Summary
Her presenterer vi en protokoll for å utføre en enkel mobil fraksjoneres for subcellular separasjon av cytoplasmatiske og kjernefysiske proteiner i menneskelig fersk og frossen intestinal biopsier.
Abstract
Formålet med denne protokollen er å smuldre vekk menneskelige tarmen tissue innhentet av endoskopi i kjernefysiske og cytoplasmatiske deler for lokalisering analyse av spesifikke proteiner eller protein komplekser i ulike vev stater (i.e., sunn vs sykdom). Denne metoden er nyttig i fraksjoneres av både fersk og frossen tarmen tissue prøver; Det er lett tilgjengelig for alle laboratorier og ikke tidkrevende.
Introduction
Proteiner delta i nesten alle biologiske funksjoner i en celle og en variant i struktur, antall eller plassering kan føre til et patogene scenario. Vev prøve fraksjoneres metoder er en nyttig tilnærming for å redusere kompleksiteten i sykdom relatert protein analyser. Noen studier bruke protein lokalisering informasjon eller berike en protein fra en bestemt mobilnettet kupé, så en protokoll reproduserbar fraksjoneres intakt proteiner er nyttig å besvare bestemte biologiske spørsmål. Bestemme den subcellular lokaliseringen av proteiner og overvåking sine avdelingsflytting Redistribusjon eller samhandlinger på basale og sykdomstilstander vil hjelpe sykdom relatert funksjonelle forskjeller1,2. Dermed skal denne metoden reproduserbar smuldre vekk tarmen tissue biopsier, både fersk og frossen, i cytoplasma og kjernefysiske subcellular rom.
Intestinal biopsi prøver er rutinemessig oppnådd under endoskopi prosedyrer3 (figur 1) og kan brukes effektivt for protein kvantifisering eller immunoprecipitation studier. Siden vevsprøver fra intestinal epithelial inneholder proteiner som kan være direkte involvert i sykdom patogenesen4, er intestinal biopsi prøver en svært verdifull kilde for vellykket identifikasjon av tarm sykdom-spesifikke proteiner. Lagrede frosne, pasient vevsprøver sammen med klinisk informasjon er nyttige ressurser for protein analyse, og en enkel og reproduserbar forberedelse er en viktig sak å gi avdelingsflytting celleinformasjon bruke begrensende mengder frosset vev5.
Det finnes flere tilgjengelige kits for separasjon av mobilnettet fraksjoner, men disse er dyrere og generelt mer tidkrevende enn protokollen presenteres her. Protokoller basert på flertrinns gradient sentrifugering og sammenhengende graderinger har også tidligere brukt fraksjoneres ulike mobilnettet rom i ulike vev6,7. Men, opprettholde konsistensen av sammenhengende graderinger er ofte en vanskelig oppgave. Like protokoller basert på den sekvensielle lysis av membraner har vært beskrevet tidligere, men de vanligvis trenger mer enn to buffere og hendene på tid er lengre8 .
Når fractionating vevsprøver, huske på at vev prøver stede celle-celle og celle-matrix interaksjoner som er både ikke i kulturperler celler og viktig når du fortsetter å protein utvinning. Riktig nedbrytning mellom celler og ekstracellulær matrix uten virkning protein vil være en kritisk faktor i tarmen tissue protein isolasjon9. I denne protokollen er celle-celle og celle-matrise kontakter først ødelagt, frigi cellene og slik at bufferen til de enkelte cellene. For å unngå protein-compartment blanding før fraksjoneres, må nedbryting av kontaktene skje uten å endre integriteten til cellene eller kjernefysiske membraner.
Fordi anriking av ulike proteaser i tarmen10er det viktig å kontrollere protein fornedrelse under utvinning. For å minimere den potensielle protein fornedrelse, må flere protease hemmer inkluderes i protein utvinning bufferne. I tillegg hvis ekstrakter skal brukes for funksjonell analyser, er det viktig å unngå denaturering av proteiner eller proteolyse som dette vil forårsake tap av protein aktivitet11. For dette formålet, protokollen utføres på 4 ° C og fersk phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF) er lagt til buffere i en siste konsentrasjon av 0,1 mM bare før å bruke å hemme ytterligere proteolyse.
Det første trinnet i celle fraksjoneres er vev avbrudd og celle lysis. Som nevnt tidligere, er målet å disaggregate celler og knuser dem med minimal skade. Tarmen tissue prøver må være homogenisert, og cellene lysed for å oppnå maksimal brudd på cellemembranen. I denne protokollen bruker vi en motorisert pistil blandebatteri for å bryte den tarmen tissue som er homogenisert innen sekunder med høyhastighets vortexing handling. Etter homogenisering er vev celler ruges i en hypotonisk buffer som vil sprekke cellemembranen, men vil holde kjerner intakt, etterfulgt av et ikke-denaturing vaskemiddel (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) og en kort vortex skille kjerner fra cytoplasmatiske brøkdel. Etter fjerning av cytoplasma, er kjerner cellemembranen brast i en hypertonic buffer med skjelvende.
Metoden som presenteres her er en metoden det subcellular fraksjoneres av fersk og frossen intestinal biopsier som har vært innhentet under endoskopisk prosedyrer og mellom 2 og 10 mg i vekt. Protokollen er enkelt og reproduserbar og kan utføres ved hjelp av grunnleggende laboratorieutstyr og reagenser i under en time.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av Cruces University Hospital etikk styret og analyser ble utført etter samtykke ble innhentet fra alle fag eller deres foreldre.
1. biopsi samling
Merk: Biopsi prøver fra distale tolvfingertarmen pasienter oppnås under rutinemessig diagnose endoskopi administrere biopsier som varierer mellom 2 og 10 mg i vekt. Biopsied vev er en kompleks vev består av forskjellige celletyper inkludert epithelial, immun og endothelial celler. Klinisk gastroenterologists utføre endoscopy følgende etablert kliniske retningslinjer.
- Plass biopsy på sterilt filter papir like etter endoskopi.
- Bruk tang til å overføre biopsier i 1,5 mL rør, suge dem med PBS og legg den i en cryotube.
- Holde rør på is før de kommer til laboratoriet.
- Start behandling av fersk biopsier umiddelbart.
- Frosne biopsier, flash fryse biopsy inneholder rør og lagre i flytende nitrogen før bruk.
Merk: Det er viktig å holde prøven frosset før kaldt supplert buffer 1 er lagt.
2. buffer forberedelse
Merk: Før du starter, supplement bufferne som følger.
- Legg 1 mM DTT (siste konsentrasjon) og protease og fosfatase hemmer cocktail (1 x siste konsentrasjon) til hypotonisk buffer 1 og hypertonic buffer 2 (tabell 1).
- Forberede 1,5 mL buffer 1 og 150 µL av buffer 2 per prøve. DTT vil hindre oksidasjon av prøvene.
- Forberede kjerner vaskebuffer ved å legge til 1% vaskemiddel (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) å en final konsentrasjon på 0,1% til den allerede supplert bufferen 1. Forberede 1 mL av kjerner vaskebuffer per prøve.
3. biopsi homogenisering
-
Frisk Biopsies
- Plass den disponible pistil i motorisert mikseren. Kontroller at støter når bunnen av røret.
- Ta biopsy ut fra cryotube og plasserer den i en 1,5 mL tube med Pipetter tips.
- Legge til 200 µL supplert bufferen 1 til 1,5 mL røret.
- Homogenize biopsy med støter til vev er helt forstyrret og holde det på is.
- Når alle biopsier er homogenisert Fortsett med trinn 4.
Merk: Disponibel støtere må endres mellom biopsier.
-
Frosne Biopsies
FORSIKTIG: Håndtere flytende nitrogen nøye. kontakt med flytende nitrogen med hud eller øynene kan forårsake alvorlig skade som frysing. Beskytte hender og øyne alltid når du arbeider med flytende nitrogen.- Ta noen flytende nitrogen i en boks til å lagre cryotubes Hentet fra nitrogen tanken.
- Finn biopsy nitrogen tanken og plasser cryotube i boksen med flytende nitrogen. Gjenta dette trinnet for alle biopsier.
- Overføre biopsy fra cryotube til en 1,5 mL tube.
Merk: Biopsies knyttet til frosset røret. Presse biopsy med sterilt pipette tips så det vil koble fra røret. - Legge til 200 µL supplert bufferen 1.
- Homogenize vev bruker den morter til vev er helt forstyrret, opprettholde temperaturen på 4 ° C i hele denne prosedyren.
Merk: Ikke la biopsier tine før du legger til bufferen.
4. cytoplasma isolasjon
- Inkuber homogenisert biopsi på is 10 min.
- Legge til 10 µL av 1% vaskemiddel (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) i hver prøve å en final konsentrasjon på 0,05%.
Merk: Celler vil hovne opp og serieopptak av osmotisk lysis som vaskemiddel vil forstyrre cellemembranen. - Ruge på isen i 5 minutter.
- Vortex kort og sentrifuger 400 x g på 4 grader i 2 minutter.
- Etter vortexing, Fjern nedbryting og overføre den til en ny ren 1,5 mL tube; Dette blir cytoplasmatiske brøken. Ikke kast pellet.
5. kjernefysiske isolasjon
- Resuspend pellets fra det tidligere trinnet med 200 µL av kjerner vaskebuffer.
- Sentrifuge røret i 2 minutter på 400 x g og 4 ° C.
- Forkast nedbryting og gjenta vaskemaskin to ganger.
Merk: Vasker fjernes cytoplasmatiske forurensning i kjernefysiske fraksjonen. - Etter tredje vask, resuspend pellet i 100 µL av buffer 2.
- Rist prøven kraftig på 4 grader i 30 min. Alternativt, ruge prøven på is og vortex hver 5 min.
- Etter risting, sentrifuge utvalget for 10 min i full fart (> 12.000 x g) og 4 ° C.
- Etter vortexing, overføre nedbryting i en ny ren 1,5. mL tube. Dette vil være kjernefysiske brøken.
6. protein kvantifisering
Merk: Kvantifisere proteiner med en bicinchoninic syre (BCA) protein analysen kit. Konsentrasjonen av proteiner i fraksjoner vil variere mellom 0,5 og 5 µg/µL, er lavere i kjernefysiske fraksjonen (se tabell 2 for protein konsentrasjoner resulterende fra 2 mg biopsier).
- Forberede en standardkurve med følgende bovin serum albumin (BSA) beløp (µg)12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.
- Forberede reagensene måtte bruke 100 µL av siste BCA per prøve.
- Pipetter 2 µL av hver protein fraksjon i en 96 godt plate, Legg BCA mix og følg produsentens instruksjoner for lesing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser en hematoxylin eosin farging av en intestinal biopsi delen med intakt villi og krypten strukturer.
Representant resultatene av kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoneres bruker denne protokollen vises i tall 2 og 3. I eksperimentet vist i figur 2, en frisk (Fh) og en frossen (Fz) biopsi var samtidig fraksjonert følger protokollen presenteres her og en western blot ble utført 20 μg av hvert utvalg. Protein konsentrasjonene i hver fraksjon og biopsi er vist i tabell 2, og protein konsentrasjoner er ikke veldig forskjellig mellom ferske og frosne vev. Avkastningen av protein utvunnet fra 2 mg biopsier er rundt 3-4 µg/µL i cytoplasmatiske brøken og ca 1,5 µg/µL i kjernefysiske fraksjonen. For å sjekke renheten av fraksjoner, HSP90 og tubulin ble brukt som en cytoplasmatiske kontroller og HDAC1 og H3 som en kjernefysisk kontroller13. Det kan være observert at HSP90 og tubulin er primære ligger i cytoplasma og HDAC1 og H3 ligger i kjernen med minimal blanding mellom to fraksjoner. For å vurdere om protokollen påvirker celledød, tas vi også etter caspase 3. Fra figur 2presentere begge prøver en minimal flekker caspase 3 kontrollere at prosedyren ikke påvirker celle død veien selv etter flash fryse biopsier. Det var også analysert hvis protein modifikasjoner opprettholdes etter prosedyren slik proteiner kan brukes for nedstrøms funksjonelle analyser. PhosphoSTAT1 ble brukt til farging som den frosne biopsy brukes i denne fraksjoneres kom fra en person med en intestinal betennelsestilstand; Dette er ikke sant av den friske biopsy. Som forventet, ligger phosphoSTAT1 i cytoplasma i den frosne biopsy, bekrefter at protein endringene opprettholdes etter fraksjoneres.
Reproduserbarhet av metoden bruker frosne biopsier vises i Figur 3. En western blot ble utført etter fraksjoneres av tre uavhengige frosset biopsier og fraksjoner er rene med minimal kupé protein blande (figur 3A): HSP90 ligger i cytoplasmatiske brøk og HDCA1 i kjernefysiske fraksjonen. I tillegg var XPO1 proteinet som finnes i både kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner14 også strøket. Det kan være observert at XPO1 kvantifisert ved ImageJ er stabil i hver fraksjon (figur 3B), bekrefter reproduserbarhet av resultatene med forskjellige biopsier.
Figur 1 : Lett mikroskop-bilde av en intestinal epithelial delen med hematoxylin eosin, fra en biopsi ervervet av endoskopisk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant Western blot av en subcellular fraksjoneres utført i en frisk (Fh) og en frossen (Fz) biopsi. HSP90 og tubulin ble brukt som cytoplasmatiske kontroller og HDAC1 og H3 som kjernefysisk kontroller. CASP3 og phosphoSTAT3 ble også vurdert.
Figur 3 : Fraksjoneres resultatene av tre uavhengige frosset biopsier. (A) representant Western blot av en subcellular fraksjoneres utført i tre frosne biopsier (1, 2 og 3). HSP90 ble brukt som en cytoplasmatiske kontroll og HDAC1 som en kjernefysisk. Lokalisering av XPO1 ble også vurdert. (B) Relative kvantifisering av XPO1 i hver av brøken gjort ImageJ programmvre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Buffer | Komponenter | Notater |
| Hypotonisk buffer 1 | 10 mM HEPES pH 7.9 | 1,5 ml buffer/sample |
| 10 mM KCl | ||
| 0,1 nmM EDTA | ||
| Hypertonic buffer 2 | 20 mM HEPES pH 7.9 | 150 µl buffer/sample |
| 400 mM NaCl | ||
| 0,1 mM EDTA | ||
| * Merk: Buffere kan lagres på 4ºC for en måned. | ||
| ** Merk: Buffere må suppleres med proteinasen og fosfatase hemmere og DTT før bruk | ||
Tabell 1: Buffer komposisjon.
| Frisk | Frosset | |
| Cytoplasma | 2.975 | 4.612 |
| Kjernen | 1.516 | 1.385 |
Tabell 2: Protein konsentrasjon av fraksjoner i en fersk og frossen 2 mg biopsi brukes i figur 2; konsentrasjon er presentert i μg/μL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrives her brukes den kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoneres av intestinal biopsier. Renset proteiner er ikke denaturert og kan brukes ikke bare i western blot analyse som vist i figur 2 og 3 , men også i analyser krever native-brettet proteiner som immunoprecipitation, electrophoretic mobilitet Skift analysen (EMSA) eller Native polyakrylamid gel geleelektroforese (side).
Metoden beskrevet er avhengig av mekanisk homogenisering av vev med osmotisk lysis å briste cellemembranen uten å påvirke de kjernefysiske membranen. Resultatet er en ren fraksjoneres av både cytoplasmatiske og kjernefysiske proteiner som skal brukes for nedstrøms analyser. Det er viktig å kontrollere nedbrytning av proteiner under prosessen med tillegg av protein og fosfatase hemmere. Videre, hvis utdraget proteiner som skal brukes for nedstrøms funksjonelle analyser, det er også viktig å unngå rødsprit og proteolyse av prøvene. Prosessene skal utføres på 4 ° C, og PMSF skal legges også til bufferne.
Fremgangsmåten som er beskrevet i denne protokollen er enkel og rimelig prøven behandlingstiden er minimal. Problemer som lange behandlingstider og bruk av kostbare fraksjoneres kits er ikke begrensninger i denne protokollen.
Fersk og frossen biopsies kan begge brukes i denne protokollen, med frosne biopsier gir ganske ren og reproduserbar fraksjoneres resultatene som vist i figur 2 og 3. Hvis det er kupé forurensning, celle lyseringstid kan reduseres for å unngå utgivelsen av kjernefysisk til cytoplasma og vaske trinnene kan legges til unngå cytoplasmatiske forurensning i kjernefysiske rommet.
Bruke frosne vev for selvstendig analyse for kjernefysiske og cytoplasmatiske protein fraksjoner kan øke vår kunnskap om intestinal inflammatoriske sykdommer der frosne biopsier lagres. Dessuten, denne teknikken kan tilpasses til andre typer menneskelig vev av biopsier. Antall buffere brukes må endres avhengig av biopsy.
Protokollen beskrevet her er utformet til å generere reproduserbar vev brøker. men noen iboende variasjon i prøven, inkludert størrelsen og status for vevet kan føre til avvik i protein mengden og distribusjon administreres i hver fraksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne bekrefter hjelp av Ander Lopez og Miren Telletxea for video opptak og redigering. ACR er finansiert av en Ikerbasque fellesskap og et prosjekt fra Asociación de Celiacos Madrid (ACM). JRB er finansiert av prosjektet ISCIII-PI16/00258 og delfinansiert av EU ERDF/ESF "En måte å gjøre Europa". ER er finansiert av et prosjekt forskningsstipend 2015111068 på baskiske Helsedepartementet. IRG og AJM støttes av predoctoral fellesskap tilskudd fra UPV/EHU og baskiske Institutt for utdanning, henholdsvis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
References
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
- Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization. eLife. 5, (2016).
- Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , Greenwich Medical Media. (1998).
- Alex, P., Gucek, M., Li, X. Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies. Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).
- Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis. Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).
- Hoffmann, K., et al. New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).
- Foster, L. J., et al. A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling. Cell. 125 (1), 187-199 (2006).
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Börner, A., et al. Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues. BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).
- Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology. Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).
- Cutler, P. Protein purification protocols. , Humana Press. (2004).
- Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).
- McLane, L. M., et al. Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).
- Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease. International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).
