I den här artikeln visar vi inrättandet av klonala kulturer av encelliga konjugera alger arter som samlats in från en naturlig plats.
Det är viktigt att etablera klonal kulturer av mikroalger för användning i studier av olika ämnen, såsom fysiologi, genetik, taxonomi och mikrobiologi. Det är således mycket viktigt att utveckla metoder för att fastställa klonal kulturer. I den här artikeln visar vi inrättandet av klonala kulturer av en konjugera alga. Vattenprover samlas in från fältet. Därefter isoleras celler med glas kapillär pipett, placeras i media, och odlas under förhållanden lämpliga för att generera en klonal kultur.
Konjugera alger (för Zygnematales), upptar även känd som conjugatophytes, en viktig fylogenetiska position som trastliknande av omedelbar förfäderna av mark växter1,2. Etablerade klonal kulturer av alger har lett till en mängd olika taxonomiska, fysiologiska och genetiska studier de senaste åren. Isolering teknikerna av mikroorganismer från naturligt har en lång tradition3,4. Under de senaste åren etablerat automatiserade isolering metoder med flödescytometri har också5. Den vanligaste metoden som används för att få en enda cell för inrättandet av en klonal kultur är encelliga isolering använder ett glas kapillär pipett6. Denna traditionella metod kräver skicklighet och en exakt experimentellt protokoll.
I den här artikeln visar vi provtagning av alger från fältprov och inrättandet av klonala kulturer av encelliga konjugera alger, såsom Closterium arten, med glas kapillär pipett. Vattenprov som innehåller vegetativa celler samlas in från en plats (t.ex., en sjö, damm eller risfält). Cellerna är isolerade från vatten provet genom att använda glas kapillär pipett och sedan tvättas. Cellerna odlas i ett provrör innehållande kväve-kompletteras medium (CA medium) vid 24 ° C under en 16-h ljus: 8-h mörka regim. Denna metod passar även isolera andra mikroalger för att generera klonal kulturer.
Med nuvarande metod, var 9 klonal kultur stammar av Closterium sp. etablerat från 15 celler isolerade från vatten provet (Inba1), som representerar en 60% framgång. Artbestämning kommer att utföras i framtiden av morfologiska observation samt DNA-analyser, såsom molekylär fylogenetisk analys8.
I denna metod är friskhet av vatten provet viktigt att framgång. Det är bättre att isolera cellerna från vattenprover så snart som möjligt efter fältuppsättningen. Även om cellerna av Closterium arter (t.ex., C. ehrenbergii, C. peracerosum-strigosum-littorale komplexa) kan bibehållas i vatten provet för ca 7 d genom att förvara det på 4-8 ° C, är isolering av cellerna önskvärt dag samlingen eller nästa dag. Det är också viktigt att ta bort eventuella föroreningar än målceller, så ökar antalet tvätt repetitioner (dvs, > 3 x) kan hindra en förorening av kulturer av mikroorganismer i marken och celler.
En begränsning av denna teknik är att det odlingssubstrat som används i detta protokoll (CA eller luftkonditionering CA medium) inte är alltid lämpliga för alla konjugera alger. I vissa fall kan det vara nödvändigt att överväga att använda ett annat medium, samt olika ljus och temperatur. Också, eftersom det är svårt att bevisa om en kultur har vuxit från en enda cell, det är nödvändigt att noggrant plocka upp endast 1 cell när du överför celler till ett provrör. Därför ska överföring göras med nya glas kapillär pipett varje gång.
Upprätta en klonal kultur med denna pipett tvätt metod är en klassisk/standard metod och är den mest tillförlitliga metoden att använda för att isolera de önskade cellerna för en studie. Klonal kulturer konjugera alger används i många studier8,9,10,11 fastställdes med hjälp av denna metod. Det är svårt att analysera konjugera alger utan en klonal kultur. Dessutom under de senaste åren, de novo hela genomet sekvenser blev lätt att få (t.ex., med hjälp av MinION nanopore sequencer) och om inrättande av klonala kulturer kommer att ytterligare underlätta de novo sekvensering. Med andra ord, är denna metod det första steget i framtiden studie av dessa alger att bättre förstå deras biologiska mångfald.
För att fastställa en stabil kultur stam, är det nödvändigt att utföra vissa kritiska steg exakt inom protokollet. Det viktigaste steget är utarbetandet av glas kapillär pipett med en optimal bländare att tillåta passage av en enda cell endast. Bländaren på glas kapillär pipetten måste vara något mer än lillaxeln längden på cellen av intresse. Optimal glas kapillär pipetten kan aspirera en enda cell av kapillärkraften. Dock om diametern på bländaren är för stor, kommer kapillären också dra i icke-levande främmande material eller ens (en) andra organismer, förutom målcellen.
För att få ett glas kapillär pipett med en optimal bländare, är följande punkter viktiga att notera. Först, pelaren i lågan måste vara smala när uppvärmning glas kapillär pipetten. Nästa, när du drar den Pasteur-pipetten, det måste tas bort från lågan; annars kommer att bländaren på Pasteur pipetten kollapsa.
Den utrustning och de behållare som visas i detta protokoll är grundläggande och kan ändras. Exempelvis genom att använda plattor med flera istället för watch glasögon med en brunn, kan cell tvätt göras effektivare. Dessutom kan andra liknande de ersätta behållarna. Genom att överföra en enda cell till odlingsmediet på det sista steget, kan en klonal kultur fastställas.
Förbereda en steriliserad behållare och arbetar i en huva upprättar axenic (oförorenad) stammar. För att förhindra förorening, är det nödvändigt att upprepa steget tvätt med färska portioner mer än 3 x. Ibland kan steriliseras bakterier också genom att lägga till antibiotika15.
Denna metod fokuserar på desmid (Zygnematales) isolering, men genom att ändra storleken på glas kapillär pipett bländare, det kan användas till isolering av olika stora plankton.
Vi tackar Hisayoshi Nozaki (University of Tokyo), Takashi Nakada (Keio University), Yuka Marukawa Hashimoto (Japan kvinnors universitet) och Hiroyuki Sekimoto (Japan kvinnors University). Vi vill tacka granskarna för deras kommentarer. Här studien har finansierats genom ett bidrag till vetenskaplig forskning (nr 26440223 och 15H 04413) från Japan Society för främjande av vetenskap, Japan, och genom ett anslag från Stiftelsen för utveckling av ny teknik att Yuki Tsuchikane.
Sampling | |||
Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
Preparation of a micropipette | |||
Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
Single-cell isolation | |||
Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |