Developmental Biology

והרצתי ניתוח של ליקויים מוטוריים תלויי-גיל בעכברים עם הקשורים ניוון מוחיים

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/57752

Christine M. Rostosky^1,2, Ira Milosevic^1,2

¹European Neuroscience Institute (ENI), ²University Medical Center Göttigen (UMG)

Summary

במחקר זה, נדגים את השימוש קנטית והרצתי ניתוח המבוסס על הגחון המטוס הדמיה לעקוב אחר שינויים עדינים קואורדינציה, כמו גם את ההתקדמות של הקשורים ניוון מוחיים עם הגיל במודלים של העכבר (למשל, endophilin מוטציה קווים העכבר).

Abstract

התנהגות מוטורית בדיקות משמשות לקביעת הרלוונטיות פונקציונלי של מודל מכרסמים ופיתח לבחון לאחרונה טיפולים בבעלי חיים אלה. באופן ספציפי, והרצתי ניתוח מאפשרת המחלה מחדש פנוטיפים רלוונטי כי הם נצפו בחולים אנושיים, במיוחד במחלות ניווניות המשפיעות על יכולות מוטוריות כגון מחלת פרקינסון (PD), מחלת אלצהיימר (AD), מחלת ניוון שרירים טרשת נפוצה לרוחב (ALS), ואחרים. במחקרים מוקדם לאורך הקו הזה, מדידת פרמטרים הילוך היה מפרך, תלויים גורמים שהיו קשה לשלוט בה (למשל, לרוץ במהירות, ריצה רציפה). פיתוח מערכות הדמיה המטוס הגחון (VPI) עשה את זה ריאלי לביצוע ניתוח הילוך בקנה מידה גדול, הופך את שיטה זו כלי שימושי עבור ההערכה של התנהגות מוטורית בחולדות. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מעמיק של אופן השימוש קנטית והרצתי ניתוח כדי לבחון את התקדמות תלויי-גיל לגירעונות מנוע העכבר דגמי הקשורים ניוון מוחיים; קווים העכבר עם רמות ירידה של endophilin, שבו ניווניות נזק בהדרגה עולה עם הגיל, משמשים כדוגמה.

Introduction

מחלות ניווניות להטיל נטל משמעותי על חולים, משפחות, ועל החברה, יהפוך לדאגה גדולה אף יותר כמו תוחלת החיים עולה, אוכלוסיית העולם ימשיך להזדקן. אחד התסמינים הנפוצים ביותר של מחלות ניווניות הן בעיות שיווי משקל וניידות. לפיכך, אפיון של התנהגות מוטורית הזדקנות יונקים (למשל, מכרסם) מודלים, ו/או מודלים מציג פנוטיפים ניווניות, הוא כלי חשוב להפגין ויוו הרלוונטיות של model(s) בעלי חיים מסוים, או טיפולית טיפולים שמטרתם לשפר את תסמיני המחלה. כמעט כל גישה לטיפול במחלות ניווניות בסופו של דבר דורשת בדיקות במודל חיה לפני תחילתן של ניסוי קליני בבני אדם. לכן, חשוב שיהיה אמין, לשחזור ההתנהגות בדיקות שניתן לכמת באופן עקבי פנוטיפים מחלות רלוונטיות לאורך התקדמות הגיל, על מנת להבטיח כי תרופה מועמד, אשר הראה פוטנציאל במודל במבחנה , יכול ביעילות להפחיתם על פנוטיפ של חיים.

היבט אחד של הערכת התנהגות מוטורית בחולדות הוא ניתוח הילוך קנטית, אשר יכול להתבצע על ידי VPI (גם צילום וידאו בשם המטוס הגחון)¹^,². שיטה זו הוקמה יהפוך לרישית על הקלטה רציפה של החלק התחתון של המכרסמים הליכה על הליכון שקוף, ממונע חגורה¹^,²^,³^,⁴. ניתוח שידור הוידיאו הנתונים יוצר "דיגיטלי עקבות" של כל ארבעת הגפיים זה באופן דינמי ובאמינות לסכם תבנית ההליכה של מכרסם, כפי שמתואר במקור על ידי קאלה. et al. ² ו. Amende et al. ³.

עקרון מבוססת הדמיה והרצתי ניתוח היא למדוד את השטח כפת בקשר עם החגורה הליכון לאורך זמן, על כל כף הרגל בודדים. כל תנוחת מיוצג על ידי גידול באזור כף היד (בשלב הבלימה), ירידה באזור כף היד (שלב ההינע). זה מלווה השלב המכריע שבו מזוהה אין קליטה. הנדנדה העמידה יחד יוצרים צעד. בנוסף הילוך dynamics פרמטרים, יציבה פרמטרים יכול גם להיות מופק קטעי וידאו מוקלט. הפרמטרים למופת ואת ההגדרות שלהם מפורטים בטבלה 1 , כוללים עמידה רוחב (SW; המרחק משולב כפות רגליו האחוריות או פור הציר החוטם-פלי), סטרייד פיאנו אורך (SL; המרחק הממוצע בין שני הצעדים של הכפה אותו) או כף השמה זווית (הזווית של הכפה לציר החוטם זנב). הנתונים dynamics ביציבה, בהליכה לאפשר והפקת לקחים על איזון בעלי חיים (על-ידי פרמטרים יציבה ולשינויים שלהם על פני מספר שלבים) ותיאום (על-ידי הילוך dynamics פרמטרים). פרמטרים נוספים, כגון אטקסיה מקדם (SL ההשתנות מחושב על ידי [(מקסימום. SL−min. SL) / מתכוון SL]), הגפיים האחוריות משותפים עמדה זמן (זמן זה שני הגפיים האחוריות נמצאים בקשר עם החגורה), או גרור כפת (בשטח כולל של הכפה על החגורה מתנוחת מלא כדי כף ההמראה) ניתן גם לחלץ, ואת דווחו להיות שונה ב- di ניווניות שונות sease מודלים⁵^,-⁶^,-⁷^,-⁸ (ראה טבלה 1).

פרמטר	יחידה	הגדרה
הנדנדה זמן	ms	משך זמן שהכפה אינו במגע עם החגורה
בזמן עמידה	ms	משך זמן שהכפה נמצא בקשר עם החגורה
בלם %	% מהזמן עמידה	אחוז הזמן עמידה שציפורניים הן בשלב בלם
% להניע	% מהזמן עמידה	אחוז הזמן עמידה שציפורניים הן בשלב הנעה
עמידת רוחב	ס מ	מרחק משולב קידמה או הינד הכפות לציר החוטם-פלי
אורך צעד	ס מ	המרחק הממוצע בין שני הצעדים של הכפה אותו
סטרייד פיאנו תדר	צעדים/s	מספר צעדים מלאה לשניה
כפת השמה זווית	מעלות	זווית הכפה ביחס הציר החוטם-הזנב של החיה
אטקסיה מקדם	א"א	השתנות SL מחושב על ידי ממוצע/[(max SL-min SL) SL]
עמידה משותפת %	אחוז עמידה	זמן תנוחת הגפיים האחוריות משותפים; פעם שני הגפיים האחוריות נמצאים בקשר עם החגורה באותו הזמן
כף של גרירה	מ מ²	השטח הכולל של הכפה על החגורה מתנוחת מלא כדי כף ההמראה
האיבר טעינה	ס מ²	מקס dA/dT; מקסימלי קצב השינוי של אזור כף הרגל בשלב שובר
שלב זווית השתנות	מעלות	סטיית התקן של הזווית בין האחוריות הכפות כפונקציה של SL ו- SW

טבלה 1. הגדרת הפרמטרים הילוך מפתח יכול להיבדק על-ידי הדמיה המטוס הגחון.

הערכת ההתנהגות המוטורית של מכרסמים מודלים עבור מחלות ניווניות עשויה להיות מאתגרת בהתאם לחומרת פנוטיפ של דגם ספציפי בגיל נתון. מספר מחלות, בולטת PD, הצג התנהגות מנוע חזק (ומכניקה) גירעונות, הן בחולים והן במודלים של בעלי חיים. אחד 4 תסמיני המפתח ב- PD הוא bradykinesia, אשר מתקדמת עם ההזדקנות, בא לידי בליקויים חמורים הילוך כבר בשלבים המוקדמים של משטרת⁹. מחקרים של המודל PD חריפה, מכרסמים שטופלו 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), כבר השתמשו VPI והרצתי ניתוח¹⁰^,¹¹^,¹². עם זאת, בהתחשב באופי חריפה של מודל זה, מחקרים אלה אינם הכתובת ההתקדמות הקשורות לגיל של גירעונות מוטוריים. מחקרים שנעשו לאחרונה מספר ניהלו והרצתי ניתוח בעכברים בגילאי בשינויים ניווניות, לדוגמה¹³^,¹⁴^,¹⁵, תוך הדגשת הרלוונטיות של הבנת את התקדמות המחלה עם הגיל .

בנוסף גירעונות מוטוריים, מודלים חייתיים של מחלות ניווניות לעיתים קרובות יש קשיים התמקדות המשימות בדיקה, להראות ליקויים קוגניטיביים בולטים, במיוחד עם ההתקדמות בגיל. פנוטיפ כזה יכול להשפיע על התוצאה של בדיקות התנהגות מוטורית. כלומר, אחד המבחנים הנפוצה ביותר לבחון את הגירעונות מוטוריים, מבחן ' rotarod '¹⁶, מסתמך על קוגניציה, תשומת לב, מתח¹⁷^,¹⁸. ואילו הנכונות כדי ללכת על הליכון ממונע תלויה גם בגורמים אלה, read-out המוקלט פועל, וזו תכונה סטנדרטית יותר, הרבה פחות מושפע קוגניציה שינו. ההשפעות של הלחץ ואת תשומת הלב עשוי להיות גלוי פרמטרים ספציפיים, כמו נדנדה/עמידה זמן דחק (סטרס) SL תשומת לב¹⁹^,²⁰, אך לא יכולת ריצה הכולל.

הגישה ניתוח הילוך קנטית נוספת מציעה את היתרון של בעל אפשרויות כדי להתאים את האתגר לדגמי מכרסמים. ההליכון עם זווית מתכווננת ומהירות מאפשר הליכה מהירויות 0.1 - 99.9 ס"מ/s, כך מכרסמים עם מגבלות הליכה קשות עדיין עשויים להיות מסוגלים לרוץ במהירות איטית (~ 10 ס"מ/s). כבדי שאינם בעלי חיים ניתן למדוד בורח מהר יותר מהירויות (30 - 40 ס"מ/s). התבוננות או לא החיות שנבדקו הם מסוגלים לרוץ במהירות מסוימת מספק תוצאה בפני עצמו. יתרה מזאת, למכרסמים ניתן לערער בנוסף לרוץ למעלה ובצדפים, או למטה ירידה, הטיית ההליכון כדי בזווית הרצויה בעזרת מד זווית, או על ידי הצמדת מזחלת משוקלל הגפיים האחוריות עכבר או חולדה.

מחקרים רבים של חלבונים יחיד הם מוטציה בחולים, יש מודעות גוברת האחרונות בקישורים בין אנדוציטוזה פגומה תהליך, הקשורים ניוון מוחיים¹³^,²¹^,²²^, ²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸. עכבר דגמים עם רמות מופחתת של endophilin-A (מעתה ואילך endophilin), שחקן מפתח שני אנדוציטוזה בתיווך clathrin¹³^,²¹^,²⁹^,³⁰^,³¹ ^, ³² ^, ³³ ^, ⁴⁵ ו clathrin תלויית אנדוציטוזה³⁴, נמצאו להראות הקשורים ניוון מוחיים ואת ליקויי תלויי-גיל¹³^,פעילות גינקולוגיות²¹. בשלושה גנים לקודד את המשפחה של חלבונים endophilin: endophilin 1, endophilin 2, ו- endophilin 3. ראוי לציין, פנוטיפ הנובע דלדול של חלבונים endophilin משתנה מאוד בהתאם למספר של חסר endophilin הגנים¹³^,²¹. בעוד טריפל הנוק-אאוט (KO) של כל הגנים endophilin הוא קטלני רק כמה שעות לאחר הלידה, ועכברים ללא שני endophilin 1 ו-2 להיכשל לשגשג ולמות בתוך 3 שבועות לאחר הלידה, קו יחיד עבור כל אחד endophilins 3 מראה אין פנוטיפ ברור עבור נבדק התנאים²¹. אחרים למוטציות אחרות endophilin להראות תוחלת החיים מופחתת ולפתח ליקויים מוטוריים עם העליה בגיל¹³. לקבלת דוגמה, endophilin 1KO-2HT-3KO עכברים התצוגה הליכה שינויים ובעיות קואורדינציה (כפי שנבדקו על-ידי קנטית והרצתי ניתוח ו- rotarod) כבר בגיל 3 חודשים של גיל, בעוד הארנבונים מאותה שלהם, endophilin 1KO-2WT-3KO חיות, התצוגה משמעותי צמצום קואורדינציה רק בגיל 15 חודשים של גיל¹³. בשל המגוון העצום של פנוטיפים במודלים אלה, יש צורך לזהות וליישם מבחן זה ניתן לשלב מגוון של אתגרים המתאימים המנוע של החיה, קוגניציה יכולות, כמו גם העידן. כאן, אנו מפרטים את הנוהלים ניסיוני באותיות גדולות על ניתוח הילוך קנטית כדי להעריך את התפתחות והתקדמות של ליקויים מוטוריים במודל של עכברים המציג שינויים ניווניות (קרי, מוטציות endophilin). זה כולל מדידת פרמטרים הילוך בכל הגילאים השונות severities שונות של ליקויי ומכניקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים דיווחו כאן מתנהלים על פי הנחיות האירופי לרווחת בעלי חיים (2010/63/האיחוד האירופי) באישור und Niedersächsisches Landesamt Verbraucherschutz לדנציג, או Lebensmittelsicherheit (LAVES), רישום מספר 14 / 1701.

1. ללמוד עיצוב

כמו התנהגות בעלי חיים עבודה דורש תכנון קפדני, שקול את הפרמטרים הבאים בעת תכנון הניסוי.
1. מספר בעלי החיים זקוקים לכל קבוצה.
  1. השתמש תוכנה סטטיסטית (למשל, המעבר, ה-EDA או GPower) כדי לחשב את גודל הקבוצה הנדרשת.
    הערה: גודל הקבוצה תלויה וריאציית בין חומרת פנוטיפ בעלי חיים. לניתוח הילוך קנטית, המספר של עכברים הוא בדרך כלל 10-20 לכל קבוצה.
2. סקס חיות ניסיוני.
  1. קח בחשבון את ההשפעה של רמות האסטרוגן על הניסוי, בהתאם המתח בעלי חיים.
    הערה: התנהגות מחקרים רבים מתמקדים הזכרים כדי למנוע את השפעת רמות האסטרוגן על הניסוי. השפעות אלו חזקים יותר או פחות בהתאם המתח רקע בעלי חיים.
  2. אם ייעשה שימוש משני המינים, לבדוק את השפעת סקס והערכת שני המינים באופן עצמאי בעת הצורך.
3. גיל חיות ניסוי.
  1. להשתמש בבעלי חיים למבוגרים (2 חודשים, ומעלה) אם רק נקודת חד פעמי יש צורך.
  2. בחר במספר נקודות זמן כאשר שינוי בהתנהגות מוטורית עם הגיל שילמדו. הנקודה האפשרי המוקדם ביותר היא 1 החודש, לאחר נגמלים עכברים מאימותיהם. לבחון את החיות במרווחי זמן קבועים, למשל כל 1, 2, או 3 חודשים.
לבקש אישור מהרשויות לבצע בדיקת התנהגות בעלי חיים.
להכין תכניות ברכישת מבעלי החיים.
1. נכין תוכנית רבייה או פנה למפיץ של בעלי חיים מבעוד כך מספיק חיות ניסוי יהיו זמינות ביום מתי להתחיל הניסויים.
2. אפשר, לחיות habituate לשבוע אחד אם הם שמרו על חדר/הגדרה חדשה במהלך הניסויים.

2. הקלטת וידאו

הערה: כדי להמחיש את השימוש קנטית והרצתי ניתוח, הנה מערכת הדמיה זמינים מסחרית עם הדמיה הנלווה, ניתוח תוכנה (ראה את הטבלה של חומרים) משמשים.

הפעל את המחשב ואת התוכנה imager.
לקבוע את מצב בריאות ורווחה של כל בעל חיים על-ידי התבוננות אותו בכלוב שלה הביתה ולאחר שקילה על איזון.
בעת הצורך, בעדינות להחיל גואש אדום על כפות רגליים של החיה עם מברשת. לאפשר לצבע להתייבש ~ 5 דקות בתוך כלוב נקי חילוף.
הערה: להימנע ציור הבטן של החיה כפי הצבע משמש כדי לשפר את הניגודיות בין כפות הרגליים לבין הגוף. . זה שימושי שיהיה גואש שחור שימושי עבור תיקונים. צעד זה נדרש עבור חיות עם פרווה חומה, או במקרה כבר לקעקע את כפות רגליו לצורך זיהוי. אם נבחר כדי לצבוע את כפות רגליו של חיה אחת, כל החיות באותה קבוצה, קבוצת הביקורת צריך להיות צבוע גם כן.
להגדיר את המהירות של ההליכון בלוח השמאלי העליון של המנגנון; אם אחד או יותר מהירות הריצה יוחלו, להתחיל עם המהירות האיטית ביותר תחילה.
מקם את החיה בבית הבליעה מבחן (למנוע מחבר חובק למעקה את הזנב או כפות רגליים, בעת סגירת החדר). לכסות את התא עם מטלית כהה ולאפשר כל בעל חיים להתאים למשך 1-2 דקות.
להדליק את האור בחדר הבדיקה על-ידי הפעלת מתג רוטרי האור הליכון למיקום "על". תלחץ על המתג רוטרי ההליכון כדי "להעביר" נתחיל את ההליכון, ולאחר מכן לחץ על לחצן "שיא" בתוכנה imager.
הערה: בעת הפעלת ההליכון, זה חשוב לבחון ביצועים חיים בזהירות ובעקביות: לעצור את ההליכון מיד אם החיה יכול להדביק המהירות על ההליכון, או מראה סימפטומים משניים שאינם קשורים גפיים (למשל, התקפים אפילפטיים). תנאי הבחינה ייתכן שתצטרך להיות והשתלב.
כאשר החיה פועל stably (בריחה לא מהירה הצדדים, הקדמי או האחורי), שיא לפחות 5 s לפני העצירה ההליכון. לעצור את ההקלטה על ידי לחיצה על "stop" על התוכנה imager והפעל הבורר רוטרי הליכון בחזרה למיקום "off".
הערה: כדי למנוע לא יציבה של חיות זה יכול להיות מועיל כדי לתת להם לרוץ למשך מספר שניות, או כדי לאפשר להן לפעול בכיוון ההפוך (על-ידי הפעלת המתג רוטרי הליכון "להפוך" במקום "קדימה").
לחץ על לחצן "עיבוד" בתוכנה imager כדי לפתוח תפריט שבו ההתחלה ונקודת הסיום של מקטע וידאו (כדי לשמש לניתוח) ניתן להגדיר. כדי לעשות זאת, השתמש במחוון על החלק התחתון של המסך כדי לנווט הוידאו.
כדי לבחור את נקודת הזמן הנוכחית התחלה או נקודת סיום, לחץ על "מתוך מסגרת #" ו- "אל", בהתאמה. ודא שהמקטע מכיל לפחות 7 שלבים/כפה (14 שלבים בסך הכל) של החיה פועל stably במהירות קבועה.
הזן את זיהוי בעלי חיים, תאריך לידה, משקל, סקס. לשמור את הנתונים במיקום הרצוי במחשב או בשרת. לחץ על "מצלמה' כדי לחזור אל הממשק הקלטה.
אם מספר מהירויות הריצה צריך להיות מוקלט, חזור על שלבים 2.6-2.10 עם המהירויות פועל הרצוי. לפני הקלטת הווידאו הבא, ודא כי הצבע האדום קיים עדיין הכפה, אחרת וחזור על שלב מספר 2.3.
לאחר ההקלטה, לשחרר את החיה לכלוב שלה הביתה. לאחר הסרת חיה, לנקות את החגורה הליכון ביסודיות עם סבון ומים ואחריו מחטא כדי להכין אותו לבעל ניסיוני הבא.

3. עיבוד וידאו

לחץ על "בחר ללמוד תיקיה" ומתחילים את תוכנת ניתוח כדי לבחור את התיקיה עם קטעי וידאו מוקלט.
בחר וידאו אחד או כמה קטעי וידאו ניתן לעבד ברציפות, ולחץ על "לך".
השתמש בפונקציה "אישורים" כדי לבחור את האזור שבו העכבר מופעל; סעיף זה צריך להכיל רק העכבר על רקע לבן.
אם הפונקציה הליכון "לאחור" שימש בעבר, לבחור "לבדוק אם האף של הנבדק ימינה >>>" לשקף את הוידאו מאז התוכנה נועד רק לנתח חיות רץ שמאלה. לחץ על "מקבל" כדי להמשיך.
השתמש בפונקציה "רענון" כדי לראות את המסכה ברירת המחדל, כף של הדפסה שמזהה התוכנה.
הערה: הסרטון המקורי מוצגת משמאל, תמונת שחור-לבן של עקבות המוצע הוא בצד הימין.
הזינו ערכים בתיבות "משך" ו- "רוחב" כדי לשנות את המסכה שתואמות את האזור אדום סביב החוטם של החיה לניתוח; כמו הצבע דומה הידיים, לא מטשטשים את האזור הזה עלול לגרום לתוכנה בטעות סיווג מאזור כמו כפה.
להתאים את המחוונים "מסנן רעש" ואת "לסנן פרווה ותיקוני כהה" כדי למטב את טביעת כף היד בשחור-לבן. הגדר את המחוון "לסנן את הרעש" ~ 800-950 לבעלי שחור וכדי ~ 700-800 לבעלי חום או לבן, בהתאם לצבע הפרווה המדויק של החיה. בחר "אישור" כאשר ההגדרות אינן משביעות רצון.
הערה: המחוון "לסנן פרווה ותיקוני כהה" תלוי על איך "אדום" הכפה הוא. עבור כפות רגליים מצוירים, הערך הוא בדרך כלל בסביבות 100-120, ועל כפות שאינו צבוע התמורה הטובה ביותר היא בסביבות 50-100. הגדרות אלה תלויים מיריעות צבע פרווה, כפות רגליים, ויש צורך להיות ממוטבים עבור כל בעל חיים. הדפסה בשחור-לבן הכפה צריך להיות ברור ייצוגים של הכפות עם כמו רעש רקע קטן ככל האפשר.
בחר אחד או כמה סרטונים שעברו ההתאמה הראשונה (המסומנת "@ @" לפני שם וידאו) ובחר בפונקציה "ללכת" כדי להפעיל הניתוח של סרטי הווידאו האלה.
הערה: הניתוח לוקח 2-5 דקות לכל הסרטונים. זה אפשרי להפעיל הניתוח של כמה קטעי וידאו בן לילה מאז שלב זה דורש קלט מהמשתמש הנסיין.
בחר סרט שנותחה (המסומנת "@ @ @") ולחץ על "לך". שימו לב כי כעת ניתן לראות כפת באזור (ס מ²) בקשר עם החגורה לאורך זמן (הילוך dynamics) עבור כל כפת נפרדים. כדי להשוות את הווידיאו המקורי, להדפיס אזור נבחר הכפה מחושב, השתמש בפונקציה "משחק וידאו".
השתמש בכלים הבאים (3) לתיקון שגיאות קטנות שנעשו על ידי התוכנה.
1. השתמש באפשרות "הנכונה" למחוק אות רע, למשל, כאשר התוכנה רשומות אות למרות הכפה המקביל אינו במגע עם החגורה. לחץ פעם אחת כדי להתמקד באזור הרלוונטי, ולסמן הגבול הימני של האובייקט כדי להסיר עם והלחיצה השניה ואת הגבול הימני עם לחץ השלישי.
2. השתמש באפשרות "התחבר" כדי לשלב את שני אותות, למשל, כאשר אין אות נרשם עבור מסגרות מספר למרות הכפה נמצא בקשר עם החגורה. לחץ פעם אחת כדי להתקרב לאזור הרלוונטיים ולחץ פעמיים באמצע שני העצמים לשלב.
3. השתמש באפשרות "מחק" כדי להסיר נקודות זמן הניתוח לחלוטין. השתמש באפשרות זו רק אם שאי אפשר לתקן את הטעות עם "נכונה" או "התחבר" פונקציה, למשל, כאשר אות מ הכפה forelimb השמאלי נרשם בטעות עבור הכפה הגפיים האחוריות השמאלי. לחץ פעם אחת כדי להתמקד באזור הרלוונטי, ולסמן על הגבול השמאלי של אזור כדי להסיר עם והלחיצה השניה ואת הגבול הימני עם לחץ השלישי.
  הערה: הכלים ניתן להשתמש רק לתקן טעות קטנה; כשלים שיטתיים (למשל, אם האות מ כפת אחד היה מאוד חלש) אפשר לתקנו: הוידאו לא להיות כלולים ניתוח וחזר ההקלטה של החיה בהתאמה, כאשר הדבר אפשרי. שים לב כי האפשרות "משחק וידאו" הוא כבר לא זמין לאחר "הנכון", "חבר", או באפשרות "מחק" שימש ולאחר לחיצה על כפתור "בטל" יאפס את כל 3 כלי עריכה.
בחר "האיבר הבא" כדי להמשיך דרך 4 הגפיים; בעת לחיצה על "האיבר הבא" לאחר שעבר הכפה, התוכנה משלימה את הניתוח, מציגה את התוצאות עבור החיה הזאת על מסכי 4.

4. והרצתי ניתוח

כאשר מאבחנים כל קטעי וידאו מניסוי אחד, בחר כל קטעי הווידאו ולחצו "לארגן מחדש תוצאות" לייצא את התוצאות (רשימה של פרמטרים בגליונות אלקטרוניים).
פתח את הקובץ עם סיום "reorganized_stride_info" ולהוסיף מידע שלא נכלל בגיליון הזה: לקבץ מידע (למשל, גנוטיפ, טיפול), ויש את המידות של בעלי חיים אורך ורוחב הנשמרים באחרת קובץ הגיליון האלקטרוני עם סיום "SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info."
לנרמל את הפרמטרים הילוך בעלי רוחב או אורך במידת הצורך, למשל, SL אורך חיים, SW לרוחב בעלי חיים.
מיון תוצאות לפי קבוצת גיל, מהירות הריצה: לנתח בכל התנאים הללו באופן עצמאי.
הערה: בגילאים שונים או מהירויות הפעלה אין אפשרות לשלב בתוך אותה קבוצה.
לחשב את הממוצע (ממוצע), סטיית תקן, וערכים שגיאת התקן של הממוצע עבור כל פרמטר עבור כל תנאי הניסוי.
לבצע ניתוח סטטיסטי לפי הדגם ניסיוני, למשל, להשתמש 2-זנבי t-test כדי להשוות חשבונאי/מטופלים בעלי חיים פראי-סוג (WT) / פקד או ANOVA כדי להשוות בין מספר קבוצות עצמאית.
תראה בכלל למדוד פרמטרים: זה עוזר להתוות כל פרמטר כדאי להמחיש את התוצאות. אם יש הבדלים סטטיסטיים בפרמטר נתון, בדוק אם שאר הפרמטרים התלויים לשנות בהתאמה.
הערה: לדוגמה, אם SL הוא ירד באופן משמעותי ב קבוצת בדיקה מסוימת, זה גם יגרום פסיעה תדר גבוה יותר (שכן מהירות הריצה זהה) עלולה לגרום SW מוגברת (כדי לשמור על יציבות יציבה).
בחר הפרמטרים הרלוונטיים ביותר עבור מודל, ו/או דומות תצפיות של המחלה האנושית. עבור מצגת, ליצור סרטי וידאו נציג עבור כל קבוצה ולהשלים אותם באמצעות גרפים המראים את המדידה עבור הפרמטרים הרלוונטיים, מאז שינויים הילוך עדין הם לעתים קרובות לא ברור מן קטעי וידאו.

5. פתרון בעיות

הערה: בעלי חיים, במיוחד העכבר דגמים עם פנוטיפ חרדה, ייתכן קושי לבצע אפילו משימה פשוטה כמו ריצה על הליכון. להלן הצעדים שניתן לנקוט כדי רמות חרדה נמוכות יותר ולעודד ריצה.

Habituation ואכיפה חיובי.
1. ב 2-3 ימים לפני המבחן הראשון, מקם את העכבר בבית הבליעה מבחן, לכסות את זה עם מטלית כהה, להשאיר את האור כבוי. תן את העכבר להסתגל לסביבה חדשה עבור ~ 5 דק צ'או הוספה או שוקולד/אגוז חמאה (למשל, נוטלה) לתא הניסוי כך עלול להיווצר קשר חיובי.
אכיפה שליליות על ידי אוויר פחזניות/אחורי גבול.
1. עכברים לא אוהב פחזניות אוויר או תנועה מאחוריהם, יפעל הרחק ההפרעה. להמריץ ריצה, השתמש פחזניות אוויר מתון, או הריתמיות של פס גמיש המהווה את הגבול האחורי של תא הבדיקה, כדי לעודד את העכבר לרוץ לכיוון החלק הקדמי של החדר הבדיקה.
ההתחלה איטית.
1. בעת בדיקת מהירויות הפעלה, הליכון בקצב נמוך ומתחילים ואז לאט לאט להגדיל את מהירות הליכון לקראת בדיקת התנאי הרצוי.
מזער את התנועה החופשית.
1. אורך קאמרית מבחן הוא מוגבל על ידי שני ברים מתכווננת מלפנים ומאחור. אם חיים מבחן דוגל מהירות הריצה, אך לא פועלת בהתמדה, להגביל את אורך החדר לגרום להם לרוץ יותר יציב.
אם המדידות הנ ל אינן מצליחות, להקליט פועל ביום הבא. אם החיה עדיין מסרב לפעול לאחר בדיקה על שלושה ימים, להקליט את זה כמו מציאת, אל תכלול את החיה לבדיקות נוספות.
הערה: התוצאות של ניתוח הילוך תלויים הקלטת וידאו באיכות טובה. אין שום סיבה לשלול סרטונים במהלך הניתוח אם קטעי וידאו תועדו היטב. אם איכות הווידאו אינה מספיקה, זה יהפוך ברור במהלך שלב 3.6 כאשר הפרמטרים עבור היצירה של הדפס דיגיטלי כפת מוגדרות. אם כל חלק גוף אחר מלבד כפות הרגליים ואת האף מופיע אדום (למשל, בגלל הפרווה החסר סביב איברי המין או אצבע צבע שמקושט פה ושם במעט על הבטן), האיכות יורדת באופן משמעותי. ההתאמות בשלב 3.6 לאפשר תיקון בעיות קטנות בלבד, אם זה לא יכול להביא. את הוידאו יחס אות/רעש מקובל, הוידאו צריך ייכללו מניתוח, והוא הקלטה צריך להיות חוזרות ונשנות. לפיכך, מומלץ לנתח קטעי וידאו אחרי הקלטות מבוצעות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להדגים את השימוש קנטית והרצתי ניתוח, ערכנו והרצתי ניתוח ב WT C57BL/6J עכברים עם התקדמות הגיל, כמו גם מספר קווי מוטציה של endophilin, באמצעות מכשור זמינים מסחרית ותוכנות (עיין הטבלה של חומרים). בהגדרת הזה, מצלמה מהירה תחת הליכון שקוף רשומות בריצה של עכבר (איור 1 א'). התוכנה מזהה ואז את הניגוד בין הכפות בצבע אדום את הפרווה לבן או שחור. ומכיוון חיות ניסוי שלנו היה צבע פרווה חומה כהה, יש צבענו את כפות רגליו של כל הנושאים עם גואש אדום. בדקנו חיות ניסוי במהירויות שונות הפועלות: הליכה (10 ס"מ/s), פועל (20 ס"מ/s), וריצה מהירה (30 ס"מ/s). אזור קשר, ואת הזמן שכפות רגליו היו על ההליכון, באוויר נמדדו. ממידע זה, היו הפרמטרים מסכם את הדברים קצב ההליכה (למשל, הנדנדה/עמידה זמן, בלם/הנעה) או יציבה (למשל, זווית כף היד, SW) מחושב (איור 1B).

ביצענו והרצתי ניתוח כחלק סוללה של מספר בדיקות התנהגות מוטורית. אנחנו העריך חוזק אחיזה (אלף), הגפיים האחוריות בכרים (סוללות היבריד), הילוך, ואת הביצועים rotarod מואצת (בעיבוד). בעוד התנהגות מוטורית הוא לא כמו מושפעים על-ידי ניסיון ובדיקות ניסיוני כמו, לדוגמה, קוגניציה, עדיין חשוב כי כל חיה עוברים את אותה סוללה של מבחנים באותו סדר, באותו גיל. הסדר צריך ללכת קושי נמוך עד גבוה לבעל החיים למזער את ההשפעות של ניסויים קודמים בבחינה הנוכחית.

יש לנו נבחרת מוטציות endophilin במחקר זה מאז, תלוי כמה מתוך השלושה אללים endophilin חסרים, פנוטיפ וכתוצאה מכך משתנה מאין פנוטיפ בקוס יחיד הפנוטיפ ניווניות מתון של צעירים endophilin 1KO-2HT-3KO עכברים מתקדמת עם ההזדקנות. מסיבה זו, קווים בעלי חיים אלה להציג מודל נאותה ללמוד שינויים עדינים להתפתח רק למען בעלי חיים גיל. בהתחשב בכך שרוב המוטציות endophilin להראות תוחלת חיים מופחתת, בחנו את התנהגות מוטורית של מוטציות endophilin במהלך 18 חודשים (נקודת זמן 18 חודשים נבחר מאז אפילו העכברים בקו 1KO-2HT-3KO endophilin המציגה החזקים פנוטיפ, אין שיתוק). ניתוח הילוך בוצע בנקודות זמן שמונה על פני תקופה 18 חודשים (איור 1C). 18 חודשים של גיל, החיות היו מורדמים, נשמר לניתוח הביוכימי ו/או היסטולוגית.

העכבר המושבה תחזוקה:

עכברים משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים ו homozygous עבור אללים endophilin 1, 2 ו- 3 דווחו במקור ב מילושביץ ואח. ²¹ C57BL/6J עכברים שימשו בנוסף littermate עכברים כפקדי ברחבי. עכברים שוכנו בכלובים פתוח עם ad libitum גישה למזון ולמים בקבוצות של מספר מרבי של 5 חיות, על מחזור/כהה 12-h. רק זכר עכברים שימשו במחקר זה כדי לא לכלול את ההשפעות של שינויים תלויי-מחזור אצל נקבות.

Genotyping של Endophilin A1, A2, A3 העכבר מודלים:

Genotyping של עכברים מוטנטים endophilin בוצע על ידי הגברה תגובת שרשרת (PCR) פולימראז באמצעות DNA גנומי שחולצו מן המכות זנב או אוזניים. מותני עבור שלושה גנים endophilin-A בוצעו עם תחל בהתאמה: endophilin-A1: קדימה פריימר 5' CCACGAACGAACGACTCCCAC3', להפוך תחל 5'-CGCACCTGCACGCGCCCTACC-3' עבור WT, 5'-TCATAGCCGAATAGCCTCTCC-3' עבור קו; endophilin-A2: קדימה תחל 5'-CTTCTTGCCTTGCTGCCTTCCTTA-3' עבור WT; 5'-CCTAGGGGCTTGGGTTG-TGATGAGT-3' קו, תחל הפוכה 5'-GCCCCACAACCTTCTCGCTGAC-3' עבור WT, 5'-CGTATGCAGCCGCCGCATTGCATC-3' עבור קו; endophilin-A3: קדימה פריימר 5'-CTCCCCATGGTGGAAAGGTCCATTC-3' הפוכה תחל 5'-TGTGACAGTGGTGACCACAG-3' עבור WT, 5-'CAACGGACAGACGAGAG-ATTC-3' עבור קו. המוצרים PCR וכתוצאה מכך היו לרוץ על agarose 1% ג'ל, מניב גדלים הלהקה ייחודי עבור WT ו KO אללים: endophilin-A1 WT ~ 384 bps, קו ~ 950 bps; endophilin-A2 WT ~ 1,280 bps, KO bps ~ 1000; endophilin-A3 WT ~ 325 bps, KO ~ 465 bps. מוצרי ה-PCR עם להקות WT והן KO מצביעים על על חיים (HT) משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים.

תוצאות:

כדי לאפיין בהליכה ויציבה בעכברים WT עם ההתקדמות בגיל, ערכנו ניתוח הילוך קנטית בבעלי חיים אלה (איור 2; סרט 1). כל עוד מספר פרמטרים, למשל SW (ממוצע המרחק בין הפורה או הגפיים האחוריות מנורמל רוחב חיות; ראה גם טבלה 1), נותרים ללא שינוי ב WT חיות עם ההתקדמות בגיל, פרמטרים אחרים לשנות בהדרגה (איור 2A– C)-למשל, תמיכה זוגי איבר הינד (זמן יחסית משך העמידה הנמצאים במגע עם הקרקע שני הגפיים האחוריות באותו זמן) עולה מ-38% ל 55% מ- 1 חודש עד 18 חודשים (איור 2B). פרמטר זה קשורה לעיתים קרובות עם תנוחה יציבות³⁵. יתר על כן, האיבר טעינה (מקסימלי קצב השינוי של אזור כף הרגל בשלב שבירה) מגדילה מ- 38 ס"מ²/s כדי /s²ס מ 59 מ 1 חודש עד 18 חודשים (איור 2C). ההאטה מהיר יכול להתפרש מחוון עבור כוח השריר מופחת. יכולת ריצה הכולל אינו מושפע בבעלי WT (94% הם מסוגלים לרוץ ב- 30 ס"מ/s ב- 18 חודשים, איור 3A). בנוסף, אפיון הפרמטרים בהליכה ויציבה להישאר מעושה, או לשנות בהדרגה עם הגיל בעכברים WT אנחנו תיעדו כי ניתוח הילוך קנטית באמצעות VPI היא שיטה מתאימה ללמוד את הקשורות לגיל מתון שינויים בהליכה ויציבה.

בעוד יכולת ריצה הכולל אינו מושפע ב WT בעלי חיים, מספר קווי מוטציה endophilin להראות שינו היכולת ללכת או לרוץ על ההליכון ממונע (איור 3 א), כפי שדווח במורדוק. et al. ¹³ על ערכת הנתונים קטנים יותר. ראוי לציין, בעוד ב- 1 חודש של גיל כל העכברים 1KO-2HT-3KO endophilin הם כולם מסוגלים לרוץ ב- 30 ס"מ/s, 18 חודשים של גיל 81% מבעלי החיים באותו אינם מסוגלים לרוץ (איור 3 א, הערה קוהורטות גדולות נותחו יותר מאלה שדווחו בעבר ¹³). מעניין, מושפעות גם המוטציות endophilin חסרי endophilin פחות אללים (קרי, endophilin 1KO-2HT-3WT), אבל ברמה נמוכה יותר (איור 3 א).

אף-על-פי מוטציות 1KO-2HT-3KO endophilin הצג מגבלות מוטוריות קשות עם קידום בגיל¹³, מספר פרמטרים הילוך אינן משתנות לעומת הפקד WT, גם בגיל 18 חודשים. למשל, שלב זווית השתנות (סטיית תקן של הזווית שלב) נשאר ללא שינוי (איור 3B). ראוי לציין, פרמטרים רבים אחרים, כי דוגמה להניע זמן (האחוז של זמן העמידה כפות רגליו נמצאים שלב ההינע), אינם שונים-1 חודש של גיל, אבל בהדרגה יחמירו עם ההזדקנות (איור 3C; ראה גם סרט 2). זה ממחיש כי הן תלויות-גיל פרמטרים, כמו גם המשתנים מוטציה ספציפית ניווניות שניתן ללמוד עם גישה ניתוח הילוך קנטית.

איור 1. עקרון וההתקנה הדמיה המטוס הגחון. (א) צילום, שרטוט סכמטי של מלכודת ניתוח הילוך. (B) עקרון תוכנת ניתוח: מגב מוקלטות עכבר רץ על הליכון שקוף, התוכנה מחשבת הכפה דיגיטלית מדפיסה. הדינמיקה שלהם במהלך הפעלה נמדד כמו כף גודל אזור לאורך זמן, זה משמש כבסיס כדי לחשב את קצב ההליכה, תנוחה פרמטרים. (ג) מסלול הזמן של הניסוי ניתוח הילוך המבוצעת על מוטציות endophilin. ומכניקה של דהירה היו העריכו 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, ו 18 חודשים. תמונות להראות את העכבר 1KO-2HT-3KO endophilin 2, 12 ו- 18 חודשים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

באיור 2. ניתוח בעכברים פראי-סוג עם הגיל הליכה. ומכניקה של הליכה. בעכברים WT (C57BL/6J) היו העריכו 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, ו 18 חודשים. (א) העמידה רוחב מנורמל לרוחב בעלי חיים של בעלי חיים WT לא משתנה עם הגיל. (B) התמיכה כפול של הגפיים האחוריות עולה עם הגיל ב WT בעלי חיים. הגרף מראה את אחוז הזמן תנוחת שנמצאים על הקרקע שני הגפיים האחוריות באותו זמן. גידול בפרמטר זה משקף חוסר יציבות בהליכה. (ג) האיבר טעינה (קצב מקסימלי השינוי של אזור כף הרגל בשלב שבירה) עולה עם הגיל ב WT בעלי חיים. ההאטה מהירה יותר עשויה להיות אינדיקטור עבור כוח השריר מופחת. כל הגרפים מייצגים הערך הממוצע ± SEM; ערכים p חושבו מ 2-זנבי t-בדיקות לעומת WT 1 - חודש הזקן, מיוצגים בתור * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3. ניתוח של מוטציות endophilin עם הגיל הליכה. (א) מהירות הריצה של מוטציות endophilin-1, 12 ו- 18 חודשים, שמחושבים על הנתונים (dataset) מורחב לעומת מורדוק. et al. ¹³ בר צבעים משקפים את האחוז של בעלי חיים מסוגלים להפעיל 30 (כחול כהה), 20 (כחול) או 10 ס"מ/s (תכלת) על ההליכון ממונע, או לסרב פועל על הכיוונון (אפור). בעוד כל החיות שנבדקו יכול לרוץ במהירות 30 m/s-1 חודש, המוטציות endophilin לפתח פועל גירעונות כשהם מזדקנים. (CB–) הצעד זווית השתנות, להניע זמן ב WT (שחור), endophilin 1KO-2WT-3WT (turquois), endophilin 1KO-2HT-3WT (כחול כהה) ועכברים endophilin 1KO-2HT-3KO (חום). ההשתנות זווית הצעד מראה שום הבדל הזדקנות WT חיות, או בין המוטציות WT ו- endophilin. הזמן propel (כאחוז מתוך עמדה) אינו משמעותי משתנה בין המוטציות endophilin WT ב חודש, אך פוחת על המוטציות endophilin ככל שהגיל עכברים. כל הגרפים מייצגים את הערך הממוצע ± SEM; ערכים p חושבו מ 2-זנבי t-בדיקות לעומת גיל מתאימים WT, מיוצגים בתור * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Movie 1
סרט 1. ניתוח עכבר (C57BL/6J) פראי-סוג 3 (משמאל) ו- 18 חודשים של גיל (מימין) הליכה. הסרטון המקורי (למעלה) מתורגמת וידאו "דפוס דיגיטלי כפת" (למטה). המהירות וידאו האיטה את 5 פעמים כך פרטים ניתן להערכה יותר. בנקודת זמן של 18 חודשים, שימו לב ההיסוס של הכפה נכון האחוריות (אדום ביד דיגיטלי הדפסה) ב ~ 2 s, ושל הכפה הקדמי הימני (כחול ביד דיגיטלי הדפסה) ~ 4 s. כבר מאט את מהירות וידאו לפי פקטור של 10. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Movie 2
הסרט 2. ניתוח ב- endophilin 1KO-2WT-3WT (בקרת; משמאל) לעומת endophilin 1KO-2HT-3KO (מימין) עכברים הליכה 18 חודשים של גיל- המהירות וידאו האיטה בפקטור של 5 אז יכול להיות מוערך יותר פרטים. העכבר 1KO-2HT-3KO endophilin מציג שינויים הילוך זה ניתן לראות הפחות יציב פועל של החיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לומד את קואורדינציה היא גישה שימושית באפיון מודלים של מחלות ניווניות, במיוחד עבור מחלות כמו משטרת שבו קואורדינציה מושפע קשות. בעזרת assay פונקציונלי ניתוח הילוך קנטית, אנו מסוגלים לזהות שינויים עדינים דהירה של בעלי חיים על תחילתה של בעיות גפיים, או בכל הדגמים עם חלש הקשורים ניוון מוחיים, פנוטיפ ומכאן יחסית צנועים. לאור המגוון הרחב של פנוטיפים במודלים שונים של מחלות ניווניות שמקיף הילוך קטן חריגות ותנועות חמורה, שיטה זו היא מתאימה להערכת פרמטרים הילוך, בהתבסס על גיל של החיה, היכולת לנוע. ניתן להקליט חיות נפגעת קשות הליכה במהירות נמוכה על המטוס ההליכון, בעוד פחות מודלים לקוי ניתן להקליט רץ במעלה או במורד במהירות גבוהה. זה יכול לחשוף את ההליכה ההבדלים בין המודל ניווניות שליטתה littermate ללא overexerting החיות.

עם פרוטוקול זה, נדגים את adequateness של השיטה VPI לעקוב אחר ההתפתחות של ליקויים מוטוריים עם ההזדקנות בעכברים. עכברים WT בדיקות בנקודות זמן מרובים כמו בגילם מקדמות אפשרו לנו לזהות חריגות תלויי-גיל הילוך ולאפיין איך הם מתקדמים עם ההזדקנות. בנוסף, בעת טיפול העכבר מודלים הקשורים ניוון מוחיים, נושא זה לעתים קרובות מציג היא כי התופעות קשורות להתנהגות המוטורית (למשל, חרדה, אדישות, קשיי הלמידה), הנכונות של החיה כדי לבצע אפילו פשוטה מנוע פעילויות כגון ריצה, מצטמצם. כאן, אנו מציעים שינויים שיטה וכלים מוטיבציה כדי לעודד ריצה על ההליכון ממונע מואר יכולים להועיל להחלת בהצלחה קנטית והרצתי ניתוח הליכה על הזדקנות קווים העכבר בשינויים ניווניות. יתר על כן, אנו משתמשים תכסיס פשוט של החלת גואש על כפות רגליים של החיה, מראים כי הוא יכול לסייע באופן משמעותי כדי לשפר את איכות נתוני ההקלטות. קבלת הקלטות וידאו טוב הוא השלב הקריטי ביותר של ניתוח הילוך: הצלחת הניתוח תלויה, כמו בכל ניתוח אוטומטית או חצי אוטומטית של תמונות או קטעי וידאו, על איכות הנתונים הגולמיים. קטעי וידאו באיכות נמוכה לא יכול להשתפר-צעדים מאוחר יותר בניתוח, ויש בדרך כלל ייכללו תהליך ניתוח.

תוך כדי לימוד שיטתי בהליכה ויציבה של WT וגם מספר קווי מוטציה endophilin במשך תקופה של 18 חודשים, שמנו לב כי אפילו עכברים WT ועכברים ללא בעיות גפיים ברור/ריצה (קרי, endophilin 1KO-WT-WT), מראים שינויים מספר פרמטרים בהליכה ויציבה עם הגיל באופן פרוגרסיבי (איור 2 ו- 3 א איור). מעניין, יש לנו גם לב כי בעוד חריגות בתוך מספר פרמטרים בהליכה ויציבה שנצפתה הזדקנות endophilin מוטציות לפתח באותו כיוון המדרון כמו החיות WT/בקרה, וחלק אינם (איור 3). לבסוף, חשוב לציין כי גם אם בגילאי WT עכברים ואנשים צעירים endophilin מוטציות אינם מציגים כל ומכניקה ברור הילוך, ליקויי יציבה כאשר שנצפה על ידי העין, שינויים בפרמטרים בהליכה ויציבה סלקטיבית שניתן לאתר עם גישה זו.

אחת מן הדרכים המקיפה ביותר כדי להמחיש כי מודל העכבר מבטאת היבטים עיקריים של מצב האדם בוחן את התנהגות מוטורית של העכבר. כתוצאה מכך, מספר בדיקות פותחו כדי להעריך היבטים שונים של התנהגות מוטורית. בדיקות אלה כוללות ניסוי השדה פתוח (פעילות גינקולוגיות כללי), rotarod (קואורדינציה, אטקסיה), אחיזה כוח (כוח השריר), פועל גלגל (פעילות), תלוי מבחן תיל (סבולת), סולם קרן הליכה פעילות (בסדר קואורדינציה, מיומנות sensorimotor), הליכה ניתוח (גפיים, תיאום האיבר), ואחרים (מסוכם ב- Wahlstein³⁶). הבדיקות השונות יש יתרונות מסוימים, חסרונות הקריאות שלהם מוגבלים בדרך כלל היבט (או היבטים) של התנהגות מוטורית כי הם נועדו כתובת. מסיבה זו, זה הפך מקובל לבצע סדרת בדיקות התנהגות מוטורית כדי לכסות את ההיבטים העיקריים של האזור.

והרצתי ניתוח לעתים קרובות אינה כלולה הסוללות הללו, בחלקו בשל דו ח מאת Guillot ב- al. ³⁷, מצא כי והרצתי ניתוח אינו מזהה גירעונות מנוע במודלים חייתיים של PD ו- ALS, ובחלק עקב שיטה מייגעת פלט מוגבלת. עם זאת, Guillot ואח. הדו ח קראו תיגר על ידי מחקר כי כתובות מספר מגבלות תכנון מחקר³⁸. התועלת של שיטה זו של הניתוח של דהירה במודלים של העכבר עם הקשורים ניוון מוחיים הוכח על ידי מספר האחרונות פרסומים¹⁰^,¹¹^,¹²^,³⁹^,⁴⁰ ^,⁴¹^,⁴²^,⁴³, כולל גם את העבודה שלנו¹³.

הקלטות VPI מגיעים עם מספר יתרונות על פני השיטה המקובלת של ציור על הידיים עם דיו ולתת העכבר לרוץ על סדין לבן של נייר⁴⁴. הברורה ביותר היא העובדה כי עם ההליכון ממונע, מהירות הריצה של החיה נשלטת, אשר יש השפעה חזקה על הילוך מספר פרמטרים¹. בנוסף, כמה ליקויים הילוך הופכים לזיהוי רק כאשר החיה פועל במהירות במהירות גבוהה בדרישה ו/או של העליה/ירידה, אשר רוצה שתראה לא פועל בהתנדבות. יתר על כן, ניתוח משוכללים יד מוחלף על ידי ניתוח אוטומטי למחצה, תפוקה גבוהה. מסיבה זו, מספר החיות נבדק בכל קבוצה ניתן להגדיל, אשר בתורו פוחתת השפעת נגרמת על ידי ההשתנות שזה בלתי נמנע בבעלי חיים. לסיכום, אנו ממליצים כי הגירסה ששונתה של ניתוח הילוך VPI כלולה הסוללות בדיקת מנוע סטנדרטי כדי להשלים את הניתוח של ליקויים מוטוריים במודלים מכרסמים הקשורים ניוון מוחיים ו/או הזדקנות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים המטפלות בבעלי חיים-מתקן בעלי חיים של ENI לעזרה עם רבייה, ד ר Raimundo נונו להערות שימושי על כתב היד. I.M. נתמך על-ידי המענקים של הגרמני מחקר קרן (DFG) דרך מרכז מחקר משותף SFB-889 (פרוייקט A8) ו- SFB-1190 (פרוייקט P02), פרס החוקר הצעיר את אמי נתר (1702/1). C.M.R. נתמך על ידי המשפחה מבית הספר בוגר גטינגן עבור מדעי המח, ביופיסיקה מולקולרית החיים (GGNB).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DigiGait	Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA		DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware
non-transparent blanket or dark cloth			cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress
balance	e.g. Satorius		balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g
red finger paint	e.g. Kreul or Staedtler		for increasing the contrast between paws and animal’s body
small paint brush			soft brush to apply finger paint to the animal paws
diluted detergent			for cleaning
disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol	e.g. B.Braun		for desinfection