado pocos estudios para preguntar si estos mismo NSCs endógenos pueden aprovecharse para promover la recuperación después de lesión de la médula espinal. De hecho, actualmente existe un debate respecto a si la activación de la piscina de la célula de vástago en la médula espinal requiere un daño físico directo del nicho periventricular Revestimiento canal central8 o si el daño al espinal médula parénquima (dejando el tallo nicho de células intacta) es suficiente para activar endógeno NSCs9.
Un número de modelos de lesión (SCI) de la médula espinal se ha utilizado para estudiar la fisiopatología de la lesión aguda y crónica. Estos modelos también se han utilizado para probar terapias potenciales para tratar SCI neuroprotección, inmunomodulación y desarrollo celular trasplante y reemplazo estrategias10,11,13. Los modelos actuales incluyen lesiones compresión o contusión, causantes de déficit funcional a gran escala, así como lesiones extensas y cavitaciones en el cable14,15. Las cicatrices gliales resultantes pueden abarcar varios segmentos espinales junto con la mayoría de la anchura, la circunferencia de la médula espinal16. Así, mientras que estos modelos son clínicamente relevantes, pueden permitirse desafíos significativos para estudiar la respuesta de NSCs endógenas después de lesión. Hay modelos químicos de lesiones que se pueden adaptar para hacer que las formas más leves de lesión que puede evitar el canal central17. Sin embargo, este tipo de lesiones se centran en la desmielinización asociada a SCI y no modelos clínicamente relevantes para el daño físico o mecánico asociado con LME traumáticas.
Para hacer frente a las limitaciones de los modelos actuales de la lesión, hemos adaptado un aguja pista SCI modelo mínimo, desarrollado originalmente en el rata9, para la aplicación de un modelo de ratón adulto. Nuestro modelo de lesión adaptado puede crear una lesión consistente de la región dorsolateral de la médula espinal de ratón y el canal central en el nivel de lesión (es) de repuesto. La ventaja de este modelo es que permite el estudio de la cinética de la NSC después de lesiones y su potencial migración radial en el sitio de la lesión. El uso de un modelo de ratón también permite el uso de ratones transgénicos que permiten seguimiento de linaje de NSCs endógenos y su progenie después de lesión. Las propiedades de NSCs adicional pueden ser evaluadas utilizando una forma modificada de la prueba en vitro desarrolló que se introduce en el presente Protocolo.
El ensayo desarrolló es un en vitro formando Colonia ensayo que permite el aislamiento de NSCs en presencia de mitógenos. En densidades de galjanoplastia clonal, NSCs individuales proliferan para dar lugar a colonias esféricas libres de células que se componen de una pequeña subpoblación de NSCs y una gran mayoría de progenitores18,19. En nuestro protocolo, demostramos el aislamiento de dos NSCs distintos, relacionados linealmente desde la región periventricular de la médula espinal, bajo las condiciones iniciales y siguiendo nuestro modelo mínimo de SCI. Definitivo neural nestin expresa células (dNSCs) y la proteína ácida fibrilosa glial (GFAP) y se cultivan en presencia de factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento fibroblástico (FGF) y heparina (juntos llamada EFH)20. Estos dNSCs son raras en la médula espinal de ingenua, dando lugar a muy pocos neuroesferas en vitro. Sin embargo, nos demuestran que dNSCs se activan después de SCI mínimo, ampliar el número de neuroesferas aisladas de la región periventricular del21. Primitivo las células madre neurales (pNSCs) son de dNSCs en el linaje de células madre neurales. pNSCs son excesivamente raros, expresados bajos niveles de los marcadores de pluripotencia Oct4 y leucemia (LiF) factor inhibitorio de la respuesta22. pNSCs no forman neuroesferas cuando están aisladas de la médula espinal de ratón adulto debido a la presencia de la proteína básica de mielina (MBP) en cultivos primarios; sin embargo, neuroesferas pueden ser aislado de ratones deficientes de MBP y su número es mayor que sigue lesión, similar a dNSCs21. Finalmente, mostramos que neuroesferas derivadas de dNSC pueden ser aislado desde el sitio de la lesión en el temprano épocas después de SCI mínimo. Estos resultados demuestran que nuestro modelo de la lesión y análisis pueden determinar las características de activación de periventricular NSC como su capacidad para proliferar y migrar en respuesta a la lesión.
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Protocol
Este protocolo fue aprobado por el Comité de cuidado del Animal en la Universidad de Toronto y está de acuerdo con la "Guía para el cuidado y uso de animales de experimentación" (2nd edición, Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal, 2017).
1. cirugía de lesiones de médula espinal mínima
Nota: Antes de la cirugía Asegúrese de que todos los materiales y los instrumentos quirúrgicos se esterilizan mediante métodos apropiados (figura 1A).
- Construir un arco de apoyo torácico 4 – 5 cuadrados de Gasa y cinta adhesiva juntos en el medio para obtener un rollo fijo de Gasa.
- Colocar el ratón en la cámara de inducción e iniciar la anestesia con isoflurano de 5%. Confirmar la ausencia de un reflejo de pellizco del dedo del pie antes de proceder, así como durante todo el procedimiento. Como la cirugía puede tomar más de 30 minutos para completar, optimizar la exposición mínima del isoflurano (5 min al 5%) y el tiempo restante en 2 – 3%.
- Transferir el ratón a un cono de nariz conectado a la máquina anestésica a dosis de mantenimiento de 2 – 3% isoflurano. Utilice cortar el pelo para quitar piel del dorso del animal desde la mitad de la espalda hasta el cuello y oídos para exponer un área amplia rectangular de piel para cirugía.
- Transferir el ratón a un instrumento estereotáxicas colocando su nariz en el cono de nariz adjunto y estabilizar el cráneo con barras de oído. Mantener isoflurano al 5% durante la colocación de las barras de oído e inferior a 2 – 3% una vez que el ratón está asegurado en el dispositivo estereotáxicas.
- Administrar medicamentos analgésicos preoperatorios por vía intraperitoneal: Meloxicam (2.0 mg/kg). Aplicar lubricación ocular en los ojos de ratón abierto para evitar la desecación corneal bajo anestesia.
- Coloque el arco de soporte torácico por debajo del abdomen del ratón al mismo tiempo enderezando el cuerpo del ratón y la columna tirando ligeramente de la base de la cola. Use cinta de etiquetado del laboratorio para asegurar la cola y las extremidades extendidas en una posición de estrella. Una vez seguro, empuje el arco de soporte torácico rostral, desde el abdomen hacia el tórax superior de ratón, con el fin de apuntalar la espina dorsal torácica (figura 1B).
- Desinfección del área de piel de piel recortada preparado en el paso 1.3 con etanol al 70%, seguido de povidona-yodo para preparar un campo quirúrgico estéril. Repetir dos veces. Aplique un paño quirúrgico estéril para mantener un campo estéril amplio.
- Usando una hoja de bisturí #10, haga una incisión vertical paralela al eje longitudinal del animal desde el punto medio de ambos omóplatos a la curvatura de la espina dorsal torácica. Retrae la piel para exponer el tejido suave y el contorno de la columna vertebral (figura 1).
- Identifique el borde inferior de la almohadilla grasa supraescapular (esto delimita el nivel vertebral de T4/5). Con la misma cuchilla #10, con cuidado pero con fuerza, corte a lo largo de ambos lados del hueso vertebral T5-T8/9 para separar los tendones del músculo de la parte posterior de la columna.
- Introduzca los dientes de los retractores en los sitios de incisión a cada lado de la columna vertebral. Ajustar la exposición mediante la expansión de los retractores para elevar suficientemente la espina dorsal sin poner demasiada tensión en las capas de músculo retraído (figura 1).
- Bajo el microscopio quirúrgico, limpiar cuidadosamente el músculo residual y otros tejidos blandos que cubren la espina dorsal para exponer el hueso vertebral (Figura 1E). Identificar las vértebras que se eliminará por abrochar la Apófisis espinosa de las vértebras con pinzas dentadas y moviéndolo ligeramente hasta y hacia abajo.
Nota: Esto debe permitir la identificación de las articulaciones intervertebrales y exponer las pequeñas aberturas (agujeros intervertebrales) por debajo de las vértebras de interés. - Inserte la cabeza de una de las Tijeras romas curvas en cada lado del agujero intervertebral expuesto, caudal a la lámina vertebral a ser suprimido y cortar las articulaciones intervertebrales conectadas bilateralmente.
- Levante la lámina y corte el adjunto superior de la lámina para aislar y retirar el hueso.
Nota: Esto lo expondrá el saco dural intacto que contiene la médula espinal (Figura 1F). Puede haber excesivo sangrado que puede ser controlado colocando precortadas gasa 1 x 1 cm en las zonas afectadas y lavar con PBS estéril. - Con la vena de la línea media dorsal que sirve como referencia, inserte un eje doblado de 45° de una punta de aguja 30 G (con aguja bisel hacia arriba) en la superficie dorsolateral de la médula espinal (aproximadamente 1 mm de profundidad) en el lateral de 0,5 mm aproximadamente a ambos lados de la línea media.
- Mover la aguja ~ 2 mm de caudal a rostral (paralelo a la línea media) para que toda la longitud del bisel de la aguja se inserta en el cable. Sacar la aguja por retroceso por el camino de entrada (figura 1).
Nota: No debe ser sangrado pero la hinchazón del tejido espinal puede verse en este paso. - Para cerrar la herida, retirar el separador y la sutura de los músculos de la espalda a ambos lados de la lesión en la línea media usando una sutura absorbible de 6-0. Utilizar una sutura de seda estéril de 4-0 para cerrar posteriormente la piel sobrepuesta.
- Aplique un ungüento antibiótico en la parte superior de la piel suturada superficial para prevenir la infección postoperatoria con la punta de un hisopo de algodón. Administrar analgésico postoperatorio de 0.1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea junto con fluidos (1 mL de solución de Ringer entibiada).
- Apagar el vaporizador de isoflurano y el oxígeno. Quitar el mouse del dispositivo estereotáxicas y en una jaula limpia con ninguna cama.
- Coloque el ratón en la jaula de unos 30 cm de una lámpara de calor para la recuperación de anestesia y monitor de comportamiento después de despertar. El ratón debe despertarse dentro de 5 a 10 minutos y tienen la función de extremidades con posible paresia o debilidad de la cola al despertar.
- Monitorear el comportamiento del ratón durante los próximos días y proporcionar el cuidado postoperatorio y analgésicos (por ejemplo, puré, lactato solución líquido subcutáneo, 0,1 mg/kg buprenorfina de Ringer 2 veces al día por vía subcutánea de 2-3 días y control de peso adecuado ) de acuerdo a las regulaciones locales Animalario y sobre una base individual como recuperación puede variar.
2. desarrolló análisis disección
Nota: Siga los procedimientos adecuado cultivo estériles para tejidos a lo largo.
- Preparación de la solución enzimática
- Agregar 32 mL de Earle equilibrada solución de sal (EBSS) a la botella de cristal que contienen albúmina espermidina inhibidor y suavemente vortex hasta que se disuelva.
- Añadir 5 mL de EBSS a un frasco de vidrio de papaína de las porciones y colocar en un baño de agua de 37 ° C para disolver. La solución se convertirá en claro (solución 1).
- Tomar 500 μl de EBSS y añadir a la ADNasa las porciones de vidrio frasco para obtener una concentración de 1 mg/mL (solución 2). Mezclar muy suavemente inclinando el frasco y hacia atrás y añadir 250 μl de esta mezcla a solución 1.
Nota: Todas las soluciones hechas (solución 1 y 2) son suficientes para el procesamiento de dos piezas del tejido. Si procesamiento de piezas de tejido, acogen con más preparación de la solución.
- Disección y preparación de tejido
- Lugar una toallita de laboratorio empapado de isoflurano en la jaula del ratón y permita que 2-3 min para vapores anestesiar completamente el ratón. Siguiente, quitar el ratón de la jaula y confirmar la ausencia de un reflejo del pellizco del dedo del pie.
- Realizar la dislocación cervical con un objeto contundente de metal (es decir, jaula del metal tarjeta) a la eutanasia del animal. Rocíe generosamente el eutanasia animal desde su cuello a media espalda con etanol al 70%.
- En la base del cráneo, use tijeras para cortar la cabeza y tire en una bolsa bio. Haga una incisión de línea media en la piel a lo largo de toda la longitud de la espalda para exponer el músculo y el hueso vertebral contorno (figura 2A).
- Levante el aspecto intermedio de cada escápula (es decir., omóplato, identificado por que cubría la almohadilla de grasa) y usar tijeras para cortar tejido blando (entre los omóplatos y vértebras). Se separa totalmente al exponer la columna vertebral subyacente.
- Siguiendo la curvatura de la columna vertebral, inserte el mismo par de tijeras en la abertura torácica superior y aislar la columna vertebral por recortar adjunto las costillas, músculos y órganos internos (figura 2B).
- Introducir tijeras en el caudal del agujero vertebral/apertura y cortar las articulaciones intervertebrales a cada lado de la lámina (superficie dorsal). Prestar especial atención a no dañar la médula intacta. Continúe este proceso hasta el nivel deseado o longitud del cable se expone.
- Con cuidado corte el spinal nerve(s) que se extiende lateralmente desde el cable antes de transferir el tejido de la médula espinal en una placa Petri con regular líquido cefalorraquídeo artificial. Mantener la muestra en hielo (figura 2).
- Bajo un microscopio de disección, cortar el tejido de la médula espinal para incluir ~ 2 mm rostral y caudal al sitio de lesión. Usar dos pares de pinzas para separar suavemente el cable en 2 mitades longitudinalmente a lo largo de las fisuras dorsales y ventrales (figura 2').
- Con microscissors, corte el lesionado dorsolateral de la materia blanca. Coloque la pieza en un tubo cónico de 15 mL.
- Una mitad de la médula espinal hacia abajo con pinzas, tease y quitar la materia blanca con otro par de Pinzas finas a lo largo de la extensión rostrocaudal de la médula espinal para aislar la región periventricular deseada. Repita para la otra mitad de la médula espinal.
- Coloque pedazos de tejido periventricular en un tubos cónicos de 15 mL separadas. Utilizar microscissors y pique suavemente el tejido contra las paredes de los tubos cónicos.
Nota: Modificaciones de la disociación del tejido son de papaína disociación sistema protocolo23 y preparación de tejido previamente descritos procedimientos24. - Añadir 2,5 mL de solución 1 nueva (paso 2.1.3) a la muestra de tejido y coloque en un eje de balancín a 37 ° C durante 30 minutos.
- Triturate suavemente el tejido en solución con una pipeta de 1000 μl. Centrifugue la suspensión de células nublado a 300 x g durante 5 min a TA.
- Preparar la solución 3 con 2,7 mL de solución de sal equilibrada de Earle, 300 μL de solución de inhibidor de la espermidina (paso 2.1.1) y 150 μL de la ADNsa I solución (paso 2.1.3).
- Desechar el sobrenadante del paso (paso 2.2.13) y resuspender en 1,5 mL de solución 3 del paso anterior (paso 2.2.14).
- La capa esta nueva suspensión celular (paso 2.2.15) sobre 5 mL de solución de inhibidor de la ovoimucoid (paso 2.1.1) en un nuevo tubo cónico de 15 mL para crear un gradiente de densidad discontinuo. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a TA.
- Deseche el sobrenadante y resuspender en 2 mL de medio de neurobasal. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a TA.
- Deseche el sobrenadante y resuspender en 1 mL de medio de neurobasal. Filtrar la suspensión utilizando un tamiz de 20 μm celular seguido por 4 mL de medio para un volumen total de 5 mL.
- De la galjanoplastia
- Preparar medios de cultivo para crecimiento desarrolló por suplir medios de neurobasal con factor de crecimiento epidérmico (20 ng/mL) factor de crecimiento del fibroblasto (20 ng/mL) / heparina (2 μg/mL) [de NSCs definitivos] o factor inhibidor de leukemina (10 ng/mL) [de NSCs primitivo]. Añadir 10 mL de cualquiera de los dos medios en un matraz de cultivo tisular de 25 mL.
- Utilizar un hemocitómetro y colorante azul tripán para calcular el número de células en suspensión (paso 2.2.18)25. Una vez calculado, añadir las células a frascos de cultivo de tejidos en (paso 2.3.1) a una densidad clonal de 10 células/μl y lugar matraz de cultivo de tejidos con células agregadas en la incubadora durante 24 h (37 ° C, 95% de humedad, 5% CO2).
Nota: Un ejemplo de la técnica de conteo es la siguiente: tomar 10 μl de la suspensión de células y mezclar con 10 μl de colorante azul de Trypan. Añadir 10 μl de esta mezcla en un hemocitómetro. En un 10 X microscopio de luz, contar el número de células vivas y suma todas las celdas de contado en 4 de los cuadrantes de 4 x 4. Utilice la fórmula: 100.000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1.000] para dar el volumen de la suspensión celular a ser plateado en cada frasco de cultivo tisular de 25 mL para densidad clonal (10 células/μl). - Después de 24 h, agitar el frasco y vierta el contenido en un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a TA.
- Deseche el sobrenadante y resuspender las células en 1 – 2 mL de medio de neurobasal fresco.
- Repita el paso 2.3.2 para contar el número de células en suspensión y la placa de células en densidad clonal en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos conteniendo 500 μl de sus medios respectivos mitógeno suplido (EFH para el definitivo crecimiento de NSC) y LIF para el crecimiento primitivo de NSC.
Nota: Utilice la fórmula adaptada (5.000 / [X células/4) x 2 x 10 x 1.000) para calcular el volumen de la suspensión de células a ser plateado en cada bien conteniendo 500 μl de medio. - Coloque las placas que contienen las células en la incubadora (37 ° C, 95% de humedad, 5% CO2) para crecer por 7 días.
- Contando
- Después de 7 días en cultivo, quitar las placas y ver bajo un microscopio de luz. Cuantificar neuroesferas por recuento de colonias esféricas que son > 80 μm de diámetro para las culturas dNSCs y > 50 μm de diámetro para las culturas pNSCs.
Nota: Si lo desea, pueden ser aún más los26 neuroesferas o diferenciados. Si las células ya no son necesarios, eliminar añadiendo acelerado peróxido de hidrógeno a los pozos (aprox. 1 mL) durante 20 min para que el color del medio se vuelve amarillo. Luego deseche.
- Después de 7 días en cultivo, quitar las placas y ver bajo un microscopio de luz. Cuantificar neuroesferas por recuento de colonias esféricas que son > 80 μm de diámetro para las culturas dNSCs y > 50 μm de diámetro para las culturas pNSCs.
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Representative Results
Después de la cirugía, los ratones deben experimentar un mínimo déficit motor que puede incluir la cola y posible paresia de extremidades para un máximo de 24 h. Después de este tiempo, los ratones no deben experimentar extremidades parálisis o paresia y cambios mínimos en la marcha.
La figura 3 muestra resultados representativos del ensayo desarrolló 5 días tras la lesión de la médula espinal mínimo. Los números absolutos de neuroesferas derivadas de dNSC (crecido en EFH) es mayor que el número de neuroesferas derivadas de sus (crecido en LIF) después de la lesión (Figura 3A y 3B, respectivamente). Mayor poder las imágenes de un desarrolló definitiva (figura 3) y un primitivo desarrolló (figura 3D) revelan diferencias en la aparición de estas colonias distintas con neuroesferas definitivo siendo más grande en diámetro (≥ 80 μm) y generalmente contar con un centro oscuro grande. Neuroesferas primitivos son más pequeñas en tamaño (≥50 μm) y las células se embalan más firmemente. Representante número de neuroesferas derivadas de diferentes partes de la médula lesionada se observa en la figura 3E (definitives) y 3F (primitivas). Figura 3E muestra que SCI mínimo provoca un aumento significativo en neuroesferas crecido del canal central en el nivel de la lesión en comparación con un aumento relativamente modesto en la médula rostral no heridos.
Curiosamente, neuroesferas definitivo se pueden generar desde el sitio de lesión, una región que no contiene células formando desarrolló en ratones solo laminectomía. Figura 3F muestra un incremento similar en pNSCs después de la lesión con excepción de sus neuroesferas en el sitio de la lesión. Por lo tanto, sólo dNSCs son capaces de migrar al sitio de lesión en este momento curso posterior a la lesión.
Figura 1: procedimiento quirúrgico. (A) el diseño de todo lo necesario, número de referencia. (B) una imagen del ratón en un dispositivo estereotáxicas con un cuerpo enderezado, columna vertebral y extremidades extiende y grabada junto con arco de apoyo torácico colocado por debajo. (C) A imagen del ratón con una incisión vertical de piel exponiendo la capa muscular y el contorno de la columna vertebral. (D) una foto del cuerpo del ratón después de incisiones musculares y exposición y aislamiento de la espina dorsal con retractores. Tenga en cuenta las capas músculo tenso con la falta de lagrimeo. (E) A imagen de la columna de ratón aislados con capas musculares eliminado, que muestran la superficie ósea de la vértebra (3 segmentos). Esto también muestra el proceso espinoso y posiblemente la articulación intervertebral y lámina de media vértebra a eliminarse. Funa foto de la laminectomía posterior visible de la médula espinal. Etiquetado es la vena de la línea media dorsal. (G) A imagen del ratón con lesiones de pista aguja bilateral a ambos lados de la vena de la línea media dorsal. Hay un primer plano inserto del eje doblado de 45° de la aguja de 30 G. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: disección de la médula espinal. (A) A imagen del ratón decapitado con la incisión de piel de la línea media para exponer el músculo posterior y la imagen de (B) un contorneada de hueso vertebral de la columna vertebral aislada, mostrando la orientación rostral y caudal. La segunda foto muestra el aislamiento del cable y la tercera muestra la médula espinal aislada en una placa Petri. (C) A representación gráfica de la fina disección de la médula espinal, donde se quitan y separados para el cultivo de diferentes segmentos (periventricular, área de la lesión). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Representante resultados de ensayo desarrolló tras lesión medular mínimo. (A) el número de neuroesferas derivadas de dNSC (crecido en EFH) cultivadas de la médula espinal lesionada es mayor que (B) el número de neuroesferas derivadas de sus (crecido en LIF) cuando plateado a igual densidad. (C, D) Imágenes de mayor poder de neuroesferas "típico" en las culturas de dNSC (C) y (D) sus culturas. (E) lesiones de tracto de aguja mínima resulta en un aumento significativo en el número de neuroesferas dNSC derivado desde el canal central en el nivel de lesión así como el canal central de rostral a la lesión y desde el sitio de la lesión. Neuroesferas derivadas (F) no se puede aislar de la médula ileso pero pueden ser aislada tras lesiones del canal central (a nivel de la lesión y del canal central rostral). Barras de error representan el error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Durante el procedimiento quirúrgico, existen algunos pasos críticos donde el investigador debe prestar especial atención a fin de obtener resultados óptimos y minimizar la variabilidad entre los animales. Debe tener cuidado con la anestesia inhalada (isoflurano) durante la cirugía, la anestesia se ha demostrado para tener efectos neuroprotectores con exposición prolongada27. Por consiguiente, al estudiar la capacidad regenerativa de la médula espinal después de lesión, hacer un esfuerzo para realizar la cirugía más rápida y eficientemente como sea posible para evitar variables confusoras. Mantener el mismo tiempo de exposición de isoflurano por ratón será reducir la variabilidad. El ritmo respiratorio del ratón debe vigilarse a lo largo de la cirugía y no debe ser demasiado lento (menos de 1 respiración cada 2 – 3 s) o muy lenta (es decir, jadeo). La dosis de mantenimiento de la anestesia puede reducirse de 2 – 3% para evitar la muerte por anestesia prolongada con la nota de los ratones que recibieron la dosis más baja.
Durante la cirugía, tenga mucho cuidado al realizar incisiones musculares a cada lado de la columna vertebral. Asegúrese de que los cortes son profundos, y la hoja tiene un ángulo intermedio hasta que el borde de la hoja se apoye contra las vértebras óseas durante la incisión muscular. Si la hoja está en ángulo hacia afuera, existe la posibilidad de sangrado excesivo de cortes vasculares. El investigador también debe prestar atención extra al realizar la laminectomía para evitar pesca profunda de las tijeras que pueden dañar la médula espinal, causando daño a los tejidos no deseados y déficits funcionales. El control adecuado para estos experimentos es un grupo de "laminectomía solamente" (sin lesión), que permitirá una comparación de la activación de NSCs atribuido a la lesión de pista de aguja en lugar de que puede resultar de la laminectomía solamente. Hemos demostrado que laminectomy sola puede resultar en un pequeño, aunque insignificante aumento en la activación de NSC según lo revelado por un incremento en el número de desarrolló de la región periventricular a nivel de la lesión21. Laminectomy solamente no causa aumentos en números de desarrolló de la región periventricular rostral o caudal a la laminectomía y no neuroesferas se encuentran en las culturas de la materia blanca aislados a nivel de la laminectomía. Además, al realizar la laminectomía, tenga cuidado de quitar la lámina dorsal de una sola pieza para permitir la amplia exposición de la médula. Esto (1) permitir el acceso suficiente para llevar a cabo la lesión de pista mínima de la aguja de la médula espinal dorsolateral y (2) evitar que los segmentos del hueso siendo dejados de lado y causando daño secundario después de cierre y post-recuperación movimiento del ratón. Si no se toma la lámina entera como una sola pieza, o se observan segmentos de huesos afilados que sobresalen a ambos lados de la laminectomía, utilice instrumentos (por ejemplo, dientes con fórceps y tijeras curvas) para retirar estos fragmentos antes de suturar.
El investigador debe ser extremadamente cuidadoso al aplicar suturas a la capa muscular durante el cierre quirúrgico. Una sutura (doble anudado) debe colocarse caudal al nivel de la laminectomía, lesión por lo que la sutura se encuentra en la parte superior del hueso vertebral intacto. Esto es para prevenir cualquier daño secundario que pueda resultar de la sutura muscular de estar en contacto con el cable expuesto cuando se mueve el ratón después de la recuperación. Además, el caudal a la lesión laminectomía de sutura muscular actúa como un hito para donde realizó el SCI al aislar de la médula espinal para el análisis. Debe tenerse cuidado en la disección de la zona lesionada de la médula espinal para evitar comprometer la estructura de la región lesionada por lo que puede seguir siendo reconocible durante la disección fina con el microscopio de disección. En relación con el ensayo desarrolló, es importante realizar la trituración mecánica de los pellets de células suavemente para evitar la producción de burbujas de aire que puede incrementar la muerte celular. neuroesferas derivadas son aún más sensibles a las condiciones de crecimiento pesados, escombros, trituración excesiva y prolongada exposición en soluciones enzimáticas — en relación con las culturas de la dNSC. Sus derivados esferas son más compacto y más pequeño que dNSCs. Dado la rareza de pNSCs, se recomienda aislar al menos 240.000 células por muestra.
El modelo mínimo de SCI es ideal para el estudio de los eventos celulares tras lesión (como la activación de NSCs endógenas) pero no permite el estudio de deterioro funcional. Como se indicó anteriormente, los ratones que recuperan de la lesión de pista de aguja no experimentan notables déficits conductuales que persisten y como tal, los ratones no se puede evaluar sobre la efectividad de las intervenciones terapéuticas destinadas a mejorar los resultados funcionales. Un aspecto importante de la medicina regenerativa es que un tratamiento no sólo debe promover reparación del tejido (que se puede evaluar usando este modelo, en combinación con el ensayo desarrolló, rastreo de linaje y immunohistochemistry/inmunofluorescencia) pero debe también demostrar mejoría funcional relevante utilizando paradigmas conductuales en su caso. Una serie de tareas conductuales utilizados para probar los resultados funcionales en modelos torácicos de lesiones tales como la prueba de falla de pie y Basso, Beattie, escala de Locomotor campo abierto Breshnan (BBB)28, no es lo suficientemente sensible como para detectar déficits medibles en nuestra mínima Modelo SCI. Para superar esta deficiencia, se puede hacer uso de más sensibles sistemas de puntuación digitales (p. ej., pasarela) que mide varios parámetros de los parámetros de gruesa y fina-extremidades locomoción incluyendo análisis de la marcha, que pueden detectar el mínimo de déficit resultante de la lesión mínima del modelo29.
Este método también podría ser adaptado para estudiar la activación endógena del NSC como una terapia potencial en modelos de lesión medular cervical. SCI cervical es el modelo más clínicamente relevante y proponemos que adaptar este modelo de lesión a los segmentos vertebrales superiores sería proporcionar la penetración en si hay variaciones regionales en la respuesta de NSCs y su progenie (cinética, migración, diferenciación) y si la lesión tendría como resultado déficits funcionales mas profunda y medibles. Los modelos utilizados actualmente lesión cervical murino (como corte transversal, compresión de clip o contusión) requieren un cuidado intensivo postoperatorio incluyendo la necesidad de expresar manualmente vejigas y vigilar constantemente la respiración del ratón. Adaptando el modelo de mínima lesión a la médula espinal cervical puede reducir la mortalidad, morbilidad y cuidados postoperatorios asociados a otros modelos SCI cervicales así como permiten examinar la efectividad de moléculas pequeños medicamentos o rehabilitación resultados en la recuperación neuronal. Nuestro modelo de lesión también puede adaptarse para crear una lesión mínima en diferentes partes de la cuerda (es decir, columnas dorsales o laterales) y lesiones más grandes con una penetración más profunda y el uso de agujas de tamaño más grandes (menor calibre). Esto permite que el investigador control/manipular el tipo y tamaño de la lesión y así evaluar la recuperación celular y funcional/comportamiento en consecuencia.
El modelo de lesión mínima en ratones permite el uso de modelos animales transgénicos. Los modelos de ratón habilitar etiquetado de endógena de las células madre o progenitores antes de la lesión. Esto permite al investigador seguir el destino de estas células la etiquetadas posterior a la lesión y evaluar la proliferación de células precursoras neuronales, migración y diferenciación posterior a la lesión, potencialmente contribuyendo a reparación neural.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es financiado por la Fundación de Krembil (subvención de funcionamiento CMM). WX fue el ganador del Premio student Carlton Marguerite Smith. NL recibió una beca de postgrado de Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30 G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25 G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1 mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3 mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1 M, 9.01 g in 100 mL dH2O |
| 1 M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155 mM, 1.30 g in 100 mL dH2O |
| 155 mM NaHCO3 | |||
| 1 M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100 mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5 mL Hormone Mix and aliquoted into 20 μL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2 M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69 g in 100 mL dH2O |
| 1 M KCL | Sigma | P5405 | 7.46 g in 100 mL dH2O |
| 1 M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g in 100 mL dH2O |
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g in 100 mL dH2O |
References
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