Summary
यहाँ, हम मानव ताजा और जमे हुए आंत्र बायोप्सी में cytoplasmic और परमाणु प्रोटीन के उपसेलुलर जुदाई के लिए एक सरल सेलुलर विभाजन प्रदर्शन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।
Abstract
इस प्रोटोकॉल के प्रयोजन के लिए मानव आंत्र fractionate के लिए परमाणु और cytoplasmic डिब्बों में विशिष्ट प्रोटीन या विभिन्न ऊतक राज्यों में प्रोटीन परिसरों के स्थानीयकरण विश्लेषण के लिए एंडोस्कोपी द्वारा प्राप्त (यानी, स्वस्थ बनाम रोग) । इस विधि दोनों ताजा और जमे हुए आंत्र ऊतक नमूनों के अंश के लिए उपयोगी है; यह आसानी से सभी प्रयोगशालाओं और नहीं समय लेने के लिए सुलभ है ।
Introduction
प्रोटीन एक कोशिका के भीतर लगभग सभी जैविक कार्यों में भाग लेते हैं और उनकी संरचना, मात्रा या स्थान में किसी भी भिन्नता का कारण रोगजनक परिदृश्य हो सकता है । ऊतक नमूना भिन्नीकरण विधियों से संबंधित प्रोटीन विश्लेषण रोग की जटिलता को कम करने के लिए एक उपयोगी तरीका है । कुछ अध्ययनों से प्रोटीन स्थानीयकरण की जानकारी का उपयोग करें या एक विशिष्ट सेलुलर डिब्बे से एक प्रोटीन को समृद्ध, तो बरकरार प्रोटीन के reproducible अंश के लिए एक प्रोटोकॉल के लिए कुछ जैविक प्रश्नों का जवाब उपयोगी है । प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण का निर्धारण और उनके डिब्बा पुनर्वितरण या बेसल और रोग की स्थिति पर बातचीत की निगरानी में मदद मिलेगी रोग संबंधित कार्यात्मक मतभेद1,2की पहचान । इस प्रकार, इस विधि को reproducibly fractionate आंत्र ऊतक बायोप्सी, दोनों ताजा और जमे हुए, cytoplasmic और परमाणु उपसेलुलर डिब्बों में करना है ।
आंतों बायोप्सी नमूने नियमित रूप से इंडोस्कोपिक प्रक्रियाओं3 (चित्रा 1) के दौरान प्राप्त कर रहे हैं और प्रभावी रूप से प्रोटीन ठहराव या immunoprecipitation अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । आंत्र उपकला से ऊतक के नमूने के बाद से सीधे रोग रोगजनन4में शामिल किया जा सकता है कि प्रोटीन शामिल होंगे, आंतों बायोप्सी के नमूने आंतों रोग की सफल पहचान के लिए एक बहुत ही मूल्यवान स्रोत हैं-विशिष्ट प्रोटीन. जमे हुए संग्रहीत, रोगी ऊतक नमूने नैदानिक जानकारी के साथ एक साथ प्रोटीन विश्लेषण के लिए उपयोगी संसाधन हैं, और एक सरल और reproducible नमूना तैयारी एक प्रमुख मुद्दा जमे हुए की मात्रा सीमित का उपयोग कर सेल डिब्बा जानकारी प्रदान करने के लिए है ऊतक5.
वहां सेलुलर भागों के जुदाई के लिए कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट हैं, लेकिन इन और अधिक महंगी और आम तौर पर अधिक समय लेने से यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल की तुलना में कर रहे हैं । एकाधिक-चरण ग्रैडिएंट केंद्रापसारक और निरंतर ग्रेडिएंट पर आधारित प्रोटोकॉल्स भी पहले विभिंन ऊतकों6,7में विविध सेलुलर डिब्बों के अंश के लिए उपयोग किया गया है । हालांकि, सतत ढाल की निरंतरता को बनाए रखना अक्सर एक मुश्किल काम है । झिल्ली की अनुक्रमिक lysis पर आधारित समान प्रोटोकॉल पहले वर्णित किया गया है लेकिन वे आम तौर पर दो से अधिक बफ़र्स की जरूरत है और समय पर हाथ8 अब है ।
जब फ्रैक् ऊतक के नमूने, मन में भालू है कि ऊतक के नमूनों सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत है कि दोनों संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं में मौजूद नहीं है और महत्वपूर्ण जब प्रोटीन निष्कर्षण के लिए आगे बढ़ रहे हैं । कोशिकाओं और प्रोटीन की गुणवत्ता को प्रभावित किए बिना extracellular मैट्रिक्स के बीच उचित टूटने आंत्र ऊतक प्रोटीन अलगाव9में एक महत्वपूर्ण कारक होगा । इस प्रोटोकॉल में, कक्ष-कक्ष और कक्ष-मैट्रिक्स संपर्क पहले टूट रहे हैं, कक्षों को रिलीज़ कर रहे है और बफ़र को व्यक्तिगत कक्षों तक पहुंचने की अनुमति दे रहे हैं । अंश से पहले मिश्रण प्रोटीन डिब्बे से बचने के लिए, संपर्कों के टूटने कोशिकाओं या परमाणु झिल्ली की अखंडता को बदलने के बिना होने चाहिए ।
आंत्र म्यूकोसा10में विभिन्न टीज़ के संवर्धन के कारण, यह निष्कर्षण के दौरान प्रोटीन क्षरण को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है । संभावित प्रोटीन गिरावट को कम करने के लिए, एकाधिक चिढ़ाना अवरोधक प्रोटीन निष्कर्षण बफ़र्स में शामिल किया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त, यदि अर्क कार्यात्मक परख के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं, यह प्रोटीन या प्रोटियोलिसिस के विकार से बचने के लिए आवश्यक है के रूप में इस प्रोटीन गतिविधि11की हानि का कारण होगा । इस प्रयोजन के लिए, प्रोटोकॉल 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है और ताजा phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF) ०.१ मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में बफर के लिए जोड़ा गया है बस आगे प्रोटियोलिसिस को बाधित करने के लिए उपयोग करने से पहले.
कोशिका अंश में पहला कदम ऊतक व्यवधान और कोशिका lysis है. जैसा कि पहले उल्लेख किया है, उद्देश्य के लिए कोशिकाओं को समग्र और टूट उंहें ंयूनतम क्षति के साथ खुला है । आंतों के ऊतकों के नमूनों homogenized होना चाहिए, और कोशिकाओं लीजड ड कोशिका झिल्ली की अधिकतम टूटना प्राप्त करने के लिए । इस प्रोटोकॉल में, हम उच्च गति भंवर कार्रवाई के माध्यम से सेकंड के भीतर homogenized है जो आंतों के ऊतकों को तोड़ने के लिए एक मोटर-मूसल मिक्सर का उपयोग करें । homogenization के बाद, ऊतक कोशिकाओं एक hypotonic बफर कि कोशिका झिल्ली फट जाएगा, लेकिन नाभिक बरकरार रखने के लिए, एक गैर denaturing डिटर्जेंट (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) और अलग नाभिक के लिए एक छोटा भंवर के अलावा के बाद रखेंगे में मशीन हैं cytoplasmic अंश से. कोशिका द्रव्य के हटाने के बाद, कोशिका नाभिक झिल्ली झटकों के साथ एक hypertonic बफर में फट है ।
विधि यहां प्रस्तुत एक उपयुक्त विधि ताजा और जमे हुए आंत्र बायोप्सी है कि इंडोस्कोपिक प्रक्रियाओं और 2 और 10 के बीच सीमा के दौरान प्राप्त किया गया है के उपसेलुलर अंश के लिए वजन में मिलीग्राम है । प्रोटोकॉल आसान और reproducible है और एक घंटे के अंतर्गत में बुनियादी प्रयोगशाला उपकरण और रिएजेंट का उपयोग किया जा सकता है ।
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Protocol
यह अध्ययन Cruces विश्वविद्यालय अस्पताल नैतिकता बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था और सभी विषयों या उनके माता-पिता से सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद विश्लेषण किया गया था ।
1. बायोप्सी संग्रह
नोट: रोगियों के बाहर ग्रहणी से बायोप्सी नमूनों नियमित निदान एंडोस्कोपी प्रबंध बायोप्सी के दौरान प्राप्त कर रहे हैं कि 2 और 10 के बीच सीमा वजन में मिलीग्राम. biopsied किया ऊतक एक जटिल उपकला, प्रतिरक्षा और endothelial कोशिकाओं सहित विभिन्न कोशिका प्रकार से बना ऊतक है. नैदानिक gastroenterologists नैदानिक दिशानिर्देश स्थापित निम्नलिखित एंडोस्कोपी करते हैं ।
- बस एंडोस्कोपी के बाद एक बाँझ फिल्टर कागज पर बायोप्सी रखें ।
- का प्रयोग करें संदंश १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में बायोप्सी हस्तांतरण, उंहें पंजाबियों के साथ भिगोने, और यह एक cryotube में जगह है ।
- बर्फ पर ट्यूबों रखें जब तक वे प्रयोगशाला में पहुंचें ।
- ताजा बायोप्सी की प्रोसेसिंग तुरंत शुरू करें ।
- जमे हुए बायोप्सी के लिए, फ्लैश ट्यूब युक्त बायोप्सी फ्रीज और तरल नाइट्रोजन में स्टोर का उपयोग करें जब तक ।
नोट: यह नमूना जब तक ठंड पूरक बफर 1 जोड़ा जाता है जमे रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।
2. बफर तैयारी
नोट: प्रारंभ करने से पहले, बफ़र्स निम्नानुसार पूरक है ।
- 1 मिमी डीटीटी (अंतिम एकाग्रता) और चिढ़ाने और hypotonic बफर 1 और hypertonic बफर 2 (तालिका 1) के लिए फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल (1x अंतिम एकाग्रता) जोड़ें ।
- बफर के 1 और १५० µ एल के १.५ मिलीलीटर तैयार नमूना प्रति 2 । डीटीटी नमूनों के ऑक्सीकरण पर रोक लगेगी ।
- 1% डिटर्जेंट (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) पहले से ही पूरक 1 बफर करने के लिए ०.१% की एक अंतिम एकाग्रता को जोड़कर नाभिक धो बफर तैयार करें । नमूना प्रति नाभिक वॉश बफ़र की 1 मिलीलीटर तैयार करें ।
3. बायोप्सी Homogenization
-
ताजा बायोप्सी
- मोटर चालित मिक्सर में डिस्पोजेबल खल रखें । यह सुनिश्चित करें कि ट्यूब के नीचे मूसल पहुंच जाए ।
- cryotube से बाहर बायोप्सी ले लो और यह एक पिपेट टिप के साथ एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में जगह है ।
- १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए पूरक बफर 1 के २०० µ एल जोड़ें ।
- जब तक ऊतक पूरी तरह से बाधित है और यह बर्फ पर रखने के मूसल के साथ बायोप्सी Homogenize ।
- एक बार सभी बायोप्सी चरण 4 के साथ आगे बढ़ना homogenized हैं ।
नोट: डिस्पोजेबल मूसल बायोप्सी के बीच बदला जाना चाहिए ।
-
जम बायोप्सी
चेतावनी: तरल नाइट्रोजन ध्यान से संभाल; त्वचा या आंखों के साथ तरल नाइट्रोजन का संपर्क गंभीर ठंड चोट के कारण हो सकता है । हाथ और आंखों की रक्षा हमेशा जब तरल नाइट्रोजन के साथ काम कर रहे ।- एक बॉक्स में कुछ तरल नाइट्रोजन ले लो cryotubes नाइट्रोजन टैंक से प्राप्त की दुकान ।
- नाइट्रोजन टैंक में बायोप्सी ढूंढें और cryotube को तरल नाइट्रोजन के साथ बॉक्स में लगाएं । सभी बायोप्सी के लिए इस चरण को दोहराएँ ।
- cryotube से एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए बायोप्सी स्थानांतरण ।
नोट: बायोप्सी फ्रोजन ट्यूब से जुड़ी होगी । यह ट्यूब से अलग होगा तो एक बाँझ पिपेट टिप के साथ बायोप्सी पुश. - जोड़ २०० µ एल के पूरक बफर 1 ।
- Homogenize के ऊतकों को खल और मोर्टार का उपयोग करने तक ऊतक पूरी तरह से बाधित है, सभी प्रक्रिया भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रखने ।
नोट: बफ़र जोड़ने से पहले बायोप्सी गल न दें ।
4. कोशिका द्रव्य अलगाव
- 10 मिनट के लिए बर्फ पर homogenized बायोप्सी मशीन ।
- ०.०५% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक नमूने के लिए 1% डिटर्जेंट (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) के 10 µ एल जोड़ें ।
नोट: कोशिकाओं प्रफुल्लित और हल्के डिटर्जेंट कोशिका झिल्ली को बाधित करेगा के रूप में आसमाटिक lysis से फट जाएगा । - 5 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
- भंवर संक्षेप में और 2 मिनट के लिए 4 ˚ सी में ४०० x g पर केंद्रापसारक ।
- भंवर के बाद, supernatant निकालें और यह एक नया साफ १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण; यह cytoplasmic अंश होगा. गोली मत छोड़ना ।
5. परमाणु अलगाव
- नाभिक धोने बफर के २०० µ एल के साथ पिछले कदम से गोली resuspend ।
- ४०० x जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक ।
- supernatant को त्यागें और दो बार वाशिंग प्रक्रिया दोहराएं ।
नोट: परमाणु अंश में cytoplasmic संदूषण को बहाकर दूर कर देंगे । - तीसरे धोने के बाद, 2 बफर के १०० µ एल में गोली resuspend ।
- 30 मिनट के लिए 4 ˚ सी में नमूना जोरदार शेक. वैकल्पिक रूप से, बर्फ और भंवर पर नमूना हर 5 मिनट की मशीन ।
- झटकों के बाद, शीर्ष गति से 10 मिनट के लिए नमूना केंद्रापसारक (> १२,००० x g) और 4 ° c ।
- भंवर के बाद, एक नया साफ १.५ में supernatant हस्तांतरण । एमएल ट्यूब । यह परमाणु अंश होगा.
6. प्रोटीन ठहराव
नोट: एक bicinchoninic एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख किट के साथ प्रोटीन यों तो । अंशों में प्रोटीन की सांद्रता ०.५ और 5 µ g/µ l के बीच होगी, जो नाभिकीय अंश में कम है (2 मिलीग्राम बायोप्सी से परिणामी प्रोटीन सांद्रता के लिए तालिका 2 देखें) ।
- निम्नलिखित गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) मात्रा (µ g)12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6 के साथ एक मानक वक्र तैयार करें ।
- नमूना प्रति अंतिम बीसीए मिश्रण के १०० µ एल का उपयोग करने के लिए आवश्यक एजेंट तैयार करते हैं ।
- पिपेट एक ९६ अच्छी प्लेट में प्रत्येक प्रोटीन अंश के 2 µ एल, बीसीए मिश्रण जोड़ें और पढ़ने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें ।
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Representative Results
चित्रा 1 बरकरार विल्ली और तहखाना संरचनाओं के साथ एक आंत्र बायोप्सी खंड के एक hematoxylin eosin दाग से पता चलता है ।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर परमाणु और cytoplasmic अंश के प्रतिनिधि परिणाम 2 और 3 आंकड़े में दिखाए जाते हैं । चित्रा 2, एक ताजा (एफ एच) और एक जमे हुए (Fz) बायोप्सी में दिखाया प्रयोग में एक साथ fractionated थे प्रोटोकॉल के बाद यहां प्रस्तुत किया और एक पश्चिमी दाग प्रत्येक नमूने के 20 μg का उपयोग किया गया था । प्रत्येक अंश और बायोप्सी में प्रोटीन सांद्रता 2 तालिकामें दिखाया गया है, और प्रोटीन सांद्रता ताजा और जमे हुए ऊतकों के बीच बहुत अलग नहीं हैं । 2 मिलीग्राम बायोप्सी से निकाली गई प्रोटीन की पैदावार लगभग 3-4 µ g/µ l के cytoplasmic अंश में है और नाभिकीय अंश में लगभग १.५ µ g/µ l अंशों की शुद्धता की जाँच करने के लिए, HSP90 और tubulin एक cytoplasmic नियंत्रण और HDAC1 और H3 के रूप में एक परमाणु नियंत्रण13के रूप में इस्तेमाल किया गया था । यह देखा जा सकता है कि HSP90 और tubulin कोशिका द्रव्य और HDAC1 और H3 में स्थित प्राथमिक दो भागों के बीच बहुत कम मिश्रण के बीच नाभिक में स्थित हैं । का आकलन करने के लिए कि प्रोटोकॉल कोशिका मृत्यु को प्रभावित करता है, हम भी caspase 3 की उपस्थिति के लिए blotted । 2 चित्रासे, दोनों नमूने caspase 3 के लिए एक बहुत कम धुंधला की पुष्टि है कि प्रक्रिया कोशिका मौत मार्ग भी फ्लैश ठंड बायोप्सी के बाद प्रभावित नहीं करता है मौजूद । यह भी विश्लेषण किया गया था अगर प्रोटीन संशोधनों की प्रक्रिया के बाद बनाए रखा है, तो प्रोटीन बहाव कार्यात्मक परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । PhosphoSTAT1 इस अंश में इस्तेमाल किया जमे हुए बायोप्सी एक आंत्र भड़काऊ हालत के साथ एक व्यक्ति से आया के रूप में धुंधला के लिए इस्तेमाल किया गया था; यह ताजा बायोप्सी के सच नहीं है । के रूप में की उंमीद है, phosphoSTAT1 जमे हुए बायोप्सी के कोशिका द्रव्य में स्थित है, पुष्टि है कि प्रोटीन संशोधनों के अंश के बाद बनाए रखा जाता है ।
फ्रोजन बायोप्सी का उपयोग करने वाली विधि का reproducibility चित्रा ३में दिखाया गया है. एक पश्चिमी दाग तीन स्वतंत्र जमे हुए बायोप्सी के अंश के बाद प्रदर्शन किया गया था, और अंशों ंयूनतम डिब्बे प्रोटीन मिश्रण (चित्रा 3ए): HSP90 cytoplasmic अंश और परमाणु अंश में HDCA1 में स्थित के साथ साफ कर रहे हैं । इसके अतिरिक्त, XPO1 प्रोटीन है कि दोनों परमाणु और cytoplasmic भागों में मौजूद है14 भी blotted था । यह देखा जा सकता है कि ImageJ द्वारा XPO1 quantified के स्तर प्रत्येक अंश (चित्र बी. ए.) में स्थिर होते हैं, विभिन्न बायोप्सी का उपयोग करके परिणामों की reproducibility की पुष्टि करते हैं.
चित्रा 1 : एक आंत्र उपकला अनुभाग के प्रकाश micrograph, hematoxylin eosin के साथ दाग, इंडोस्कोपिक प्रक्रिया द्वारा अधिग्रहीत एक बायोप्सी से. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : प्रतिनिधि एक उपसेलुलर एक ताजा (एफ एच) और एक जमे हुए (Fz) बायोप्सी में प्रदर्शन अंश के पश्चिमी दाग । HSP90 और tubulin परमाणु नियंत्रण के रूप में cytoplasmic नियंत्रण और HDAC1 और H3 के रूप में इस्तेमाल किया गया । CASP3 व phosphoSTAT3 की उपस्थिति का भी आकलन किया गया ।
चित्रा 3 : तीन स्वतंत्र जमे हुए बायोप्सी के अंश परिणाम । (एक) एक उपसेलुलर भिन्नीकरण के प्रतिनिधि पश्चिमी दाग तीन जमे हुए बायोप्सी में प्रदर्शन किया (1, 2 और 3). HSP90 एक cytoplasmic नियंत्रण और HDAC1 के रूप में परमाणु नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । XPO1 के स्थानीयकरण का भी आकलन किया गया. (ख) ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग किया अंश में से प्रत्येक में XPO1 के सापेक्ष ठहराव । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| बफ़र | घटक | नोट्स |
| Hypotonic बफ़र 1 | 10 मिमी HEPES पीएच ७.९ | १.५ एमएल बफर सैंपल/ |
| 10 एमएम KCl | ||
| ०.१ nmM EDTA | ||
| Hypertonic बफ़र 2 | 20 एमएम HEPES नं० ७.९ | १५० µ l बफर नमुना/ |
| ४०० मिमी NaCl | ||
| ०.१ मिमी EDTA | ||
| * नोट: बफ़र्स एक महीने के लिए 4 º c पर संग्रहीत किया जा सकता है । | ||
| * * नोट: बफ़र्स उपयोग करने से पहले proteinase और फॉस्फेट अवरोधकों और डीटीटी के साथ पूरक होना करने के लिए है | ||
तालिका 1: बफ़र संरचना ।
| ताजा | जमे हुए | |
| कोशिका द्रव्य | २.९७५ | ४.६१२ |
| नाभिक | १.५१६ | १.३८५ |
तालिका 2: एक ताजा और जमे हुए 2 मिलीग्राम बायोप्सी चित्रा 2में इस्तेमाल में अंशों में से प्रत्येक के प्रोटीन एकाग्रता; एकाग्रता में प्रस्तुत है μg/μL ।
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Discussion
प्रोटोकॉल यहां वर्णित आंत्र बायोप्सी के परमाणु और cytoplasmic अंश के लिए प्रयोग किया जाता है । शुद्ध प्रोटीन विकृत नहीं कर रहे है और न केवल पश्चिमी दाग विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में चित्र 2 और 3 में दिखाया गया है, लेकिन यह भी immunoprecipitation जैसे देशी-जोड़ प्रोटीन की आवश्यकता परख में, electrophoretic गतिशीलता पारी परख (EMSA) या नेटिव polyacrylamide जेल ट्रो (PAGE) ।
वर्णित विधि आसमाटिक lysis के साथ एक साथ ऊतक के यांत्रिक homogenization पर निर्भर करता है के लिए परमाणु झिल्ली को प्रभावित किए बिना कोशिका झिल्ली फट । परिणाम cytoplasmic और नाभिकीय प्रोटीन दोनों के बहाव के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक साफ अंश है । यह प्रोटीन और फॉस्फेट अवरोधकों के अलावा द्वारा प्रक्रिया के दौरान प्रोटीन के क्षरण को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, अगर निकाले प्रोटीन के बहाव कार्यात्मक परख के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं, यह भी विकार और नमूनों की प्रोटियोलिसिस से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । प्रक्रियाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए और PMSF भी बफ़र्स करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए.
इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रिया सरल और सस्ती है, और नमूना प्रसंस्करण समय कम है । लंबे समय प्रसंस्करण समय और महंगा अंश किट के उपयोग के रूप में समस्याओं इस प्रोटोकॉल में बाधाओं नहीं हैं ।
ताजा और जमे हुए बायोप्सी दोनों इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है, जमे हुए बायोप्सी के साथ काफी स्वच्छ और reproducible अंश परिणाम के रूप में चित्र 2 और 3में देखा दे । यदि डिब्बा संदूषण है तो कोशिका द्रव्य के लिए परमाणु की रिहाई से बचने के लिए कोशिका lysis समय को कम किया जा सकता है और धुलाई के कदमों को परमाणु डिब्बे में cytoplasmic संदूषण से बचने के लिए जोड़ा जा सकता है.
परमाणु और cytoplasmic प्रोटीन भागों के लिए स्वतंत्र विश्लेषण के लिए जमे हुए ऊतकों का उपयोग करने की संभावना आंत्र भड़काऊ रोगों जिसमें जमे हुए बायोप्सी जमा हो जाती है के बारे में हमारे ज्ञान में वृद्धि कर सकते हैं । इसके अलावा, इस तकनीक बायोप्सी द्वारा अधिग्रहीत मानव ऊतकों के अंय प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । उपयोग बफ़र्स की मात्रा बायोप्सी के आकार के आधार पर संशोधित किया जाना चाहिए ।
प्रोटोकॉल यहां वर्णित reproducible ऊतक भागों उत्पंन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है; हालांकि, नमूने के भीतर कुछ आंतरिक परिवर्तनशीलता, आकार और ऊतक की स्थिति सहित, प्रोटीन राशि और वितरण प्रत्येक अंश में प्रबंधित में विचलन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक वीडियो रिकॉर्डिंग और संपादन के लिए Ander लोपेज और मिरेन Telletxea की सहायता स्वीकार करते हैं । एसीआर एक Ikerbasque फैलोशिप और Asociación de Celiacos मैड्रिड (ACM) से एक अनुसंधान परियोजना द्वारा वित्त पोषित है । JRB परियोजना ISCIII द्वारा वित्त पोषित है-PI16/00258 और सह यूरोपीय संघ ERDF द्वारा वित्त पोषित/ESF "एक तरह से यूरोप बनाने के लिए" । है स्वास्थ्य बास्क विभाग के एक अनुसंधान परियोजना अनुदान २०१५१११०६८ द्वारा वित्त पोषित है । IRG और AJM UPV/एहु और बास्क शिक्षा विभाग, क्रमशः से डॉक्टरेट फैलोशिप अनुदान द्वारा समर्थित हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
References
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
- Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization. eLife. 5, (2016).
- Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , Greenwich Medical Media. (1998).
- Alex, P., Gucek, M., Li, X. Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies. Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).
- Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis. Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).
- Hoffmann, K., et al. New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).
- Foster, L. J., et al. A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling. Cell. 125 (1), 187-199 (2006).
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Börner, A., et al. Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues. BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).
- Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology. Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).
- Cutler, P. Protein purification protocols. , Humana Press. (2004).
- Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).
- McLane, L. M., et al. Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).
- Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease. International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).
