Summary
ここでは、人間および冷凍腸生検で細胞質および核蛋白質の細胞レベル下の分離の簡単な細胞分画を実行するプロトコルを提案する.
Abstract
このプロトコルの目的は特定の蛋白質または異なる組織状態 (すなわち、健全な蛋白質の複合体の局在解析用核と細胞質コンパートメントに内視鏡検査によって得られる人間の腸組織を分別するには対病)。このメソッドは両方生鮮・冷凍の腸組織サンプルの分別のため便利簡単にアクセスできるすべての研究所、いない時間がかかるです。
Introduction
蛋白質はセル内のほぼすべての生物学的機能に参加し、構成、量や場所の変化は、病原性のシナリオにつながることができます。組織サンプルの分別方法は病気の複雑さを軽減する有用なアプローチ関連タンパク質解析。いくつかの研究蛋白質ローカライズ情報を使用または特定の細胞内コンパートメントからタンパク質を豊かにそのままな蛋白質の再現可能な分別のためのプロトコルは特定の生物的質問に答えるために役立ちます。タンパク質の細胞内局在を決定し、彼らのコンパートメントの再配布または基底での相互作用を監視病態の疾患の識別に役立つ、関連する機能の違い1,2。したがって、このメソッドは、再現性をもって分別腸組織生検、新鮮、冷凍、細胞質と核の細胞内コンパートメントを目指しています。
腸生検内視鏡手順3 (図 1) 日常的に得られる、タンパク質定量や免疫沈降法研究の効果的に使用できます。疾患病態4に直接かかわることができる蛋白質、腸上皮組織試料に含まれるので腸生検サンプル、腸疾患固有の成功の識別のための非常に貴重な情報源蛋白質。タンパク質解析のための有用な資源であり、シンプルで再現性のある試料は制限量を使用して細胞コンパートメント情報を提供するためにキー問題臨床情報と共にストアド冷凍、患者組織サンプルを凍結組織5。
細胞分画の分離のためのいくつかの市販キットがありますが、これらはより高価で、一般的に時間がかかるここで提示されたプロトコルよりも。多段勾配遠心法に基づいてプロトコルおよび連続的な勾配はまた以前使用された異なったティッシュ6、7の多様な細胞コンパートメントの分別のため。連続的な勾配の一貫性を維持することは、しばしば困難な作業です。膜の連続溶解に基づく類似したプロトコルが以前に記載されているが、彼らは一般的に 3 つ以上のバッファーを必要し、時間に手が長く8 。
組織サンプルを分留するとき覚えておいてその組織培養細胞の存在も重要な蛋白質の抽出に進む、サンプル プレゼント細胞間や細胞-マトリックスの対話。細胞と細胞外基質タンパク質の質に影響を与えることがなく適切な内訳を腸組織タンパク質分離9で重要な要因となります。このプロトコルでセルとセル行列連絡先最初壊れている、セルを解放し、個々 のセルに到達するバッファーを許可します。タンパク質コンパートメント分別に混合を避けるためには、細胞や原子膜の完全性を変えることがなく連絡先の内訳があります。
による小腸粘膜10様々 なプロテアーゼの濃縮、抽出中にタンパク質の分解を制御することが重要です。潜在的なタンパク質の分解を抑えるタンパク質抽出バッファーに複数のプロテアーゼ阻害剤を含める必要があります。さらに、抽出機能アッセイに使用する場合は、このタンパク質活動11の損失が発生、タンパク質やタンパク質の変性を避けるために不可欠です。このため、プロトコルは 4 ° C で行われた、新鮮な特異フッ化物 (PMSF) が 0.1 mM を使って、さらにタンパク質分解を阻害する直前の最終濃度でバッファーに追加されます。
セル分別の最初のステップは、組織の混乱とセル換散です。前述のように、目的は細胞とそれらを最小限のダメージでこじ開けるを細かく分けたです。腸の組織サンプルを均質化する必要がありますと、細胞が細胞膜の最大破壊を達成するために分離します。このプロトコルでは数秒以内に高速ボルテックス アクションによる均質化は腸の組織を分割するのにモーターを備えられた杵ミキサーを使用します。均質化後、細胞に細胞膜を破裂が、核をそのまま維持、非変化洗剤 (ノニル phenoxypolyethoxylethanol) と核を分離する短い渦の加え、続いて低張バッファーで孵化します。細胞質分画。細胞核は細胞質を除去した後揺れで高張バッファーどっと。
ここで紹介した方法は、内視鏡手術と重 2 と 10 mg の間の範囲の間に得られた生鮮・冷凍の腸生検の細胞レベル下の分別のための適切なメソッドです。プロトコルは簡単で再現性のある、基本的な実験装置および時間の下で試薬を使用して実行可能性があります。
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Protocol
本研究はラスクルーセス大学病院倫理委員会によって承認された、すべての科目や両親からインフォームド コンセントを得た後分析を行った。
1. 生検コレクション
注: 患者の遠位十二指腸生検重量 2 〜 10 mg 間の範囲の通常の診断内視鏡生検の管理中に取得されます。生検組織は、異なる細胞など上皮、免疫および血管内皮細胞から成る複雑な組織です。臨床消化器内科内視鏡検査を実行する確立された臨床ガイドラインに従う。
- 内視鏡検査後だけ滅菌フィルター ペーパーに生検を配置します。
- 1.5 mL チューブに生検を転送し、PBS でそれらを浸し、cryotube に鉗子を使用します。
- 研究室に到着するまで、氷の上の管を保ちます。
- すぐに新鮮な生検の処理を開始します。
- 凍結生検、フラッシュ チューブを含む生検を凍結し、使用するまで液体窒素で格納します。
注: 1 冷たい補われたバッファーが追加されるまで凍結サンプルを保つために重要です。
2. バッファー準備
注: 始める前に、バッファーを次のとおり補足します。
- 1 mM DTT (最終濃度) を追加し、プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤カクテル (最終濃度 x 1) 低張バッファー 1 および高張にバッファー 2 (表 1)。
- 1 サンプルあたり 2 バッファーのバッファー 1、150 μ L の 1.5 mL を準備します。DTT は、サンプルの酸化を防ぐ。
- 既に補われたバッファー 1 0.1% の最終濃度 1% 洗剤 (ノニル phenoxypolyethoxylethanol) を追加することによって核洗浄バッファーを準備します。1 mL のサンプルあたり核洗浄バッファーを準備します。
3. 生検均質化
-
新鮮な生検
- 電動ミキサーで使い捨ての杵を配置します。杵が管の底に達することを確認します。
- Cryotube から、生検を取り出し、ピペット チップを 1.5 mL チューブに配置。
- 1.5 mL チューブに補われたバッファー 1 の 200 μ L を追加します。
- 杵で生検を均質化組織は完全に崩壊するまで氷の上保管してください。
- すべてのバイオプシーが均質化した後は、手順 4 に進みます。
注: 使い捨てすりこぎは、バイオプシーの間変更する必要があります。
-
冷凍生検
注意: 慎重に液体窒素を取り扱い皮膚や目に液体窒素との接触は、凍結重傷を引き起こす可能性があります。液体窒素を使用するときに常に手や目を保護します。- いくつかの液体窒素を窒素タンクから取得した cryotubes を保存するボックスで取る。
- 生検は、窒素タンクと液体窒素でボックスに、cryotube を配置します。すべての生検のためには、この手順を繰り返します。
- 1.5 mL チューブに、cryotube から生検を転送します。
注: 生検は凍結チューブに添付されます。それは管から接続解除されますので滅菌ピペット チップで生検をプッシュします。 - 補われたバッファー 1 の 200 μ L を追加します。
- 乳棒と乳鉢を使用して、組織は完全に崩壊するまで、すべてのプロシージャ全体で 4 ° C の温度を維持する組織をホモジナイズしてください。
注: バッファーを追加する前に解凍生検をてはいけないです。
4. 細胞質の分離
- 10 分間氷の上の均質化の生検を孵化させなさい。
- 各サンプルを最終濃度 0.05% に 1% 洗剤 (ノニル phenoxypolyethoxylethanol) の 10 μ L を追加します。
注: セルにうねり、浸透圧換散によってバースト中性洗剤は細胞膜を破壊します。 - 氷で 5 分間インキュベートします。
- 簡単に渦と 4 ° C で 400 x g で 2 分間遠心します。
- ボルテックス後、上澄みを除去し、新しいきれいな 1.5 mL チューブ; に転送これは細胞質画分になります。ペレットは捨てないでください。
5. 核隔離
- 核洗浄バッファーの 200 μ L で前の手順からペレットを再懸濁します。
- 400 x g と 4 ° C で 2 分間チューブを遠心分離します。
- 上澄みを廃棄し、さらに 2 回洗濯の手順を繰り返します。
注: 核の細胞質の汚染は、洗浄が削除されます。 - 第 3 洗浄後バッファー 2 の 100 μ L にペレットを再懸濁します。
- また 30 分の 4 ° C でサンプルを積極的に振る、氷と渦 5 分ごとにサンプルをインキュベートします。
- 後揺れ、トップ スピードで 10 分間のサンプルを遠心分離機 (> 12,000 g x) および 4 ° C
- ボルテックス後、新しいきれいな 1.5 に上清を移します。mL のチューブ。これは、核分画になります。
6. プロテインの定量
注: 定量化ビシンコニン酸 (BCA) タンパク質アッセイ キットとタンパク質です。分数の蛋白質の濃度が範囲 0.5 ~ 5 μ g/μ L、核の一部分に低く (2 mg 生検から得られた蛋白質濃度の表 2を参照)。
- 次のウシ血清アルブミン (BSA) 量 (μ g)12の標準曲線の準備: 0-0.5-1-2-3-4-5-6。
- サンプルあたり BCA ファイナルミックスの 100 μ L を使用するために必要な試薬を準備します。
- 96 ウェル プレートに各蛋白分画の 2 μ L をピペット BCA ミックスを追加して、読書のための製造元の指示に従ってください。
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Representative Results
図 1は、ヘマトキシリン エオシン染色腸生検部そのまま絨毛と地下構造を示しています。
このプロトコルを使用して核および細胞質分別の代表の結果は、図 2および3に示します。冷凍 (Fz) フレッシュ (Fh)、図 2に示すように実験で生検はここで提示されたプロトコルを次を同時に分別された、西部のしみは、各サンプルの 20 μ g を用いて行われました。各画分および生検でタンパク質濃度が表 2に示す、タンパク質の濃度は非常に新鮮な凍結組織間で異なるありません。2 mg 生検から抽出したタンパク質の収量は周り 3-4 μ g/μ L 細胞質画分の核分画の約 1.5 μ g/μ L。分数の純度を確認するは、HSP90 とチューブリンは細胞質コントロールとして使用された HDAC1 と核コントロール13として H3。それは、細胞質にある、HSP90 とチューブリンがプライマリ、2 つの分数の間非常に最小限の混合核にある HDAC1 と H3 に観察できます。プロトコル細胞死に影響を与えるかどうかを評価するために、我々 はまたカスパーゼ 3 の存在を消されました。図 2、両方のサンプルはカスパーゼ 3 がプロシージャが flash の生検を凍結後も細胞死のパスを与えないことを確認するため非常に最小限の染色を提示します。下流の機能試金のための蛋白質を使用できるように、手順の後、蛋白質の修正が保持している場合への対応にも行った。PhosphoSTAT1 は腸の炎症性の条件を持つ個人から来たこの分別で使用される冷凍生検、染色用これは新鮮な生検の真ではありません。予想通り、phosphoSTAT1 は分別後、蛋白質の修正が保持されることを確認する、冷凍の生検の細胞質にあります。
冷凍生検を用いた手法の再現性は、図 3に示すです。西部のしみを凍結生検、3 つの独立の分別後行ったし、分数は、最小区画蛋白質 (図 3 a) を混合きれい: HSP90 が核の細胞質画分および HDCA1 にあります。さらに、両方の核と細胞質画分の14に存在する XPO1 蛋白質はまた消されました。XPO1 ImageJ による定量化のレベルが異なるバイオプシーを使用して結果の再現性を確認する (図 3 b)、各分数で安定していることが観察できます。
図 1: 生検内視鏡操作によって取得からのヘマトキシリン エオシンのステンド_グラス、腸の上皮部の光学顕微鏡像。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: フレッシュ (Fh) と冷凍 (Fz) 生検で細胞レベル下の分別の代表の西部のしみ方が実行されます。HSP90 とチューブリンは、原子力のコントロールとして細胞質コントロール、HDAC1 と H3 として使用されました。CASP3 と phosphoSTAT3 の存在も評価しました。
図 3: 凍結生検 3 つ独立の分別結果。(A)細胞レベル下の分別の代表の西部のしみ方が 3 つ凍結生検 (1、2、3) で実行されます。HSP90 は核抑止として細胞質制御、HDAC1 として使用されました。XPO1 の局在も検討した.(B)各 ImageJ ソフトウェアを使用して行われる分数の XPO1 の相対的な定量化。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| バッファー | コンポーネント | ノート |
| 低張性バッファー 1 | 10 mM HEPES pH 7.9 | 1.5 ml のバッファー/サンプル |
| 10 mM KCl | ||
| 0.1 nmM EDTA | ||
| 高張バッファー 2 | 20 mM HEPES pH 7.9 | 150 μ l バッファー/サンプル |
| 400 mM の NaCl | ||
| 0.1 mM EDTA | ||
| * 注: バッファーは 4ºC で一ヶ月保存できます。 | ||
| * * 注: バッファーがあるプロティナーゼおよびホスファターゼ阻害剤と DTT を使用する前に補充するには | ||
表 1: バッファー組成物。
| 新鮮です | 冷凍 | |
| 細胞質 | 2.975 | 4.612 |
| 核 | 1.516 | 1.385 |
図 2で使用されている新鮮な冷凍 2 mg 生検で分数のそれぞれのテーブル 2: 蛋白質の集中濃度は、μ g/μ L で示されます。
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Discussion
ここで説明したプロトコルは腸生検の核および細胞質分別のため使用されます。浄化された蛋白質が変性していないとだけでなく、免疫沈降、電気泳動の移動性シフト試金 (EMSA) などのネイティブ折り畳まれたタンパク質を必要とするアッセイにも図 2と3に示されて西部のしみの分析で使用できますかネイティブ ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ)。
この方法は、核膜に影響を与えずに細胞膜を破裂する浸透圧溶解とともに組織の力学的均質化に依存します。結果は、ダウン ストリームの解析に使用する細胞質、核タンパク質のきれいな分別です。蛋白質およびホスファターゼ阻害剤の添加によるプロセス中にタンパク質の分解を制御することが重要です。さらに、抽出されたタンパク質は、下流の機能アッセイに使用するが場合も、変性およびサンプルの分解を避けるために重要です。4 ° C でプロセスを実行する必要があります、PMSF はバッファーにも追加する必要があります。
このプロトコルで説明されている手順はシンプルで、手頃な価格、サンプル処理時間は最小限。処理時間が長い、高価な分画キットの使用などの問題は、このプロトコルでは制約ではありません。
生鮮・冷凍の生検両方使用できますこのプロトコルで凍結生検図 2および3に見られるように非常にきれいな、再現性のある分別結果を与えると。区画の汚染がある場合核の細胞質への放出を避けるために細胞溶解時間を短縮でき、核内細胞質汚染を避けるために洗浄手順を追加できます。
核と細胞質蛋白の独立した分析のための凍結するティッシュを使用する可能性は、冷凍の生検が格納されている腸の炎症性疾患に関する知識を増やすことができます。さらに、この手法はヒト組織生検によって取得の他の種類に合わせることができます。使用されるバッファーの量は、生検のサイズに応じて変更しなければなりません。
ここで説明されているプロトコルは再現性のある組織画分; を生成する設計されていますただし、サンプル内のいくつかの本質的な変動、サイズと組織の状態などを含むタンパク質の量と分布の各分画の管理の偏差につながります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、ビデオ録画や編集の Ander ロペスとみれん Telletxea の支援を認めます。ACR は、Ikerbasque ・ フェローシップ ・隣人・ デ ・ Celiacos マドリード (ACM) から研究プロジェクトによって資金を供給します。JRB はプロジェクト ISCIII-PI16/00258 によって資金を供給、共同欧州連合 ERDF/ESF「ヨーロッパをさせる方法」によって資金を供給されます。バスク保健省の研究プロジェクト助成 2015111068 によって資金を供給されます。IRG と AJM それぞれ UPV/EHU とバスク語教育部門からまた、博士課程フェローシップ助成金によってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
References
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