Summary
本研究で我々 は腹面が加齢マウス モデル (例えば、エンドフィリン突然変異体の神経変性の進行と同様、モーターの調整の微妙な変化を監視するイメージングに基づく運動歩行解析の使用方法を示すマウスの行)。
Abstract
モーターの動作テストは齧歯動物モデルの機能的関連性を決定するために使用されますが、新しくをテストするこれらの動物の治療法を開発しました。具体的には、歩行解析により再収集病、筋萎縮性側アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD) など運動能力に影響を与える神経変性疾患を中心に、人間の患者で観察される関連する表現型外側硬化症 (ALS)、および他。この線に沿った初期の研究で歩行パラメーターの測定は骨の折れるとコントロールしにくい要因に依存して (例えば、走行速度、連続運転)。腹面イメージング (VPI) システムの開発では、齧歯動物でこのメソッドの運動行動の評価のための便利なツールを作って、大規模な歩行分析を実行することは不可能。ここでは、提案する神経変性; のマウス ・ モデルにおける運動障害の年齢依存進行を調べる運動学的歩行分析を使用する方法の詳細なプロトコルエンドフィリン、変性損傷が徐々 に年齢とともに増加の低下レベルでのマウスの行は例として使用されます。
Introduction
神経変性疾患の患者・家族・社会に深刻な負担を課すこと、平均寿命が上がるにつれて、関心が大きくなるし、世界の人口でエージングを続けます。神経変性疾患の最も一般的な症状の一つはバランスと機動性の問題です。したがって、特性 (例えば、齧歯動物) の哺乳類の老化運動行動のモデル、またはモデルの神経変性の表現型を示すが生体内で関連性を示す特定の動物モデルまたは治療する貴重なツール病気の症状を改善することを目指して治療します。神経変性疾患の治療にほぼすべてのアプローチは最終的に人間の臨床試験の開始前に動物モデルでのテストが必要です。したがって、一貫して年齢の進行に沿って病に関連した表現型を定量化するための in vitroモデルの可能性を示した、候補薬ができるようにするために使用できる信頼性の高い、再現可能な動作テストすることが重要です。生きている動物の表現型を効果的に改善します。
齧歯動物の運動行動評価の 1 つの側面は、VPI (また呼ばれる腹面ビデオ撮影)1,2で行うことができる運動歩行分析です。透明およびモーターを備えられたトレッドミル ベルト1,2,3,4の頂上に歩いて齧歯動物の下側の連続記録この確立されたメソッドを使用します。ビデオ フィード データの解析が動的にかつ確実に要約齧歯動物の歩行パターンでは、もともとケールらで定義されているすべての 4 つの手足の「デジタル足プリント」を作成します2 Amendeら3。
イメージングに基づく歩行分析の原則は、それぞれの個々 の足の時間をかけてトレッドミル ベルトと接触して手領域を測定することです。すべての姿勢は、足エリア (ブレーキの段階では) で、(推進中) 足の面積の減少の増加によって表されます。これは、信号が検出されない遊脚相が続きます。スイングやスタンス一緒にストライドを形成します。歩行ダイナミクスのパラメーターに加え、姿勢パラメーターは、記録したビデオから抽出できます。模範的なパラメーターと定義の表 1に掲げるとスタンス幅 (SW; 前部または後部足から吻尾軸までの複合距離) を含む、歩幅 (SL; 同じ足の 2 つの前進間の平均距離)、または足の配置角度 (吻尾軸に足の角度)。姿勢と歩行の動態データを許可 (姿勢パラメーターと複数のステップ変動) による動物のバランスと (歩行力学パラメーター) によって調整に関する結論を引き出す。運動失調係数 (SL 変動 [(最大で計算など、その他のパラメーターSL−min。SL) 意味する SL/])、後肢共有スタンス時間 (両後肢がベルトに接触している時間) または足ドラッグ (リフトオフの手による姿勢からベルトに足の総面積) も抽出することができます、様々 な神経変性 · ディ · 変更する報告されています。病モデル5,6,7,8 (表 1参照)。
| パラメーター | ユニット | 定義 |
| スイング ・ タイム | ms | 足はベルトとの接触時間の期間 |
| 立ち時間 | ms | 足はベルトとの接触時間 |
| % ブレーキ | 立ち時間の % | 姿勢の時間足、ブレーキの段階の割合 |
| % を推進します。 | 立ち時間の % | 足は、推進段階スタンス時間の割合 |
| スタンス幅 | cm | 前部または後部足から吻尾軸までの距離合計 |
| ストライドの長さ | cm | 同じ足の 2 つの前進間の平均距離 |
| ストライド | 前進/s | 1 秒あたりの完全な大またの数 |
| 足の配置角度 | 度 | 動物の吻尾軸に関連して足の角度 |
| 運動失調の係数 | a.u. | SL [(max SL-min SL)/平均によって計算された SL 変動] |
| % 共有姿勢 | スタンスの % | 後肢共有姿勢の時間;両後肢が同時にベルトと接触している時間 |
| 足ドラッグ | mm2 | リフトオフの手による姿勢からベルトに足の総面積 |
| 肢荷重 | cm2 | 最大ダ/dT;速報段階では足の変化の最大レート |
| ステップ角度変動 | 度 | 後肢の間の角度の標準偏差は、SL と SW の関数として足します。 |
表 1。腹面イメージングによってテストすることができますキー歩行パラメーターの定義。
神経変性疾患モデルマウスの運動行動の評価は与えられた年齢での特定のモデルの表現型の重症度に応じて挑戦することができます。いくつか病気、最も目立つように PD を強力なモーター動作 (歩行) 赤字は、患者と動物モデルの両方。PD の 4 つの主症状の一つは加齢とともに進行し、PD9の初期の段階で既に重度の歩行障害のマニフェスト運動緩慢です。急性の PD モデル 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) が奏効の齧歯動物の研究は既に VPI 歩行分析10、11,12を使用しています。しかし、このモデルの急性の性質を考えると、これらの研究は対処できません加齢に伴う運動障害の進行。いくつかの最近の研究はたとえば13,14,15, 加齢とともに病気の進行を理解することの関連性を強調して神経変性変化高齢マウスにおける歩行分析を行った.
運動障害に加えて神経変性疾患の動物モデルはしばしば検討タスクに焦点を当て問題を抱えるし、加齢と共に特に顕著な認知障害を示します。このような表現型はモーターの動作テストの結果に影響を与えます。すなわち、rotarod テスト16、運動障害を調べる最も広く使用されている試験の一つは、認知、注意、およびストレス17,18に依存します。モーターを備えられたトレッドミルの上を歩く意欲は、またこれらの要因によって異なります記録の読み出しを実行すると、標準的な機能であるし、これまで変更された認知の影響は小さい。ストレスと注意の影響は、全体的な実行能力ではなくスイング ・ スタンス時間の応力、および注意19、20SL のような特定のパラメーターで表示ことがあります。
運動学的歩行分析のアプローチをさらに齧歯動物モデルの課題を調整するオプションを持つことの利点を提供しています。調整可能な角度とスピードでトレッドミルにより、歩行速度 0.1 ~ 99.9 cm/s、重度の歩行障害を持つ齧歯類は遅い速度で実行することができますように (~ 10 cm/s)。高速走行速度で測定できる非障害動物 (30 - 40 cm/s)。テストの動物が一定の速度で実行することができるかどうかの観察は、それ自体で結果を提供します。さらに、齧歯類は、ゴニオメータの助けを借りて、希望の角度にトレッドミルを傾けることによってまたは加重そりをマウスまたはラットの後肢にアタッチすることにより減少、上下、傾斜を実行するさらに挑戦しました。
患者で変異が単一のタンパク質の多くの研究に加えて不良エンドサイトーシス プロセスと神経変性13,21,22、間のリンクの最近の増加の意識があります。 23,24,25,26,,2728。エンドフィリン A の減らされたレベルを持つモデルをマウス (今後エンドフィリン) 両方クラスリン依存性エンドサイトーシス13,21,の29,30,31の主要プレイヤー,32,33,45とクラスリン依存エンドサイトーシス34、神経変性を示し、自発運動13,21の年齢に依存して障害が判明しました。3 つの遺伝子をエンコード エンドフィリン蛋白質の家族: エンドフィリン エンドフィリン 2、1 とエンドフィリン 3。特に、エンドフィリン蛋白質の枯渇から生じる表現型は数によって大幅に異なりますエンドフィリン遺伝子13,21を不足しています。トリプル ノック アウト (KO) エンドフィリン遺伝子は致死が誕生と両方のエンドフィリン 1 と 2 失敗繁栄し、出産後 3 週間以内に死亡することがなくマウス後わずか数時間、3 つの endophilins のいずれかの単一の KO を示しています明白な表現型のテスト条件21。他エンドフィリン変異遺伝子は減らされた寿命を表示し、年齢13の増加と運動障害を開発します。例、エンドフィリン 1KO 2HT 3KO マウス表示歩行変化と運動協調性問題 (運動学的歩行分析と rotarod によってテスト) としての同腹子ながら、生後 3 か月ですでにエンドフィリン 1KO 2WT 3KO 動物表示重要です年齢13の 15 ヶ月間は運動協調性が減少します。これらのモデルにおける表現型の広大な多様性のため、識別し、さまざまな動物のモーター認知能力と時代に対応する課題を統合することができますテストを適用する必要です。ここでは、発症および神経変性変化 (すなわち、エンドフィリン変異体) を示すマウス モデルにおける運動障害の進行を評価する運動学的歩行分析に活用実験の手順を詳しく説明します。様々 な年齢や歩行障害の重要度が異なるで歩行パラメーターの測定が含まれます。
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Protocol
ここで報告したすべての動物実験は動物福祉のためのヨーロッパの指針に基づいて実施される (2010/63/EU) Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (ラーベス)、登録番号 14 の承認で/1701。
1. 研究デザイン
- 動物の行動の仕事は、慎重な計画を必要とする実験を設計しながら次のパラメーターを検討します。
- グループごとに必要な動物の数です。
- (例えばパス、EDA、または GPower) 必要なグループのサイズを計算する統計ソフトウェアを使用します。
注: グループのサイズは、動物と表現型の重症度との相違に依存します。動歩行解析のためネズミの数は通常 10-20 グループごとであります。
- (例えばパス、EDA、または GPower) 必要なグループのサイズを計算する統計ソフトウェアを使用します。
- 実験動物のセックス。
- 動物の系統によって、実験に及ぼすエストロゲンのレベルを検討します。
注: 多くの行動研究は、実験に及ぼすエストロゲンの影響を避けるために男性に集中します。これらの影響は、動物の背景系統によってもっとまたはより少なく強い。 - 男女が使用される場合、性の影響をテストし、必要があるときに独立して 2 つの男女を評価します。
- 動物の系統によって、実験に及ぼすエストロゲンのレベルを検討します。
- 実験動物の時代。
- のみ 1 回限りのポイントが必要な場合は、大人動物 (2 ヶ月以上の年齢の方) を使用します。
- 加齢とともにモーター動作の変更を検討するときは、いくつかの時間ポイントを選択します。最も早く可能な時間ポイントは 1 ヶ月、マウスは、母親から引き離されます。例えば、 1、2、または 3 か月ごと定期的に動物をテストします。
- グループごとに必要な動物の数です。
- 動物の動作テストを実施する地元当局からの承認を申請します。
- 実験動物の調達計画を立てます。
- 繁殖計画を立てる、またはとき、実験開始日に十分な実験動物が利用できるようにタイムリーに動物のディストリビューターにお問い合わせください。
- 新しい部屋の/設定、実験中に保持されている場合、1 週間の習慣になって動物を許可します。
2. ビデオ録画
注: 運動学的歩行分析の使用を示すためには、ここで市販イメージング システムとその付属のイメージング解析ソフトウェア (材料の表を参照) を使用します。
- コンピューターと撮像素子のソフトウェアを起動します。
- ホームおり、観察してみるとバランスの重さによって健康状態とそれぞれの動物の幸福を決定します。
- 必要に応じて、ブラシで動物の足に赤い指塗料を適用優しく。予備のきれいなケージで 〜 5 分間乾燥する塗料を許可します。
メモ: は、塗料は足と体のコントラストを高めるために動物の腹部を塗装しないでください。黒指塗料の修正のために便利を持っていると便利です。褐色の毛皮を持つ動物のため、この手順は必要またはケースの足が同定の入れ墨をされました。1 つの動物の足を描画するを選択した場合同じグループとコントロール グループのすべての動物は、同様に塗装する必要があります。 - 装置の右上のパネルでトレッドミルの速度を設定します。1 つ以上の走行速度を適用する場合は、まず最も遅い速度から始めます。
- 試験室に動物を配置 (商工会議所を閉じるとき、尾や足をクランプを避けるため)。チャンバー内に暗い布をカバーでき、各動物に 1-2 分を調整します。
- 「オン」の位置にトレッドミル光ロータリー スイッチを回すことによって試験室でライト点灯します。トレッドミルのロータリー スイッチ、トレッドミルを開始する「転送」を撮像素子のソフトウェアで「レコード」ボタンをクリックします。
注: トレッドミルを実行中それが動物パフォーマンスを慎重に常に観察することが重要: 動物をトレッドミルの速度に追いつかない場合は、トレッドミルを直ちに停止または歩行に関連して非二次症状を示しています (などてんかん発作)。試験条件は、再調整する必要があります。 - 安定走行に動物 (ないクイック エスケープの側面、前面、または背面に) 記録少なくとも 5 のトレッドミルを停止する前に s。撮像素子ソフトウェアを「停止」をクリックして録音を停止、トレッドミルのロータリー スイッチを「オフ」ポジションに向けます。
注: 動物の不安定な実行を避けるために立ちますいくつか秒間に実行できるようにするか (「フォワード」ではなく「逆」トレッドミルのロータリー スイッチを回す)、他の方向で実行するそれらを許可します。 - (分析に使用)、ビデオのセクションの開始と終点を設定することができますメニューを開きますイメージャ ソフトウェアで「処理」ボタンをクリックしてします。これを行うには、ビデオを移動する画面の下部にスライダーを使用します。
- 始点または終点として現在の時間ポイントを選択するをクリックして"からフレーム #"および"to"それぞれ。一定の速度で安定して動作する動物の少なくとも 7 手順/足 (合計で 14 のステップ) が記載されていることを確認します。
- 動物の個体識別、出生年月日、重量、およびセックスを入力します。コンピューターまたはサーバー上の目的の場所にデータを保存します。「カメラ」レコーディング インターフェイスに戻りますをクリックします。
- 複数の実行速度は、記録する必要があります、手順 2.6 2.10 を目的の実行速度に。次のビデオを記録する前に赤いペンキがまだ前足で、それ以外の場合手順 2.3 に存在するを確認します。
- 録音後、その家のケージに動物をリリースします。動物を削除すると、次の実験動物の準備に消毒剤と石鹸水とトレッドミル ベルトを徹底的にきれい。
3. ビデオ処理
- 解析ソフトウェアを起動し、「勉強フォルダーを選択」をクリックして記録されたビデオのフォルダーを選択します。
- 1 つのビデオ、またはいくつかのビデオ、連続して処理することができますをクリックして"go"を選択します。
- 「再描画」関数を使用してマウスを実行している領域を選択このセクションは、マウスと白背景のみ含める必要があります。
- 「逆」トレッドミル関数が以前に使用した場合は、選択"被験者の鼻は右側になるかどうかはチェックしてください >>>"ビデオの左右反転だけ左に実行している動物を分析するソフトウェアが設計されているので。「受け入れる」続行するをクリックします。
- 「リフレッシュ」関数を使用して、既定のマスクを参照してくださいし、あしあとソフトウェアを検出します。
メモ: 左側の元のビデオが表示され、提案の足の印刷物の黒と白の画像は右側。 - 分析のための動物の鼻の周りの赤い部分を除外マスクを変更する「長さ」と「幅」ボックスに値を入力します。色は、足と同様、その領域をマスキングしないと足と鼻の領域を誤って分類するソフトウェア可能性があります。
- 調整スライダー「フィルター ノイズ」と「毛皮と暗いパッチをフィルター」黒と白の足の印刷を最適化します。~ 800-950 黒い動物のために、動物の正確な毛の色によって、茶色または白い動物のため 700 ~ 800 には、「ノイズ フィルター」のスライダーを設定します。設定が満足のいく「ok」を選択します。
注:「毛皮と暗いパッチをフィルター」スライダー依存方法「赤」の前足です。塗られた足の値は通常、約 100-120、非塗装の足の最高値は周り 50-100。これらの設定は、毛皮と、足の色の調整に依存する、すべての動物のために最適化する必要があります。印刷の黒と白の足として可能な限りほとんどのバック グラウンド ノイズと足の明確な表現が必要です。 - 最初の調整を渡された 1 つまたは複数の動画を選択 (ラベルの付いた"@ @"ビデオの名の前に) これらのビデオの解析を開始する「行く」関数を選択。
注: 分析は、動画ごと 2-5 分します。この手順が実験者からの入力を必要としないので、一晩いくつかのビデオの解析を実行することが可能です。 - 分析ビデオを選択 (ラベルの付いた"@")"go"をクリックしてそれぞれの独立した足 (歩行力学) を時間をかけてベルトとの接触 (cm2) 足エリアが画いてある今に注意してください。元のビデオと計算された足の選択範囲を印刷を比較、「動画再生」機能を使用します。
- 次の (3) のツールを使用して、ソフトウェアによって小さな誤りを修正します。
- 例えばソフトウェアが対応する足がベルトと接触してないのに、信号を記録するとき、間違った信号を削除するのには「正しい」のオプションを使用します。関連する領域を拡大表示するをクリックし、2 番目のクリックで削除するオブジェクトの左の枠と 3 番目をクリックすると右側の境界線をマークします。
- などにもかかわらず、足はベルトとの接触に、いくつかのフレームの信号を記録してないとき、2 つの信号を結合するのにには、「接続」オプションを使用します。一度をクリックして関連する領域を拡大表示し途中で結合する 2 つのオブジェクトをダブルクリックします。
- 時間ポイントを分析から完全に削除するのに「削除」オプションを使用します。「正しい」または「接続」機能、例えば、左後肢足に左前肢足から信号が誤って記録されるときに間違いを修正できない場合にのみこのオプションを使用します。関連する領域を拡大表示するをクリックし、2 番目のクリックで削除する領域の左枠と 3 番目をクリックすると右側の境界線をマークします。
のみメモ: 小さな誤りを修正するツールを使用することがあります。(例えば、 1 つの足からの信号は非常に弱い場合) の組織的失敗を訂正できない: ビデオを解析から除外する必要があり、それぞれの動物の記録、可能なときに繰り返し。「動画再生」オプションは、「正しい」後は、もはや利用可能なノートでは、「接続」または「削除」オプションが使用されていますと編集ツールすべての 3 にリセットされます「元に戻す」ボタンをクリックしますします。
- 「次に上肢」を選択 4 手足進むには最後の足の後「次の肢」をクリックするソフトウェア分析を完了し、、4 つスクリーンにこの動物の結果を示します。
4. 歩行分析
- 1 つの実験からすべての動画を分析するときすべての動画を選択し、「結果を再編成」をクリックして結果 (スプレッドシート ファイル内のパラメーターの一覧) をエクスポートします。
- 終了の"reorganized_stride_info"ファイルを開くし、このスプレッドシートに含まれていない情報を追加: グループ情報 (例えば遺伝子、治療)、年齢、および別に保存された動物の長さと幅の測定スプレッドシート ファイル終了"SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info"
- 必要に応じて、動物の幅または長さを歩行パラメーターの正規化などSL 動物の長さと SW に動物の幅に。
- グループ、年齢、および走行速度で結果を並べ替える: すべてのこれらの条件を個別に分析します。
注: 年齢や実行速度は、同じグループ内で併用はできません。 - 平均値、標準偏差、およびすべての実験条件の各パラメーターの平均値の標準誤差を計算します。
- 実験デザインによると統計分析を行う、2 尾tを使用するなど-変異/扱った動物野生型 (WT) を比較するテスト/制御、または ANOVA のいくつかの独立したグループを比較します。
- 一見まったく測定パラメーター: 良い結果を視覚化する各パラメーターをプロットすると便利です。任意のパラメーターの統計的な差異が存在する場合は、かどうか他の依存のパラメーターを適宜変更することを確認してください。
注: たとえば、SL は特定のテスト グループに大幅に減少した場合もこう高いストライド (走行速度が同じである) ので、その結果増加 SW (姿勢の安定性を維持する) ために。 - モデル、最も関連のあるおよび/またはヒトの疾患の観察に匹敵するパラメーターを選択します。プレゼンテーション、グループごとに代表的な動画を作成し、以来、微妙な歩容変更がビデオから明白ではない多くの場合、関連するパラメーターの読み出しを示すグラフでそれらを補完します。
5. トラブルシューティング
注: いくつかの動物は、不安の表現型、特にマウス モデルもトレッドミル上で実行のような単純なタスクを実行する難しさがあります。下位の不安レベルを取ることができるし、実行を奨励する手順を次に示します。
- 慣れや肯定的な施行。
- 最初のテストの前に 2 〜 3 日で試験室にマウスを置き、暗い布でカバー、ライトをオフのままにします。マウス 〜 5 分追加チョウの新しい環境や試験室にチョコレート/ナット バターを (例えばヌテッラ) 肯定的な連合を形成する可能性がありますので調整をしましょう。
- 空気のパフ/リアの境界によって否定的な施行。
- マウスは空気のパフや、その背後にある運動好きではないと妨害から実行されます。実行をやる気にさせるには、穏やかな空気のパフや試験室は、試験室の前部の方にマウスを奨励するためのリアの境界を形成する柔軟なバーのリズミカルな動きを使用します。
- 起動が遅い。
- 高速の実行速度をテストするとき低速でトレッドミルを起動し、目的のテスト条件に向かってトレッドミルの速度をゆっくり増加します。
- 自由な動きを最小限に抑えます。
- テスト部屋の長さは、前面と背面の 2 つの調節可能なバーによって制限されます。試験動物が走行速度を維持、着実に実行されない場合より安定した実行の結果を商工会議所の長さを制限します。
- 上記測定が成功しなかった場合は、次の日に実行を記録します。動物はまだ後 3 日間のテストを実行することを拒否、発見として記録し、さらにテストから動物を除外します。
注: 歩行分析の結果は、良い品質のビデオ録画に依存します。動画は慎重に記録されている場合、解析中に動画を除外する理由はないです。ビデオの品質が不足している場合明らかになる段階 3.6 デジタル足のプリントを作成するためのパラメーターが設定されているとき。足と鼻以外の部位が赤表示されます (例えば性器や腹部に指塗料マイメロディ周り不足している毛皮のため)、品質が大幅に低下します。3.6 のステップで調整できるだけ小さな問題を修正する、これは許容可能な信号/ノイズ比にビデオをもたらすことはできません、する場合、解析から除外する必要がありますビデオと記録が繰り返される必要があります。したがって、録音が実行された後すぐに動画を分析することをお勧めします。
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Representative Results
運動学的歩行分析の使用を説明するために行った歩行分析いくつかエンドフィリン突然変異系統と同様に、時代の進展と WT c57bl/6 j マウスに市販の計測器とソフトウェアを使用して (テーブルを参照してくださいの材料)。このセットアップでは、透明なトレッドミルの下の高速カメラはマウス (図 1 a) の実行を記録します。ソフトウェアは、赤い色の足と白または黒の毛皮のコントラストを認識します。以来、私たちの実験動物は、暗い茶色の毛皮の色を持っていた、我々 は赤い指塗料とすべての科目の足を塗装しています。我々 は異なる実行速度で実験動物テスト: ウォーキング (10 cm/s)、(20 cm/s) を実行して、高速 (30 cm/s) を実行しています。接触面積と足が空気中とトレッドミル時間を測定しました。この情報から、歩行のリズム (例えば、スイング スタンス時間、ブレーキ/推進) や姿勢 (足角度、SWなど) を要約するパラメーターが (図 1 b) を計算します。
いくつかの運動行動テスト バッテリーの一部として歩行分析を行った。握力 (GS) 後肢 (HLC) を握りしめる評価した歩行と加速 rotarod (ARR)。モーターの動作は以前の経験と実験としての影響を受けるではなく、たとえば、認知、まだ重要ですすべての動物がテストと同じ順序で、同じ歳で同じバッテリーを受けること。順序は、以前の実験から現在のテストに及ぼす影響を最小限に抑えるには、動物の高低難易度から行く必要があります。
エンドフィリン対立遺伝子がない 3 つの数によって、この研究のためエンドフィリン変異体を選択した、若いエンドフィリン 1KO-2HT-3KO で軽度の変性表現型単一のコスでない表現型によって異なります生じる表現型加齢とともに進行するマウス。このため、これらの動物のラインは動物時代としてのみ開発の微妙な変化を検討する適切なモデルを提示します。(18 ヶ月時点は最強が表示されますエンドフィリン 1KO 2HT 3KO ラインでマウスもから選択された 18 ヶ月にわたってエンドフィリン変異体のモータの挙動を調べたとことを考えるとほとんどエンドフィリン変異体は、減らされた寿命を表示表現型、麻痺はありません)。歩行分析は、18 か月間 (図 1) 8 時間ポイントで行われました。生後 18 カ月で動物に安楽死させた、生化学的、組織学的分析のために保存します。
マウス コロニーのメンテナンス:
エンドフィリン 1、2、および 3 の対立遺伝子のヘテロ接合体、ホモ接合体マウスはもともとミロシェビッチら報告されました。21 c57bl/6 j マウスを littermate マウス全体のコントロールとして使用しました。マウスは、12 時間の明暗サイクルの 5 匹の動物の最大のグループの食品や水に自由にアクセスできる公開ケージで収容されました。雄マウスだけは、女性の周期に依存した変化の効果を除外するこの研究で使用されました。
エンドフィリン A1、A2、および A3 マウス モデルの遺伝子型別:
エンドフィリン変異マウスのジェノタイピングは、尾や耳パンチから抽出したゲノム DNA を使用してのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の拡大によって行われました。それぞれプライマー 3 エンドフィリン A 遺伝子の Pcr を行った: エンドフィリン A1: 転送プライマー 5' CCACGAACGAACGACTCCCAC3' と逆プライマー 5'-CGCACCTGCACGCGCCCTACC-3' WT の 5'-TCATAGCCGAATAGCCTCTCC-3' KO; のエンドフィリン A2: 転送プライマー 5'-CTTCTTGCCTTGCTGCCTTCCTTA-3' の重量;5'-CCTAGGGGCTTGGGTTG-TGATGAGT-3' KO と逆プライマー 5'-GCCCCACAACCTTCTCGCTGAC-3 の ' WT の 5'-CGTATGCAGCCGCCGCATTGCATC-3' の KO。エンドフィリン A3: 転送プライマー 5'-CTCCCCATGGTGGAAAGGTCCATTC-3' プライマー 5'-TGTGACAGTGGTGACCACAG-3 の逆と 'WT、5-'CAACGGACAGACGAGAG と ATTC 3 の' KO の。WT と KO の対立遺伝子のための特徴的なバンド サイズを降伏 1% アガロースゲル上結果として得られる PCR の製品で実行された: エンドフィリン A1 WT 〜 384 bps、KO ~ 950 bps;エンドフィリン A2 WT 〜 1,280 bps、KO ~ 1,000 bps;エンドフィリン A3 WT ~ 325 bps、KO ~ 465 bps。WT と KO バンドと PCR の製品を示すヘテロ接合体 (HT) 動物。
結果:
歩行、WT マウス加齢とともに姿勢を特徴付ける、行った運動学的歩行分析これらの動物 (図 2;映画 1)。一方、いくつかのパラメーター、たとえば SW (平均前面間の距離または後肢動物の幅を正規化; また表 1を参照してください)、このまま加齢とともに WT 動物で、その他のパラメーターを徐々 に変更 (図 2 a-C). たとえば、後肢のダブル サポート (両後肢が同時に地面に接触している立脚時間を基準時間) が 38% から 55 %1 ヶ月から 18 ヶ月 (図 2 b) に増加します。このパラメーターは、しばしば姿勢不安定35関連付け。また、下肢荷重 (速報段階で前足部の変化の最大レート) は、59 cm2/s 1 ヶ月から 18 ヶ月 (図 2) に 38 cm2/s から増加します。高速の減速は、減らされた筋肉強さの指標として解釈できます。全体的な実行能力 (94% は 18 ヶ月、図 3 aで 30 cm/秒で実行できる) WT 動物は影響を受けません。VPI を用いた運動学的歩行解析の加齢に伴う軽度変化を検討する適切なメソッドであること記載されているだけでなく、そのままの状態、または WT マウスにおける加齢と共に徐々 に変更歩行・姿勢パラメーターの特性、歩行と姿勢。
マードックらの報告にいくつかエンドフィリン突然変異系統が徒歩またはモーターを備えられたトレッドミル (図 3 a)、上で実行する変更の能力を示す全体的な実行能力に WT 動物に影響がない間小さい方のデータ セットで13 。特に、年齢の 1 ヶ月ですべてエンドフィリン 1KO 2HT 3KO マウスはすべて 30 cm/秒で実行できる、生後 18 ヶ月で 81% 同じ動物のことができないを実行する (図 3 a、 13で以前に報告されたものよりも大きなコホートが行った注意)。興味深いことに、少ないエンドフィリン対立遺伝子 (すなわち、エンドフィリン 1KO-2HT-3WT) を欠いたエンドフィリン変異体も影響を受けますが、低い程度 (図 3 a)。
エンドフィリン 1KO 2HT 3KO 変異体は、年齢13の進展と重度の運動障害を表示、にもかかわらずいくつかの歩行パラメーターは変更されません WT コントロールと比較しても 18 ヶ月歳の時。たとえば、ステップ角度変動 (ステップ角度の標準偏差) のまま変更されていない (図 3 b)。特に、他の多くのパラメーター例を推進 (足が推進段階にある姿勢の時間の割合) を時間、年齢、1 ヶ月での違いはありませんが徐々 に加齢とともに悪くなる (図 3; またムービー 2を参照してください)。これは年齢に依存するパラメーターとして神経変性変異体固有の変数が歩行の運動学的解析アプローチで学ぶことができますを示しています。
図 1。腹面イメージング セットアップと原理。(A) 写真と歩行解析セットアップの模式図します。(B) 解析ソフトウェア原則: 透明なトレッドミルで実行されているマウスの記録の下側からソフトウェアはデジタル足印刷を計算します。実行中にそのダイナミクスは測定領域のサイズを時間をかけて足し、歩行リズムを計算して姿勢パラメーターの基礎として使用されます。(C) エンドフィリン変異体に対して歩行解析実験の時間コース。歩行や歩行は、1、2、3、6、9、12、15、および 18 ヶ月で評価しました。画像は、2、12、18 ヶ月でエンドフィリン 1KO 2HT 3KO マウスを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。加齢と共に野生型マウスの解析を歩行します。WT (c57bl/6 j) マウスの歩行能力と歩行は、1、2、3、6、9、12、15、および 18 ヶ月で評価しました。加齢とともに WT 動物の動物の幅を正規化 (A) スタンス幅は変更されません。(B) 後肢のダブル サポートは WT 動物の年齢とともに増加します。グラフは、両後肢が同時に地面に立ち時間の割合を示します。このパラメーターの増加では、歩行の不安定性を反映しています。(C) 負荷 (速報段階で前足部変更の最大速度) 手足は WT 動物の年齢とともに増加します。急速な減速減らされた筋肉強さの指標となる可能性があります。すべてのグラフを表す平均値 ± SEM;p値を 2 尾tから求めた-1 ヶ重量対テスト、として表されます * p < 0.05 * * p < 0.01、* * * p < 0.001この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。加齢とともにエンドフィリン変異体の解析を歩行します。1、12、18 エンドフィリン変異体の走行速度 (A) ヶ月、マードックらと比較して拡張データセットから計算13バーの色 (灰色) のセットアップを実行することを拒否またはモーターを備えられたトレッドミル 30 (紺)、20 (青)、または 10 cm/s (ライトブルー) で実行することができる動物の割合が反映されます。エンドフィリン変異体を開発すると、テストのすべての動物は、1 ヶ月で 30 m/s で実行できますが、彼らの年齢としての赤字を実行しています。(B-C)ステップ角度の変動と WT (黒) ・ エンドフィリン 1KO-2WT-3WT (空色)、エンドフィリン 1KO-2HT-3WT (紺) ・ エンドフィリン 1KO 2HT 3KO (ブラウン) マウスを推進します。WT 動物、高齢化や WT とエンドフィリン変異体間に、ステップ角変動が違いを示します。(姿勢のパーセンテージ) propel 時間 1 ヶ月でエンドフィリン変異体と WT の間大幅に変更してされませんが、マウス時代としてエンドフィリン変異体の減少します。すべてのグラフを表す平均値 ± SEM;p値を 2 尾tから求めた-年齢をマッチさせた WT 対テスト、として表されます * p < 0.05 * * p < 0.01、* * * p < 0.001この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ムービー 1。3 (左)、(右) 生後 18 カ月の野生型 (c57bl/6 j) マウスにおける歩行します。オリジナル ビデオ (上) は、"デジタル paw print"ビデオ (下) に変換されます。詳細をよりよく理解できるように、ビデオの速度の鈍化を 5 回しているされています。18 ヶ月の時点で ~ 2 (デジタル印刷の足で赤) 右後肢のためらいを注意してください s、および右の前足 (デジタル印刷の足で青) ~ 4 s。動画の速度は 10 の要因によって減速されているが。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
ムービー 2。生後 18 ヶ月で歩行エンドフィリン 1KO-2WT-3WT (コントロール; 左) エンドフィリン 1KO 2HT 3KO (右) マウスの解析。動画の速度が減速されている 5 の要因によって詳細をより良い理解できるので。エンドフィリン 1KO 2HT 3KO マウス表示歩行変化少ないと見ることができる動物の安定稼働します。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
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Discussion
神経変性疾患、特に PD 運動協調性は深刻な影響を受けるのような病気のためのモデルの特性評価に有用なアプローチは、運動の協調性を学ぶします。運動歩行分析の機能分析の助けを借りて、我々 は弱い神経変性とそれ故に比較的控えめな表現型歩行問題の発症で動物の歩行またはモデルの微妙な変化を識別できます。小さな歩行異常、重度の運動障害を含む神経変性疾患の様々 なモデルで表現型の広い範囲を与え、このメソッドは、動物の年齢と移動する能力に基づく歩行パラメーターを評価するために適しています。重度障害者の動物は、平面トレッドミル、上り坂を実行している以下の障害モデルを記録することができますまたは下り坂の高速での低速でウォーキング記録できます。これは、動物をなります overexerting なし歩行神経変性モデルとその littermate コントロールの違いを明らかにできます。
このプロトコルでは、マウスにおける加齢に伴う運動障害の開発を監視する VPI 法適合を示しています。複数の時点で試験の WT マウス、年齢が進むにつれてことができました年齢依存性歩行異常を識別し、どのように彼らは加齢とともに進行を特徴付けます。また、神経変性疾患のマウスモデルを処理するときしばしば提示する問題は、(例えば不安、無関心、学習の難しさ)、モーターの動作に関係のない症状のため単純なもを実行する動物の意欲実行などのタスクをモーター、減る。ここでは、メソッドの変更と老化の神経変性変化マウス行に正常に動歩行解析を適用する役立つことができる照明のモーターを備えられたトレッドミル上で実行を奨励する動機付けのツールをお勧めします。さらに、我々 は動物の前足と記録されたデータの品質を向上することができます大幅ショーに指塗料を適用する簡単なトリックを使用します。歩行分析の最も重要なステップは、良いビデオ録画を取得: 分析の成功によって異なります、画像や動画のすべての自動または半自動分析のような生データの品質。低品質のビデオ分析では、後の手順で改善できないし、通常解析プロセスから除外する必要があります。
歩行と WT と数行エンドフィリン変異体の両方の姿勢を 18 ヶ月にわたって体系的に勉強しながらも WT マウスと明らかな歩行/走行問題のない (すなわち、エンドフィリン 1KO-WT-WT)、マウスを示す変化我々 に気づいた(図 2および図 3 a)、進歩的な方法で加齢とともにいくつかの歩行・姿勢パラメーター。興味深いことに、我々 もエンドフィリン変異体の老化にみられるいくつかの歩行・姿勢パラメーターに異常が同じ方向に開発、WT/対照動物のように斜面他ないことを気づいている (図 3)。最後に、明白な歩行、歩行、姿勢不良の目で観察すると高齢者 WT マウスと若いエンドフィリン変異が表示されない、場合でもは、このアプローチの選択的な歩行・姿勢パラメーターの変更を検出できるに注意する重要です。
マウスの運動動作をテストは、マウス モデル マニフェスト人間の条件の主要な側面であることを示すために最も包括的な方法の 1 つです。その結果、モーターの動作のさまざまな側面を評価するテストの数をしました。これらのテストのほか、オープン フィールド試験 (一般的な自発運動)、rotarod (モーターの調整、運動失調)、握力 (筋力) ホイール (活動)、吊りワイヤー テスト (持久力)、タスク (細かい運動の調整を歩いてはしご梁を実行感覚運動スキル)、歩行分析 (歩行, 効果器間協調) と (Wahlstein36要約) 他。異なるテストある特定の利点および不利な点および自分の読み出しアドレスするように設計されたモーターの動作のアスペクト (または側面) に制限があります。そのため、この地域の主要な側面をカバーするための運動行動テスト バッテリーを実行するの一般的になりました。
歩行分析頻繁に含まれていないこれらの電池の一部レポートのためらで・ ギョー37、それは歩行解析も PD、ALS と一部で骨の折れる方法と限られた出力のための動物モデルに運動障害が検出されないことを見つけた。ただし、・ ギョーら。報告書は、研究デザイン38でいくつかの制限に対処する研究によって挑戦されています。最近出版物10、11,12,39,40 数によってこのモデル マウス神経変性の歩行運動解析法の有用性が実証されています ,41,42,43, また私たちの仕事13を含みます。
VPI 録音のインクで足を絵画とマウス44紙の白いシートで実行させる従来の方式に比べていくつかの利点が備わっています。最も明白ないくつかの歩行パラメーター1に強い影響力を持つモーターを備えられたトレッドミル、動物の実行速度は制御、事実であります。さらに、いくつかの歩行異常になる動物が自主的な実行には見られないだろう、インクライン/減少および/または要求の厳しい高速で実行されるときにのみ検出。さらに、手による精巧な分析は、半自動化されたハイスループット解析に置き換えられます。そのため、生きている動物では避けられない変動による効果が下がります、各グループでテスト動物数を増加できます。要約すると、VPI の歩行分析の修正版が神経変性疾患や老化の齧歯動物モデルにおける運動障害の分析を補完するために標準的なモータのテスト電池で含まれていることをお勧めします。
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Disclosures
著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。
Acknowledgments
Eni 社の動物施設については、繁殖と博士ヌーノ ライムンド原稿の有用なコメントのために動物の世話人に感謝いたします。イオ ミンは Emmy Noether 若手研究者賞および SFB-1190 (P02)、プロジェクト共同研究センター SFB-889 (プロジェクト A8) を通じてドイツ研究振興協会 (DFG) からの補助金によってサポートされている (1702/1)。ガイドライン作成は、神経科学、生物物理学、分子生命科学 (GGNB) のゲッティンゲン大学院フェローシップによってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA | DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware | |
| non-transparent blanket or dark cloth | cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress | ||
| balance | e.g. Satorius | balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g | |
| red finger paint | e.g. Kreul or Staedtler | for increasing the contrast between paws and animal’s body | |
| small paint brush | soft brush to apply finger paint to the animal paws | ||
| diluted detergent | for cleaning | ||
| disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol | e.g. B.Braun | for desinfection |
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