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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

变性小鼠年龄依赖性运动障碍的步态分析

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/57752
Automatic Translation
1,2, 1,2
1European Neuroscience Institute (ENI), 2University Medical Center Göttigen (UMG)

Summary

在本研究中, 我们演示了基于腹面成像的运动步态分析方法, 以监测运动协调的细微变化以及小鼠模型中变性的进展 (如 endophilin 突变体) 。鼠标线)。

Abstract

运动行为测试通常用于确定啮齿动物模型的功能相关性, 并测试这些动物新开发的治疗方法。具体来说, 步态分析允许在人类患者中观察到的与疾病相关的表型, 特别是在影响运动能力的神经退行性疾病中, 如帕金森病 (PD)、阿尔茨海默病 (AD)、肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和其他。在这条线的早期研究中, 步态参数的测量是费力的, 取决于难以控制的因素 (例如,运行速度, 连续运行)。腹面成像系统的发展使步态分析成为可能, 使该方法成为评估啮齿动物运动行为的有效工具。在这里, 我们提出了一个深入的协议, 如何使用运动学步态分析, 以检查年龄依赖性进展的运动缺陷的小鼠模型的变性;endophilin 的小鼠线, 神经退行性损伤随着年龄的增长逐渐增加, 被用作例子。

Introduction

神经退行性疾病给病人、家庭和社会带来了沉重的负担, 随着预期寿命的增加, 世界人口继续老龄化, 这将变得更加令人担忧。神经退行性疾病最常见的症状之一是平衡和流动性问题。因此, 衰老哺乳动物 (如啮齿动物) 模型和/或模型显示神经退行性表型的运动行为的表征, 是证明特定动物模型在体内相关性的重要工具, 或治疗旨在改善疾病症状的治疗方法。几乎每一种治疗神经退行性疾病的方法最终都需要在动物模型中进行试验, 然后才开始对人类进行临床试验。因此, 重要的是要有可靠的, 可重复的行为测试, 可以用来始终如一地量化疾病相关的表型沿年龄的发展, 以确保候选药物, 这表明潜在的体外模型, 可以有效改善活体动物的表型。

啮齿类动物运动行为评估的一个方面是运动学步态分析, 它可以由录像 (也称为腹面平面的)1,2进行。这种建立的方法利用了连续记录的啮齿动物的底部行走在一个透明和机动的跑步机皮带1,2,3,4。对视频提要数据的分析创建了所有四肢体的 "数字爪印", 它能动态、可靠地重述啮齿类动物的行走模式, 最初是由羽衣甘蓝等所描述的。2和 Amende等。3。

基于成像的步态分析的原理是测量与跑步机带接触的爪面积, 随着时间的推移, 每个单独的爪子。每种姿态都代表了爪面积 (在制动阶段) 的增加和爪面积 (推进阶段) 的减少。接下来是没有检测到信号的摆动相位。摇摆和姿态在一起形成一大步。除了步态动力学参数, 还可以从录制的视频中提取姿势参数。示范性参数及其定义列于表 1中, 包括立场宽度 (SW; 从前爪或后爪子到鼻尾轴的组合距离), 步幅长度 (SL; 同一爪两大步之间的平均距离), 或爪子放置角度 (爪子的角度到鼻子-尾巴轴)。姿势和步态动力学数据允许得出关于动物平衡的结论 (通过姿势参数及其在几个步骤中的变异性) 和协调 (通过步态动力学参数)。其他参数, 如共济失调系数 (由 [(最大) 计算的 SL 变异性。SL−min。sl)/平均 SL]), 后肢共享的姿势时间 (两个后肢都与皮带接触的时间), 或爪子拖拉 (从完全立场到爪的所有的爪子在皮带的总面积) 也可以提取, 并已报告在各种神经退行性 di 改变星瑞机型5、6、7、8 (见表 1)。

参数 单位 定义
摇摆时间 女士 爪不与皮带接触的时间长短
姿态时间 女士 爪与皮带接触的时间长短
% 刹车 % 的立场时间 脚爪在刹车阶段所占的姿势时间百分比
% 推进 % 的立场时间 在推进阶段爪的比例时间百分比
姿态宽度 厘米 前后爪与鼻尾轴的组合距离
步幅长度 厘米 同一爪两大步之间的平均距离
步幅频率 步幅/秒 每秒完成步长数
爪子放置角度 度 爪的角度关于动物的鼻尾轴
共济失调系数 天文单位 由 [(最大 sl-最小 sl]/平均 sl] 计算的 SL 变异性
% 共享立场 % 的立场 后肢共用姿势时间;两个后肢同时接触皮带的时间
爪拖 mm2 从完全立场到爪子升降的皮带上的爪子的总面积
肢体装载 cm2 最大 dA/dT;破断阶段爪面积最大变化率
步进角度可变性 度 后爪作为 SL 和 SW 函数的角度的标准偏差

表1。可通过腹面成像测试的关键步态参数的定义。

对神经退行性疾病的啮齿动物模型的运动行为进行评估, 取决于某一特定年龄模型的表型的严重性。一些疾病, 最突出的 PD, 表现出强烈的运动行为 (运动) 赤字, 无论是在病人和动物模型。pd 的四个关键症状之一是运动迟缓, 随着年龄的增长, 在 pd9早期已经出现严重的步态损伤。对 1-甲基4苯基-12、36-tetrahydropyridin (MPTP) 的急性 PD 模型进行研究, 已采用了 "新品步态分析10、11、12"。然而, 鉴于这种模式的急性性质, 这些研究并没有解决与年龄有关的运动缺陷的进展。最近的几项研究已经对衰老的小鼠进行了步态分析, 如13、14、15, 强调了了解疾病进展与进步年龄的相关性。.

除运动缺陷外, 神经退行性疾病的动物模型往往难以集中于检查任务, 显示显著的认知障碍, 特别是随着年龄的提高。这种表型可以影响运动行为测试的结果。即, 最广泛使用的测试, 以检查电机赤字, rotarod 测试16, 依赖于认知, 关注, 和压力17,18。虽然在机动跑步机上行走的意愿也取决于这些因素, 但记录的读出是运行的, 这是一个更标准化的特点, 而且远没有被改变的认知影响。压力和注意力的影响可能在特定的参数, 如摆动/立场时间的压力, 和 SL 的注意19,20, 但不是在整体运行能力。

运动学步态分析方法进一步提供了选择调整啮齿动物模型挑战的优势。可调角度和速度的跑步机允许步行速度从 0.1-99.9 厘米/秒, 使严重行走障碍的啮齿动物仍然能够以慢速运行 (~ 10 厘米/秒)。非受损动物可以以更快的运行速度 (30-40 厘米/秒) 来测量。观察测试过的动物是否能够以某种速度运行, 本身就能产生结果。此外, 啮齿类动物还可以在量角器的帮助下, 通过将跑步机倾斜到所需的角度, 或者附加一个加权的雪橇到老鼠或老鼠的后腿上, 来进行倾斜或下降。

除了对患者中变异的单个蛋白质的大量研究之外, 最近对有缺陷的吞过程与变性13、21、22之间的联系有了越来越多的认识, 23,24,25,26,27,28。小鼠模型与减少的水平 endophilin a (从今以后 endophilin), 一个关键的球员在网格蛋白介导的吞13,21,29,30,31,32,33,45和网格蛋白独立吞34, 被发现显示变性和年龄依赖性的损伤在运动活动13,21。三基因编码 endophilin 蛋白家族: endophilin 1, endophilin 2, endophilin 3。值得注意的是, 因 endophilin 蛋白的耗尽而导致的表型差异很大, 这取决于缺失 endophilin 基因13、21的数量。虽然在出生后几个小时内, 所有 endophilin 基因的三重敲出 (高) 都是致命的, 而没有 endophilin 1 和2的老鼠在出生后3周内无法生长和死亡, 那么三 endophilins 中的任何一个都没有显示出明显的表型供测试。情况21。其他 endophilin 突变基因型显示寿命缩短, 并发展13岁以上的运动障碍。例如, endophilin 1 高-2 ht-3 高老鼠显示步行改变和马达协调问题 (由运动步态分析和 rotarod 测试) 已经在3月的年龄, 而他们的窝, endophilin 1 高-2-3 高动物, 显示一个重要的仅在15月13岁时, 电机协调减少。由于这些模型中的表型的多样性很大, 因此有必要确定和应用一种能够结合动物的运动和认知能力以及年龄的各种挑战的测试。在这里, 我们详细的实验程序, 利用运动学步态分析, 以评估运动损伤的发生和进展的小鼠模型, 显示神经退行性变化 (即endophilin 突变体)。这包括测量不同年龄的步态参数和运动损伤的不同严重性。

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Protocol

这里报告的所有动物实验都是根据欧洲动物福利准则 (2010/63/欧盟) 进行的, 经 Niedersächsisches Landesamt Verbraucherschutz 和 Lebensmittelsicherheit (LAVES) 批准, 注册号 14/1701。

1. 研究设计

  1. 当动物行为工作需要周密规划时, 在设计实验时考虑以下参数。
    1. 每组需要的动物数量。
      1. 使用统计软件 (例如,通过、EDA 或 GPower) 计算所需的组大小。
        注意: 组大小取决于动物之间的变化和表型的严重性。对于运动步态分析, 小鼠的数量通常为每组 10-20。
    2. 实验动物的性别。
      1. 根据动物的应变, 考虑雌激素水平对实验的影响。
        注意: 许多行为研究关注雄性, 以避免雌激素水平对实验的影响。这些影响或多或少强烈取决于动物的背景应变。
      2. 如果男女双方都将使用, 测试性别影响和评估两个性别独立时, 必要的。
    3. 实验动物的年龄。
      1. 使用成年动物 (2 月的年龄, 或更旧的), 如果只需要一个时间点。
      2. 选择几个时间点时, 运动行为的变化, 以提高年龄是要研究。最早可能的时间点是1月后, 老鼠从他们的母亲断奶。定期对动物进行测试,例如每1、2或3个月。
  2. 申请地方当局授权进行动物行为测试。
  3. 制定采购试验动物的计划。
    1. 制定一个育种计划或与动物经销商及时联系, 以便在实验开始的当天有足够的实验动物。
    2. 允许动物习惯一个星期, 如果他们被保存在一个新的房间/设置在实验期间。

2. 视频录制

注: 为了说明使用运动学步态分析, 这里有一个商业上可用的成像系统与它伴随的成像和分析软件 (见材料表) 使用。

  1. 启动计算机和成像软件。
  2. 通过在家庭笼子里观察, 确定每种动物的健康状况和福祉, 并权衡它的平衡。
  3. 需要时, 用刷子轻轻地将红色手指涂在动物的爪子上。允许油漆在备用清洁笼中干燥5分钟。
    注意: 避免涂上动物的腹部, 因为油漆是用来增强爪子和身体的对比。这是有用的, 有黑色的手指油漆方便的更正。这一步骤是需要的动物棕色毛皮, 或如果爪子已经纹身的标识。如果选择画一只动物的爪子, 同一组和对照组中的所有动物都需要被涂上油漆。
  4. 在仪器的右上板设置跑步机的速度;如果将应用多个运行速度, 请先以最慢的速度开始。
  5. 将动物放在试验室 (避免在关闭房间时夹紧尾巴或爪子)。用深色布盖住房间, 允许每只动物调整 1-2 分钟。
  6. 打开测试室的灯, 把跑步机的灯旋转开关转向 "on" 位置。转动跑步机旋转开关到 "前进" 开始跑步机, 然后点击 "记录" 按钮在成像软件。
    注意: 跑步机跑步的时候, 仔细地观察动物的性能是很重要的: 如果动物不能跟上跑步机的速度, 或者显示与运动无关的次要症状 (例如,癫痫发作)。测试条件可能需要重新调整。
  7. 当动物运行稳定 (没有快速逃逸到两侧, 前面, 或背部), 记录至少5秒前停止跑步机。停止录音, 点击 "停止" 在成像软件, 并把跑步机旋转开关回到 "关闭" 的位置。
    注意: 为了避免动物的不稳定运行, 它可以帮助他们运行几秒钟, 或允许他们跑在另一个方向 (通过转动跑步机旋转开关改为 "反向" 而不是 "前进")。
  8. 单击成像软件中的 "处理" 按钮, 打开一个菜单, 在其中可以设置视频部分的开始和结束点 (用于分析)。为此, 请使用屏幕底部的滑块浏览视频。
  9. 要选择当前时间点作为起始点或终点, 请分别单击 "从帧 #" 和 "到"。确保该部分至少包含7步/爪 (总共14步), 动物以恒定的速度稳定运行。
  10. 输入动物身份、出生日期、体重和性别。将数据保存到计算机或服务器上所需的位置。单击 "照相机" 返回到录制界面。
  11. 如果需要记录多个运行速度, 请使用所需的运行速度重复步骤 2.6-2.10。在录制下一个视频之前, 请确保红色颜料仍然存在于爪子上, 否则重复步骤2.3。
  12. 录音后, 将动物放到其家庭笼子里。除去动物后, 用肥皂水彻底清洁跑步机皮带, 然后用消毒剂为下一个实验动物准备。

3. 视频处理

  1. 启动分析软件并单击 "选择学习文件夹" 以选择带有录制视频的文件夹。
  2. 选择一个视频或几个可以连续处理的视频, 然后单击 "转到"。
  3. 使用 "重绘" 函数选择鼠标运行的区域;本节只应包含鼠标和白色背景。
  4. 如果 "反向" 跑步机功能以前使用过, 选择 "检查主题的鼻子是您的权利 > > >" 镜像视频, 因为软件设计只分析动物跑到左边。单击 "接受" 继续。
  5. 使用 "刷新" 功能可以查看软件检测到的默认掩码和爪子打印。
    注意: 原来的视频显示在左边, 和黑白图像的建议爪印是在右边。
  6. 在 "长度" 和 "宽度" 框中输入值, 以更改排除动物鼻子周围红色区域以进行分析的掩码;由于颜色类似的爪子, 不掩盖该区域可能导致软件意外分类的鼻子区域作为一个爪子。
  7. 调整滑块 "过滤器噪音" 和 "过滤毛皮和深色补丁", 以优化黑白爪子打印。设置 "过滤噪声" 滑块到 ~ 800-950 为黑动物和 ~ 700-800 为褐色或白色动物, 取决于动物的确切的毛皮颜色。当设置令人满意时, 选择 "确定"。
    注: "过滤毛皮和深色补丁" 滑块取决于如何 "红色" 的爪子。对于手绘的爪子, 该值通常约为 100-120, 而对于非手绘爪子, 最佳值是大约 50-100。这些设置取决于毛皮和爪子的颜色阴影, 需要为每种动物进行优化。黑和白色爪打印应该有清楚的表示法爪子以尽可能小的背景噪声尽可能。
  8. 选择一个或多个通过第一次调整的视频 (在视频名称前标有 "@@"), 然后选择 "转到" 函数开始分析这些视频。
    注意: 每个视频的分析需要 2-5 分钟。因为这个步骤不需要实验者的输入, 所以可以在一夜之间运行对几个视频的分析。
  9. 选择分析后的视频 (用 "@@@" 标记), 然后单击 "转到"。注意, 爪子区域 (在 cm2) 与传送带的接触随着时间的推移 (步态动力学) 为每一个单独的爪子现在可以看到。要比较原始视频和所选区域的计算爪打印, 请使用 "播放视频" 功能。
  10. 使用以下 (三) 工具纠正软件所犯的小错误。
    1. 使用 "正确" 选项删除错误的信号,例如,当软件记录信号时, 即使相应的爪子与皮带没有接触。单击一次可缩放到相关区域, 并将对象的左边框标记为在第二次单击时删除, 右边框与第三次单击。
    2. 使用 "连接" 选项结合两个信号,例如,当没有信号记录几个帧, 即使爪子是与皮带接触。单击一次放大相关区域, 双击两个对象中间的组合。
    3. 使用 "删除" 选项可以完全删除分析中的时间点。仅当错误不能用 "正确" 或 "连接" 功能固定时,例如,当左前肢爪的信号被意外记录为左后肢爪时, 才使用此选项。单击一次可缩放到相关区域, 并将区域的左边框标记为在第二次单击时删除, 右边框与第三次单击。
      注: 这些工具只能用来改正小错误;系统故障 (例如,如果从一只爪子的信号是极端微弱的) 不能被改正: 录影应该被排除从分析和各自的动物的录音重复, 当可能时。请注意, 在使用 "正确"、"连接" 或 "删除" 选项后, "播放视频" 选项不再可用, 单击 "撤消" 按钮将重置所有3编辑工具。
  11. 选择 "下肢体" 进行4肢体;当 "下肢体" 被点击最后的爪子后, 软件完成分析, 并显示该动物在4屏幕上的结果。

4. 步态分析

  1. 当分析来自一个实验的所有视频时, 选择所有视频并单击 "重新组织结果" 以导出结果 (电子表格文件中的参数列表)。
  2. 打开具有 "reorganized_stride_info" 结尾的文件, 并添加此电子表格中未包括的信息: 组信息 (例如,基因型、治疗)、年龄和动物长度和宽度的测量, 保存在另一个具有 "SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info" 结尾的电子表格文件。
  3. 在必要时, 将步态参数规范化到动物的宽度或长度,例如, SL 到动物的长度和 SW 到动物的宽度。
  4. 按组、年龄和运行速度对结果进行排序: 独立分析所有这些条件。
    注意: 不同的年龄或运行速度不能在同一组中组合。
  5. 计算所有实验条件下每个参数平均值 (平均值) 值、标准偏差和标准误差。
  6. 根据实验设计进行统计分析,例如,使用2尾t检验, 将突变体/被处理动物与野生型 (体重)/对照组进行比较, 或对方差进行比较。
  7. 查看所有测量的参数: 绘制每个参数以更好地可视化结果是很有帮助的。如果给定参数中存在统计差异, 请检查其他相关参数是否相应变化。
    注: 例如, 如果在某一测试组中 SL 明显减少, 这也会导致更高的步频 (因为运行速度相同), 并可能导致增加的 SW (以保持姿态稳定)。
  8. 选择与模型最相关的参数, 并且/或与人类疾病中的观察相媲美。对于演示文稿, 为每个组创建具有代表性的视频, 并通过图形显示相关参数的读数来补充它们, 因为微妙的步态变化通常不明显的视频。

5. 故障排除

注意: 有些动物, 特别是有焦虑表型的老鼠模型, 即使是在跑步机上跑步之类的简单任务, 也可能有困难。以下是可以采取的步骤, 以降低焦虑水平, 并鼓励跑步。

  1. 适应性和积极的执行。
    1. 在第一次测试前 2-3 天, 把鼠标放在测试室里, 用深色布盖住, 然后把灯关掉。让鼠标调整到新的环境为 ~ 5 分钟. 将周或巧克力/坚果黄油 (如花生酱) 添加到测试室中, 这样就可以形成一个正的关联。
  2. 由空气喷/后边界的负执行。
    1. 老鼠不喜欢空气喷吹或在他们身后的运动, 并将逃离的干扰。为了激励跑步, 使用温和的空气喷吹, 或有节奏的运动的柔性杆, 形成的后方边界的测试室, 鼓励鼠标跑向前部的测试室。
  3. 慢点开始
    1. 在测试快速运行速度时, 以较低的速度启动跑步机, 然后慢慢地将跑步机速度提高到所需的测试条件。
  4. 尽量减少自由运动。
    1. 测试室长度受两个可调节的杆在前面和后面的限制。如果一个试验动物跟上运行速度, 但不稳定运行, 限制室的长度, 使运行更稳定。
  5. 如果上述测量不成功, 则在第二天运行记录。如果动物在三天的测试后仍拒绝运行, 请将其记录为发现, 并将该动物排除在进一步测试之外。
    注意: 步态分析的结果取决于高质量的视频记录。如果视频已被仔细记录, 在分析过程中没有理由排除视频。如果视频质量不足, 在步骤3.6 中, 当设置数字爪打印的创建参数时, 它将变得明显。如果其他身体部位, 除了爪子和鼻子出现红色 (例如,由于在生殖器周围缺少毛皮或手指油漆 sprinklings 在腹部), 质量下降显著。步骤3.6 中的调整只允许更正小问题, 如果这不能使视频达到可接受的信号/噪声比, 则需要从分析中排除视频, 并且需要重复录制。因此, 建议在执行录制后不久对视频进行分析。

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Representative Results

为了说明运动学步态分析的应用, 我们对 C57BL/6J 小鼠的步态分析, 以及几个 endophilin 突变线, 使用商用仪器和软件 (请参阅表材料)。在此设置中, 在透明跑步机下的高速摄像机记录鼠标的运行情况 (图 1A)。软件然后识别红色的爪子和白色或黑色毛皮的对比。由于我们的实验动物有深褐色的毛皮颜色, 我们用红色的手指画了所有主题的爪子。我们以不同的运行速度测试实验动物: 步行 (10 厘米/秒), 运行 (20 厘米/秒), 快速运行 (30 厘米/秒)。接触区, 和时间的爪子在跑步机和在空气中测量。从这些信息中, 计算出了复述步态节奏的参数 (例如摆动/姿态时间、刹车/推进) 或姿势 (如爪角、SW) (图 1B)。

我们进行了步态分析, 作为一个部分的电池的几个运动行为测试。我们评估了抓握强度 (GS), 后肢紧握 (HLC), 步态和加速 rotarod 的表现。虽然运动行为不受以往的经验和实验测试的影响, 如认知, 但仍然重要的是, 每一个动物进行相同的测试, 在相同的顺序和相同的年龄。该命令应由低到高的困难, 以减少对动物的影响, 从以往的试验对目前的测试。

我们为这项研究选择了 endophilin 突变体, 因为根据三 endophilin 等位基因中有多少是缺失的, 结果表型不同于单个科斯的表型和年轻的 endophilin 1-2 ht-3 高的轻度神经退行性表型。衰老的老鼠。因此, 这些动物线提供了一个足够的模型来研究微小的变化, 只发展为动物的年龄。鉴于大多数 endophilin 变种显示寿命缩短, 我们检查了 endophilin 突变体在18月内的运动行为 (18 月的时间点被选中, 因为即使是在 endophilin 1 高 2 ht-3 高线的老鼠, 显示最强的表型, 没有麻痹)。步态分析是在18月期间的八个时间点进行的 (图 1C)。在18月的年龄, 这些动物被安乐死, 并保存为生物化学和/或组织学分析。

鼠标菌落维护:

endophilin 1、2和3个等位基因的异型和纯合小鼠最初是在米洛舍维奇和al中报道的。除 littermate 小鼠外, 还使用了21 C57BL/6J 小鼠作为对照。老鼠被安置在开放笼子与广告随意获得食物和水在小组至多5个动物, 在12小时光/黑暗的周期。在这项研究中, 只有雄性小鼠被用来排除雌性中周期依赖性变异的影响。

Endophilin A1、A2 和 A3 小鼠模型的基因分型:

endophilin 突变小鼠的基因分型采用聚合酶链反应 (PCR) 扩增, 利用基因组 DNA 从尾部或耳拳中提取。PCRs 为三 endophilin-一个基因执行了与各自引物: endophilin-A1: 向前底漆 5 ' CCACGAACGAACGACTCCCAC3 ' 和反向引物 5 '-CGCACCTGCACGCGCCCTACC-3 ' 为重量, 5 '-TCATAGCCGAATAGCCTCTCC-3 ' 为高;endophilin-A2: 前底漆 5 '-CTTCTTGCCTTGCTGCCTTCCTTA-3 ' 的重量;5 '-CCTAGGGGCTTGGGTTG-TGATGAGT-3 ' 为高和反向底漆 5 '-GCCCCACAACCTTCTCGCTGAC-3 ' 为重量, 5 '-CGTATGCAGCCGCCGCATTGCATC-3 ' 为高;endophilin-A3: 向前底漆 5 '-CTCCCCATGGTGGAAAGGTCCATTC-3 ' 和反向底漆 5 '-TGTGACAGTGGTGACCACAG-3 ' 为重量, 5-' CAACGGACAGACGAGAG-美洲金枪鱼委员会-3 ' 为高。所得到的 PCR 产品运行在1% 琼脂糖凝胶, 产生独特的波段大小的野生和高等位基因: endophilin-A1 384 bps, 高 ~ 950 bps;endophilin-A2 1280 bps, 高 ~ 1000 bps;endophilin-A3 325 bps, 高 ~ 465 bps。PCR 产品的重量和高带表明异型 (HT) 动物。

结果：

为了描述衰老小鼠的步态和体位, 我们对这些动物进行了运动学步态分析 (图 2;电影 1)。而一些参数, 例如 SW (前部或后肢之间的平均距离正常化为动物的宽度; 请参见表 1), 保持不变的动物随着年龄的提高, 其他参数逐渐变化 (图 2A-C). 例如, 后肢双支支持 (相对于姿势持续时间, 两个后肢同时接触地面) 从1月增加到18月 (图 2B)。此参数通常与姿势不稳定35有关。此外, 肢体负荷 (打破阶段的爪子面积最大变化率) 从1月到18月从38厘米2/秒增加到59厘米2/秒 (图 2C)。快速减速可以解释为降低肌肉强度的指标。总体运行能力不受影响的动物 (94% 可以运行在30厘米/秒18月,图 3A)。除了描述不受影响的步态和姿势参数, 或随着年龄的增加而逐渐改变, 我们已经证明, 使用新品的运动步态分析是研究年龄相关轻度改变的一种合适方法。步态和姿势。

虽然总体运行能力不受影响的动物, 一些 endophilin 突变线显示改变的能力行走或运行在机动跑步机 (图 3A), 据报道, 默多克等。13在更小的数据集合。值得注意的是, 虽然在1月的所有 endophilin 1 高-2 ht-3 高老鼠都能跑在30厘米/秒, 在18月的年龄81% 的相同的动物无法运行 (图 3A, 注意到更大的队列分析比那些以前报告的13)。有趣的是, 缺乏 endophilin 等位基因的 endophilin 突变体 (即endophilin 1-2 ht-3) 也受到影响, 但程度较低 (图 3A)。

尽管 endophilin 1 高-2 ht-3 高的突变体显示严重的运动障碍, 随着年龄的提高13, 一些步态参数没有改变, 比控制, 也在18月的年龄。例如, 步进角变异性 (步进角度的标准偏差) 保持不变 (图 3B)。值得注意的是, 许多其他参数, 例如推动时间 (爪子在推进阶段的姿态时间的百分比), 在1月的年龄没有不同, 但随着老化逐渐变差 (图 3C; 参见影片 2)。这表明, 年龄相关的参数, 以及神经变性突变特异变量可以研究的运动学步态分析方法。

Figure 1
图1。腹面成像的设置和原理.(a) 步态分析设置的照片和示意图。(B) 分析软件原理: 从记录下来的鼠标在一个透明的跑步机上运行, 软件计算数字爪印。随着时间的推移, 它们在跑步过程中的动力学被测量为爪子面积大小, 这是用来计算步态节律和姿态参数的基础。(C) 对 endophilin 突变体进行步态分析实验的时间过程。运动和步态评估在 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18 月。图像显示, endophilin 1 高-2 ht-3 高鼠标在 2, 12, 18 月。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图2。野生型小鼠步态分析.在1、2、3、6、9、12、15和18月内对 C57BL/6J 小鼠的运动和步态进行了评估。(A) 对动物宽度规范化的姿态宽度不随年龄的提高而变化。(B) 后肢双支支持随年龄增长而增加。该图显示了两个后肢同时在地面上的姿势时间的百分比。这个参数的增加反映了步态的不稳定性。(C) 肢体负荷 (打破阶段爪子面积的最大变化率) 随年龄增加而增大。更快速的减速可能是降低肌肉强度的指标。所有图均代表均值 "SEM";p值是从2尾t检验与1月的老重量计算, 并表示为 * p < 0.05, *** < 0.01, *** p < 0.001请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图3。endophilin 突变体的步态分析.(A) endophilin 突变体的运行速度在1、12和18月, 从一个扩大的数据集计算, 与默多克等。13 Bar 颜色反映了在机动跑步机上能够运行在 30 (深蓝色), 20 (蓝色), 或10厘米/秒 (浅蓝色) 的动物的百分比, 或拒绝运行设置 (灰色)。虽然所有被测试的动物可以在1月内以30米/秒的时间运行, 但 endophilin 突变体随着年龄的发展而出现运行赤字。(B)步进角的可变性和推动时间在小波 (黑色), endophilin 1 高-2-3 重量 (turquois), endophilin 1 高 2 ht-3 (深蓝色) 和 endophilin 1 高-2 ht-3 高 (棕色) 小鼠。阶跃角变异性在衰老的动物, 或在 endophilin 突变体之间没有差异。endophilin 突变体与体重在1月间没有明显改变, 但随着小鼠年龄的增加, endophilin 突变体的推进时间 (占姿态的比例) 没有显著变化。所有图都表示平均值的扫描电镜;p值是从2尾t检验与年龄匹配的重量计算, 并表示为 * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001请单击此处查看此图的较大版本.

Movie 1
电影1。野生型 (C57BL/6J) 小鼠步态分析 3 (左) 和18月 (右).原始视频 (顶部) 被翻译成 "数字爪打印" 视频 (底部)。视频速度已经放慢了5倍, 使细节可以更好地欣赏。在18月的时间点, 注意右后爪的犹豫 (红色在数字爪打印) 在 ~ 2 s, 和右前爪 (蓝色在数字式爪打印) 在 4 s。视频速度已经减慢了10的因素。请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.

Movie 2
电影 2。步态分析在 endophilin 1 高-2-3 重量 (控制; 左) 对 endophilin 1 高 2 ht 3 高 (右) 老鼠在18月的年龄.视频速度已经放慢了5的因素, 所以细节可以更好地欣赏。endophilin 1 高-2 ht-3 高鼠标显示步态的变化, 可以看作是不稳定运行的动物。请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.

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Discussion

研究运动协调是神经退行性疾病模型的一种有用的方法, 特别是对运动协调受到严重影响的 PD 等疾病的描述。在运动步态分析功能检测的帮助下, 我们可以确定在运动问题开始时动物步态的细微变化, 或者在弱变性的模型中, 因此相对温和的表型。鉴于各种神经退行性疾病模型中的表型广泛, 包括小步态异常和严重的运动损伤, 这种方法很适合根据动物的年龄和移动能力来评估步态参数。严重受损的动物可以在一个平面跑步机上以低速的速度记录, 而较少受损的模型可以高速地记录在上坡或下坡上。这可以揭示神经退行性模型与 littermate 控制之间的步态差异, 而不 overexerting 动物。

通过该协议, 我们展示了都方法对小鼠衰老运动损伤的监测。测试小鼠在多个时间点, 因为他们的年龄的进步, 使我们能够确定年龄依赖性的步态异常, 并描述他们如何进步与衰老。此外, 当处理变性的鼠标模型时, 经常出现的一个问题是, 由于与运动行为无关的症状 (如焦虑、冷漠、学习困难), 动物的意愿甚至简单电机任务, 如运行, 减少。在这里, 我们建议方法修改和激励工具, 以鼓励运行在照明电动跑步机, 有助于成功地应用运动学步态分析的衰老小鼠线与神经退行性变化。此外, 我们使用一个简单的技巧, 应用手指涂料的动物的爪子, 并表明它可以大大有助于提高记录的数据质量。获取良好的视频记录是步态分析最关键的一步: 分析的成功取决于每个自动或半自动分析图像或视频, 对原始数据的质量。低质量的视频在分析后的步骤中无法改进, 通常必须从分析过程中排除。

在系统地研究18月跨度的 endophilin 和几种变异线的步态和姿势的同时, 我们注意到即使是没有明显运动/跑步问题的小鼠和小鼠 (即endophilin 1), 也显示了改变几个步态和姿势参数随着年龄的进步的方式 (图 2和图 3A)。有趣的是, 我们也注意到, 虽然在衰老 endophilin 突变体中观察到的一些步态和姿势参数异常发育在同一个方向和斜坡上, 就像在控制动物中一样, 其他的则没有 (图 3)。最后, 重要的是要注意到, 即使年老的小鼠和年轻的 endophilin 突变体没有显示任何明显的运动, 步态和姿势缺陷时, 眼睛观察, 选择步态和姿势参数的变化可以检测到这种方法。

测试鼠标马达的行为是最全面的方法之一, 以说明鼠标模型体现了人类的主要方面的情况。因此, 已经制定了许多测试来评估马达行为的各个方面。这些测试包括野外试验 (一般运动活动), rotarod (马达协调, 共济失调), 握杆强度 (肌肉强度), 运行轮 (活动), 挂线测试 (耐力), 阶梯梁行走任务 (精细马达协调,感觉运动技能), 步态分析 (运动, 肢体协调), 和其他 (总结在 Wahlstein36)。不同的测试有特定的优点和缺点, 它们的读出通常仅限于他们设计用来解决的马达行为的方面 (或方面)。由于这个原因, 执行电池的马达行为测试, 以涵盖这一领域的主要方面已成为普遍的做法。

步态分析通常不包括在这些电池中, 部分原因是 Guillot 的报告. 37, 发现步态分析不检测 PD 和 ALS 动物模型的运动缺陷, 部分原因是费力的方法和有限的输出。然而, Guillot. 报告受到了研究的挑战, 解决了研究设计38中的几个局限性。最近发表的10、11、12、39、40 的出版物表明了这种方法在变性小鼠模型步态分析中的实用性. ,41,42,43, 也包括我们的工作13。

与传统的用墨水画爪子和让鼠标在白纸44上运行的方法相比, 新品唱片有几个优点。最明显的事实是, 随着机动跑步机, 动物的运行速度被控制, 这对几个步态参数有很强的影响1。此外, 只有当动物以要求高的速度和/或倾斜/下降而运行时, 某些步态异常才会被发现, 这在自愿跑步中是看不到的。此外, 手工细致的分析被半自动化的高通量分析所取代。因此, 每组试验的动物数量都可以增加, 这反过来又减少了在活着的动物中不可避免的变异所造成的影响。总之, 我们建议在标准的马达测试电池中加入变性的改进版本, 以补充对老鼠模型中的运动损伤和/或老化的分析。

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Disclosures

作者声明没有竞争的财政利益。

Acknowledgments

我们感谢在埃尼动物设施的动物看护者帮助育种, Nuno 博士雷蒙对手稿有用的评论。通过合作研究中心 SFB-889 (项目 A8) 和 SFB-1190 (项目 P02) 和艾美奖诺特青年调查员奖 (1702/1), 德国研究基金会 (DFG) 提供的赠款支持了贝得通。C.M.R. 得到了来自神经、生物物理学和分子生物科学 (GGNB) 的哥廷根研究生院的研究员的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DigiGait Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware
non-transparent blanket or dark cloth cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress
balance e.g. Satorius balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g
red finger paint e.g. Kreul or Staedtler for increasing the contrast between paws and animal’s body
small paint brush soft brush to apply finger paint to the animal paws
diluted detergent for cleaning
disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol e.g. B.Braun for desinfection

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发育生物学 问题 136 老化 步态分析 运动 变性 吞 endophilin 马达行为 马达测试电池 腹面成像
变性小鼠年龄依赖性运动障碍的步态分析
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Rostosky, C. M., Milosevic, I. Gait… More

Rostosky, C. M., Milosevic, I. Gait Analysis of Age-dependent Motor Impairments in Mice with Neurodegeneration. J. Vis. Exp. (136), e57752, doi:10.3791/57752 (2018).

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