Alvéolaire Lavage Exosomen in Lipopolysaccharid-induzierte septischen Lungenschädigung
Summary
Mäusen intraperitoneal LPs absondern exosomen in Broncho-alveoläre Lavage (BAL) Flüssigkeit, die mit MiRNAs verpackt sind. Ein Kokulturen-System verwenden, zeigen wir, dass exosomen veröffentlicht in der BAL-Flüssigkeit engen Kreuzung Proteinexpression in bronchialen Epithelzellen stören und Ausdruck von Pro-inflammatorischen Zytokinen, die Lungenschädigung betonen zu erhöhen.
Abstract
Akute Lungenschädigung (ALI) und akute Atemnotsyndrom (ARDS) repräsentieren eine heterogene Gruppe von Lungenkrankheiten, die nach wie vor eine hohe Morbidität und Mortalität haben. Die molekulare Pathogenese von ALI wird besser definiert; jedoch aufgrund der Komplexität der Krankheit müssen Molekulare Therapien erst noch entwickelt werden. Hier verwenden wir ein Lipopolysaccharid (LPS) induzierte Mausmodell der akuten septischen Lungenschädigung, um die Rolle der exosomen in der entzündlichen Reaktion zu beschreiben. Mit diesem Modell konnten wir zeigen, dass Mäuse, die intraperitoneale LPS ausgesetzt sind, exosomen in Broncho-alveoläre Lavage (BAL) Flüssigkeit aus der Lunge absondern, die verpackt sind, mit MiRNA und Zytokine die entzündliche Reaktion zu regulieren. Weiter mit kokultur Modellsystem, zeigen wir, dass exosomen veröffentlicht von Makrophagen engen Kreuzung Proteinexpression in bronchialen Epithelzellen stören. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass (1) Übersprechen zwischen angeborenen immun- und strukturelle Zellen durch die Exosomal pendelt beitragen, die entzündliche Reaktion und Störung der strukturelles Hindernis und (2) diese MiRNAs targeting kann eine neuartige Plattform zur Behandlung von ALI und ARDS.
Introduction
ALI und ARDS sind die lebensbedrohliche Formen der respiratorische Insuffizienz mit schweren Hypoxämie, verursacht durch nicht-kardiogenen Lungenödem betrifft etwa 1 Million Menschen weltweit pro Jahr1. Die Ätiologie des ARDS umfasst direkte Verletzung zu den Lungen von Infektionen oder Aspiration und eine Vielzahl von indirekten Beleidigungen. Im letzten Jahrzehnt gab es ein besseres Verständnis der molekularen Pathogenese des ARDS, gezielten Spezialbehandlungen für ARDS sind jedoch noch zu2,3entwickelt.
Verschiedenen Tiermodellen der akuten Lungenversagen sind entwickelt worden, die eine Brücke bieten, für die Übersetzung von experimentellen Therapien auf Studien am Menschen4,5. Häufigsten verwendeten Modelle verfügen über lokale Installation von Ölsäure, Bakterien, LPS und Bleomycin. Andere Ansätze sind Ischämie-Reperfusion, cecal Ligatur Punktion, mechanische Lüftung-induzierte Stretch Verletzungen, hyperoxie oder systemischen Verabreichung von Bakterien und LPS5. Diese Modelle bieten ein nützliches biologische System um klinische Hypothesen zu testen und für die Entwicklung von möglichen Therapien. Um menschliche ARDS zu simulieren, sollten Tiermodellen Entzündungen und akute Verletzung der epithelialen und endothelial Zellen mit defekten in Barriere-Funktion in der Lunge reproduzieren.
Exosomen sind membranvesikel mit 20-200 nm im Durchmesser, deren molekulare Inhalt Lipide, Proteine, DNA und RNA enthält, und Inter Mobilfunk in Gewebe Mikroumgebung über Molekulare Zusammensetzung Transfer erleichtern. Exosomen sind mehrere Arten von Zellen, wie endothelial Zellen, Epithelzellen, glatten Muskelzellen und Tumor-Zellen sezerniert und im menschlichen Körper Flüssigkeit vorhanden. Studien zeigen, dass exosomen Übersprechen zwischen Immunzellen und Stromazellen Zellen bei Infektions- und sterilen entzündlichen Erkrankungen regulieren und ihre abnorme Release erscheint durch die verschiedenen natürlichen und experimentellen Stimuli während physiologische geregelt werden und pathologische Prozesse6. Solchen Kommunikationsnetz kann eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Lungenerkrankungen und pathophysiologischen Fortschreiten7,8beeinträchtigen. So 18-22 Nukleotid nicht-kodierende RNAs, MiRNAs vorhanden im Gewebe und Körperflüssigkeiten, Plasma, Serum und modulieren mRNA Expression am Post-translationalen Ebene9,10.
Verpackte MiRNAs in exosomen zu beeinflussen, Differenzierung und Funktion von mehreren Arten von Zellen und übermässigem sind verbunden mit einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Krebs, Lungenkrankheiten, Fettleibigkeit, Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankungen11, 12,13,14,15,16. Einstieg in den empfängerzellen und pendelt von Exosomal MiRNAs erleichtern interzelluläre Kommunikation ändern die Blutstillung Mikroumgebung17,18. Akutes Lungenversagen ist eine komplexe Prozesse, bei denen mehrere Zelltypen mit umfangreichen interzelluläre Kommunikation durch exosomen8. MiR-155 und MiR-146a Teilen der gemeinsamen transkriptionelle Regulierungsmechanismus und dazu beitragen, die entzündliche Reaktion und die Immuntoleranz19,20. Aktuelle Studien zeigen, dass sowohl entzündliche Reaktion über Exosomal MiRNAs pendeln zwischen Immunzellen21modulieren. Jedoch die molekularen Mechanismen, die modulierende Effekte der Exosomal MiRNAs alveoläre Reaktion auf Endotoxin bleiben unklar, zweifellos die potenzielle klinische Relevanz und Translationale Implikation Verdienst weitere Untersuchungen.
Kokultur Modelle werden eingesetzt, um die Interaktion der spezifischen Zelltypen im komplexen Umfeld, wie Entzündungen und Krebs22,23zu definieren. Diese Plattformen bieten eine alternative Strategie zur Nebensprechen zwischen Zelltypen besonders für immun- und strukturelle Zellen zu befragen.
Intra-trachealen, Aerosol, intraperitoneal oder systemische Gabe von LPS sind weit verbreitet, experimentelle Lunge Verletzungen24,25,26zu induzieren und haben gezeigt, dass die Durchlässigkeit von epithelialen und endotheliale induzieren Mängel. Hier verwenden wir intraperitoneale LPS, um septische Modellcharakter für die akute Lungenschädigung bei Mäusen zu induzieren. Innerhalb 24 h nach intraperitonealer Gabe von LPS induziert werden Permeabilität Defekte in der Lunge bei der Einstellung von Entzündungszellen. Darüber hinaus zeigen wir, dass exosomen aus BAL MiRNA-155 und MiR-146a enthalten, und exosomen von BAL-Flüssigkeit Pro-inflammatorischen Zytokinen Ausdruck im Empfänger Epithelzellen induzieren, wie IL-6 und TNF-α. Diese Daten sind erstmals zeigen, dass Exosomal MiRNAs sind in diesem Modell der akuten septischen Lungenschädigung in BAL abgesondert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mausmodelle von Krankheiten werden üblicherweise verwendet, um die physiologische Funktion bestimmter Gene bewerten und zur Reduzierung der Kosten des Experimentierens2. Die akute septische Lungenversagen beschrieben hier imitiert Entzündungsreaktion bei Menschen mit ARDS gesehen. Dieses Modell ist relevant, die molekulare Pathogenese, Entwicklung von Biomarkern zu untersuchen und mögliche neue Therapien5zu testen.
Kokultur Systeme sind releva…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt erklärt.
Materials
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Escherichia coli 055:B5 | |
| PBS pH7.2(1X) | Life technologies | 20012-027 | |
| mirVana miRNA isolation kit | Thermo Fisher | 449774 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher | 4369016 | |
| mmu-miR-155 (002571) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| has-miR-146a (000468) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| U6snRNA primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| TNF-α(Mm00443258_m1 ) primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| IL-6 (Mm00446190_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| ZO-1 (Mm00493699_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| minimal essential medium (MEM) | Thermo Fisher | 11095-072 | |
| Trysin-EDTA solution(0.05%) | Thermo Fisher | 25300054 | |
| Exosomes were labeled with PKH67 through PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Exosome Spin Columns (MW3000) | Thermo Fisher | 4484449 | |
| Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher | ||
| transmission electron microscopes (TEM) | JEOL Ltd | 120 kV TEM | |
| Olympus BX41 microscope | Olympus | BX41 |
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