Bronchoalveolar लेवेज Exosomes Lipopolysaccharide-प्रेरित सेप्टिक फेफड़ों में चोट
Summary
चूहों के संपर्क में intraperitoneal एलपीएस स्रावित exosomes में ब्रॉन्को-वायुकोशीय लेवेज (बाल) द्रव है कि miRNAs के साथ पैक कर रहे हैं. एक सह संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर, हम बताते है कि exosomes बाल द्रव में तंग जंक्शन प्रोटीन की अभिव्यक्ति में जारी बाधित उपकला कोशिकाओं और समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस की अभिव्यक्ति में वृद्धि कि फेफड़ों की चोट का दबाव का चिह्न ।
Abstract
एक्यूट फेफड़े की चोट (अली) और तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम (ARDS) फेफड़ों के रोगों जो एक उच्च रुग्णता और मृत्यु के लिए जारी है की एक विषम समूह का प्रतिनिधित्व करते हैं । अली की आणविक रोगजनन को बेहतर ढंग से परिभाषित किया जा रहा है; हालांकि, रोग आणविक चिकित्सा के जटिल प्रकृति के कारण अभी तक विकसित किया जाना है । यहाँ हम भड़काऊ प्रतिक्रिया में exosomes की भूमिका चित्रित करने के लिए तीव्र सेप्टिक फेफड़ों की चोट के एक lipopolysaccharide (एलपीएस) प्रेरित माउस मॉडल का उपयोग करें. इस मॉडल का उपयोग कर, हम कि चूहों कि वायुकोशीय और लेवेज जो भड़काऊ प्रतिक्रिया को विनियमित के साथ पैक कर रहे हैं फेफड़ों से ब्रॉन्को-miRNA साइटोकिंस (बाल) द्रव में intraperitoneal एलपीएस स्रावित exosomes उजागर कर रहे हैं दिखाने के लिए सक्षम थे. इसके अलावा एक सह संस्कृति मॉडल प्रणाली का उपयोग कर, हम बताते है कि exosomes से जारी मैक्रोफेज की अभिव्यक्ति में बाधा से तंग जंक्शन प्रोटीन के दमा उपकला कोशिकाओं. इन परिणामों का सुझाव है कि 1) exosomal गढ़शंकर के माध्यम से जंमजात प्रतिरक्षा और संरचनात्मक कोशिकाओं के बीच पार बात भड़काऊ प्रतिक्रिया और संरचनात्मक बाधा के विघटन और 2 के लिए योगदान) इन miRNAs लक्ष्यीकरण एक उपंयास मंच प्रदान करने के लिए इलाज कर सकते है अली आणि ARDS.
Introduction
अली और ARDS गंभीर hypoxemia गैर फुलाव फुफ्फुसीय शोफ जो लगभग १,०००,००० लोगों को दुनिया भर में प्रतिवर्ष1को प्रभावित करता है के कारण के साथ श्वसन विफलता के जीवन धमकी रूपों रहे हैं । ARDS के एटियलजि में संक्रमण या आकांक्षा और कई तरह के अप्रत्यक्ष अपमान से फेफड़ों में सीधी चोट भी शामिल है. पिछले दशक में वहां ARDS के आणविक रोगजनन की वृद्धि हुई समझ गया है, तथापि, ARDS के लिए विशिष्ट लक्षित उपचार अभी तक2,3विकसित किया जाना है ।
तीव्र फेफड़ों की चोट के कई पशु मॉडलों को विकसित किया गया है जो मानव अध्ययन4,5के लिए प्रयोगात्मक चिकित्सा के अनुवाद के लिए एक पुल प्रदान करते हैं । आमतौर पर इस्तेमाल किया मॉडल ओलिक एसिड, बैक्टीरिया, एलपीएस, और ब्लीयामीसिन के स्थानीय अधिष्ठापन शामिल हैं । अंय दृष्टिकोण ischemia-reperfusion, cecal बंधाव पंचर, यांत्रिक वेंटिलेशन-प्रेरित खिंचाव चोट, hyperoxia या बैक्टीरिया और एलपीएस के प्रणालीगत प्रशासन5शामिल हैं । ये मॉडल नैदानिक परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए और संभावित उपचारों के विकास के लिए एक उपयोगी जैविक प्रणाली प्रदान करते हैं । मानव ARDS अनुकरण करने के लिए, पशु मॉडलों फेफड़ों में बाधा समारोह में दोषों के साथ उपकला और endothelial कोशिकाओं को सूजन और तीव्र चोट पुन: पेश करना चाहिए ।
Exosomes व्यास, जिसका आणविक सामग्री में 20-200 एनएम के साथ झिल्ली बुलबुले प्रोटीन होते हैं, डीएनए, आरएनए, और लिपिड, और आणविक संरचना हस्तांतरण के माध्यम से ऊतक microenvironment में अंतर सेलुलर संचार की सुविधा. Exosomes कोशिकाओं के कई प्रकार, जैसे endothelial कोशिकाओं, उपकला कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं के द्वारा स्रावित कर रहे हैं, और मानव शरीर द्रव में मौजूद हैं । अध्ययनों से संकेत मिलता है कि exosomes संक्रामक और बाँझ भड़काऊ रोगों के दौरान प्रतिरक्षा कोशिकाओं और stromal कोशिकाओं के बीच पार बात को विनियमित, और उनके असामान्य रिलीज शारीरिक के दौरान विभिन्न प्राकृतिक और प्रयोगात्मक उत्तेजनाओं द्वारा विनियमित किया जा करने के लिए प्रकट होता है और रोग प्रक्रियाओं6। इस तरह के संचार नेटवर्क फेफड़ों के रोगों के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है और pathophysiological प्रगति7,8को प्रभावित कर सकता है । के रूप में 18-22 न्यूक्लियोटाइड गैर कोडिंग RNAs, miRNAs ऊतक और शरीर के तरल पदार्थ, प्लाज्मा, सीरा, और पोस्ट-शोधोंस्तर9, 10 पर mRNA अभिव्यक्ति मिलाना में मौजूद हैं ।
डिब्बाबंद miRNAs में exosomes प्रभाव भेदभाव और कोशिकाओं के कई प्रकार के समारोह, और अत्यधिक स्तर रोगों की एक किस्म के साथ जुड़े रहे हैं, कैंसर सहित, फेफड़ों के रोगों, मोटापा, मधुमेह, और हृदय रोग11, 12,13,14,15,16. प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में प्रवेश और गढ़शंकर exosomal miRNAs के microenvironment17,18के रक्तस्तम्भन को संशोधित करने के लिए सेलुलर संचार की सुविधा । एक्यूट फेफड़ों की चोट एक जटिल प्रक्रियाओं, exosomes8के माध्यम से व्यापक सेलुलर संचार के साथ कई सेल प्रकार शामिल है । मीर-१५५ और मीर-146a आम transcriptional विनियामक तंत्र साझा करें और भड़काऊ प्रतिक्रिया और प्रतिरक्षा सहिष्णुता के लिए योगदान19,20. हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि दोनों exosomal miRNAs गढ़शंकर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच के माध्यम से भड़काऊ प्रतिक्रिया को21मॉडुलन । हालांकि, आणविक तंत्र exosomal miRNAs के वायुकोशीय प्रतिक्रिया पर modulatory अंतर्निहित endotoxin के लिए अस्पष्ट, निस्संदेह संभावित नैदानिक प्रासंगिकता और शोधों निहितार्थ आगे की जांच योग्यता रहते हैं ।
सह संस्कृति मॉडल जैसे कि सूजन और कैंसर22,23के रूप में जटिल वातावरण में विशिष्ट कोशिका प्रकार की बातचीत को परिभाषित करने के लिए नियोजित किया जा रहा है । इन प्लेटफार्मों विशेष रूप से प्रतिरक्षा और संरचनात्मक कोशिकाओं के लिए सेल प्रकार के बीच क्रॉस टॉक पूछताछ करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति प्रदान करते हैं ।
इंट्रा सांस, एयरोसोल, intraperitoneal या एलपीएस के प्रणालीगत प्रशासन व्यापक रूप से प्रयोगात्मक फेफड़ों की चोट24,25,26प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, और उपकला और endothelial पारगम्यता प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है दोष. यहां हम intraperitoneal एलपीएस का उपयोग करने के लिए चूहों में तीव्र फेफड़े की चोट के एक सेप्टिक मॉडल प्रेरित । एलपीएस के intraperitoneal प्रशासन के 24 ज के भीतर, पारगम्यता दोषों भड़काऊ कोशिकाओं की भर्ती के साथ फेफड़ों में प्रेरित कर रहे हैं । इसके अलावा, हम बताते है कि बाल से exosomes miRNA-१५५ और मीर-146a होते हैं, और बाल द्रव से exosomes, आईएल-6 और साइटोकिंस-TNF सहित प्राप्तकर्ता उपकला कोशिकाओं में समर्थक भड़काऊ α अभिव्यक्ति प्रेरित । इन आंकड़ों से पता चलता है कि पहले exosomal miRNAs बाल में तीव्र सेप्टिक फेफड़ों की चोट के इस मॉडल में स्रावित होते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
रोगों के माउस मॉडल सामांयतः विशिष्ट जीन के शारीरिक समारोह का मूल्यांकन करने के लिए और प्रयोग2की लागत को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है । तीव्र सेप्टिक फेफड़ों की चोट यहाँ वर्णित भड़काऊ प्र…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने हितों का टकराव नहीं होने का ऐलान किया है ।
Materials
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Escherichia coli 055:B5 | |
| PBS pH7.2(1X) | Life technologies | 20012-027 | |
| mirVana miRNA isolation kit | Thermo Fisher | 449774 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher | 4369016 | |
| mmu-miR-155 (002571) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| has-miR-146a (000468) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| U6snRNA primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| TNF-α(Mm00443258_m1 ) primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| IL-6 (Mm00446190_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| ZO-1 (Mm00493699_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| minimal essential medium (MEM) | Thermo Fisher | 11095-072 | |
| Trysin-EDTA solution(0.05%) | Thermo Fisher | 25300054 | |
| Exosomes were labeled with PKH67 through PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Exosome Spin Columns (MW3000) | Thermo Fisher | 4484449 | |
| Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher | ||
| transmission electron microscopes (TEM) | JEOL Ltd | 120 kV TEM | |
| Olympus BX41 microscope | Olympus | BX41 |
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