Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at udføre en simpel cellulær fraktionering for subcellulært adskillelse af cytoplasmatisk og nukleare proteiner i human ferske og frosne intestinal biopsier.
Abstract
Formålet med denne protokol er at fractionate menneskelige tarmens væv fremstillet ved endoskopi i nukleare og cytoplasmatisk rum for lokalisering analyse af specifikke proteiner eller proteinkomplekser i forskellige væv stater (dvs., sund vs sygdom). Denne metode er nyttig til fraktionering af både ferske og frosne intestinal vævsprøver; Det er let tilgængeligt for alle laboratorier og ikke tidskrævende.
Introduction
Proteiner deltage i næsten alle biologiske funktioner i en celle og enhver variation i deres struktur, mængde eller placering kan føre til sygdomsfremkaldende scenario. Væv prøve fraktionering metoder er en nyttig tilgang til at reducere kompleksiteten af sygdom relateret protein analyser. Nogle undersøgelser bruge protein lokalisering information eller berige et protein fra en specifikke cellulære rum, så en protokol til reproducerbare fraktionering af intakt proteiner er nyttige til at besvare visse biologiske spørgsmål. Bestemmelse af den subcellulært lokalisering af proteiner og overvåge deres afdelingsmæssig omfordeling eller interaktioner på basal og sygdomstilstande vil hjælpe med at identificere sygdom relateret funktionelle forskelle1,2. Således, denne metode har til formål at reproducerbar fractionate tarmens væv biopsier, både ferske og frosne, i cytoplasmatisk og nukleare subcellulært rum.
Tarm biopsi prøver rutinemæssigt er opnået under endoskopi procedurer3 (figur 1) og kan bruges effektivt for protein kvantificering eller immunoprecipitation studier. Da vævsprøver fra tarm epitel indeholder proteiner, der kan være direkte involveret i den sygdom patogenese4, er tarm biopsi prøver en meget værdifuld kilde til succesfulde identifikation af intestinal sygdoms-specifikke proteiner. Gemte frossen, patient vævsprøver med de kliniske oplysninger er nyttige ressourcer til proteinanalyse, og en simpel og reproducerbar prøveforberedelse er et centralt spørgsmål om celle mangelfulde oplysninger ved hjælp af begrænsende mængder frosset væv5.
Der er flere kommercielt tilgængelige kits til adskillelse af cellulære fraktioner, men disse er dyrere og generelt mere tidskrævende end præsenteret her-protokollen. Protokoller baseret på flere trin gradient centrifugering og kontinuerlige gradueringer har også tidligere er blevet anvendt til fraktionering af forskellige cellulære rum i forskellige væv6,7. Men opretholde sammenhængen i kontinuerlige forløb er ofte en vanskelig opgave. Lignende protokoller baseret på den sekventielle lysering af membraner har tidligere beskrevet, men de generelt har brug for mere end to buffere og hænderne på tid er længere8 .
Når fractionating vævsprøver, huske på, at vævscentre prøver nuværende celle-celle og celle-matrix interaktioner, der er ikke til stede i kulturperler celler og vigtigt når fortsætter til protein udvinding. Den korrekte fordeling mellem celler og ekstracellulære matrix uden at påvirke protein kvalitet bliver en kritisk faktor i tarmens væv protein isolation9. I denne protokol er celle-celle og celle-matrix kontakter først brudt, frigive cellerne og giver bufferen til at nå de enkelte celler. For at undgå protein-rum blanding forud fraktionering, skal opdeling af kontakterne forekomme uden at ændre integriteten af cellerne eller nukleare membraner.
Berigelse af forskellige proteaser i tarmslimhinden10er det vigtigt at kontrollere protein nedbrydning under udvinding. For at minimere det potentielle protein nedbrydning, skal flere protease hæmmer medtages i protein udvinding buffere. Derudover hvis ekstrakter skal bruges til funktionelle assays, er det vigtigt at undgå denaturering af proteiner eller proteolyse, da dette vil medføre et tab af protein aktivitet11. Til dette formål, protokollen er udført ved 4 ° C og friske phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) er føjet til buffere i en endelig koncentration på 0,1 mM bare forudgående skal bruges til at hæmme yderligere proteolyse.
Det første skridt i celle fraktionering er væv forstyrrelser og celle lysering. Som tidligere nævnt, er formålet at disaggregate celler og bryde åbne dem med minimale skader. Tarm vævsprøver skal være homogeniseret, og cellerne mængden til at opnå maksimal brud af cellemembranen. I denne protokol bruger vi en motoriseret pistil mixer til at bryde den intestinale væv, der er homogeniseret inden for få sekunder ved hjælp af høj hastighed vortexing handling. Efter homogenisering, er væv celler inkuberes i en hypotonic buffer, der vil briste cellemembranen, men vil holde atomkerner intakt, efterfulgt af tilføjelsen af en ikke-denatureringen vaskemiddel (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) og en kort vortex at adskille kerner fra den cytoplasmatisk brøkdel. Efter fjernelse af cytoplasma, er kerner cellemembranen brast i en hypertonisk buffer under omrystning.
Den metode, der præsenteres her er en velegnet metode til subcellulært fraktionering af ferske og frosne intestinal biopsier, der er opnået under endoskopiske procedurer og varierer mellem 2 og 10 mg i vægt. Protokollen er let og reproducerbare og kunne udføres ved hjælp af grundlæggende laboratorieudstyr og reagenser i under en time.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af Cruces University Hospital etik Board og analyser blev udført efter informeret samtykke blev opnået fra alle fag eller deres forældre.
1. biopsi samling
Bemærk: Biopsi prøver fra patienter distale duodenum er opnået under rutinemæssige diagnosen endoskopi styring af biopsier der spænder mellem 2 og 10 mg i vægt. Biopsi væv er et komplekst væv består af forskellige celletyper, herunder epitel-, immun- og endothelial celler. Kliniske gastroenterologists udføre endoskopi følgende etableret kliniske retningslinjer.
- Placere biopsi på en steril filtrerpapir lige efter endoskopi.
- Bruge pincet til at overføre biopsier i 1,5 mL rør, sættetid dem med PBS, og læg det i en cryotube.
- Holde rør på is, indtil de ankommer til laboratoriet.
- Starte behandlingen af frisk biopsier straks.
- For frosne biopsier, flash fryse den biopsi der indeholder rør og opbevares i flydende nitrogen indtil brug.
Bemærk: Det er vigtigt at holde prøve frosne indtil den kolde suppleres med buffer 1 er tilføjet.
2. buffer forberedelse
Bemærk: Før du starter, supplere bufferne som følger.
- Tilføj 1 mM DTT (endelig koncentration) og protease og fosfatase hæmmer cocktail (1 x slutkoncentration) til den hypotonic buffer 1 og hypertonisk buffer 2 (tabel 1).
- Forberede 1,5 mL buffer 1 og 150 µL af buffer 2 pr. prøve. DTT vil forhindre oxidation af prøverne.
- Forberede kerner wash buffer ved at tilføje 1% vaskemiddel (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) til en endelig koncentration på 0,1% til den allerede suppleret buffer 1. Forberede 1 mL af kerner wash buffer pr. prøve.
3. biopsi homogenisering
-
Frisk biopsier
- Sted engangs pistil i den motoriserede mixer. Sikre at pistil når bunden af røret.
- Tage biopsi fra cryotube og læg det i 1,5 mL rør med pipette spids.
- Tilføje 200 µL af suppleres med buffer 1 til 1,5 mL tube.
- Homogeniseres biopsi med pistil, indtil væv er helt forstyrret og holde det på is.
- Når alle biopsier er homogeniseret fortsætte med trin 4.
Bemærk: Engangs pestles skal ændres mellem biopsier.
-
Frosne biopsier
Forsigtig: Håndtere flydende kvælstof omhyggeligt; Kontakt af flydende kvælstof med hud eller øjne kan forårsage alvorlige indefrysning skade. Beskyttelse af hænder og øjne altid når man arbejder med flydende kvælstof.- Tage nogle flydende kvælstof i en boks til at gemme cryotubes hentet fra kvælstof tank.
- Find biopsi i kvælstof tank og placere cryotube i boksen med flydende kvælstof. Gentag dette trin for alle biopsier.
- Overføre biopsi fra cryotube til en 1,5 mL tube.
Bemærk: Biopsier vil blive knyttet til den frosne rør. Skubbe biopsi med en steril pipette spids, så det vil løsne sig fra røret. - Tilføje 200 µL af suppleres med buffer 1.
- Homogeniseres væv ved hjælp af pistil og morter indtil væv er helt forstyrret, opretholde temperaturen ved 4 ° C i hele alle procedure.
Bemærk: Lad ikke biopsier tø før du tilføjer bufferen.
4. cytoplasma Isolation
- Inkuber homogeniseret biopsi i isbad i 10 min.
- Tilføje 10 µL 1% vaskemiddel (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) til hver prøve til en endelig koncentration på 0,05%.
Bemærk: Celler vil svulme op og brast af osmotisk lysering som den mildt rengøringsmiddel vil forstyrre cellemembranen. - Ruger på is i 5 minutter.
- Vortex kort og centrifugeres ved 400 x g på 4 ˚C i 2 min.
- Efter vortexing, Fjern supernatanten og overføre det til en ny ren 1,5 mL tube; Dette vil være den cytoplasmatisk brøkdel. Smid ikke pelleten.
5. nukleare Isolation
- Resuspenderes fra det forrige trin med 200 µL af kerner wash buffer.
- Centrifugeres tube for 2 min på 400 x g og 4 ° C.
- Supernatanten og Gentag vask proceduren to gange mere.
Bemærk: Vasker vil fjerne cytoplasmatisk forurening i den nukleare fraktion. - Hold resuspenderes i 100 µL af buffer 2 efter den tredje vask.
- Ryst prøven kraftigt på 4 ˚C i 30 min. Alternativt, inkuberes prøve på ice og vortex hvert 5 min.
- Efter omrystning, centrifugeres prøve for 10 min. ved tophastighed (> 12.000 x g) og 4 ° C.
- Efter vortexing, skal du overføre supernatanten ind i en ny ren 1,5. mL tube. Dette vil være den nukleare fraktion.
6. protein kvantificering
Bemærk: Kvantificere proteiner med en bicinchoninic syre (BCA) protein assay kit. Koncentrationen af proteiner i brøkdele, der kommer til at ligge mellem 0,5 og 5 µg/µL, er lavere i den nukleare fraktion (Se tabel 2 for protein koncentrationer resulterende fra 2 mg biopsier).
- Forberede en standardkurve med følgende bovint serumalbumin (BSA) beløb (µg)12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.
- Forberede de reagenser, der er nødvendige for at bruge 100 µL af endelige BCA mix pr. prøve.
- Der afpipetteres 2 µL af hver proteinfraktion i en 96 godt plade, tilføje BCA mix og Følg fabrikantens instruktioner for læsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser en hæmatoxylin eosin pletter af en tarm biopsi sektion med intakt villi og krypten strukturer.
Repræsentative resultater af nukleare og cytoplasmatisk fraktionering bruger denne protokol er vist i figur 2 og 3. I forsøget vist i figur 2, en frisk (Fh) og en frosne (Fz) biopsi blev samtidig fraktioneret efter protokollen præsenteres her og en vestlige skamplet blev udført ved hjælp af 20 μg af hver prøve. Protein koncentrationer i hver fraktion og biopsi er vist i tabel 2, og protein fusioner er ikke meget forskellige mellem friske og frosne væv. Udbyttet af protein udvundet fra 2 mg biopsier er omkring 3-4 µg/µL i cytoplasmatisk brøken og ca 1,5 µg/µL i den nukleare fraktion. For at tjekke renheden af fraktioner, HSP90 og tubulin blev brugt som et cytoplasmatisk kontrol og HDAC1 og H3 som en nuklear kontrol13. Det kan konstateres, at HSP90 og tubulin er primært beliggende i cytoplasma og HDAC1 og H3 findes i kernen med meget minimal blanding mellem de to fraktioner. For at vurdere, om protokollen påvirker celledød, renset vi også for tilstedeværelsen af caspase 3. Fra figur 2præsentere begge prøver en meget minimal farvning for caspase 3 bekræfter, at proceduren ikke påvirker celle død vej selv efter flash frysning af biopsier. Det blev også analyseret hvis protein ændringer bevares efter proceduren, så proteiner kan bruges til downstream funktionelle assays. PhosphoSTAT1 blev brugt til farvning som frosne biopsi anvendes i denne fraktionering kom fra en person med en tarm inflammatorisk tilstand; Dette er ikke tilfældet for friske biopsi. Som forventet, ligger phosphoSTAT1 i cytoplasma af frosne biopsi, bekræfter, at protein ændringer bevares efter fraktionering.
Metoden bruger frosne biopsier reproducerbarhed er vist i figur 3. En vestlige skamplet blev udført efter fraktionering af tre uafhængige frosne biopsier, og fraktioner er ren med minimal rum protein blanding (figur 3A): HSP90 beliggende i cytoplasmatisk fraktion og HDCA1 i den nukleare fraktion. Derudover blev XPO1 protein, der findes i både nukleare og cytoplasmatisk fraktioner14 også renset. Det kan konstateres, at niveauet af XPO1 kvantificeres ved ImageJ er stabile i hver fraktion (figur 3B), bekræfter reproducerbarhed ved hjælp af forskellige biopsier.
Figur 1 : Lys Mikrograf af en tarm epitel sektion, farves med hæmatoxylin eosin, fra en biopsi, erhvervet af endoskopisk procedure. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentant Western blot af en subcellulært fraktionering udført i en frisk (Fh) og en frosne (Fz) biopsi. HSP90 og tubulin blev brugt som cytoplasmatisk kontrol og HDAC1 og H3 som nukleare kontrolelementer. Tilstedeværelsen af CASP3 og phosphoSTAT3 blev også vurderet.
Figur 3 : Fraktionering resultaterne af tre uafhængige frosne biopsier. (A) repræsentant Western blot af en subcellulært fraktionering udført i tre frosne biopsier (1, 2 og 3). HSP90 blev brugt som et cytoplasmatisk kontrol og HDAC1 som en nuklear kontrol. Lokalisering af XPO1 blev også vurderet. (B) Relative kvantificering af XPO1 i hver af den fraktion gjort ved hjælp af ImageJ software. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Buffer | Komponenter | Noter |
| Hypotonic buffer 1 | 10 mM HEPES pH 7,9 | 1,5 ml buffer/prøve |
| 10 mM KCl | ||
| 0,1 nmM EDTA | ||
| Hypertonisk buffer 2 | 20 mM HEPES pH 7,9 | 150 µl buffer/prøve |
| 400 mM NaCl | ||
| 0.1 mM EDTA | ||
| * Bemærk: Buffere kan opbevares ved 4 c i en måned. | ||
| ** Bemærk: Buffere skal suppleres med proteinase og fosfatase hæmmere og DTT før brug | ||
Tabel 1: Buffer sammensætning.
| Frisk | Frosne | |
| Cytoplasmaet | 2.975 | 4,612 |
| Nucleus | 1.516 | 1.385 |
Tabel 2: Proteinkoncentration af hver af fraktioner i en frisk og frosset 2 mg biopsi anvendes i figur 2. koncentration er præsenteret i μg/μL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her bruges til den nukleare og cytoplasmatisk fraktionering af intestinal biopsier. De renset protein er ikke denatureret og kan bruges ikke kun i western blot analyse som vist i figur 2 og 3 , men også i assays kræver native-foldet proteiner som immunoprecipitation, elektroforese mobilitet Skift assay (EMSA) eller Native polyacrylamid gelelektroforese (side).
Den beskrevne metode er baseret på mekaniske homogenisering af væv samt osmotisk lysering spraenge cellemembranen uden at påvirke Kernemembranen. Resultatet er en ren fraktionering af begge cytoplasmatisk og nukleare proteinerne der skal bruges til downstream analyser. Det er vigtigt at styre nedbrydning af proteiner under processen ved tilsætning af protein og fosfatase hæmmere. Desuden, hvis udvundne proteiner er skal bruges til downstream funktionelle assays, det er også vigtigt at undgå denaturering og proteolyse af prøverne. Processerne, der skal udføres ved 4 ° C og PMSF skal føjes også til bufferne.
Fremgangsmà ¥ den i denne protokol er enkel og økonomisk overkommelig, og prøven behandlingstid er minimal. Problemer såsom lange sagsbehandlingstider og anvendelse af kostbare fraktionering kits er ikke begrænsninger i denne protokol.
Friske og frosne biopsier kan både bruges i denne protokol, med frosne biopsier giver helt ren og reproducerbare fraktionering resultater som det ses i figur 2 og 3. Hvis der er rum forurening, celle lysis time kan reduceres for at undgå frigivelsen af nukleare til cytoplasma og vaske trin kan føjes til cytoplasmatisk kontaminering i den nukleare rum.
Mulighed for at bruge frossen væv for den uafhængige analyse for nukleare og cytoplasmatisk protein fraktioner kan øge vores viden om inflammatoriske tarmsygdomme, frosne biopsier er lagret. Denne teknik kunne desuden tilpasses til andre former for humant væv erhvervet af biopsier. Mængden af buffere anvendes skal ændres afhængigt af størrelsen af biopsi.
Protokollen beskrevet her er designet til at generere reproducerbare væv fraktioner; Men, nogle iboende variation inden for stikprøven, herunder størrelse og status af væv kan føre til afvigelser i protein beløb og distribution forvaltes i hver fraktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender assistance af Ander Lopez og Miren Telletxea til video optagelse og redigering. ACR er finansieret af et Ikerbasque Fællesskab og et forskningsprojekt fra Asociación de Celiacos Madrid (ACM). Fællesorganet er finansieret af projekt ISCIII-PI16/00258 og medfinansieres af den Europæiske Union EFRU/ESF "En måde at gøre Europa". ER er finansieret af en research project grant 2015111068 af baskiske Department of Health. IRG og AJM er støttet af predoctoral fellowship tilskud fra UPV/EHU og baskiske Department of Education, henholdsvis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
References
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
- Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization. eLife. 5, (2016).
- Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , Greenwich Medical Media. (1998).
- Alex, P., Gucek, M., Li, X. Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies. Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).
- Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis. Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).
- Hoffmann, K., et al. New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).
- Foster, L. J., et al. A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling. Cell. 125 (1), 187-199 (2006).
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Börner, A., et al. Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues. BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).
- Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology. Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).
- Cutler, P. Protein purification protocols. , Humana Press. (2004).
- Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).
- McLane, L. M., et al. Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).
- Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease. International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).
