Lavage broncho-alvéolaire Exosomes en lésion induite par le Lipopolysaccharide septique pulmonaire
Summary
Des souris exposées aux LPS intrapéritonéales sécrètent des exosomes dans le liquide de lavage (BAL) Broncho-alvéolaire qui sont emballés avec les miARN. À l’aide d’un système de culture mixte, nous montrons que les exosomes libérés dans le liquide BAL perturber l’expression des protéines de jonction serrées dans les cellules épithéliales bronchiques et augmenter l’expression des cytokines pro-inflammatoires qui accentuent les lésions pulmonaires.
Abstract
Lésion pulmonaire aiguë (ALI) et syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) représentent un groupe hétérogène de maladies pulmonaires qui continue d’avoir un taux élevé de morbidité et de mortalité. La pathogenèse moléculaire d’ALI sont mieux définis ; Toutefois, en raison de la complexité de la maladie thérapies moléculaires doivent encore être développées. Ici, nous utilisons un modèle de souris induite de lipopolysaccharides (LPS) de la lésion pulmonaire septique aiguë afin de délimiter le rôle des exosomes dans la réponse inflammatoire. En utilisant ce modèle, nous avons été en mesure de démontrer que les souris qui sont exposées aux LPS intrapéritonéales sécrètent exosomes dans le liquide de lavage (BAL) Broncho-alvéolaires des poumons qui sont emballés avec miRNA et cytokines qui régulent la réponse inflammatoire. En utilisant un système de modèle de culture mixte, nous montrons que les exosomes libérés des macrophages perturber l’expression des protéines de jonction serrées dans les cellules épithéliales bronchiques. Ces résultats suggèrent que la diaphonie 1) entre les cellules immunitaires et structurels innées grâce à la navette d’exosomal contribuent à la réponse inflammatoire et rupture de la barrière physique et 2) ciblant ces miARN peut fournir une nouvelle plate-forme pour traiter ALI et SDRA.
Introduction
ALI et SDRA est les formes mortelles de l’insuffisance respiratoire avec hypoxémie sévère causée par un oedème pulmonaire non cardiogénique qui affecte environ 1 million de personnes de partout dans le monde chaque année1. L’étiologie de l’ARDS comprend atteinte directe aux poumons contre les infections ou aspiration et une variété d’injures indirectes. Ces dix dernières années, il y a eu une meilleure compréhension de la pathogenèse moléculaire de SDRA, cependant, des traitements spécifiques ciblés pour ARDS sont encore à être développé2,3.
Plusieurs modèles animaux de la lésion pulmonaire aiguë ont été développés qui fournissent un pont pour la traduction des traitements expérimentaux pour les études humaines4,5. Les modèles couramment utilisés incluent installation locale d’acide oléique, les bactéries, les LPS et la bléomycine. Autres approches incluent l’ischémie-reperfusion, perforation caecale ligature, lésion stretch induite par la ventilation mécanique, hyperoxie ou administration systémique de bactéries et de LPS5. Ces modèles offrent un système biologique utile pour tester des hypothèses cliniques et pour le développement des thérapies potentielles. Pour simuler le SDRA humaine, modèles animaux doivent reproduire l’inflammation et des lésions aiguës aux cellules épithéliales et endothéliales présentant des défauts en fonction de la barrière dans les poumons.
Exosomes sont des vésicules de la membrane avec 20-200 nm de diamètre, dont le contenu moléculaire contient des protéines, ADN, ARN et lipides, et faciliter les communications inter-cellulaires dans le microenvironnement des tissus par transfert de composition moléculaire. Exosomes sont sécrétées par différents types de cellules comme les cellules endothéliales, les cellules épithéliales, les cellules musculaires lisses et les cellules tumorales et existent en liquide de corps humain. Études indiquent que les exosomes réglementer la diaphonie entre les cellules immunitaires et les cellules du stroma au cours des maladies inflammatoires infectieuses et stériles, et leur libération anormale semble être régulés par divers stimuli naturels et expérimentales au cours physiologique et les processus pathologiques6. Tel réseau de communication peut-être jouer un rôle important dans la pathogenèse des maladies pulmonaires et peut affecter la progression physiopathologiques7,8. Sous le nom de 18-22 nucléotides ARN non codants, miRNAs existe dans les tissus et fluides corporels, plasma, sérum et module l’expression de l’ARNm à post-traductionnelles niveau9,,10.
MiARN emballés dans les exosomes influence la différenciation et la fonction des différents types de cellules, et des niveaux excessifs sont associées à une variété de maladies, y compris le cancer, maladies pulmonaires, obésité, diabète et maladies cardiovasculaires11, 12,13,14,15,16. Entrée dans les cellules réceptrices et faire la navette des miARN exosomal faciliter les communications intercellulaires modifiant l’hémostase du microenvironnement17,18. Lésion pulmonaire aiguë est un processus complexe, faisant intervenir plusieurs types de cellules avec une vaste communication intercellulaire à exosomes8. miR-155 et miR-146 a partagent le mécanisme de régulation transcriptionnel commun et contribuent à la réponse inflammatoire et de la tolérance immunitaire19,20. Des études récentes indiquent que les deux modulent la réponse inflammatoire via exosomal miARN faisant la navette entre cellules immunitaires21. Cependant, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les effets modulateurs des miARN exosomal sur réponse alvéolaire à l’endotoxine demeurent obscures, sans aucun doute la pertinence clinique potentielle et le translationnelle implication mérite un complément d’enquête.
Modèles de co-culture sont utilisées pour définir l’interaction entre les types de cellules spécifiques dans l’environnement complexe, tels que l’inflammation et le cancer22,23. Ces plates-formes fournissent une autre stratégie pour interroger la diaphonie entre les types de cellules en particulier pour les cellules immunitaires et structurels.
Intra-trachéale, administration en aérosol, intrapéritonéale ou systémique de LPS sont largement utilisés pour induire pulmonaire expérimentale blessure24,25,26et ont montré pour induire la perméabilité épithéliale et endothéliale les défauts. Ici nous utilisons intrapéritonéales LPS pour induire un modèle septique de lésion pulmonaire aiguë chez les souris. Dans les 24h de l’administration intrapéritonéale de LPS, défauts de perméabilité sont induites dans les poumons avec le recrutement des cellules inflammatoires. En outre, nous montrons qu’exosomes de BAL contiennent miRNA-155 et miR-146 a, et induire des exosomes de LBA expression de cytokines pro-inflammatoires dans les cellules épithéliales bénéficiaires, y compris l’IL-6 et TNF-α. Ces données sont les premiers à montrer qu’exosomal miARN sont sécrétées en BAL dans ce modèle de lésion pulmonaire septique aiguë.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modèles murins de maladies sont couramment utilisés pour évaluer la fonction physiologique des gènes spécifiques et de réduire le coût de l’expérimentation2. La lésion pulmonaire septique aiguë décrite ici imite la réponse inflammatoire chez les humains avec SDRA. Ce modèle est pertinent pour étudier la pathogenèse moléculaire, développement de biomarqueurs et de tester de potentielles nouvelles thérapies5.
Des systèmes de co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs n’ont déclaré aucun conflit d’intérêts.
Materials
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Escherichia coli 055:B5 | |
| PBS pH7.2(1X) | Life technologies | 20012-027 | |
| mirVana miRNA isolation kit | Thermo Fisher | 449774 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher | 4369016 | |
| mmu-miR-155 (002571) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| has-miR-146a (000468) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| U6snRNA primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| TNF-α(Mm00443258_m1 ) primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| IL-6 (Mm00446190_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| ZO-1 (Mm00493699_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| minimal essential medium (MEM) | Thermo Fisher | 11095-072 | |
| Trysin-EDTA solution(0.05%) | Thermo Fisher | 25300054 | |
| Exosomes were labeled with PKH67 through PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Exosome Spin Columns (MW3000) | Thermo Fisher | 4484449 | |
| Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher | ||
| transmission electron microscopes (TEM) | JEOL Ltd | 120 kV TEM | |
| Olympus BX41 microscope | Olympus | BX41 |
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