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Developmental Biology

Neurodegeneration के साथ चूहों में उम्र के आश्रित मोटर विकलांगता की चाल विश्लेषण

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/57752
Automatic Translation
1,2, 1,2
1European Neuroscience Institute (ENI), 2University Medical Center Göttigen (UMG)

Summary

इस अध्ययन में, हम गाढ़ापन चाल विश्लेषण ventral विमान इमेजिंग के आधार पर मोटर समंवय में सूक्ष्म परिवर्तन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से माउस मॉडल में उंर बढ़ने के साथ neurodegeneration की प्रगति पर नजर रखने के उपयोग का प्रदर्शन (जैसे, endophilin उत्परिवर्ती माउस लाइनें) ।

Abstract

मोटर व्यवहार परीक्षण आमतौर पर एक कुतर मॉडल के कार्यात्मक प्रासंगिकता निर्धारित करने के लिए और इन जानवरों में नव विकसित उपचार का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । विशेष रूप से, चाल विश्लेषण रोग प्रासंगिक phenotypes है कि मानव रोगियों में मनाया जाता है reकैप्चरिंग की अनुमति देता है, विशेष रूप से पार्किंसंस रोग (पीडी), अल्जाइमर रोग (AD) जैसे मोटर क्षमताओं को प्रभावित neurodegenerative रोगों में, पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS), और अंय । इस लाइन के साथ प्रारंभिक अध्ययन में, चाल मापदंडों की माप श्रमसाध्य था और कारकों पर निर्भर है कि नियंत्रित करने के लिए मुश्किल थे (उदाहरण के लिए, गति चल रहा है, निरंतर चल). ventral विमान इमेजिंग (VPI) प्रणालियों के विकास के लिए यह एक बड़े पैमाने पर चाल विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए संभव बना दिया, इस विधि को कुतर में मोटर व्यवहार के आकलन के लिए एक उपयोगी उपकरण बना । यहां, हम कैसे गाढ़ापन चाल विश्लेषण का उपयोग करने के लिए neurodegeneration के माउस मॉडल में मोटर घाटे की उंर पर निर्भर प्रगति की जांच के एक में गहराई प्रोटोकॉल मौजूद; endophilin के कम स्तर के साथ माउस लाइनों, जिसमें neurodegenerative नुकसान उत्तरोत्तर उंर के साथ बढ़ जाती है, एक उदाहरण के रूप में उपयोग किया जाता है ।

Introduction

Neurodegenerative रोगों रोगियों, परिवारों, और समाज पर एक महत्वपूर्ण बोझ थोपना, और जीवन प्रत्याशा बढ़ जाती है के रूप में भी अधिक से अधिक चिंता का बन जाएगा, और दुनिया की आबादी उंर के लिए जारी है । neurodegenerative रोगों के सबसे आम लक्षणों में से एक संतुलन और गतिशीलता समस्याओं कर रहे हैं । इस प्रकार, उंर बढ़ने स्तनधारी में मोटर व्यवहार के लक्षण वर्णन (जैसे, कुतर) मॉडल, और/या मॉडल neurodegenerative phenotypes दिखा रहा है, एक महत्वपूर्ण उपकरण के लिए विशिष्ट पशु मॉडल के vivo प्रासंगिकता में प्रदर्शित करने के लिए है (ओं), या चिकित्सकीय उपचार है कि उद्देश्य रोग के लक्षणों में सुधार करने के लिए । लगभग हर दृष्टिकोण neurodegenerative रोगों के इलाज के लिए अंततः एक पशु मॉडल में मानव में एक नैदानिक परीक्षण की दीक्षा से पहले परीक्षण की आवश्यकता है । इसलिए, यह करने के लिए विश्वसनीय, reproducible व्यवहार परीक्षण है कि लगातार उंर प्रगति के साथ रोग-प्रासंगिक phenotypes, क्रम में यह सुनिश्चित करने के लिए कि एक उंमीदवार दवा है, जो एक इन विट्रो मॉडल में क्षमता पता लगाया जा सकता है महत्वपूर्ण है, कर सकते है प्रभावी ढंग से एक जीवित जानवर में phenotype उंनति ।

कुतर में मोटर व्यवहार मूल्यांकन का एक पहलू गाढ़ापन चाल विश्लेषण है, जो VPI द्वारा किया जा सकता है (ventral विमान वीडियोग्राफी भी कहा जाता है)1,2। इस विधि की स्थापना की एक पारदर्शी और मोटर चालित ट्रेडमिल बेल्ट1,2,3,4के ऊपर चलने कुतर के नीचे की निरंतर रिकॉर्डिंग पर कैपिटल । वीडियो फ़ीड डेटा का विश्लेषण बनाता है "डिजिटल पंजा प्रिंट" सभी चार अंग है कि गतिशील और मज़बूती से दोहराऊंगा है कुतर घूमना पैटर्न, के रूप में मूल रूप से गोभी एट अल द्वारा वर्णित है । 2 और संशोधन एट अल । 3.

इमेजिंग आधारित चाल विश्लेषण के सिद्धांत को समय के साथ ट्रेडमिल बेल्ट के साथ संपर्क में पंजा क्षेत्र को मापने के लिए है, प्रत्येक व्यक्ति पंजा के लिए । हर रुख पंजा क्षेत्र में वृद्धि (ब्रेक लगाना चरण में) और पंजा क्षेत्र में कमी (लैबोरेटरी चरण में) द्वारा प्रतिनिधित्व किया है । इसके बाद स्विंग फेज में कोई सिग्नल नहीं लग पाया है । स्विंग और रुख एक साथ एक प्रगति फार्म । गतिशीलता मापदंडों चाल के अलावा, मुद्रा पैरामीटर भी दर्ज वीडियो से निकाला जा सकता है । अनुकरणीय मापदंडों और उनकी परिभाषा तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं और रुख चौड़ाई (दप; थूथन-पूंछ धुरी के लिए सामने या हिंद पंजे से संयुक्त दूरी), छलाँग लंबाई (SL; एक ही पंजा के दो प्रगति के बीच औसत दूरी), या पंजा प्लेसमेंट शामिल कोण (पंजा के कोण थूथन-पूंछ धुरी के लिए) । मुद्रा और चाल गतिशीलता डेटा (मुद्रा मापदंडों और कई कदम पर उनकी परिवर्तनशीलता) और समन्वय (गतिशीलता मापदंडों को चाल द्वारा) पशु संतुलन पर निष्कर्ष ड्राइंग की अनुमति देते हैं । अंय पैरामीटर, जैसे गतिभंग गुणांक (SL परिवर्तनशीलता [(अधिकतम द्वारा परिकलित । SL − min. sl)/mean sl]), हिंद अंग दृष्टिकोण समय साझा (समय है कि दोनों पिछले अंग बेल्ट के साथ संपर्क में हैं), या पंजा खींचें (पंजा लिफ्ट से पूरा रुख से बेल्ट पर पंजा के कुल क्षेत्र) भी निकाले जा सकते हैं, और विभिंन neurodegenerative di में परिवर्तित होने की सूचना दी गई है sease मॉडल5,6,7,8 ( तालिका 1देखें) ।

पैरामीटर इकाई परिभाषा
स्विंग समय सुश्री समय पंजा बेल्ट के साथ संपर्क में नहीं है की अवधि
रूख समय सुश्री समय पंजा बेल्ट के संपर्क में है की अवधि
% ब्रेक रुख समय का% रुख समय के पंजे ब्रेक चरण में है का प्रतिशत
% वृद्धि रुख समय का% रुख समय का प्रतिशत पंजे लैबोरेटरी चरण में है
रुख चौड़ाई सेमी थूथन-पूंछ धुरी के लिए सामने या हिंद पंजे से संयुक्त दूरी
डग लम्बाई सेमी एक ही पंजा की दो छलाँग के बीच औसत दूरी
डग कव प्रगति एस/ प्रति सेकंड पूर्ण प्रगति की संख्या
पंजा प्लेसमेंट कोण डिग्री पशु की थूथन-पूंछ धुरी के संबंध में पंजा के कोण
गतिभंग गुणांक a.u. sl परिवर्तनशीलता [(अधिकतम sl-ंयूनतम sl)/mean sl द्वारा गणना]
% साझा रुख रुख का% हिंद अंग साझा रुख समय; समय है कि दोनों हिंद अंग एक ही समय में बेल्ट के साथ संपर्क में है
पंजा खींचें एमएम2 पूरे रूख से बेल्ट पर पंजा-पंजा लिफ्ट तक का कुल क्षेत्रफल
अंग लदान cm2 मैक्स दा/ तोड़कर चरण में पंजा क्षेत्र के परिवर्तन की अधिकतम दर
चरण कोण परिवर्तनशीलता डिग्री SL और SW के एक समारोह के रूप में हिंद पंजे के बीच कोण के मानक विचलन

तालिका 1. ventral विमान इमेजिंग द्वारा परीक्षण किया जा सकता है कि कुंजी चाल मापदंडों की परिभाषा.

neurodegenerative रोगों के लिए कुतर मॉडलों के मोटर व्यवहार का आकलन एक विशेष मॉडल के phenotype की गंभीरता के आधार पर एक दिया उंर में चुनौतीपूर्ण हो सकता है । कई रोगों, सबसे प्रमुखता पीडी, मजबूत मोटर व्यवहार (गतिवान) घाटा, दोनों रोगियों में और पशु मॉडल में दिखाते हैं । पीडी में चार प्रमुख लक्षणों में से एक है bradykinesia, जो उंर बढ़ने और पीडी9के प्रारंभिक दौर में पहले से ही गंभीर चाल में प्रकट होता है के साथ प्रगति । एक्यूट पीडी मॉडल के अध्ययन, 1 के साथ इलाज कुतर-मिथाइल-4-फिनाइल-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridin (MPTP), पहले से ही उपयोग किया है VPI चाल विश्लेषण10,11,12. हालांकि, इस मॉडल की तीव्र प्रकृति को देखते हुए, इन अध्ययनों से मोटर घाटे की उंर से संबंधित प्रगति का पता नहीं है । कई हाल के अध्ययनों से neurodegenerative परिवर्तन के साथ वृद्ध चूहों में विश्लेषण चाल का आयोजन किया है, उदाहरण के लिए13,14,15, उम्र को आगे बढ़ाने के साथ रोग की प्रगति को समझने की प्रासंगिकता पर बल .

मोटर घाटे के अलावा, neurodegenerative रोगों के पशु मॉडल अक्सर परीक्षा कार्यों पर ध्यान केंद्रित करने और उम्र बढ़ने के साथ विशेष रूप से, प्रमुख संज्ञानात्मक विकलांगता दिखाने कठिनाइयों है । इस तरह के एक phenotype मोटर व्यवहार परीक्षणों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं । अर्थात्, सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया परीक्षणों में से एक मोटर घाटे की जांच करने के लिए, rotarod परीक्षण16, अनुभूति, ध्यान पर निर्भर करता है, और17,18तनाव । जबकि एक मोटर चालित ट्रेडमिल पर चलने की इच्छा भी इन कारकों पर निर्भर करता है, दर्ज की रीडिंग बाहर चल रहा है, जो एक अधिक मानकीकृत सुविधा है और अब तक कम बदल अनुभूति से प्रभावित है । तनाव और ध्यान के प्रभाव विशेष मापदंडों में दिखाई जा सकता है, जैसे स्विंग/तनाव के लिए रुख समय, और ध्यान के लिए SL19,20, लेकिन नहीं समग्र चलाने की क्षमता में ।

गाढ़ापन चाल विश्लेषण दृष्टिकोण आगे करने के लिए कुतर मॉडलों के लिए चुनौती को समायोजित करने के लिए विकल्प होने का लाभ प्रदान करता है । समायोज्य कोण और गति के साथ ट्रेडमिल ०.१-९९.९ सेमी/एस से गति चलने की अनुमति देता है, ताकि गंभीर चलने हानि के साथ कुतर अभी भी एक धीमी गति से चलाने के लिए सक्षम हो सकता है (~ 10 सेमी/ गैर बिगड़ा जानवरों तेजी से चल गति पर मापा जा सकता है (30-40 cm/ परीक्षण जानवरों को एक निश्चित गति से चलाने के लिए सक्षम हैं या नहीं का अवलोकन अपने आप में एक परिणाम प्रदान करता है । इसके अलावा, कुतर इसके अतिरिक्त एक इच्छा को चलाने के लिए चुनौती दी जा सकता है, या एक गिरावट के नीचे, एक goniometer की मदद से एक वांछित कोण करने के लिए ट्रेडमिल झुकाव द्वारा, या माउस या चूहे हिंद अंगों के लिए एक भारित स्लेज संलग्न द्वारा ।

एक प्रोटीन है कि रोगियों में रूपांतरित हो रहे है के कई अध्ययनों के अलावा, वहां दोषपूर्ण endocytosis प्रक्रिया और neurodegeneration13,21,22के बीच लिंक के एक हाल ही में वृद्धि जागरूकता है, 23,24,25,26,27,28। endophilin केकम स्तर के साथ माउस मॉडल-एक (फिर से endophilin), दोनों clathrin में एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी-मध्यस्थता endocytosis13,21,29,30,31 , ३२ , ३३ , ४५ और clathrin-निर्दलीय endocytosis३४, हरकत गतिविधि13,21में neurodegeneration और उंर के आश्रित विकलांगता दिखाने के लिए पाए गए । तीन जीन endophilin प्रोटीन के परिवार सांकेतिक शब्दों में बदलना: endophilin 1, endophilin 2, और endophilin 3 । विशेष रूप से, endophilin प्रोटीन की कमी से उत्पंन phenotype बहुत लापता endophilin जीन13,21की संख्या के आधार पर बदलता है । जबकि ट्रिपल नॉक आउट (KO) सभी endophilin जीन के जंम के बाद बस कुछ ही घंटों के घातक है, और चूहों दोनों endophilin 1 और 2 के बिना कामयाब और जंम के बाद 3 सप्ताह के भीतर मर जाते हैं, तीन endophilins में से किसी के लिए एक KO पता चलता है कोई स्पष्ट phenotype परीक्षण के लिए शर्तें21. अन्य endophilin उत्परिवर्ती पादी कम उम्र दिखाने के लिए और बढ़ती उम्र13के साथ मोटर विकलांगता का विकास । उदाहरण के लिए, endophilin 1KO-2HT-3KO चूहों घूमना परिवर्तन और मोटर समंवय समस्याओं (के रूप में गाढ़ापन चाल विश्लेषण और rotarod द्वारा परीक्षण) पहले से ही उंर के 3 महीने में, जबकि उनके littermates, endophilin 1KO-2WT-3KO पशुओं, एक महत्वपूर्ण प्रदर्शन केवल13वर्ष की आयु के 15 महीनों में मोटर समंवय में कमी । इन मॉडलों में phenotypes की विशाल विविधता के कारण, यह पहचान करने और एक परीक्षण है कि पशु मोटर और अनुभूति क्षमताओं के लिए इसी चुनौतियों की एक किस्म को एकीकृत कर सकते हैं, साथ ही साथ उंर लागू करने के लिए आवश्यक है । यहां, हम विस्तार प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं है कि गाढ़ापन चाल विश्लेषण पर कैपिटल के लिए शुरुआत और एक माउस मॉडल में मोटर हानि की प्रगति का आकलन है कि neurodegenerative परिवर्तन (यानी, endophilin म्यूटेंट) से पता चलता है । यह विभिंन उंर और गतिवान विकलांगता के विभिंन विच्छेद पर चाल मापदंडों को मापने शामिल है ।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों की सूचना यहाँ पशु कल्याण के लिए यूरोपीय दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित की जाती हैं (2010/63/EU) Niedersächsisches Landesamt फर Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) द्वारा अनुमोदन के साथ, पंजीकरण संख्या 14/ १७०१.

1. अध्ययन डिजाइन

  1. के रूप में पशु व्यवहार काम सावधान योजना की आवश्यकता है, निंनलिखित मानकों पर विचार करते हुए प्रयोग डिजाइनिंग ।
    1. प्रति समूह की जरूरत पशुओं की संख्या ।
      1. आवश्यक समूह आकार की गणना करने के लिए एक सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर (उदा., PASS, ीडा या GPower) का उपयोग करें ।
        नोट: समूह आकार जानवरों और phenotype की गंभीरता के बीच भिन्नता पर निर्भर करता है. गाढ़ापन चाल विश्लेषण के लिए, चूहों की संख्या आमतौर पर प्रति समूह 10-20 है ।
    2. प्रयोगात्मक पशुओं के सेक्स ।
      1. प्रयोग पर एस्ट्रोजन के स्तर के प्रभाव पर विचार करें, पशु तनाव पर निर्भर करता है ।
        नोट: प्रयोग पर एस्ट्रोजन के स्तर के प्रभाव से बचने के लिए कई व्यवहार अध्ययनों में पुरुषों पर ध्यान दिया जाता है । इन प्रभावों को कम या ज्यादा जानवर पृष्ठभूमि तनाव के आधार पर मजबूत कर रहे हैं ।
      2. यदि दोनों लिंगों का इस्तेमाल किया जाएगा, सेक्स के प्रभाव के लिए परीक्षण और दो लिंगों का मूल्यांकन स्वतंत्र रूप से जब आवश्यक है ।
    3. प्रायोगिक पशुओं की आयु ।
      1. यदि केवल एक बार बिंदु की आवश्यकता हो तो वयस्क पशुओं (2 महीने की आयु, या पुराने) का उपयोग करें ।
      2. कई समय अंक का चयन करें जब आगे बढ़ती उंर के साथ मोटर व्यवहार में परिवर्तन का अध्ययन किया जाना है । सबसे जल्दी संभव समय बिंदु 1 महीने है, चूहों के बाद उनकी माताओं से छुड़ाया जाता है । नियमित अंतराल, जैसे, हर 1, 2, या 3 महीने में जानवरों का परीक्षण करें ।
  2. स्थानीय अधिकारियों से प्राधिकरण के लिए आवेदन करने के लिए पशु व्यवहार परीक्षण प्रदर्शन ।
  3. परीक्षण जानवरों की खरीद के लिए योजना बनाओ ।
    1. एक प्रजनन योजना बनाओ या एक समय पर तरीके से एक पशु वितरक से संपर्क करें ताकि पर्याप्त प्रयोगात्मक पशु दिन पर उपलब्ध है जब प्रयोग शुरू करते हैं ।
    2. एक सप्ताह के लिए जानवरों को habituate करने की अनुमति दें यदि वे प्रयोगों के दौरान एक नए कमरे में रखा/

2. वीडियो रिकॉर्डिंग

नोट: गाढ़ापन चाल विश्लेषण के उपयोग को समझाने के लिए, यहां अपने साथ इमेजिंग और विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इमेजिंग प्रणाली ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग किया जाता है ।

  1. कंप्यूटर और imager सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें ।
  2. स्वास्थ्य की स्थिति और अच्छी तरह से यह अपने घर पिंजरे में देख कर प्रत्येक जानवर की जा रही निर्धारित करते हैं, और यह एक संतुलन पर वजन ।
  3. जब जरूरत है, धीरे एक ब्रश के साथ पशु के पंजे के लिए लाल उंगली रंग लागू होते हैं । के लिए एक अतिरिक्त साफ पिंजरे में ~ 5 मिनट के लिए सूखी रंग की अनुमति दें ।
    नोट: रंग के पंजे और शरीर के बीच के विपरीत को बढ़ाने के लिए प्रयोग किया जाता है के रूप में पशु के पेट पेंटिंग से बचें । यह सुधार के लिए काला उंगली रंग काम करने के लिए उपयोगी है । इस कदम के भूरे रंग के फर, या मामले में पंजे पहचान के लिए टैटू किया गया है के साथ जानवरों के लिए आवश्यक है । एक जानवर के पंजे पेंट करने के लिए चुना है, तो एक ही समूह और नियंत्रण समूह में सभी जानवरों के रूप में अच्छी तरह से चित्रित करने की आवश्यकता है ।
  4. तंत्र के शीर्ष दाहिने पैनल पर ट्रेडमिल की गति निर्धारित करें; यदि एक से अधिक चलित गति लागू की जाएगी, तो पहले धीमी गति से प्रारंभ करें ।
  5. परीक्षण कक्ष में पशु प्लेस (पूंछ या पंजे जब चैंबर बंद clamping से बचें) । एक काले कपड़े के साथ चैंबर को कवर और प्रत्येक जानवर 1-2 मिनट के लिए समायोजित करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  6. "पर" स्थिति के लिए ट्रेडमिल प्रकाश रोटरी स्विच मोड़ द्वारा परीक्षण कक्ष में प्रकाश पर बारी । बारी ट्रेडमिल रोटरी स्विच करने के लिए "आगे" ट्रेडमिल शुरू करने के लिए, तो क्लिक करें "रिकॉर्ड" imager सॉफ्टवेयर में बटन ।
    ध्यान दें: जबकि ट्रेडमिल चल रहा है, यह महत्वपूर्ण है कि पशु के प्रदर्शन का पालन ध्यान से और लगातार: ट्रेडमिल रोक तुरंत अगर जानवर ट्रेडमिल की गति के साथ नहीं रख सकते हैं, या माध्यमिक लक्षण गैर गतिवान से संबंधित दिखाता है (जैसे, मिरगी बरामदगी) । परीक्षण शर्तों को पुनः समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है ।
  7. जब जानवर छुरा चलाता है (पक्ष, सामने, या वापस करने के लिए कोई जल्दी नहीं बच), ट्रेडमिल रोकने से पहले कम से कम 5 एस के लिए रिकॉर्ड । imager सॉफ्टवेयर पर "बंद करो" पर क्लिक करके रिकॉर्डिंग बंद करो, और बारी ट्रेडमिल रोटरी "बंद" स्थिति को वापस स्विच ।
    नोट: जानवरों के अस्थिर चलने से बचने के लिए यह उंहें कई सेकंड के लिए चलाने के लिए, या उंहें अंय दिशा में चलाने के लिए अनुमति देने के लिए सहायक हो सकता है ("रिवर्स" के बजाय "आगे" ट्रेडमिल रोटरी स्विच मोड़ द्वारा) ।
  8. एक मेनू खोलने के लिए imager सॉफ्टवेयर में "प्रसंस्करण" बटन पर क्लिक करें जिसमें वीडियो खंड के प्रारंभ और अंत बिंदु (विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाने वाला) सेट किया जा सकता है । ऐसा करने के लिए, वीडियो के माध्यम से नेविगेट करने के लिए स्क्रीन के निचले भाग पर स्लाइडर का उपयोग करें.
  9. प्रारंभ या समाप्ति बिंदु के रूप में वर्तमान समय बिंदु का चयन करने के लिए, क्रमशः "फ़्रेम #" और "to," क्लिक करें । सुनिश्चित करें कि अनुभाग में एक स्थिर गति पर छुरा चलाने वाले जानवर के ंयूनतम 7 कदम/पंजा (कुल 14 कदम) शामिल है ।
  10. पशु पहचान, जंम तिथि, वजन, और सेक्स दर्ज करें । कंप्यूटर या सर्वर पर किसी इच्छित स्थान पर डेटा सहेजें । रिकॉर्डिंग इंटरफेस पर लौटने के लिए "कैमरा" पर क्लिक करें ।
  11. एकाधिक चल गति दर्ज करने की आवश्यकता है, तो चरण २.६-२.१० वांछित चल रहे गति के साथ दोहराएँ । अगले वीडियो रिकॉर्डिंग से पहले, यह सुनिश्चित करें कि लाल रंग अभी भी पंजा पर मौजूद है, अंयथा चरण २.३ दोहराएं ।
  12. रिकॉर्डिंग के बाद, अपने घर पिंजरे के लिए पशु रिलीज । एक जानवर को हटाने के बाद, यह अगले प्रयोगात्मक पशु के लिए तैयार करने के लिए विसंक्रमित द्वारा पीछा साबुन पानी के साथ अच्छी तरह से ट्रेडमिल बेल्ट साफ ।

3. वीडियो प्रसंस्करण

  1. विश्लेषण सॉफ्टवेयर शुरू और दर्ज की वीडियो के साथ फ़ोल्डर का चयन करने के लिए "अध्ययन फ़ोल्डर का चयन करें" क्लिक.
  2. एक वीडियो का चयन करें, या कई वीडियो है कि लगातार संसाधित किया जा सकता है, और क्लिक करें "जाओ."
  3. उस क्षेत्र का चयन करने के लिए "पुनर्ड्रा" फ़ंक्शन का उपयोग करें जहां माउस चल रहा है; इस अनुभाग में केवल माउस और सफेद पृष्ठभूमि शामिल होनी चाहिए ।
  4. यदि "रिवर्स" ट्रेडमिल समारोह पहले इस्तेमाल किया गया था, चुनें "जांच अगर है विषय नाक अपने अधिकार के लिए है > > >" वीडियो दर्पण के बाद से सॉफ्टवेयर के लिए ही छोड़ दिया चल रहे पशुओं का विश्लेषण बनाया गया है । आगे बढ़ने के लिए "स्वीकारें" क्लिक करें ।
  5. डिफ़ॉल्ट मास्क और पंजा प्रिंट कि सॉफ्टवेयर का पता लगाता है देखने के लिए "ताज़ा" समारोह का प्रयोग करें ।
    नोट: मूल वीडियो बाईं ओर प्रदर्शित किया जाता है, और प्रस्तावित पंजा प्रिंट के एक काले और सफेद छवि सही पर है ।
  6. "लंबाई" और "चौड़ाई" बक्से में मान दर्ज करें मुखौटा है कि विश्लेषण के लिए पशु के थूथन के आसपास लाल क्षेत्र शामिल नहीं बदलने के लिए; के रूप में रंग पंजे के समान है, मास्किंग नहीं है कि क्षेत्र सॉफ्टवेयर गलती से एक पंजा के रूप में थूथन क्षेत्र वर्गीकृत में परिणाम सकता है ।
  7. स्लाइडर्स "फिल्टर शोर" और काले और सफेद पंजा प्रिंट का अनुकूलन करने के लिए "फिल्टर फर और अंधेरे पैच" समायोजित करें । काले जानवरों के लिए ~ ८००-९५० के लिए "फिल्टर शोर" स्लाइडर सेट और पशु के सटीक फर रंग पर निर्भर करता है, भूरे या सफेद जानवरों के लिए ~ ७००-८०० के लिए । सेटिंग्स संतोषजनक होने पर "ok" का चयन करें ।
    नोट: "फिल्टर फर और डार्क पैच" स्लाइडर कैसे "लाल" पंजा है पर निर्भर करता है । चित्रित पंजे के लिए, मूल्य आमतौर पर लगभग १००-१२० है, और गैर के लिए चित्रित पंजे सबसे अच्छा मूल्य ५०-१०० के आसपास है । इन सेटिंग्स फर और पंजे के रंग छायांकनों पर निर्भर करता है, और हर जानवर के लिए अनुकूलित करने की जरूरत है । काले और सफेद पंजा प्रिंट संभव के रूप में छोटे पृष्ठभूमि शोर के साथ पंजे के स्पष्ट अभ्यावेदन होना चाहिए ।
  8. पहले समायोजन पारित किए गए एक या कई वीडियो का चयन करें (वीडियो नाम से पहले "@ @" के साथ लेबल किया गया) और इन वीडियो के विश्लेषण को प्रारंभ करने के लिए "go" फ़ंक्शन का चयन करें.
    नोट: विश्लेषण वीडियो प्रति 2-5 मिनट लगते हैं । यह कई वीडियो के विश्लेषण चलाने के बाद से इस कदम को प्रयोगकर्ता से कोई इनपुट की आवश्यकता है रातोंरात संभव है ।
  9. किसी विश्लेषित वीडियो का चयन करें ("@ @ @" के साथ लेबल किया गया) और "go" पर क्लिक करें. ध्यान दें कि पंजा क्षेत्र (सेमी2में) समय पर बेल्ट के साथ संपर्क में प्रत्येक अलग पंजा के लिए (चाल गतिशीलता) अब देखा जा सकता है । किसी चयनित क्षेत्र के लिए मूल वीडियो और परिकलित पंजा प्रिंट की तुलना करने के लिए, "वीडियो चलाएं" फ़ंक्शन का उपयोग करें.
  10. सॉफ़्टवेयर द्वारा की गई छोटी गलतियों को सही करने के लिए निम्न (तीन) टूल का उपयोग करें.
    1. एक गलत संकेत को नष्ट करने के लिए "सही" विकल्प का प्रयोग करें, उदाहरण के लिए, जब सॉफ्टवेयर एक संकेत रिकॉर्ड भले ही इसी पंजा बेल्ट के साथ संपर्क में नहीं है । प्रासंगिक क्षेत्र में ज़ूम करने के लिए एक बार क्लिक करें, और दूसरे क्लिक के साथ निकालने के लिए ऑब्जेक्ट की बाईं बॉर्डर और तीसरे क्लिक के साथ दाईं बॉर्डर पर चिह्न दें.
    2. दो संकेतों गठबंधन करने के लिए "कनेक्ट" विकल्प का प्रयोग करें, उदाहरण के लिए, जब कोई संकेत कुछ फ्रेम के लिए रिकॉर्ड किया जाता है भले ही पंजा बेल्ट के साथ संपर्क में है । प्रासंगिक क्षेत्र में ज़ूम करने के लिए एक बार क्लिक करें और संयोजित करने के लिए दो ऑब्जेक्ट्स के बीच में डबल-क्लिक करें.
    3. विश्लेषण से समय बिंदुओं को पूरी तरह से निकालने के लिए "हटाएँ" विकल्प का उपयोग करें. इस विकल्प का उपयोग केवल तभी करें जब गलती "सही" या "कनेक्ट" फ़ंक्शन के साथ ठीक नहीं की जा सकती, उदा., जब बाएं forelimb पंजा से कोई संकेत गलती से बाएं हिंद कृतिम पंजा के लिए रिकॉर्ड किया गया है । प्रासंगिक क्षेत्र में ज़ूम करने के लिए एक बार क्लिक करें, और तीसरे क्लिक के साथ दूसरी क्लिक और दाईं बॉर्डर के साथ हटाने के लिए क्षेत्र की बाईं बॉर्डर को चिह्नित करे ।
      नोट: उपकरण केवल छोटी गलतियों को सही करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; व्यवस्थित विफलताओं (उदाहरण के लिए, यदि एक पंजा से संकेत बेहद कमजोर था) सही नहीं किया जा सकता: वीडियो विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए और संबंधित जानवर दोहराया, जब संभव की रिकॉर्डिंग । ध्यान दें कि "वीडियो चलाएं" विकल्प के बाद अब उपलब्ध नहीं है "सही," "कनेक्ट," या "हटाएं" विकल्प का उपयोग किया गया है, और क्लिक करें "पूर्ववत् करें" बटन सभी 3 संपादन उपकरण रीसेट होगा ।
  11. 4 अंगों के माध्यम से आगे बढ़ने के लिए "अगले अंग" का चयन करें; जब "अगले अंग" पिछले पंजा के बाद क्लिक किया है, सॉफ्टवेयर विश्लेषण पूरा करता है और 4 स्क्रीन पर इस जानवर के लिए परिणाम से पता चलता है ।

4. चाल विश्लेषण

  1. जब एक प्रयोग से सभी वीडियो का विश्लेषण कर रहे हैं, सभी वीडियो का चयन करें और परिणाम (स्प्रेडशीट फ़ाइलों में पैरामीटर की एक सूची) को निर्यात करने के लिए "फिर से संगठित परिणाम" क्लिक.
  2. समाप्त "reorganized_stride_info" के साथ फ़ाइल खोलें और जानकारी है कि इस स्प्रेडशीट में शामिल नहीं है जोड़ें: समूह जानकारी (जैसे, जीनोटाइप, उपचार), उंर, और पशु लंबाई और चौड़ाई जो दूसरे में बच रहे है की माप स्प्रेडशीट फ़ाइल के साथ समाप्त "SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info."
  3. जानवर चौड़ाई या लंबाई जहां आवश्यक है, जैसे, पशु की लंबाई और SW के लिए SL पशु चौड़ाई को चाल मापदंडों को सामान्य ।
  4. समूह, आयु, और गति रनिंग द्वारा परिणामों को क्रमबद्ध करें: स्वतंत्र रूप से इन सभी शर्तों का विश्लेषण ।
    नोट: भिंन आयु या चलित गति को एक ही समूह में संयोजित नहीं किया जा सकता ।
  5. सभी प्रायोगिक शर्तों के लिए प्रत्येक पैरामीटर के लिए माध्य का औसत (माध्य) मान, मानक विचलन और मानक त्रुटि परिकलित करें ।
  6. प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं, उदाहरण के लिए, एक 2-पूंछ टीपरीक्षण का उपयोग करने के लिए एक जंगली प्रकार (WT)/control, या ANOVA के लिए उत्परिवर्ती/स्वास्थ्यकर्मी पशु तुलना करने के लिए कई स्वतंत्र समूहों की तुलना करें ।
  7. सभी मापा मापदंडों को देखो: यह बेहतर परिणाम कल्पना करने के लिए प्रत्येक पैरामीटर साजिश करने के लिए उपयोगी है । यदि किसी दिए गए पैरामीटर में सांख्यिकीय अंतर हैं, तो अंय निर्भर पैरामीटर तदनुसार परिवर्तित की जांच करें ।
    नोट: उदाहरण के लिए, यदि SL एक निश्चित परीक्षण समूह में काफी कमी आई है, यह भी एक उच्च प्रगति आवृत्ति के कारण होगा (के बाद से चल गति एक ही है) और एक वृद्धि की SW में परिणाम (मुद्रा स्थिरता बनाए रखने के क्रम में) हो सकता है ।
  8. उन पैरामीटर्स का चयन करें जो किसी मॉडल के लिए सर्वाधिक प्रासंगिक हैं, और/या मानव रोग में टिप्पणियों के लिए तुलनीय हैं । एक प्रस्तुति के लिए, प्रत्येक समूह के लिए प्रतिनिधि वीडियो बनाने के लिए और उंहें प्रासंगिक मापदंडों के लिए readout दिखा रेखांकन से पूरक हैं, क्योंकि सूक्ष्म चाल परिवर्तन अक्सर वीडियो से स्पष्ट नहीं हैं ।

5. समस्या निवारण

नोट: कुछ जानवरों, विशेष रूप से एक चिंता phenotype के साथ माउस मॉडल, कठिनाइयों को भी एक ट्रेडमिल पर चलने की तरह एक साधारण काम करने के लिए हो सकता है । निंनलिखित कदम है कि चिंता का स्तर कम करने के लिए लिया जा सकता है और प्रोत्साहित कर रहे हैं ।

  1. आदी होना और सकारात्मक प्रवर्तन ।
    1. पहले परीक्षण के 2-3 दिन पहले, परीक्षण कक्ष में माउस रखें, इसे एक गहरे कपड़े से ढक दें, और प्रकाश को बंद करके छोड़ें । माउस को समायोजित करने के लिए नए वातावरण के लिए ~ 5 min. चाउ या चॉकलेट/नट मक्खन जोड़ें (जैसे, Nutella) परीक्षण कक्ष के लिए तो एक सकारात्मक संघ का गठन किया जा सकता है ।
  2. एयर puffs/रियर सीमा द्वारा नकारात्मक प्रवर्तन ।
    1. चूहे हवा कश या उनके पीछे एक आंदोलन की तरह नहीं है, और गड़बड़ी से दूर चला जाएगा । चलाने के लिए प्रेरित करने के लिए, हल्के हवा कश, या लचीला पट्टी के लयबद्ध आंदोलन का उपयोग करें कि परीक्षण कक्ष के पीछे सीमा रूपों, माउस को प्रोत्साहित करने के लिए परीक्षण कक्ष के सामने भाग की ओर चला ।
  3. धीमी शुरुआत ।
    1. जब परीक्षण तेजी से चल गति, एक कम गति से ट्रेडमिल शुरू और फिर धीरे से वांछित परीक्षण हालत की ओर ट्रेडमिल गति में वृद्धि ।
  4. मुक्त आंदोलन को कम करें ।
    1. परीक्षण चैंबर लंबाई सामने और पीछे दो समायोज्य सलाखों द्वारा सीमित है । यदि एक परीक्षण पशु चल गति के साथ रहता है, लेकिन तेजी से नहीं चला है, चैंबर की लंबाई सीमा को और अधिक स्थिर चल में परिणाम है ।
  5. यदि उपर्युक्त माप सफल नहीं होते हैं, तो अगले दिन पर रिकॉर्ड चल रहा है । पशु अभी भी तीन दिन पर परीक्षण के बाद चलाने के लिए मना कर दिया, तो खोज के रूप में इस रिकॉर्ड, और आगे परीक्षण से पशु को बाहर ।
    नोट: चाल विश्लेषण के परिणाम अच्छी गुणवत्ता वाले वीडियो रिकॉर्डिंग पर निर्भर करते हैं । वीडियो को ध्यान से रिकॉर्ड किया गया है, तो विश्लेषण के दौरान वीडियो को बाहर करने के लिए कोई कारण नहीं है । यदि वीडियो की गुणवत्ता अपर्याप्त है, तो यह चरण ३.६ के दौरान स्पष्ट हो जाएगा जब डिजिटल पंजा मुद्रण के निर्माण के लिए पैरामीटर सेट किए जा रहे हैं । यदि पंजे और थूथन को छोड़कर किसी अंय शरीर भाग लाल प्रकट होता है (जैसे, जननांग या उंगली पेट पर रंग छिड़काव के आसपास लापता फर के कारण), गुणवत्ता काफी गिरता है । चरण ३.६ में समायोजन केवल छोटे समस्याओं को सुधारने की अनुमति देता है, और यदि यह वीडियो को एक स्वीकार्य संकेत/शोर अनुपात में नहीं ला सकता, तो वीडियो को विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए, और रिकॉर्डिंग को दोहराए जाने की आवश्यकता होती है । इस प्रकार, यह रिकॉर्डिंग किया जाता है के बाद जल्द ही वीडियो का विश्लेषण करने के लिए सिफारिश की है ।

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Representative Results

गाढ़ापन चाल विश्लेषण के उपयोग को समझाने के लिए, हम WT C57BL पर चाल विश्लेषण प्रदर्शन किया है/6J चूहों उंर को आगे बढ़ाने के साथ, के रूप में अच्छी तरह के रूप में कई endophilin उत्परिवर्ती लाइनों, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इंस्ट्रूमेंटेशन और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर (कृपया की तालिका को देखें सामग्री) । इस सेटअप में, एक पारदर्शी ट्रेडमिल के तहत एक उच्च गति कैमरा एक माउस के चल रहे रिकॉर्ड (1a आंकड़ा) । सॉफ्टवेयर तो लाल रंग का पंजे और सफेद या काले फर के बीच इसके विपरीत पहचानता है । चूंकि हमारे प्रयोगात्मक पशुओं गहरे भूरे रंग फर था, हम लाल उंगली रंग के साथ सभी विषयों के पंजे चित्रित किया है । हम अलग चल गति पर प्रायोगिक जानवरों का परीक्षण किया है: घूमना (10 सेमी/एस), चल रहा है (20 सेमी/एस), और तेजी से चल रहा है (30 सेमी/ संपर्क क्षेत्र, और समय पंजे ट्रेडमिल पर थे और हवा में मापा गया । इस जानकारी से, पैरामीटर है कि दोहराऊंगा चाल लय (जैसे, स्विंग/रुख समय, ब्रेक/लैबोरेटरी) या आसन (जैसे, पंजा कोण, SW) की गणना की गई (आंकड़ा 1b) ।

हम कई मोटर व्यवहार परीक्षणों की एक बैटरी के एक भाग के रूप में चाल विश्लेषण प्रदर्शन किया । हम पकड़ शक्ति (जी एस), हिंद अंग अकवार (एचएलसी), चाल, और त्वरित rotarod प्रदर्शन (आगमन) का आकलन किया । जबकि मोटर व्यवहार के रूप में पिछले अनुभव और प्रयोगात्मक परीक्षणों से प्रभावित नहीं है के रूप में, उदाहरण के लिए, अनुभूति, यह अभी भी महत्वपूर्ण है कि हर जानवर एक ही क्रम में और एक ही उंर में परीक्षणों की एक ही बैटरी से गुजरना है । आदेश वर्तमान परीक्षण पर पिछले प्रयोगों से प्रभावित करने के लिए पशुओं के लिए उच्च कठिनाई के लिए कम से जाना चाहिए ।

हम इस अध्ययन के लिए endophilin म्यूटेंट के बाद से चुना है, के आधार पर तीन endophilin alleles के कितने याद आ रही है, जिसके परिणामस्वरूप phenotype एक कोस में कोई phenotype से युवा neurodegenerative phenotype में एक हल्के endophilin 1KO-2HT-3KO बदलता है चूहों कि उंर बढ़ने के साथ प्रगति । इस कारण से, इन जानवरों की लाइनें एक पर्याप्त मॉडल प्रस्तुत करने के लिए सूक्ष्म परिवर्तन है कि केवल पशुओं उंर के रूप में विकसित अध्ययन । यह देखते हुए कि सबसे endophilin म्यूटेंट एक कम उंर दिखाने के लिए, हम 18 महीने के पाठ्यक्रम पर endophilin म्यूटेंट के मोटर व्यवहार की जांच की है (18 महीने के समय बिंदु के बाद से भी endophilin 1KO में चूहों-2HT-3KO लाइन है कि सबसे मजबूत प्रदर्शित करता है चुना गया था phenotype, पक्षाघात न हो) । चाल विश्लेषण एक 18 महीने की अवधि (चित्रा 1C) पर आठ समय अंक पर किया गया था । उम्र के 18 महीनों में, जानवरों euthanized थे, और जैव रासायनिक और/या ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए संरक्षित ।

माउस कॉलोनी रखरखाव:

Heterozygous और homozygous चूहों endophilin 1, 2, और 3 alleles के लिए मूल रूप से मिलोसेविक एट अलमें सूचित किया गया । 21 C57BL/6J चूहों littermate चूहों के अलावा में नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया भर । चूहों खुले पिंजरों में भोजन और पानी के लिए एक अधिकतम 5 पशुओं के समूहों में उपयोग के साथ libitum में स्थित थे, एक 12-h प्रकाश/ इस अध्ययन में केवल पुरुष चूहों का उपयोग किया गया जो महिलाओं में चक्र-निर्भर विविधताओं के प्रभाव को बहिष्कृत करते हैं.

Endophilin A1, A2, और A3 माउस मॉडलों का Genotyping:

endophilin उत्परिवर्ती चूहों के Genotyping पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) जीनोमिक पूंछ या कान घूंसे से निकाले डीएनए का उपयोग प्रवर्धन द्वारा किया गया था । पीसीआर तीन endophilin के लिए-एक जीन संबंधित प्राइमरों के साथ प्रदर्शन किया गया: endophilin-A1: फॉरवर्ड प्राइमरी 5 ' CCACGAACGAACGACTCCCAC3 ' और रिवर्स प्राइमर 5 '-CGCACCTGCACGCGCCCTACC-3 ' के लिए WT, 5 '-TCATAGCCGAATAGCCTCTCC-3 ' के लिए KO; endophilin-A2: फॉरवर्ड प्राइमर्स 5 '-CTTCTTGCCTTGCTGCCTTCCTTA-3 ' for WT; 5 '-CCTAGGGGCTTGGGTTG-TGATGAGT-3 ' को ko और रिवर्स प्राइमर्स के लिए 5 '-GCCCCACAACCTTCTCGCTGAC-3 ' के लिए WT, 5 '-CGTATGCAGCCGCCGCATTGCATC-3 ' के लिए ko; endophilin-A3: फॉरवर्ड प्राइमरी 5 '-CTCCCCATGGTGGAAAGGTCCATTC-3 ' और रिवर्स प्राइमर्स 5 '-TGTGACAGTGGTGACCACAG-3 ' के लिए WT, 5-' CAACGGACAGACGAGAG-ATTC-3 ' को KO. परिणामस्वरूप पीसीआर उत्पादों एक 1% agarose जेल पर चला रहे थे, WT और ko alleles के लिए विशिष्ट बैंड आकार उपज: endophilin-A1 WT ~ ३८४ बीपीएस, KO ~ ९५० बीपीएस; endophilin-A2 WT ~ १,२८० बीपीएस, KO ~ १,००० बीपीएस; endophilin-A3 WT ~ ३२५ बीपीएस, KO ~ ४६५ बीपीएस । दोनों WT और KO बैंड के साथ पीसीआर उत्पादों एक heterozygous (एचटी) जानवर का संकेत है ।

परिणाम:

WT चूहों में उम्र को आगे बढ़ाने के साथ चाल और आसन की विशेषता के लिए, हम इन जानवरों में गाढ़ापन चाल विश्लेषण प्रदर्शन किया है (चित्रा 2; फिल्म 1). जबकि कुछ मापदंडों, उदाहरण के लिए SW (जानवर चौड़ाई को सामान्यीकृत सामने या हिंद अंगों के बीच औसत दूरी; भी तालिका 1देखें), उम्र बढ़ने के साथ WT जानवरों में अपरिवर्तित रहने, अन्य मापदंडों में उत्तरोत्तर परिवर्तन (चित्रा 2a- ग). उदाहरण के लिए, हिंद अंग दोहरे समर्थन (समय दृष्टिकोण अवधि के सापेक्ष है कि दोनों पिछले अंग एक ही समय में जमीन के साथ संपर्क में हैं) ३८% से ५५% से 1 महीने से बढ़ जाती है 18 महीने (चित्रा 2 बी) । इस पैरामीटर अक्सर मुद्रा अस्थिरता३५के साथ जुड़ा हुआ है । इसके अलावा, अंग लोड हो रहा है (तोड़ने चरण में पंजा क्षेत्र के परिवर्तन की अधिकतम दर) से बढ़ जाता है ३८ cm2/से ५९ cm2/1 महीने से 18 महीने (चित्रा 2c) । फास्ट मंदी कम मांसपेशियों की ताकत के लिए एक संकेतक के रूप में व्याख्या की जा सकती है । कुल चलाने की क्षमता WT पशुओं में प्रभावित नहीं है (९४% 30 सेमी पर चलाने के लिए कर सकते है/ निस्र्पक चाल और मुद्रा मापदंडों कि अप्रभावित रहने के अलावा, या WT चूहों में उम्र को आगे बढ़ाने के साथ उत्तरोत्तर परिवर्तन, हम प्रलेखित है कि गाढ़ापन चाल VPI का उपयोग कर विश्लेषण एक उपयुक्त विधि में उम्र से संबंधित हल्के परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए है चाल और आसन ।

जबकि कुल चलाने की क्षमता WT पशुओं में प्रभावित नहीं है, कई endophilin उत्परिवर्ती लाइनों को चलने या मोटर चालित ट्रेडमिल (आंकड़ा 3ए) पर चलाने की क्षमता को दिखाने के लिए, के रूप में मर्डोक एट अल में सूचना दी । छोटे डेटा सेट पर 13 . विशेष रूप से, जबकि उम्र के 1 महीने में सभी endophilin 1KO-2HT-3KO चूहों सभी 30 सेमी पर चलाने के लिए सक्षम हैं/उंर के 18 महीने में ही पशुओं के ८१% से कम (आंकड़ा 3ए, ध्यान दें कि बड़े साथियों से लोगों को 13में पहले रिपोर्ट की तुलना में विश्लेषण किया गया) नहीं चला पा रहे हैं । दिलचस्प है, endophilin म्यूटेंट कि कमी कम endophilin alleles (यानी, endophilin 1KO-2HT-3WT) भी प्रभावित कर रहे हैं, लेकिन एक कम डिग्री (आंकड़ा 3ए) ।

हालांकि endophilin 1KO-2HT-3KO म्यूटेंट13साल की उंर को आगे बढ़ाने के साथ गंभीर मोटर विकलांगता दिखाने के लिए, कई चाल मानकों को WT नियंत्रण की तुलना में नहीं बदल रहे हैं, भी 18 महीने की उंर में । उदाहरण के लिए, चरण कोण परिवर्तनशीलता (चरण कोण का मानक विचलन) अपरिवर्तित रहता है (चित्र बी) । विशेष रूप से, कई अन्य मापदंडों, उदाहरण के लिए प्रेरित समय (पंजे लैबोरेटरी चरण में हैं कि रुख समय का प्रतिशत), उम्र के 1 महीने में अलग नहीं कर रहे हैं, लेकिन उत्तरोत्तर उंर बढ़ने के साथ बदतर हो (चित्रा 3सी; भी फिल्म 2देखें). यह दिखाता है कि दोनों उंर पर निर्भर पैरामीटर के रूप में अच्छी तरह के रूप में neurodegenerative उत्परिवर्ती-विशिष्ट चर एक गाढ़ापन चाल विश्लेषण दृष्टिकोण के साथ अध्ययन किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1. Ventral विमान इमेजिंग सेटअप और सिद्धांत । (क) तस्वीर और योजनाबद्ध एक चाल विश्लेषण सेटअप की ड्राइंग । (ख) विश्लेषण सॉफ्टवेयर सिद्धांत: एक पारदर्शी ट्रेडमिल पर चल रहे एक चूहे के दर्ज की गई नीचे से, सॉफ्टवेयर डिजिटल पंजा प्रिंट की गणना करता है । चल के दौरान उनकी गतिशीलता समय के साथ पंजा क्षेत्र के आकार के रूप में मापा जाता है, और इस चाल लय और आसन मापदंडों की गणना करने के लिए एक आधार के रूप में प्रयोग किया जाता है । (ग) endophilin म्यूटेंट पर प्रदर्शन चाल विश्लेषण प्रयोग के समय पाठ्यक्रम । गतिवान और चाल 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, और 18 महीनों में मूल्यांकन किया गया । छवियां 2, 12, और 18 महीने में endophilin 1KO-2HT-3KO माउस दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. उंर को आगे बढ़ाने के साथ जंगली प्रकार के चूहों में विश्लेषण चाल । WT (C57BL/6J) चूहों में गतिवान और चाल का मूल्यांकन 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, और 18 महीनों में किया गया । (क) रुख चौड़ाई WT पशुओं की पशु चौड़ाई को सामान्यीकृत उंर को आगे बढ़ाने के साथ नहीं बदलता है । (ख) हिंद अंग दोहरे समर्थन WT पशुओं में उंर के साथ बढ़ जाती है । ग्राफ रुख समय का प्रतिशत है कि दोनों हिंद अंग एक ही समय में जमीन पर है दिखाता है । इस पैरामीटर में वृद्धि चाल अस्थिरता को दर्शाता है । (ग) अंग लदान (तोड़ने चरण में पंजा क्षेत्र के परिवर्तन की अधिकता दर) WT पशुओं में उम्र के साथ बढ़ जाती है । अधिक तेजी से मंदी कम मांसपेशियों की ताकत के लिए एक संकेतक हो सकता है । सभी रेखांकन मतलब मूल्य ± SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं; p मान 1-माह पुराने WT बनाम 2-पुच्छेड t-परीक्षणों से परिकलित किए गए थे, और इसे * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 के रूप में प्रस्तुत किया गया है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3. endophilin म्यूटेंट में चाल विश्लेषण उंर के साथ आगे बढ़ने के साथ । (क) 1, 12, और 18 महीनों में endophilin म्यूटेंट की चलित गति, मर्डोक एट अल की तुलना में किसी विस्तारित डेटासेट से गणना की गई. 13 पट्टी रंग 30 (डार्क ब्लू), 20 (नीला), या मोटर चालित ट्रेडमिल पर 10 सेमी/एस (हल्के नीले) पर चलाने के लिए सक्षम जानवरों के प्रतिशत को प्रतिबिंबित, या सेटअप (ग्रे) पर चलने से मना । जबकि सभी परीक्षण जानवरों पर चला सकते है 30 मी 1 महीने में, endophilin म्यूटेंट के रूप में वे उंर के घाटे चल विकास । (बी-सी) कदम कोण परिवर्तनशीलता और WT में समय में वृद्धि (काला), endophilin 1KO-2WT-3WT (turquois), endophilin 1KO-2HT-3WT (डार्क ब्लू), और endophilin 1KO-2HT-3KO (ब्राउन) चूहों । कदम कोण परिवर्तनशीलता WT पशुओं, या WT और endophilin म्यूटेंट के बीच उंर बढ़ने में कोई अंतर नहीं दिखाता है । (रुख के प्रतिशत के रूप में) काफी endophilin म्यूटेंट और WT के बीच 1 महीने में परिवर्तित नहीं होता है, लेकिन चूहों की उंर के रूप में endophilin म्यूटेंट में कम हो जाती है । सभी रेखांकन मतलब मूल्य ± SEM प्रतिनिधित्व करते हैं; p मानों की गणना 2-पुच्छेड t-परीक्षणों बनाम आयु-मिलान WT से की गई थी, और इसे * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 के रूप में प्रस्तुत किया गया है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Movie 1
फिल्म 1. चाल विश्लेषण में जंगली प्रकार (C57BL/6J) माउस 3 पर (बाएं) और उंर के 18 महीने (दाएं) । मूल वीडियो (ऊपर) एक "डिजिटल पंजा प्रिंट" वीडियो (नीचे) के लिए अनुवाद किया है । वीडियो की गति को धीमा किया गया है 5 बार ताकि विवरण बेहतर सराहना की जा सकती है । 18 महीने के समय बिंदु पर, सही हिंद पंजा की झिझक पर ध्यान दें (डिजिटल पंजा प्रिंट में लाल) पर ~ 2 s, और ठीक सामने पंजा के (नीले डिजिटल पंजा प्रिंट में) पर ~ 4 एस । वीडियो की गति 10 के एक पहलू से धीमा कर दिया गया है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 2
फिल्म 2. endophilin 1KO में चाल विश्लेषण-2WT-3WT (नियंत्रण; बाएं) बनाम endophilin 1KO-2HT-3KO (दाएं) चूहों की उंर के 18 महीनों में । वीडियो की गति 5 का एक पहलू से नीचे धीमा किया गया है तो विवरण बेहतर सराहना की जा सकती है । endophilin 1KO-2HT-3KO माउस दिखाता है कि चाल परिवर्तन कि कम स्थिर जानवर के चलने के रूप में देखा जा सकता है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

मोटर समन्वय का अध्ययन neurodegenerative रोगों के मॉडल के लक्षण वर्णन में एक उपयोगी तरीका है, पीडी की तरह रोगों के लिए विशेष रूप से जो मोटर समन्वय बुरी तरह से प्रभावित है. एक गाढ़ापन चाल विश्लेषण कार्यात्मक परख की मदद के साथ, हम गतिवान समस्याओं, या कमजोर neurodegeneration और इसलिए अपेक्षाकृत मामूली phenotype के साथ मॉडलों में की शुरुआत में पशुओं की चाल में सूक्ष्म परिवर्तन की पहचान कर सकते हैं । छोटे चाल विसंगतियों और गंभीर आंदोलन हानि शामिल है कि neurodegenerative रोगों के विभिन्न मॉडलों में phenotypes की विस्तृत श्रृंखला को देखते हुए, इस विधि अच्छी तरह से जानवरों की उम्र और स्थानांतरित करने के लिए क्षमता के आधार पर चाल मापदंडों का आकलन करने के लिए अनुकूल है. गंभीर रूप से बिगड़ा जानवरों एक विमान ट्रेडमिल पर एक कम गति से चलने दर्ज किया जा सकता है, जबकि कम बिगड़ा मॉडल एक उच्च गति से ऊपर की ओर या डाउनहिल चल दर्ज किया जा सकता है । यह neurodegenerative मॉडल और इसके littermate नियंत्रण के बीच जानवरों पर काबू किए बिना चाल मतभेदों को प्रकट कर सकते हैं ।

इस प्रोटोकॉल के साथ, हम चूहों में उंर बढ़ने के साथ मोटर हानि के विकास पर नजर रखने के लिए VPI विधि की पर्याप्तता का प्रदर्शन । उनकी उंर के अग्रिम के रूप में कई समय अंक में WT चूहों का परीक्षण हमें उंर निर्भर चाल विषमताओं की पहचान करने की अनुमति दी है और कैसे वे उंर बढ़ने के साथ प्रगति की विशेषता । इसके अलावा, जब neurodegeneration के लिए माउस मॉडल हैंडलिंग, एक मुद्दा है कि अक्सर प्रस्तुत करता है कि मोटर व्यवहार से संबंधित नहीं लक्षण के कारण (जैसे, चिंता, उदासीनता, सीखने में कठिनाइयों), पशु की इच्छा भी एक सरल प्रदर्शन करने के लिए मोटर कार्य ऐसे चल रहा है, कम है । यहां, हम विधि संशोधनों और प्रेरक उपकरण का सुझाव प्रबुद्ध मोटर चालित ट्रेडमिल कि मददगार हो सकता है पर चलने को प्रोत्साहित करने के लिए सफलतापूर्वक neurodegenerative परिवर्तन के साथ उंर बढ़ने माउस लाइनों को गाढ़ापन चाल विश्लेषण लागू होते हैं । इसके अलावा, हम जानवर के पंजे के लिए उंगली रंग लागू करने की एक सरल चाल का उपयोग करें और पता चलता है कि यह काफी दर्ज डेटा की गुणवत्ता में सुधार करने में मदद कर सकते हैं । अच्छा वीडियो रिकॉर्डिंग प्राप्त करने की चाल विश्लेषण के सबसे महत्वपूर्ण कदम है: विश्लेषण की सफलता पर निर्भर करता है, हर स्वचालित या अर्द्ध छवियों या वीडियो के स्वचालित विश्लेषण की तरह, कच्चे डेटा की गुणवत्ता पर । कम गुणवत्ता वाले वीडियो विश्लेषण में बाद में चरणों में सुधार नहीं किया जा सकता, और आमतौर पर विश्लेषण प्रक्रिया से बाहर रखा जाना चाहिए ।

जबकि व्यवस्थित चाल और 18 महीने की अवधि में दोनों WT और कई endophilin उत्परिवर्ती लाइनों के आसन का अध्ययन, हमने देखा है कि भी WT चूहों और कोई स्पष्ट गतिवान के साथ चूहों/चल रहे मुद्दों (यानी, endophilin 1KO-WT-WT), शो में परिवर्तन कई चाल और एक प्रगतिशील रास्ते में उंर को आगे बढ़ाने के साथ मुद्रा मापदंडों (2 चित्रा और 3 ए आंकड़ा) । दिलचस्प है, हम यह भी देखा है कि जब कई चाल और मुद्रा मापदंडों में विषमता उंर बढ़ने endophilin म्यूटेंट में मनाया एक ही दिशा और ढलान में WT/नियंत्रण जानवरों के रूप में विकसित, दूसरों (आंकड़ा 3) नहीं है । अंत में, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि भले ही वृद्ध WT चूहों और युवा endophilin म्यूटेंट किसी भी स्पष्ट गतिवान, चाल, और आसन दोष प्रदर्शित नहीं करते जब आँख से मनाया, चयनात्मक चाल और मुद्रा मापदंडों में परिवर्तन इस दृष्टिकोण के साथ पता लगाया जा सकता है.

माउस मोटर व्यवहार परीक्षण एक सबसे व्यापक तरीके से वर्णन है कि एक माउस मॉडल एक मानव हालत के प्रमुख पहलुओं प्रकट होता है में से एक है । एक परिणाम के रूप में, परीक्षण के एक नंबर मोटर व्यवहार के विभिंन पहलुओं का आकलन करने के लिए विकसित किया गया है । इन परीक्षणों में शामिल है ओपन फील्ड टेस्ट (जनरल हरकत गतिविधि), rotarod (मोटर समंवय, गतिभंग), पकड़ शक्ति (मांसपेशियों की ताकत), रनिंग व्हील (गतिविधि), हैंगिंग वायर टेस्ट (धीरज), सीढ़ी चलने की बीम टास्क (ठीक मोटर समन्वय, ज्ञानेंद्रिय कौशल), चाल विश्लेषण (गतिवान, अंग समंवय), और दूसरों (Wahlstein३६में संक्षेप) । विभिंन परीक्षणों विशिष्ट लाभ और नुकसान है और उनके पढ़ने के बहिष्कार आमतौर पर पहलू (या मोटर व्यवहार के पहलुओं) है कि वे पते के लिए डिजाइन किए गए थे तक सीमित हैं । कि कारण के लिए, यह सामांय अभ्यास के लिए मोटर व्यवहार परीक्षण की एक बैटरी प्रदर्शन के लिए इस क्षेत्र के मुख्य पहलुओं को कवर हो गया है ।

चाल विश्लेषण अक्सर इन बैटरियों में शामिल नहीं है, अल में Guillot द्वारा एक रिपोर्ट के कारण भाग में । ३७, कि चाल विश्लेषण पीडी और ALS के पशु मॉडलों में मोटर घाटे का पता नहीं लगा पाया है, और श्रमसाध्य विधि और सीमित उत्पादन के कारण भाग में । हालांकि, Guillot एट अल. रिपोर्ट अनुसंधान कि अध्ययन डिजाइन३८में कई सीमाओं पते द्वारा चुनौती दी गई है । neurodegeneration के साथ माउस मॉडल में चाल के विश्लेषण में इस विधि की उपयोगिता हाल के प्रकाशनों के एक नंबर द्वारा प्रदर्शन किया गया है10,11,12,३९,४० ,४१,४२,४३, भी हमारे काम13सहित ।

VPI रिकॉर्डिंग स्याही के साथ पंजे पेंटिंग और दे माउस४४कागज के एक सफेद चादर पर चलाने के पारंपरिक विधि पर कई फायदे के साथ आते हैं । सबसे स्पष्ट तथ्य यह है कि मोटर चालित ट्रेडमिल के साथ, पशु की गति चल नियंत्रित है, जो कई चाल मानकों1पर एक मजबूत प्रभाव है । इसके अलावा, कुछ चाल विषमताओं जब पशु एक मांग उच्च गति और/या एक इच्छा/गिरावट है, जो स्वैच्छिक चलाने में नहीं देखा जाएगा पर चलाता है तभी detectable हो जाते हैं । इसके अलावा, हाथ से विस्तृत विश्लेषण एक अर्द्ध स्वचालित, उच्च प्रवाह विश्लेषण की जगह है । कि कारण के लिए, प्रत्येक समूह में परीक्षण पशुओं की संख्या में वृद्धि की जा सकती है, जो बदले में परिवर्तनशीलता है कि पशुओं के रहने में अपरिहार्य है की वजह से प्रभाव कम हो जाती है । सारांश में, हम अनुशंसा करते है कि VPI चाल विश्लेषण के संशोधित संस्करण मानक मोटर परीक्षण बैटरी में शामिल करने के लिए neurodegeneration और/या उंर बढ़ने के कुतर मॉडलों में मोटर दोष के विश्लेषण पूरक ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

हम प्रजनन के साथ मदद के लिए ेनि पशु सुविधा पर पशु कार्यवाहियों धंयवाद, और डॉ नॅनो Raimundo पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी के लिए । आइएमएस जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG) से सहयोगात्मक अनुसंधान केंद्र SFB-८८९ (परियोजना A8) और SFB-११९० (परियोजना P02), और एमी Noether यंग अंवेषक पुरस्कार (1702/1) के माध्यम से अनुदान द्वारा समर्थित है । C.M.R. गौटिंगेन स्नातक स्कूल से तंत्रिका विज्ञान के लिए फैलोशिप द्वारा समर्थित है, भौतिकी, और आणविक GGNB () ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DigiGait Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware
non-transparent blanket or dark cloth cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress
balance e.g. Satorius balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g
red finger paint e.g. Kreul or Staedtler for increasing the contrast between paws and animal’s body
small paint brush soft brush to apply finger paint to the animal paws
diluted detergent for cleaning
disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol e.g. B.Braun for desinfection

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References

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Neurodegeneration के साथ चूहों में उम्र के आश्रित मोटर विकलांगता की चाल विश्लेषण
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Rostosky, C. M., Milosevic, I. Gait… More

Rostosky, C. M., Milosevic, I. Gait Analysis of Age-dependent Motor Impairments in Mice with Neurodegeneration. J. Vis. Exp. (136), e57752, doi:10.3791/57752 (2018).

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