Бронхоальвеолярный лаваж Exosomes в Липополисахарид индуцированной септик легких травм
Summary
Мышей в внутрибрюшинного ПЛАСТИНОК выделяют exosomes в жидкости бронхо альвеолярные промывание (БАЖ), которые упакованы с адаптивной. С помощью системы совместного культуры, мы показывают, что exosomes, выпущенный в жидкости бал нарушить экспрессию белков жесткой перехода в бронхиальной эпителиальных клеток и увеличить выражение провоспалительных цитокинов, что подчеркнет повреждения легких.
Abstract
ОПЛ (Али) и острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) представляют собой разнородную группу легочных заболеваний, который продолжает иметь высокие показатели заболеваемости и смертности. Молекулярный патогенез Али в настоящее время лучше определены; Однако ввиду сложного характера заболевания молекулярной терапии еще не разработаны. Здесь мы используем модель индуцированных мыши липополисахарида (LPS) септик ОПЛ разграничить роль exosomes в воспалительной реакции. С помощью этой модели, мы смогли показать, что мышей, которые подвергаются воздействию внутрибрюшинного ПЛАСТИНОК выделяют exosomes в бронхо альвеолярные промывание (BAL) жидкости из легких, которые упакованы с Мирна и цитокины, которые регулируют воспалительной реакции. Далее с помощью системы модель совместного культуры, мы показываем, что exosomes выпущена с макрофаги нарушить экспрессию белков жесткой перехода в бронхиальной эпителиальных клеток. Эти результаты показывают, что 1) кросс talk между врожденной иммунной и структурных клетки через exosomal челночные способствовать воспалительной реакции и нарушения структурных барьеров и 2) ориентации этих адаптивной может предоставить новые платформы для лечения Али и ОРДС.
Introduction
Али и ОРДС являются опасные для жизни формы дыхательной недостаточности с тяжелой гипоксемия, вызванные non кардиогенный отек легких, которая затрагивает около 1 миллиона человек во всем мире ежегодно1. Этиология ОРДС включает прямой травмы легких от инфекции или аспирации и целый ряд косвенных оскорбления. За последнее десятилетие наблюдается рост понимания молекулярный патогенез ОРДС, однако, конкретных целевых лечения ОРДС еще быть разработаны2,3.
Были разработаны несколько животных модели острого повреждения лёгких, которые обеспечивают мост для перевода экспериментальной терапии для человека исследования4,5. Часто используемые модели включают в себя местные установки олеиновой кислоты, бактерий, ПЛАСТИНОК и блеомицин. Другие подходы включают ишемии реперфузии, сенситизации лигирование прокол, механические ИВЛ индуцированное стрейч травмы, гипероксия или системного администрирования бактерий и LPS5. Эти модели обеспечивают полезные биологические системы для тестирования клинических гипотезы и для разработки потенциальных терапий. Чтобы имитировать человека ОРДС, Животные модели следует воспроизвести воспаления и острой травмы эпителиальных и эндотелиальных клеток с дефектами в барьерные функции в легких.
Exosomes мембрана везикулы с 20-200 Нм в диаметре, содержание которых молекулярный содержит белки, ДНК, РНК и липидов, и облегчить между сотовой связи в ткани микроокружения молекулярного состава переводом. Exosomes выделяется несколько типов клеток, таких как эндотелиальные клетки, клетки эпителия, гладкомышечные клетки и клетки тумора и существуют в человеческий организм жидкости. Исследования показывают, что exosomes регулировать перекрестных помех между иммунные клетки и стромальных клеток при инфекционных и стерильные воспалительных заболеваний, и их аномальные релиз, как представляется, регулируются различные природные и экспериментальных стимулы при физиологических и6патологических процессов. Такие сети связи могут играть важную роль в патогенезе легочных заболеваний и может повлиять на патофизиологические прогрессирования7,8. Как 18-22 нуклеотидов некодирующих РНК, адаптивной существуют в ткани и жидкости организма, плазмы, сера и модулировать выражение mRNA в столб-поступательные уровня9,10.
Фасованные интерферирующим в exosomes влияние дифференциации и функции различных типов клеток, и чрезмерные уровни связаны с целым рядом заболеваний, включая рак, легочных заболеваний, ожирения, диабета и сердечно-сосудистых заболеваний11, 12,13,14,,1516. Вступление в получателя клетки и челночные exosomal интерферирующим облегчить межклеточные связи, изменения гемостаза микроокружения17,18. Острого повреждения лёгких-это сложные процессы, с участием нескольких типов клеток с обширной межклеточных коммуникаций через exosomes8. Мир-155 и мир 146А общий механизм transcriptional регулирования и способствовать воспалительной реакции и Иммунологическая толерантность19,20. Недавние исследования показывают, что оба модуляции воспалительной реакции через exosomal интерферирующим челночные иммунные клетки21. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе модулирующее влияние exosomal интерферирующим на альвеолярной ответ эндотоксина остаются неясными, несомненно потенциальных клинической значимости и заслуг трансляционная последствия дальнейшего расследования.
Совместное культуры модели используются для определения взаимодействия типов конкретных клеток в сложных условиях, таких как воспаление и рак22,23. Эти платформы предоставляют альтернативную стратегию допросить кросс talk между типами клеток, особенно для иммунной и структурных клеток.
Внутри трахеи, аэрозольных, внутрибрюшинного или системного администрирования LPS широко используются для стимулирования экспериментальной легких повреждений24,25,26и показали, чтобы побудить проницаемость эпителия и эндотелиальных дефекты. Здесь мы используем внутрибрюшинного LPS побудить децентрализованная модель острого повреждения легких у мышей. В течение 24 h внутрибрюшинного администрации LPS проницаемость дефектов наведенные в легких с набора воспалительных клеток. Кроме того мы показывают, что exosomes от бал содержат Мирна-155 и мир 146А, и exosomes от жидкости бал побудить выражение провоспалительных цитокинов в получателей эпителиальных клеток, включая ИЛ-6 и ФНО α. Эти данные являются первым, чтобы показать, что exosomal интерферирующим выделяется в бал в этой модели септик ОПЛ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модели мыши заболеваний широко используются для оценки физиологические функции конкретных генов и уменьшить стоимость экспериментов2. Септик ОПЛ описанных здесь имитирует воспалительной реакции, видел в людях с ОРДС. Эта модель имеет отношение к расследованию молекуляр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы заявили никакого конфликта интересов.
Materials
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Escherichia coli 055:B5 | |
| PBS pH7.2(1X) | Life technologies | 20012-027 | |
| mirVana miRNA isolation kit | Thermo Fisher | 449774 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher | 4369016 | |
| mmu-miR-155 (002571) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| has-miR-146a (000468) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| U6snRNA primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| TNF-α(Mm00443258_m1 ) primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| IL-6 (Mm00446190_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| ZO-1 (Mm00493699_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| minimal essential medium (MEM) | Thermo Fisher | 11095-072 | |
| Trysin-EDTA solution(0.05%) | Thermo Fisher | 25300054 | |
| Exosomes were labeled with PKH67 through PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Exosome Spin Columns (MW3000) | Thermo Fisher | 4484449 | |
| Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher | ||
| transmission electron microscopes (TEM) | JEOL Ltd | 120 kV TEM | |
| Olympus BX41 microscope | Olympus | BX41 |
References
- Rubenfeld, G. D., Herridge, M. S. Epidemiology and outcomes of acute lung injury. Chest. 131, 554-562 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L485-L497 (2012).
- Han, S., Mallampalli, R. K. The acute respiratory distress syndrome: from mechanism to translation. Journal of immunology. , 855-860 (1950).
- Aeffner, F., Bolon, B., Davis, I. C. Mouse Models of Acute Respiratory Distress Syndrome: A Review of Analytical Approaches, Pathologic Features, and Common Measurements. Toxicologic pathology. 43, 1074-1092 (2015).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L379-L399 (2008).
- Terrasini, N., Lionetti, V. Exosomes in Critical Illness. Critical care medicine. , (2017).
- Fujita, Y., Kadota, T., Araya, J., Ochiya, T., Kuwano, K. Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity. American journal of respiratory cell and molecular biology. , (2017).
- Kubo, H. Extracellular Vesicles in Lung Disease. Chest. 153, 210-216 (2018).
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nature reviews. Genetics. 11, 597-610 (2010).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Fanini, F., Fabbri, M. CANCER-DERIVED EXOSOMIC microRNAs SHAPE THE IMMUNE SYSTEM WITHIN THE TUMOR MICROENVIRONMENT: STATE OF THE ART. Seminars in cell & developmental biology. , (2016).
- Agarwal, U., et al. Experimental, Systems, and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation research. 120, 701-712 (2017).
- Prattichizzo, F., et al. Extracellular microRNAs and endothelial hyperglycaemic memory: a therapeutic opportunity?. Diabetes, obesity & metabolism. 18, 855-867 (2016).
- Huang-Doran, I., Zhang, C. Y., Vidal-Puig, A. Extracellular Vesicles: Novel Mediators of Cell Communication In Metabolic Disease. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 28, 3-18 (2017).
- Khalyfa, A., et al. Circulating Plasma Extracellular Microvesicle MicroRNA Cargo and Endothelial Dysfunction in Children with Obstructive Sleep Apnea. American journal of respiratory and critical care medicine. 194, 1116-1126 (2016).
- Thomou, T., et al. Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues. Nature. 542, 450-455 (2017).
- Gregson, A. L., et al. Altered Exosomal RNA Profiles in Bronchoalveolar Lavage from Lung Transplants with Acute Rejection. American journal of respiratory and critical care medicine. 192, 1490-1503 (2015).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature cell biology. 9, 654-659 (2007).
- Doxaki, C., Kampranis, S. C., Eliopoulos, A. G., Spilianakis, C., Tsatsanis, C. Coordinated Regulation of miR-155 and miR-146a Genes during Induction of Endotoxin Tolerance in Macrophages. Journal of immunology. , 5750-5761 (2015).
- Schulte, L. N., Westermann, A. J., Vogel, J. Differential activation and functional specialization of miR-146 and miR-155 in innate immune sensing. Nucleic acids research. 41, 542-553 (2013).
- Alexander, M., et al. Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin. Nature communications. 6, 7321 (2015).
- Yuan, Z., et al. TREM-1 is induced in tumor associated macrophages by cyclo-oxygenase pathway in human non-small cell lung cancer. PloS one. 9, e94241 (2014).
- Xu, R., Richards, F. M. Development of In Vitro Co-Culture Model in Anti-Cancer Drug Development Cascade. Combinatorial chemistry & high throughput screening. 20, 451-457 (2017).
- Yuan, Z., et al. TREM-1-accentuated lung injury via miR-155 is inhibited by LP17 nanomedicine. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L426-L438 (2016).
- Sadikot, R. T., et al. High-dose dexamethasone accentuates nuclear factor-kappa b activation in endotoxin-treated mice. American journal of respiratory and critical care medicine. 164, 873-878 (2001).
- Yuan, Z., et al. Curcumin mediated epigenetic modulation inhibits TREM-1 expression in response to lipopolysaccharide. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 2032-2043 (2012).
- Chauret, C. P., et al. Chlorine dioxide inactivation of Cryptosporidium parvum oocysts and bacterial spore indicators. Applied and environmental microbiology. 67, 2993-3001 (2001).
- Cizmar, P., Yuana, Y. Detection and Characterization of Extracellular Vesicles by Transmission and Cryo-Transmission Electron Microscopy. Methods in molecular biology. , 221-232 (2017).
- Yuan, Z., et al. HIV-related proteins prolong macrophage survival through induction of Triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Scientific reports. 7, 42028 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Analysis of Mitochondrial Transfer in Direct Co-cultures of Human Monocyte-derived Macrophages (MDM) and Mesenchymal Stem Cells (MSC). Bio-protocol. 7, (2017).
- Fujita, Y., et al. Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity. American journal of respiratory cell and molecular biology. 17, 474-484 (2017).
- Gunasekaran, M., et al. Donor-Derived Exosomes With Lung Self-Antigens in Human Lung Allograft Rejection. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 474-484 (2017).
- Kalra, H., et al. Comparative proteomics evaluation of plasma exosome isolation techniques and assessment of the stability of exosomes in normal human blood plasma. Proteomics. 13, 3354-3364 (2013).
- Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PloS one. 10, e0145686 (2015).
- Nordin, J. Z., et al. Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties. Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine. 11, 879-883 (2015).
