Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以执行一个简单的细胞分离的胞质和核蛋白在人类新鲜和冰冻肠道活检。
Abstract
本议定书的目的是分级人肠道组织获得的内窥镜进入核和细胞质室, 以定位分析特定的蛋白质或蛋白质复合体在不同的组织状态 (即,健康与疾病)。该方法对新鲜和冷冻小肠组织标本的分馏有重要意义;它是容易接近的所有实验室, 而不是费时。
Introduction
蛋白质参与细胞内几乎所有的生物功能, 其结构、数量或位置的任何变化都可能导致致病性的情况。组织样品分馏法是降低疾病相关蛋白质分析复杂性的有效方法。一些研究使用蛋白质定位信息或丰富一个特定细胞室的蛋白质, 因此, 一个完整的蛋白质可再生分馏的协议是有用的回答某些生物学问题。确定蛋白质的亚细胞定位和监测其在基础和疾病条件下的区划再分配或相互作用, 将有助于确定与疾病相关的功能差异1,2。因此, 该方法的目的是重现性分级小肠组织活检, 无论是新鲜和冷冻, 进入细胞质和核亚细胞室。
肠道活检标本通常获得在内窥镜程序3 (图 1), 可以有效地用于蛋白质定量或免疫沉淀研究。由于肠道上皮组织样本将含有可能直接参与疾病发病机制4的蛋白质, 肠道活检标本是成功鉴别肠道疾病特异性的一个非常有价值的来源。蛋白质。储存冷冻, 病人组织样本连同临床信息是蛋白质分析的有用资源, 一个简单和可重复的样品准备是提供细胞区划信息的关键问题, 使用限制数量的冷冻组织5。
有几个商业可用的工具包分离的细胞分数, 但这些是更昂贵的, 一般比这里提出的协议花费更多的时间。基于多级梯度离心和连续梯度的协议以前也被用于不同组织6、7中各种细胞间隔的分馏。但是, 保持连续渐变的一致性往往是一项艰巨的任务。先前已经描述了基于连续裂解膜的类似协议, 但通常需要两个以上的缓冲器, 而手的时间更长8 。
当分馏组织样品时, 请记住, 组织样本呈现细胞细胞和细胞基质相互作用, 它们既不存在于培养细胞中, 又在蛋白质提取过程中很重要。在不影响蛋白质质量的情况下, 细胞与胞外基质的适当分解将是肠道组织蛋白分离9的关键因素。在这个协议中, 细胞细胞和细胞矩阵的接触首先被打破, 释放细胞并允许缓冲区到达各个细胞。为了避免在分馏之前进行蛋白质间的混合, 必须在不改变细胞或核膜完整性的情况下进行接触击穿。
由于肠道黏膜10中各种蛋白酶的丰富, 在提取过程中控制蛋白质降解具有重要意义。为了尽量减少潜在的蛋白质降解, 必须将多种蛋白酶抑制剂包括在蛋白质提取缓冲器中。此外, 如果提取物将用于功能化验, 这是必要的, 以避免蛋白质变性或蛋白水解, 因为这将导致蛋白质活性的损失11。为此, 该协议的执行在4摄氏度, 新鲜的 phenylmethylsulfonyl 氟化物 (PMSF) 被添加到缓冲区在最后浓度为0.1 毫米之前, 使用进一步抑制蛋白质水解。
细胞分馏的第一步是组织破坏和细胞裂解。如前所述, 其目的是将细胞分解, 并以最小的损伤打开。肠道组织样品必须均匀化, 细胞裂解以达到最大的细胞膜断裂。在本协议中, 我们使用电动杵式搅拌机打破了在几秒钟内均匀化的肠道组织通过高速涡流行动。均匀化后, 组织细胞在低渗缓冲中孵化, 它会爆裂细胞膜, 但会使细胞核保持完好, 其次是添加非变性洗涤剂 (壬 phenoxypolyethoxylethanol) 和短涡来分离细胞核。从细胞质分数。胞浆切除后, 细胞细胞核膜爆裂成高渗缓冲液, 晃动。
本文提出的方法是在内镜手术中获得的新鲜和冰冻小肠活检的亚细胞分馏的适当方法, 在2至10毫克的重量范围内。该协议简单、重现性好, 可在一小时内使用基本的实验室设备和试剂进行。
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Protocol
这项研究获得了该大学医院伦理委员会的批准, 并在获得所有受试者或其父母的知情同意后进行分析。
1. 活检收集
注: 患者远端十二指肠活检标本可在常规诊断内窥镜下进行, 检查范围为2至10毫克。活检组织是由不同细胞类型组成的复杂组织, 包括上皮、免疫和内皮细胞。临床肠胃根据既定的临床指南执行内窥镜。
- 在内窥镜下, 将活检放在无菌滤纸上。
- 使用镊子转移活检1.5 毫升管, 浸泡在 PBS, 并将其放入 cryotube。
- 把管子放在冰上直到他们到达实验室。
- 立即开始处理新鲜的活检。
- 对于冰冻活检, 闪光冷冻的活检包含管和贮存在液氮, 直到使用。
注意: 在添加了冷补充的缓冲1之前, 保持样品冻结是很重要的。
2. 缓冲准备
注意: 开始之前, 请按如下所示补充缓冲区。
- 将1毫米的 (最终浓度) 和蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒 (1x 最终浓度) 添加到低渗缓冲1和高渗缓冲 2 (表 1)。
- 准备1.5 毫升的缓冲区1和150µL 的缓冲区2每个样本。德勤将防止样品的氧化。
- 通过加入1% 洗涤剂 (壬 phenoxypolyethoxylethanol) 来制备核洗涤缓冲器, 最后浓度为0.1% 到已经补充的缓冲1。每个样品准备1毫升的原子核洗涤缓冲器。
3. 同质活检
-
新鲜活检
- 把一次性杵放在电动搅拌机里。确保杵达到管的底部。
- 从 cryotube 中取出活检, 把它放在一个1.5 毫升的试管里, 用吸管尖。
- 添加200µL 的补充缓冲1到1.5 毫升管。
- 融汇活检与杵, 直到组织完全中断, 并保持在冰上。
- 一旦所有的活检都是均匀的进行步骤4。
注意: 一次性杵必须在活检之间改变。
-
冰冻活检
注意: 小心处理液氮;与皮肤或眼睛接触液氮可能导致严重的冰冻损伤。使用液氮时, 要始终保护双手和眼睛。- 在盒子里取一些液氮储存从氮气罐中回收的 cryotubes。
- 在氮气罐中找到活检, 并将 cryotube 放在盒子里, 用液氮。对所有活检重复此步骤。
- 将活检从 cryotube 转移到1.5 毫升管。
注: 活检将附在冷冻管上。用一根不育的吸管来推活检, 这样它就会从管子里分离出来。 - 添加200µL 的补充缓冲1。
- 融汇组织使用杵和砂浆, 直到组织完全中断, 保持温度在4摄氏度整个过程。
注意: 在添加缓冲区之前不要让活检解冻。
4. 细胞质分离
- 在冰上孵化10分钟的匀质活检。
- 添加10µL 1% 洗涤剂 (壬 phenoxypolyethoxylethanol) 到每个样品到最后浓度为0.05%。
注意: 由于温和的洗涤剂会扰乱细胞膜, 细胞会膨胀并通过渗透裂解而爆裂。 - 在冰上孵化5分钟。
- 漩涡简要地和离心机在 400 x g 在4˚C 为2分钟。
- 涡流后, 取出上清, 并将其转移到新的清洁1.5 毫升管;这将是细胞质分数。不要丢弃小球。
5. 核隔离
- 并用重悬用200µL 核洗涤缓冲器从上一步对颗粒进行了处理。
- 离心管为2分钟在 400 x g 和4°c。
- 放弃上清, 再重复洗涤程序两次。
注: 洗涤将去除核分数中的细胞质污染。 - 第三次清洗后, 并用重悬在100µL 2 的缓冲颗粒。
- 用力摇动样品4˚C 30 分钟. 或者, 每5分钟在冰和旋涡上孵化样品。
- 震动后, 在最高速度 (> 1.2万 x g) 和4摄氏度离心样品10分钟。
- 涡流后, 将上清液转移到新的清洁1.5。毫升管。这将是核分数。
6. 蛋白质量化
注: 用二辛可宁酸 (蛋白质检测试剂盒) 量化蛋白质。蛋白质在分数中的浓度将介于0.5 和5µg/µL 之间, 在核分数中较低 (见表 2为由2毫克活检结果产生的蛋白质浓度)。
- 用以下牛血清白蛋白 (BSA) 量 (µg)12: 0-0. 5-1-2-3-4-5-6, 制备标准曲线。
- 准备所需的试剂, 以使用100µL 的最终可达性的组合, 每个样本。
- 吸管2µL 的每一个蛋白质分数在一个96井板, 添加的综合体的组合, 并按照制造商的说明, 为阅读。
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Representative Results
图 1显示了一个具有完整绒毛和隐窝结构的小肠活检切片的苏木精的伊红染色。
使用本议定书的核和细胞质分馏的代表性结果见图 2和3。在图 2所示的实验中, 新的 (Fh) 和冰冻的 (组织) 活检是在这里提出的协议同时进行分割的, 并使用每个样本的20微克进行了一个西方印迹。表 2显示了每个分数和活检的蛋白质浓度, 而新鲜和冰冻组织之间的蛋白质浓度并没有很大的差别。从2毫克活检中提取的蛋白质的产量约为3-4 µg/µL, 胞浆分数约为1.5 µg/µL。为了检查分数的纯度, HSP90 和蛋白被用作细胞质控制, HDAC1 和 H3 作为核控制13。可以观察到, HSP90 和蛋白主要位于细胞质中, HDAC1 和 H3 位于细胞核中, 两者之间的混合极少。为了评估该议定书是否影响细胞死亡, 我们还涂抹了 caspase 3 的存在。从图 2中, 两个样本都有一个非常极小的染色为 caspase 3 确认, 该程序不影响细胞死亡路径, 即使在闪光冻结活检。还分析了在手术后是否维持蛋白质的修饰, 因此蛋白质可以用于下游功能化验。PhosphoSTAT1 被用于染色, 因为这种分馏所用的冰冻活检来自一个具有肠道炎症状态的个体;这是不正确的新鲜活检。如预期的那样, phosphoSTAT1 位于冷冻活检的细胞质中, 确认蛋白质的修饰是在分馏后维持的。
使用冰冻活检的方法重现性如图 3所示。在三个独立的冷冻活检分离后进行了一个西方印迹, 并且分数是干净的以极小的室蛋白质混合 (图 3A): HSP90 位于细胞质分数和 HDCA1 在核分数。此外, 在核和细胞质分数14中存在的 XPO1 蛋白也被涂抹。可以观察到, ImageJ 量化的 XPO1 水平在每一个分数 (图 3B) 中都是稳定的, 通过不同的活检证实了结果的重现性。
图 1: 从内镜手术获得的活检中, 用苏木精红染色的小肠上皮切片的光显微图像.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2:一种在新鲜 (Fh) 和冰冻 (组织) 活检中进行的亚细胞分馏的典型印迹.HSP90 和蛋白被用作细胞质控制, HDAC1 和 H3 作为核控制。还评估了 CASP3 和 phosphoSTAT3 的存在。
图 3: 三份独立冷冻活检的分馏结果。(a)三例冰冻活检 (1、2和 3) 进行的亚细胞分馏具有代表性的西方印迹。HSP90 被用作细胞质控制, HDAC1 作为核控制。对 XPO1 的定位也进行了评估。(B)使用 ImageJ 软件完成的每个分数中 XPO1 的相对量化。请单击此处查看此图的较大版本.
| 缓冲区 | 组件 | 笔记 |
| 低渗缓冲器1 | 10毫米 HEPES pH 值7。9 | 1.5 毫升缓冲器/样品 |
| 10毫米氯化钾 | ||
| 0.1 nmM EDTA | ||
| 高渗缓冲液2 | 20毫米 HEPES pH 值7。9 | 150µl 缓冲器/样品 |
| 400毫米氯化钠 | ||
| 0.1 毫米 EDTA | ||
| * 注: 缓冲区可以存储在4ºC 一个月。 | ||
| ** 注: 在使用前必须辅以蛋白酶、磷酸酶抑制剂和德勤的缓冲剂。 | ||
表 1: 缓冲成分。
| 新鲜 | 冷冻 | |
| 细胞质 | 2.975 | 4.612 |
| 核 | 1.516 | 1.385 |
表 2: 在图 2中使用的新鲜和冰冻的2毫克活检中每个组分的蛋白质浓度;浓度呈微克/ul。
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Discussion
这里描述的协议用于肠道活检的核和细胞质分馏。纯化的蛋白质不变性, 不仅可以用于西方印迹分析如图 2和3 , 但也在化验要求本机折叠的蛋白质, 如免疫沉淀, 电泳移动转移检测 (EMSA) 或本机聚丙烯酰胺凝胶电泳 (页)。
所述方法依赖于组织的机械均匀化和渗透裂解, 在不影响核膜的情况下爆裂细胞膜。其结果是将用于下游分析的细胞质和核蛋白都进行了干净的分馏。通过添加蛋白质和磷酸酶抑制剂来控制蛋白质在过程中的降解是很重要的。此外, 如果提取的蛋白质用于下游功能化验, 也很重要的是要避免变性和蛋白质水解的样品。这些过程应在4摄氏度内执行, PMSF 也应添加到缓冲区中。
本协议中描述的过程简单, 价格低廉, 采样处理时间最小。处理时间长和使用昂贵的分馏套件等问题不是本议定书的限制因素。
新鲜和冰冻活检可以在本议定书中使用, 冷冻活检给予相当干净和可重现的分馏结果, 如图 2和3所示。如果有隔间污染, 细胞裂解时间可以减少, 以避免核向细胞质释放, 洗涤步骤可以增加, 以避免细胞质污染的核隔间。
使用冷冻组织对核和细胞质蛋白分数进行独立分析可以增加我们对储存冰冻活检的肠道炎症疾病的认识。此外, 这种技术可以适应其他类型的人体组织活检获得。使用的缓冲区数量必须根据活检的大小进行修改。
此处描述的协议旨在生成可再生的组织分数;然而, 样本内的某些内在变异, 包括组织的大小和状态, 可能导致蛋白质数量和分布在每个分数中的偏差。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者承认下洛佩兹和 Miren Telletxea 为视频录制和编辑提供的帮助。ACR 由 Ikerbasque 奖学金和协会 de Celiacos 马德里 (ACM) 的研究项目资助。JRB 由 ISCIII-PI16/00258 项目资助, 并由欧洲联盟 ERDF/英法基金会共同出资, "成为欧洲的一种方式"。是由巴斯克卫生部的一个研究项目赠款2015111068资助的。IRG 和 AJM 分别得到 UPV/EHU 和巴斯克教育部 predoctoral 奖学金资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
References
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