Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג דגימות RNA גבוהה-שלמות של הגרעינים המעית מבודד מבולבל, resected טריים מעיים רקמה אנושית באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). פרוטוקול זה כולל הכנת קפואה דגימות של רקמות אנושיות מעיים, cryosectioning, ethanolic מכתים, התייבשות, הפונקציה LCM, והפקת RNA.
Abstract
מטרת שיטה זו היא להשיג דגימות RNA גבוהה-שלמות של הגרעינים המעית שנאסף מבולבל, resected טריים מעיים רקמה אנושית באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). זיהינו חמישה שלבים בזרימת העבודה כי הם חיוניים להשגת RNA מבודד מן הגרעינים המעית עם כמות ואיכות גבוהה מספיק בשביל RNA-תת סעיף. ראשית, בעת הכנת רקמת המעי, כל מדגם חייב להיות כל נוזל עודף הוסר על-ידי סופג לפני שיטוח serosa ככל האפשר לרוחב החלק התחתון של תבניות הבסיס גדול. דוגמאות ואז מוקפאים במהירות על גבי slurry של קרח יבש ו- 2-methylbutane. שנית, בעת חלוקתה הרקמה, חשוב למקם cryomolds כך מעיים מקטעים מקבילים המטוס מלא של מקלעת myenteric, ובכך מניב את פני השטח הגדול ביותר של הגרעינים המעית לכל שקופית. שלישית, במהלך LCM, napthalate פוליאתילן (עט)-ממברנה שקופיות מציעים את המהירות ואת גמישות חלוקה לרמות את הצורות לא אחידה של הגרעינים המעית בעת איסוף הגרעינים המעית הגדול ביותר. רביעית, להמחשת ברורים של הגרעינים המעית בתוך המקטעים, צבעים התואמים לאתנול, כמו Cresyl, ויולט, מציעים מעולה לשימור RNA תקינות ביחס צבעי מימית. בסופו של דבר, על החילוץ של RNA מן הגרעינים בשבי, נצפו הבדלים בין מסחרי ערכות חילוץ RNA הניב סופריור RNA כמות ואיכות, תוך צמצום זיהום ה-DNA. אופטימיזציה של גורמים אלה בפרוטוקול הנוכחי מאיץ את זרימת העבודה במידה רבה ותשואות הגרעינים המעית דגימות עם איכות יוצאת דופן של RNA וכמות.
Introduction
שיטה זו נועדה להשיג דגימות RNA באיכות גבוהה של הגרעינים המעית של רקמה אנושית מעיים באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). הפרוטוקול המתואר כאן מוטבה כדי לספק מספיק תשואות ואיכות RNA RNA רצף (RNA-seq) והוא נועד לשמש עם רקמת המעי האנושי resected טריים, מבולבל, קפואה.
הפרעות תנועתיות מערכת העיכול, במעיים פונקציונלי להשפיע על אחד של כל ארבעה אנשים בארצות הברית. מערכת העצבים המעית (ENS), המכונה גם השני המוח1, לעתים קרובות במרכז בהפרעות אלה, כפי שהיא משחקת תפקיד מכריע בטן הומאוסטזיס, תנועתיות. מניפולציה של תנועתיות המעיים הוגבלה כלל כריתה כירורגית לרקמות aganglionic/noncontractile, שינוי תזונה כרונית ו/או תרופות. באופן מפתיע, transcriptome המלא של התרנגולות למבוגרים נשאר היה לסדרם, במידה רבה הגבלת היכולת שלנו לזהות מולקולות בתוך התרנגולות ניתן לפלח הם או מנוצל טיפולים תאי גזע.
ישנן שיטות מעטים יחסית לבידוד RNA מן הגרעינים המעית אנושי. הגישה הראשונה, דיסוציאציה תא2, דורש טמפרטורות גבוהות דגירה דגירה ארוך פעמים; שניהם אשר ידועים לקדם השפלה RNA ולשנות את2,transcriptome3. גישה חלופית, הפונקציה LCM, יותר אמין משמר את transcriptome ומגן RNA שלמות. אף על פי מספר מחקרים השתמשו LCM כדי לאסוף את הגרעינים מוקפאות רקמת המעי האנושי4,5,6, גישות אלה היו גם הקשו על ידי RNA איכות וכמות המסכן, היו די עתירי עבודה, או צריך שינוי של להכתים או RNA מיצוי טכניקות לעבודה בידיים שלנו. LCM פרוטוקולים אחרים המיועדים לשימור RNA שנמצאו במוצר LCM מדריכים מספק שיפורים נוספים7,8, אבל הסתגלות שהיה נחוץ כאשר חל על הבידוד של הגרעינים המעית8, 9. מסיבות אלו, פיתחנו פרוטוקול ממוטבת בהתבסס על משאבים אלה מניב כמויות ניכרות של RNA גבוהה-שלמות מן הגרעינים המעית האנושי, יש זרימת עבודה מהיר יחסית, ולא מייצר תוצאות עקביות לרוחב גדול מספר דוגמאות.
במחקר זה, אנו מציגים תקציר של תהליכי אופטימיזציה המאפשרים את הבידוד של RNA גבוהה-שלמות מן הגרעינים המעית הטרייה resected. מרקמות מעיים. השיטה שלנו משלבת חמישה היבטים חשובים. הראשון, resected טריים, מבולבל דגימות מעיים אנושיים צריך חיתוך לפי מידה, יש לחות עודפת כל מוסרים עם טישו מעבדה, משוטחים על תבנית הבסיס גדול לפני פלאש-ההקפאה על גבי slurry של קרח יבש ו- 2-methylbutane (2 MB). שנית, היסטולוגית מקטעים של המעי צריכים להיות מוכנים לקבל את המטוס מלא של מקלעת myenteric בשקופית, אשר מציעה מטען רב של הגרעינים המעית. ההצלחה עם שלב זה היא תלויה במידה רבה על תהליך הכנת הרקמה. שלישית, המבנה לא אחידה של גרעיני ב התרנגולות מחייב שימוש פוליאתילן napthalate (עט) ממברנה שקופיות6, אשר מציעים את מהירות ודיוק הגדול ביותר במהלך תהליך LCM. צבעי הרביעי, אתנול תואמת, כגון Cresyl, ויולט, אמור לשמש כדי לשמר את שלמות RNA בזמן צביעת המעית הגרעינים. . האחרון, תהליך החילוץ RNA הוא קריטי עבור תוצאות מוצלחות עם ה-RNA-תת סעיף. חיפשנו גישה החילוץ RNA אשר מייצרת שלמות RNA גבוה, הגדלת התשואות RNA כאשר החל אוספים קטנים של הגרעינים המעית, מבטלת את ה-DNA זיהום ו שומר על מינים RNA רבים ככל האפשר.
יחדיו, אופטימיזציה של גורמים אלה במחקר הנוכחי במידה רבה מאיץ את זרימת העבודה ותשואות דגימות של הגרעינים המעית עם דופן RNA בכמות ובאיכות. התוצאות היו עקביות במידה רבה בקרב קבוצה גדול למדי של דגימות, המציין את העקביות של גישה זו. יתר על כן, השתמשנו גישות אלה כדי בהצלחה רצף של RNA דגימות מן הגרעינים המעית עשרות. האסטרטגיות מודגש כאן ניתן גם בהרחבה להתאים לביצוע LCM של הגרעינים הרצוי או גרעינים של ההיקפית ואת מערכת העצבים המרכזית במקרים אחרים הדורשים את הבידוד של RNA באיכות גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים המתוארים כאן אושרו על ידי ואנדרבילט אוניברסיטת מוסדיים סקירה לוח (IRB).
1. הכנה לפני ההגעה רקמות
- לקבל אישור IRB נאות ולתאם עם סוכנויות תרומת איבר אנושי כדי לקבל את רקמות מעיים resected טריים, מבולבל מתורמים אשר עונות על הקריטריונים מחקר כל הנדרש לצורך המחקר.
הערה: פרוטוקול זה ניתן להתאים לשימוש עם מודלים אחרים מכרסמים ועכברים.- מיד לאחר כריתה של כל אחד מהמקטעים מעיים, ביסודיות לשטוף לומן עם PBS צונן או באמצעי אחסון רקמות כדי להסיר שאריות חומר luminal או צואה.
- לאחר שטיפה, השלכת פסולת קיבול הביולוגי המתאים, להטביע את רקמות נפח מספיק של רקמת אחסון בינוני (כמו 3 - 5 פעמים נפח רקמת המעי) ולאחסן שכותרתו בנפרד, מים חזק מפלסטיק מכולות, שקוע בתוך קרח או בקירור עד לשימוש).
- תהליך הרקמה בתוך 18-26 שעות מרגע אוסף כדי למנוע השפלה RNA משמעותי.
הערה: בהתאם הניקיון של קטע המעי, אחסון, זה ייתכן שניתן להרחיב את מגבלת הזמן המוצע שלנו.
- להכין את כל החומרים הדרושים עבור אוסף רקמה אנושית מראש, כמצוין בפרוטוקול הזה (עיין טבלה של חומרים למידע מפורט יותר מוצר). ודא כי כל נדרש ציוד מגן אישי שחוקה בכל עת.
- להכין דליים קרח יבש יחד עם slurry קרח יבש כפי שמוצג באיור1.
- לרסק קרח יבש מספיק כדי למלא 4 דליים קרח רגיל מעגלית ודלי קרח מלבני אחד. לאחד הדליים רגילים צריך להיות קטן (11 x 21 ס מ) מעבדה רקמות להציב בפני השטח של קרח יבש. במידת האפשר, השתמש בתיבות חדש, נפתחה מעבדה רקמות.
- הפוך של slurry קרח יבש על ידי powderizing 2 ל' של קרח יבש בתוך דלי קרח נקי מלבני.
- להוסיף 2 MB טרום מקורר על פני השטח של קרח יבש. מעט לערבב ולשטח את slurry באמצעות פיפטה עצה תיבת כיסוי פני הצורה slurry לתוך ערוץ מוקף גדול יותר חתיכות קרח יבש לאורך צידי מלבני הדלי.
- מקום מספר גושי קרח יבש לאורך קצות דלי קרח דק כדי לעודד הקפאה מהירה יותר. צריך להיות מקום ≥4 בתבניות הבסיס כדי מתאימים ברפיון בדלי slurry קרח יבש בזמן נתון.
- באופן אופציונלי, מחסנית דלי קרח בתוך עוד דלי קרח מלבני מלא ¼ בקרח יבש. המיקום הזה עוזר כדאי לבודד את slurry קרח יבש ומונע את הצורך שינויים תכופים של קרח יבש ו 2 MB במהלך ההליך.
- מקם את דליים קרח יבש ב פס לפי הסדר הבא: 1) קרח יבש slurry דלי, דלי קרח 2) מעבדה רקמות-יבש, 3 & 4) נורמלי דליים קרח יבש, דלי קרח יבש 5) מלבני (איור 1א').
2. הכנת קפואה רקמות מעיים אנושיים
הערה: כל התהליך הזה יכול לקחת בין 45-80 דקות קטע המעי, בהתאם לאיכות רקמת המעי. אנו ממליצים גם איסוף דגימות בקרת איכות כדי להעריך את איכות ה-RNA, היסטולוגיה לפני שתמשיך עם הפונקציה LCM.
- למלא מגש גדול עם קרח רטוב ולמקם קרשי חיתוך כירורגי על גבי הקרח היבש.
- בהגדרת הזה, מקררים בקבוקונים 500-mL ו- 100-mL לאחסון את רקמת ואת מקטעי החתוך בפתרון אחסון הקרה. בסיס צונן מראש תבניות על לוחות חיתוך כך שתהיה מוכן לקבל רקמות.
- עם קבלת רקמת המעי טריים, יוצקים את התקשורת שבו מועבר הרקמה, לשמור אותו בבקבוקונים טרום מקורר. להשאיר קצת מקום אלה ספלים לאחסון זמני של רקמת המעי, מקטעי החתוך, שיוכן בצעדים העוקבים.
- לחתוך באורך של 20 ס מ, אשר מספק בשפע רקמות (40-60 ס מ2) ליצירת RNA ליישומים במורד הזרם ודוגמאות בקרת איכות על קטע המעי. בהתאם שלמות רקמות, זה עשוי להיות ריאלי להשיג בידוד RNA לעיבוד הזרם באורך קטן בהרבה (קרי, 5 ס מ של המעי).
- לקצץ משם שומן ורקמות של המעי באמצעות מספריים כירורגיים. ממסר אדיפוז לאורך serosa המעי פוגעת ביכולת לשטח מלא רקמות בצעדים העוקבים. בזהירות לקצץ את הרקמה כדי להימנע חותך serosa במהלך ההסרה של שומן, רקמת חיבור, אשר יכול לגרום נזק של מקלעת myenteric מבנית או להפוך את החלק החיצוני של הרקמה לשטח לצר על חלוקתה.
- עושים חתך אורכי לאורך כל המדגם מעיים, רצוי באתר של מצע המעי העליון מצורף.
- לנתח משם ולמחוק את החיידק אצלה מן המעי הגס, כך זה משטחת בקלות רבה יותר, לאחר ששוחרר ממתח.
- לפעור את הצד רירית המעי למטה על גבי קרש חיתוך צוננת וחותכים רצועות 1.25 ברוחב ס מ מ באורך מלא של הרקמה.
הערה: רקמת המעי לעיתים קרובות מרחיב לאחר חיתוך, אז צריך להיות מותאם לגודל זה בהתאם. - לאחסן זמנית את הרצועות בפתרון אחסון רקמות צוננת.
הערה: אנו משתמשים פתרון אחסון הקרה UW קאהן כי יש חיי מדף ארוכים, היא חסכונית יחסית, והוא ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר עד שהוא נדרש. - להסיר רצועת רקמה פתרון אחסון הקרה, לחתוך אותו ל מקטעים ~1.5-2 ס מ באורך.
- כתם במהירות את מקטעי מעיים על ערימה של מגבונים מעבדה, כדי להסיר עודפי נוזלים ולמנוע היווצרות גבישי קרח לאורך serosa מעיים במהלך פלאש-הקפאה. אם הרקמה לא התייבש מספיק, זה יהיה קשה להשיג חלקים באיכות גבוהה מ מקלעת myenteric.
- שכבה רירית-הצד מחק חתיכות מעיים על גבי טרום מקורר, גדול חד פעמיות הבסיס כייר פלסטיק (37 מ מ x 24 מ מ x 5 מ מ).
- בזהירות לשטח כל קטע על ידי בקלילות מתיחה הרקמה על פני התבנית בסיס באמצעות מלקחיים מעוקלים כדי לחץ כלפי מטה בעדינות ולהוציא בועות אוויר זה יכולה להיות. לכודה מתחת serosa. שימו לב כי הרקמה מתרחב בזמן שיטוח. אם יש צורך, לקצץ את מקטעי וחותכים את הדגימות הנותרים על גודל קטן יותר.
הערה: אם הרקמה הוא נמתח יותר מדי, זה יעוות את מקלעת myenteric. לאחר כל בועות האוויר יוסרו, להעריך את העובי של המדגם להקפאה. אם יש צורך, דחוף את הקצוות של פנימה הדגימה עד המדגם מעיים מתקרב העובי המקורי. - מניחים את התבנית בסיס שנטען על פני הקרח היבש, 2 MB slurry. הרקמה צריך להקפיא לחלוטין בתוך 30-60 s, תלוי בגודל עובי מקטע המעי.
- יבש בתחתית התבנית הבסיסית כדי להסיר שאריות 2 MB על ידי שפשוף במהירות את בסיס התבנית על הרקמות מעבדה טרום מקורר בדלי השני של קרח יבש.
- להעביר את הדגימה מיובשים לאמבטיה השלישי של קרח יבש ולקבור אותה מתחת לפני השטח של קרח יבש עד שהוא מוכן להיות עטוף.
- במהירות להתבונן לתחתית התבנית הבסיסית לפני גלישה, כדי לבחון את איכות הכנת הדוגמא. רשום דוגמיות לא שטוח, או בועות אוויר גדולים, כמו אלה יש להימנע cryosectioning, הפונקציה LCM.
- לעטוף את הדגימה בנייר אלומיניום שכותרתו מראש זה מונח על גבי קרח יבש בדלי כך עטיפה של רקמות מתרחשת בזמן שאני. נשאר קפוא לגמרי.
- לעטוף את הדגימה עם שכבה של ניילון נצמד, כדי למזער את רקמת להתייבשות במהלך האחסון ב- 80 ° c
- חנות דגימות בדלי מלבני עד שהם יהיו מוכנים להעביר למקפיא.
- מראש תווית ולהירגע מראש מקפיא תיבות ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון מיידי של דגימות אחרי אוסף.
- לקחת חלק קטן של רקמה מתוך כל קטע המעי עבור הערכה של RNA תקינות לפני ביצוע הפונקציה LCM.
- תווית מראש צינור ללא RNase 2-mL עבור כל קטע, מלא ≥500 µL פירוק המאגר. אנו ממליצים להשתמש ערכת חילוץ RNA "D", המופיעים בטבלה של חומרים.
- Homogenize חתיכה קטנה (2 מ מ x 2 מ"מ) של המעי אצל מהמגן מיקרו רקמות סטנדרטי (20-40 s, עד להישאר אין חתיכות רקמה). לאחר מכן, מיד להקפיא את הרנ א lysate על קרח יבש, החנות ב-80 מעלות צלזיוס עד שתמשיך עם החילוץ-RNA.
- באופן אופציונלי, להטביע חלק מהסעיפים במדיום הקפאת רקמת (TFM) בתור גיבוי. הכנת הרקמה סעיפים בדיוק באותו אופן המתואר בסעיף זה, אך להטביע דוגמאות TFM בתוך כייר הבסיס להקפאה-פלאש.
3. Cryosectioning
- לפני cryosectioning, להכין את כל החומרים הדרושים עבור צביעת והתייבשות, להעביר את דגימות רקמה הרצוי מהמקפיא-80 ° C לתוך דלי קרח יבש.
- להכין את cryostat לשימוש על-ידי קביעת הטמפרטורה האופטימלית חיתוך (-18 ל-22 מעלות צלזיוס), ניגוב למטה משטחים עם 100% אתנול, בטיפול הלהב ולצחצח מגש עם פתרון טיהור RNase.
- לדבוק בצורה הטובה ביותר את הדוגמית להוכיח הצ'אק, השתמש הגישה הבאים.
- למקם את המלקחיים קרח יבש במשך לפחות 30 s לפני הסרת העטיפה את דגימת מעיים והנחתי אותה על פני השטח של קרח יבש serosa-הצד-הלמעלה.
- למזוג גבעה 3-5 מ מ של רקמות מקפיא בינוני (TFM) אל בעל הדגימה cryostat גדול ולהעביר מיד את דגימת מעיים serosa-הצד-up על גבי TFM.
- במהירות העברה בעל הדגימה קרח יבש ולכסות עם קרח יבש powderized לאחר המאפשר את TFM לדבוק המדגם עבור 2-5 s בטמפרטורת החדר. להבטיח TFM יישאר מתחת למישור מקלעת myenteric.
הערה: באופן אידיאלי, המשטח החיצוני של רירית המעי מלא דוגלים TFM לפני TFM מתחיל לקפוא ללא הפשרתו של המדגם.
- הר בעל הדגימה לראש הדגימה של cryostat ויישר את הדגימה עם הלהב cryostat, כך המטוס של מקלעת myenteric יהיה מקביל להב חיתוך.
- להגדיר את עובי אופטים cryostat 8 מיקרומטר. המטרה של יישור באופן מושלם את הדגימה הוא לקבל הגדול ביותר האפשרי שטח הפנים של מקלעת myenteric בכל שקופית. עובי זה מומלץ בדרך כלל על הרקמה האנושית והן מכרסמים, אך ניתן להתאים, לפי הצורך.
- חתך דרך serosa שרירים אורכיים עד שהגיע על מקלעת myenteric.
- כדי לאתר את מקלעת myenteric, הר קטע לדוגמה לשקופית, מכתים את המקטע עם צבע מימית, כגון 1% Cresyl סגול או כחול טולדין, וכו '.
- עיין בסעיף תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה 40-2000 X לזיהוי צומת בין שכבות שריר אורכי, מעגלית. פרמטרים במיקרוסקופ הינם מסופקים בכל טבלה של חומרים. בתחילת חלוקתה, serosa יסומן על ידי הנוכחות של רקמת חיבור. קצת שומן מצע המעי העליון הנותרים עשוי גם להיות נוכח לאורך serosa. גיליון של השכבה החיצונית שרירים אורכיים ואז מתחיל. פעם הגיע לגבול בין שכבות שריר אורכי, עגול, חלק הגרעינים המעית יתקיימו.
הערה: בסעיפים מספר הבא, מקלעת myenteric יהיה גלוי לעין, עם רצועות גדולות של הגרעינים להיות נוכח בתוך מקטע יחיד (איור 2C). אם הרקמה אינה שטוחה לחלוטין בתחילת חלוקתה, אז רק על חלק הגרעינים יהיה נוכח בכל מקטע בזמן נתון. לפעמים, ייתכן המדגם מעיים של מקלעת myenteric מטבעו לא אחידה, למרות הרקמה המופיעים שטוח לחלוטין. הדבר נכון במיוחד עבור דגימות התריסריון. מניסיוננו, הדוגמיות הללו יכול לקחת עוד זמן כדי לעבד עם הפונקציה LCM, אך ניתן לאסוף מספיק RNA הפעלה של יום אחד. המיקום המדויק של מקלעת myenteric יכול להשתנות במידה ניכרת בין דגימות, בהתבסס על הרקמה והכנות שלה להקפאה.
- בגין איסוף מקטעים טורי עבור הפונקציה LCM, עם אוספים אופטימלית לספק את המספר הגדול ביותר של נוירונים, עכשיו, דונלד לכל שקופית. בהתאם פני השטח של המדגם, ניתן לשלב מספר מקטעים לשקופית עט-ממברנה בודדת.
- הר הסעיפים על העט ממברנה שקופיות, מקורר בקצרה ב cryostat עבור s 5-10. כאשר הרכבה, הרקמה צריך להמיס רק במעט, מקסימאלית שמירה על תקינות RNA.
4. מכתים
הערה: לקבלת סקירה של תהליך צביעת, עיין טבלה 1. כל הפתרונות המשמש אך ורק סטנדרט 50-mL בקבוקונים חרוט. לטיפול החיצוני של הצינורות עם פתרון טיהור RNase אינו מופיע כדי לשפר תוצאות (נתונים לא מוצג).
- הכן תמיסה רוויה של ויולט Cresyl 4% אתנול 95% לפחות יום אחד מראש, באופן מלא מחדש להשעות את הננס Cresyl לפני טעינת את המזרק.
הערה: ריכוז האתנול ייתכן שיהיה עליך להיות הנמיך עבור צביעת יעילה, כפי שמתואר במקטע דיון. לא בדקנו אם באמצעות אתנול 50% או 75% במהלך צביעת משמעותית מפחית את תקינות ה-RNA. ויולט cresyl וכך צריך להיות מוגן מפני אור הינם רגישים לאור. - לאחר הרכבה מקטעים של מקלעת myenteric אותן לשקופית, מיד להטביע השקופית בקבוקון חרוט של 95% אתנול (טרום מקורר ב-20 ° C) במשך 30 s.
- אם הסעיפים תואם באופן מלא אל השקופית בשלב הקודם, מעט חמים התחתון של השקופית עם בכפפה יד (מחיקה מעבדה צריך להיות ממוקם באמצע השקופית, כפפות), ב"זכות מלאה לפני השוקע 95% אתנול. פתרון זה יכול להיות שימוש חוזר עבור שקופיות לפחות 3-6 מבלי להפחית את תקינות ה-RNA.
- הנח את הפנים שקופיות על מחיקה מעבדה להציב על גבי מיכל קדם טיפול, ללא RNase8.
- מראש ממלאים מזרק 3-mL עם 4% Cresyl ויולט וצרף מסנן מזרק 0.2-מיקרומטר.
הערה: אנו ממליצים מסננים אצטט תאית. - להחיל 6-10 טיפות של כתם ישירות על גבי רקמות סעיפים8 , דגירה s 10-30, או עד מספיק צבע נשמר כאשר בטל צבעונית. בעת צביעת, סובב בעדינות את המיכל שקופיות ידנית על מנת להבטיח כי הסעיפים הרקמה הם מצופים אחיד הכתם.
- יוצקים את הכתם, מיד מבטל את כתם השקופית בקבוקון של 75% אתנול. להטביע את השקופית שוב ושוב עד לצבוע עודף יש שרידים בעיקר מתוך המדגם. זה עשוי לקחת בין 10-20 s.
- גיבוש סופי של דה-צביעת בטבילת שוב ושוב את הדגימה בבקבוקון של אתנול 95% עבור Submerge ס' 10 המדגם שוב ושוב עד כל עודף הכתם הוסר.
- שינוי משך destaining, לפי הצורך, כדי לייעל את ההכתמה של הגרעינים. אם יותר מדי הכתם יוסר, המדגם הופכת שקופה מדי, זה עשוי להיות קשה לדמיין
הערה: פרוטוקול זה מכתימים מוטבה בהתבסס על מספר פרסומים5,8,10,11 אשר נדרש שינוי לפני התקבלו תוצאות משביעות רצון. לכן, הריכוז של אתנול המשמש לצבוע, במהלך תהליך destaining צריך להיות שונה, בעת הצורך להשיג תוצאה מיטבית.
- שינוי משך destaining, לפי הצורך, כדי לייעל את ההכתמה של הגרעינים. אם יותר מדי הכתם יוסר, המדגם הופכת שקופה מדי, זה עשוי להיות קשה לדמיין
5. התייבשות
- מיד לטבול את השקופית אתנול 100% 2 - 3 פעמים, עבור סכום כולל של 10-20 ש'.
- להטביע את השקופית אתנול 100% נטול מים לפחות ב-30 s. כמו אתנול נטול מים מאוד היגרוסקופי, להוסיף מולקולרית הנפות (8-12 mesh) בקבוקון 100% אתנול לפני תחילת ההליך כדי להסיר מים נספג ובכך לחלוטין. יותר מייבשים את מדגם5.
- שוב ושוב טובלים השקופית קסילן עבור s 15-20. שלב זה מסיר לחלוטין את השכבה של אתנול בשקופית. להוסיף הנפות מולקולרית מבעוד מועד הצינורות של קסילן, כדי מלא לספוח עודפי אתנול ומים מולקולות5.
התראה: Xylenes מסווגים מכשלה בעיניים ודרכי הנשימה העליונות, אמור לשמש בשכונה fume כימי. - להטביע את השקופית של קסילן (עם הנפות מולקולרית, רשת 8-12) לפחות 10 דקות.
הערה: ניתן לקחת הפסקה קצרה לאחר שלב זה, במידת הצורך. דוגמאות ניתן להשאיר קסילן במשך 4-5 שעות ללא השפעות מזיקות כדי להכתים, הפונקציה LCM או RNA תשואה/תקינות. - באופן אופציונלי, בנפרד להכין כמה שקופיות נוספים בשלב זה. אם מכינים בסיבוב השני של השקופיות לאחר השלמת LCM על כל השקופיות מוכן, הרקמה ב cryostat ייתכן שתצטרך להיות refaced, עקב התייבשות של המשטח רקמות. עד ארבעה מקטעים ייתכן שתצטרך להיות מושלך לפני ניתן לאסוף במקטעים שמיש.
6. לייזר לכידת Microdissection (LCM)
- הסר את השקופית של קסילן, מילה נהדרת זה בשכונה fume כימיים לפחות 1 מינימלית הכנס מחסנית משתי אותיות הפונקציה LCM לשלב מיקרוסקופ LCM. טעינת השקופית לבמה ולרכוש תמונה סקירה של השקופית.
- לזהות את המיקום הרצוי עבור הפונקציה LCM וטען כובע אותן לשקופית.
- יישור הלייזר האינפרא-אדום (IR) ולהתאים את כוחה ואת משך כדי להפוך בקוטר 20-30 מיקרומטר ללכוד נקודה.
- אתר הלייזר אולטרה סגול (UV) והגדר של חיתוך המתאים מהירות ועוצמה.
- חלוקה לרמות את הגרעינים הרצוי להיאסף באמצעות התוכנה LCM, מקפיד להישאר בגבולות האזור לאספנים על המכסה (מתואר סקירה שקופיות של התוכנה כמו עיגול ירוק).
- בכל אחד של העקבות, להתאים את הנקודות IR כזה יש לפחות אחד IR לזהות כל מיקרומטר 100-500.
- לחץ על לחצן גזור IR/UV להמשיך עם האוסף של כל הגרעינים מסומן.
- לאחר השלמת אוספים, או להעביר את הכובע למיקום חדש, חזור על התהליך אוסף או לבחון את הכובע LCM בתחנה QC ברגע הכיפה מספיק מלא עם גרעיני (או עד המועד המומלץ של 60-80 דקות).
- אם פסולת קיימות על המכסה, נגב את זה משם תוך שימוש במכחול שקצהו פיין יש כבר טרום טיפול עם פתרון טיהור RNase, לשטוף עם מים ללא נוקלאז ולאחר יבשים לגמרי.
- בזהירות לבחון את הכובע על ידי העין או עם הגדלה במיקרוסקופ שדה בהיר כדי להבטיח כל פסולת הוסר. אם לא ניתן להסיר את הלכלוך על-ידי שימוש במכחול שטופלו מראש, השתמש טיפ פיפטה בסדר (חינם RNase) כדי לגרד משם את ההריסות.
- אבטח את הכובע על גבי צינור microfuge 0.5 mL מלא µL 230 מאגר פירוק RNA (מאגר RLT מ- RNA ערכת חילוץ "B", עם β-mercaptoethanol הוסיף-ריכוז של µL 10/mL).
- הפוך את הכובע, בקצרה מערבולת, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה אצל ≥ 5,000 x g במשך 5 דקות, ואז העברת microfuge צינור לקרח יבש.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. RNA lysates ניתן לאחסן ב- 80 ° C ללא השפעה משמעותית על השפלה RNA לפחות שבוע אחד. אם RNA בידוד מתבצעת באותו היום, ואז מקררים את הדוגמאות על הקרח עד הם מוכנים לחילוץ. - לבצע כל אוספים נוספים בתוך מגבלת הזמן המקסימלי המומלץ של 80-90 דקות לאחר הסרת השקופית קסילן. כל הסעיפים מיובש נחשפים בלחות, RNases יכול בהדרגה הופכים מחדש. הגבלת התקופה באוסף ניתן למזער תופעות כאלה, מקסימאלית לשמור RNA שלמות.
7. RNA בידוד
- היכונו של תחנת עבודה ללא RNase RNA עקירות.
- היכונו ערכת חילוץ RNA כל צינורות, ריאגנטים לפי ספר ההוראות.
הערה: אמנם יש הרבה ערכות זמינים עבור בידוד RNA בעקבות LCM, היו לנו הטוב ביותר הצלחה באמצעות ערכת חילוץ RNA "B", מופיע ברשימת החומרים. ראה איור 5 השוואה side-by-side של ריאגנטים מיצוי ה-RNA. - להסיר דגימות מהמקפיא-80 ° C, להפשיר במהירות בתוך אמבט מים 37 º C.
- מיד מערבולת הקרת דגימות עבור 2-3 s לפיזור אחיד המלחים thiocyanate guanidinium.
- לשלב כל דגימה עם אמצעי אחסון שווים 70% אתנול. בריכת lysates 2 או יותר יחד, במידת הצורך להגיע ריכוז ה-RNA מספיקות.
- המשך לפי הוראות היצרן במדריך עבור תהליך החילוץ RNA, באמצעות פרוטוקול אופטימיזציה עבור דגימות microdissected.
- Elute RNA בשלב הסופי לתוך המינימלי המומלץ נפח המים ללא נוקלאז (14 µL).
- בעקבות בידוד ה-RNA, aliquot µL 1-2 של RNA של כל מדגם חדש מראש בתווית RNase ללא צינור לבקרת איכות הערכה/איכות עם מכשיר מיקרופלואידיקה שיכולים להמחיש כמויות קטנות של RNA, כגון Bioanalyzer. Aliquot µL 1 נוספים לתוך צינור נפרד על כימות עם ערכת כימות של RNA רגישות גבוהה.
- להתאים את השלבים הבאים, בהתאם לצורך, כדי להשיג כמות מספקת של RNA לניתוח במורד הזרם (כלומר., בריכה מספר גדול יותר של הפונקציה LCM כמוסות לפני החילוץ-RNA).
- חנות RNA ב-80 מעלות צלזיוס עד איסוף מספיק דוגמאות לניתוח במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנחנו עשינו מספר שיפורים הפרוטוקולים הקיימים המאפשרים את האוסף מהירה יחסית של הגרעינים המעית מדגימות המעי האנושי באמצעות הפונקציה LCM, עמידה בסטנדרטים ביותר עבור ה-RNA-תת סעיף. ראשית, אנחנו אופטימיזציה ההקפאה המהירה של מקטעי רקמת המעי בתבניות הבסיס גדול להציב בפני השטח של slurry קרח יבש ב- 2 MB (איור 1B). ההצלחה הטובים ביותר במהלך cryosectioning, הפונקציה LCM הבאים היה מתקבל על ידי הנחת מקטעי מעיים שטוח בתוך תבנית בסיס, פונה כלפי רירית-מעלה (דמויות 1B-1c). להבטיח כי התבניות בסיס שטוח ככל האפשר בבסיס, כפי מאפקט יעשה את זה הרבה יותר קשה להשיג חתך גדול של מקלעת myenteric. גישה זו גורמת הרקמות בקלות הוא למחלקה-עובי 8-מיקרומטר (איור 1E) ומאפשר עבור חיסול מוחלט של TFM מתהליך מכתימים. מצאנו כי TFM משבשת תהליך צביעת, ובכך מטשטש את הזיהוי של הגרעינים המעית. מיצוב הרקמה בכיוון זה גם ימנע חלוקתה דרך רירית, שבו יש תכולה גבוהה של RNases12, למרות מהניסיון שלנו, נראה כי השימוש של כתמים ethanolic מעכב במידה רבה את RNases האלה. במקרים שבהם TFM או טמפרטורה אופטימלית חיתוך בינוני (אוקטובר) יש צורך, מצאנו את זה הכי אמין כדי תחילה לשטח המדגם בתחתית תבנית הבסיס ולאחר מכן להוסיף את TFM כייר בעקבות צעד זה (איור 1D). זה משאיר "חלון" בו המעי ניתן לאבחן בקלות, ולכן קל ליישר את הדגימה ולייצר קטעים מקבילים לחלוטין מקלעת myenteric (איור 1E).
הכנת cryosections longitudinally לאורך כל המעי אצל אוריינטציה מקביל מקלעת myenteric (איור 2א), יוצרת מקטעים שבו האזור הגדול ביותר של הגרעינים המעית לכל שקופית גלויים על צביעת ( איור 2 C). כאשר אתם ניגשים מקלעת myenteric (איור 2C), בהפרד של השכבות שריר אורכי, מעגלית (איור 2B), סעיפים 6-12 טורי יכול להיות שנאספו (איור 2א, האורך) המכילים כ"שטח נוף פתוח של הגרעינים המעית (איור 2C). ניתן לטעון LCM כמוסות לקיבולת באמצעות קטע בודד (איור 4D). לעומת זאת, כאשר מכינים קטעים רוחבי של המעי קפוא טרי (דמויות 2A-2B), יש רק אזור קטן של מקלעת myenteric נוכח בכל שקופית (איור 2B). הגרעינים המעית מעט מאוד ניתן לאסוף ממקטעים רקמות רוחבי, וכתוצאה מכך זמן רב יותר מושקעת עלות גבוהה יותר לכל דגימה הכוללת. הגישה חלוקתה במקביל משתמשים פחות חמישית של מספר אותיות הפונקציה LCM ושקופיות בהשוואה מקטעים רוחבי, מאיץ את התהליך אוסף.
לפני LCM, חייב להיות מוכתם ודוגמאות מיובש באופן מלא כדי להימנע מפעילות RNase במהלך LCM אוסף. תיכננו ניסוי להשוות ישירות את ההשפעה של כתמי מימית נגד כתמים ethanolic על תקינות RNA. בניסוי זה, שני מקטעים מעיים רכוב יחד על שקופית בודדת, עובדו באחת מארבע דרכים, עם n = 2-3 ביולוגי משכפל לכל קבוצה. בקבוצה הראשונה, סעיפים מעיים טריים לא רכוב לשקופית, אחד הועבר ישירות לתוך מאגר פירוק RNA באמצעות מלקחיים נטולת RNase טרום מקורר על קרח יבש (איור 3א). עבור כל הקבוצות הנותרות, סעיפים היו דבקה שקופית, מעובד, גרדו אותה מתוך השקופית באמצעות RNase טיהור שטופלו פתרון גילוח, הועבר למאגר פירוק RNA עם מלקחיים RNase-חופשית. תקן של מיקרו-מהמגן שימש באופן מלא lyse הדגימות בכל קבוצות. בקבוצה השנייה, השקופיות עובדו היטב את כל השלבים, אבל אין צבע שימש במהלך ההליך מכתימים (איור 3ב). שלוש קבוצות עיבוד עם פרוטוקול המתואר לעיל, באמצעות צבע סגול Cresyl 4% (איור 3ג'). בקבוצה הרביעית, הכתם מימית, טולדין כחול, נעשה שימוש בעת ביצוע את פרוטוקול מבוסס-מימית מכתימים ערכת באמצעות תערובת של טולדין כחול hematoxylin (איור 3ד'). לאחר חילוץ RNA, כמתואר, איכות RNA הוערכה עם Bioanalyzer. ההבדל היחיד בין מימית ethanolic מכתים פרוטוקולים היה התוספת של שני incubations מים (30 s כל), מיד לפני ואחרי מכתים, אשר נדרש עבור ספיגת ושמירה של לצבוע. מצאנו כי התהליך של הקפדה מקטעי רקמת לשקופית ולאחר עיבוד עם השלבים התייבשות הוביל לירידה קלה, נמנעת באיכות RNA (דמויות 3A-3B), אך זה מכתים עם לצבוע ethanolic, ויולט Cresyl, לא רחוק מאיכות RNA (איור 3ג'). לעומת זאת, לצבוע מימית, טולדין כחול, הובילה השפלה RNA ניכר, ככל הנראה בגלל חשיפה מימית מורחב המאפשר פעילות RNase אנדוגני (איור 3ד').
הצורות ייחודי של הגרעינים המעית לדגמן קשיים IR-LCM סטנדרטי עם זכוכית קונבנציונאלי שקופיות6 (איור 4א). בעת שימוש בעט-הממברנה שקופיות (איור 4B), דוגמאות הם דבקו גיליון דק מנותק מן הרוב המכריע של השקופית זכוכית. הלייזר UV חותך דרך הדגימה והן קרום עט, וכתוצאה מכך בניתוק מוחלט של הגרעינים שקופית (איור 4C), הדבקות מלאה הכיפה LCM (איור 4D). מבנים של כל הרצוי גודל וצורה (> 10-15 מיקרומטר) יכולים להיות לחלוטין, בדיוק אספתי (Figured 4E-4 שעות). דוגמאות עם הגרעינים פחות לכל סעיף, הכובע עשוי להיות ≥ ועבר ארבע פעמים לפני איסוף. במקרה זה, הרכבה שלושה מקטעים לכל שקופית ממזער את השימוש בעט-הממברנה שקופיות.
כאשר בידוד RNA מדגימות LCM עבור ה-RNA-seq, המטרה היא להשיג את האיכות הגבוהה ביותר של RNA אפשרי והכמות, תוך סילוק כל הדנ א (gDNA). כדי לזהות בשגרת בידוד RNA אידיאלי, ביצענו עפות השוואה עם ערכת חילוץ RNA "A" (איור 5א), ערכת חילוץ RNA "B" (איור 5B) או שיטת החילוץ RNA "C" עם ניקיון של הדגימות RNA על-ידי ערכת חילוץ RNA "B" (איור 5C). לאחר עיבוד הדגימות עם הסגול Cresyl אופטימיזציה מכתים פרוטוקול, הפונקציה LCM שימש לאסוף דגימות מעגלית מתוקנן (קוטר של 500 מיקרומטר) של רקמת המעי, שנלקחו השכבה שרירים אורכיים. כל כובע היה אקראי לכל אחת הקבוצות בידוד RNA שלוש, להצבה על גבי צינור 0.5-mL microfuge מלא מראש עם המאגר בהתאמה פירוק של כל ערכה. ההוראות היו במעקב בדיוק כפי שתואר עבור כל ערכה, עם ערכת חילוץ RNA "A" מאגר פירוק הדורשים הדגירה ב 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עבור ערכות אחרות, דגירה בטמפרטורת החדר שימש במשך 30 דקות. כל הדגימות היו בקצרה vortexed על תוספת למאגר פירוק. דוגמאות ואז היו מקורר על הקרח עד עקירות נערכו באותו היום (n = 4). מצאנו כי ערכת חילוץ RNA "B" עם שלב העיכול הדנ א על עמודות הביא האיכות הגבוהה ביותר של RNA והכמות תוך המבטלת ביעילות gDNA (דמויות 5A-5 C). חשוב לציין, המאגר פירוק RNA שסופקו על-ידי ערכת חילוץ RNA "B" באופן מלא lyses את הגרעינים שנתפסו בעת איסוף המעית הגרעינים (איור 5D).
בממוצע, הדגימות שלנו יש של רין של 7.49 ± 0.53 (טבלה 2). רין ציונים של יותר מ 6-7 נחשבים באיכות מספקת עבור ה-RNA-seq (בהתאם לפרופיל ה-RNA ספציפי)13, נותנים לנו ביטחון כי הדגימות שלנו הם באיכות מספקת עבור ה-RNA-תת סעיף. בהתחשב בכך את רין לדוגמאות האלה, עם קבלת, יש טווח רחוק מ- 7.4 עד 9.5, תוצאות אלה מציינים כי פרוטוקול ממוטבת שלנו מספק מעולה לשימור RNA שלמות. רנ א נציג איכות תוצאות דגימות נאספו עבור ה-RNA-seq מתוארים ב 6A דמויות - 6 C. תוצאות מ- RNA-seq להדגים כי הדגימות שלנו היו וסודרו בהצלחה ויש דעה קדומה צנוע-3' end (איור 6D). באופן כללי, גדול יותר 3' בייאס הוא המועדף בדגימות עם רין התחתון14; אפקט זה משתקף בינוני הדגימות שלנו. למרות זאת, biotypes ג'ין שנצפו היו עקביים במידה רבה בין כל דוגמאות (איור 6E), המציין את המהימנות של הנתונים.
איור 1 . אופטימלי הקפאת רקמת המעי. דליים קרח יבש (A) מוכנים לפי הסדר המתואר; אני) קרח יבש slurry, רקמות ii) מעבדה להציב על גבי קרח יבש, אחסון זמני iii) דלי, iv) גלישת דלי, v) קדם מקפיא אחסון הדלי, vi) קדם מקפיא אחסון גלישה דלי. (B) אנחנו אופטימיזציה הקפאה מהירה של מקטעי רקמת ב גדול בתבניות הבסיס ממוקם על פני השטח של slurry של קרח יבש ו- 2-methylbutane. (ג) A קרוב התמונה של הדגימה קפוא לחלוטין, נצפתה בכיוונון המוצגים בלוח ב' במעיים מקטעי הונחו שטוח בתוך תבנית הבסיס פונה רירית הפונה למעלה. (ד) שיטה הקפאה זו ניתן להתאים בקלות לשימוש עם TFM על ידי הכנת הרקמה באותה דרך, אבל הוספת TFM כייר הבסיס לפני ההקפאה. תוצאות המדגם יהיה של מקלעת myenteric שטוח לחלוטין, עם serosa זה ניתן לאבחן בקלות. (E) הכנה רקמת שתי גישות לייצר רקמות מצוינת מקטעים-עובי 8 מומלצים-מיקרומטר. ההליך באמצעות TFM מתואר כאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . כיוון נכון של רקמת המעי מספק קטעים עשיר הגרעינים המעית. בעת הכנת תקן רוחבי חתכי רוחב של המעי קפוא טרי (A, B), יש רק אזור קטן של מקלעת myenteric (B) נוכח בכל שקופית. הגרעינים המעית מעט מאוד ניתן לאסוף לכל שקופית, וזה זמן רב ויקרות. לעומת זאת, הכנת סעיפים האורך במישור של מקלעת myenteric (C), ומציע הרבה שטח פנים גדול יותר של הגרעינים (C). קטעים של מקלעת myenteric מתקבלים על ידי החל serosa ואת חלוקתה פנימה דרך השריר האורך (B). כאשר אתם ניגשים של מקלעת myenteric, בצומת של שכבת השריר אורכי, מעגלית (B), ניתן לאסוף מקטעים טורית 6-12. כל מקטע האורך של מקלעת myenteric מכיל כ"שטח נוף פתוח של הגרעינים המעית (המיוצגים ב- C, באמצעות הליך מכתימים ששונה, בלי קסילן, כתם מעדיפים את הגרעינים). יכול להיות מלא בקבוקים LCM לקיבולת באמצעות קטע רקמה אחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . צביעת עם צבע התואם לאתנול משפר את איכות רנ א. איכות RNA נמדדה על ידי Bioanalyzer ואת מוצגות התוצאות נציג של שתי דגימות מכל קבוצה. איכות ה-RNA הראשוני היה מספר שלמות RNA (RIN) של 8.65 ± 0.07, נמדד ממקטעים טריים, שטעינתו בוטלה (A, אין טיפול). עבור מקטעים רכוב ומעובדים היטב את כל השלבים, אבל בלי כתם (B), רין היה 7.95 ± 0.35. צביעת 4% Cresyl סגול עם נוספה אל המדרגות התייבשות, היה השפעה זניחה על רין, עם רין הממוצע של ± 7.87 אינצ 0.35 (C). לשם השוואה, השימוש של הכתם מימית טולדין כחול (T-כחול), התוספת של שטיפות מים נדרש להליך (D) הביא באיכות RNA מופחתת באופן משמעותי, עם רין של 6.45 ± 0.21. כל קבוצה כללה n = 3 ביולוגי משכפל חוץ "לא טיפול", "T-Blue"(n=2). RINs מדווחים כאן כמו הממוצע ± סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . עט ממברנה LCM שקופיות מאפשרות אוספים מדויק של הגרעינים המעית. באמצעות שקופיות מיקרוסקופ רגיל זכוכית כדי לאסוף את הגרעינים המעית באמצעות הפונקציה LCM נוטה לגרום בטנדר רקמות לא רצויות (A). העיגולים האדומים (30 מיקרומטר בקוטר) לציין את הגודל של המקומות LCM אינפרא-אדום המשמש בתהליך איסוף. החץ הלבן מציין אוסף גנגליון שמשך את חתיכת רקמה muscularis הסמוך. עם עט-הממברנה מגלשות (B), דוגמאות הם דבקו גיליון דק מנותק מן הרוב המכריע של השקופית זכוכית. כאשר אתה מבתר עם לייזר UV-LCM, מדגם והן קרום העט הם פרוסים, וכתוצאה מכך בניתוק מוחלט של הגרעינים של השקופית, ללא קשר לצורה גנגליון (C), ולהשלים ההקפדה הכיפה LCM בעת הסרת מדגם (D ). מבנים של כל הרצוי גודל וצורה ≥ 10-15 מיקרומטר יכול לחלוטין, בדיוק שנאספו [(E), ראשוניות רקמות מארק-up; חיתוך לייזר (F) IR ו UV הושלמה; כובע LCM (G) להסיר מקטע], כפי דמיינו על המכסה LCM (H). רקע מנומר בחלונית H טבועה כובע ואינו פסולת בלתי רצויה. הם מצייני מיקום עבור לייזרים UV ו- IR, בהתאמה, הינם חלק מתוכנית LCM הכוונת כחול ירוק חוגים פאנלים E-H . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . בחירת ערכת אופטימלית של בידוד רנ א. התוצאות תקינות RNA יוצגו לאחר השוואה בו-זמניות של שלושה הליכים בידוד שונים של RNA. שני מגרשים נציג מכל קבוצה מוצגים כדי להמחיש את מידת ההשתנות שיכולה להתרחש בין דגימות מעובד במקביל. ערכת חילוץ RNA "A" (A) המיוצר דגימות עם רין של 6.83 ± 0.65 סיפק בינוני ובתשואות RNA ו נטו יש זיהום ה-DNA, למרות ביצוע של עיכול DNase על עמודות. ערכת חילוץ RNA "B" (B) הביא רין הגבוה ביותר נמדד, ב- 8.3 ± 0.1. בעוד פנול בשיטה המבוססת על ה-RNA החילוץ "C" (ואחריו ניקיון של הדגימות RNA עם ערכת חילוץ RNA "B") (C) הופיע לחסל את gDNA, והיא היתה של רין של 7.5 ± 0.26, היו גדולים מזהמות להקות, אשר ייתכן נבעה המסת פולימר דביק של הכיפה LCM במהלך השלב פירוק RNA. עוד, RNA היבול של ערכת חילוץ RNA "A" ושיטת מיצוי "C" היו נמוכים באופן עקבי יותר מאלו מתקבל על ידי ערכת חילוץ RNA "B". חשוב לציין, RNA פירוק המאגר שסופק על-ידי ערכת חילוץ RNA "B". (עם תוספת β-mercaptoethanol) lyses באופן מלא את הגרעינים שנתפסו (D). לכל קבוצה היה n = 3 משכפל ביולוגי, מוצג כאן רשע ± סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 . התוצאות נציג. בעת צירוף שתי כמוסות של הגרעינים המעית לדגימה, אנו משיגים כמויות מספיקות של RNA עבור ה-RNA-seq (> 1 ng) יחד עם איכות מעולה של RNA. נציג RNA חלקות מוצגים עבור מדגם עם רין 8.3 (A), 7.5 (B) ו 6.9 (C). RNA-seq נתונים נוהלו באמצעות של תוכניות איכות-הערכה, הפועלות r (D). העלילה סוף בייאס מציין כי הדגימות היו וסודרו בהצלחה ויש דעה קדומה צנוע-3' end. (E) העלילה biotype ג'ין מייצג גם את רצף תוצאות עקביים במידה רבה בין הדגימות. בסך הכל, יש לנו > שיעור ההצלחה 95% של יצירת דגימות שמיש עבור ה-RNA-Seq אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| שלב | משך | מטרה |
| 95% אתנול (C-20 o) | 30 s | קיבעון |
| ויולט cresyl 4% 95% אתנול | s 10-30 | כתם |
| 75% אתנול (עם טבילה חוזרות) | s-15-25 | מבטל את כתם |
| 95% אתנול (עם טבילה חוזרות) | s 5-15 | מבטל את כתם |
| 100% אתנול | 15 s | התייבשות |
| 100% אתנול (נטול מים) | 30 s | התייבשות |
| קסילן (עם טבילה חוזרות) | 15-20 s | התייבשות |
| קסילן | > 10 דקות | התייבשות |
| מילה נהדרת. | 1-3 דקות | אידוי של קסילן |
טבלה 1. מכתים, מבט כולל על פרוטוקול התייבשות. השולחן הזה מתאר פרוטוקול מכתימים ממוטבת שלנו. שימו לב: כל אתנול תואמי כתם יכול לשמש כדי להחליף את Cresyl, ויולט, אם הוא מציע תוצאות טובות יותר. במקרים מסוימים, משך הזמן של צביעת ו destaining יהיה צורך להיות מורחב או מקוצר. בדרך כלל, ככל הזמן קיבוע, מהר יותר הרקמה להיות מלא מוכתם. אנחנו לא הבחין כל ירידה RNA תקינות לאחר מחדש באמצעות את הבקבוקונים עד 3 פעמים בעת הכנת שקופיות מחלוקה באותט קטע של רקמות.
| התורם | רקמה | רין |
| F | המעי הגס | 7.1, 7.4, 7.2 |
| M | המעי העקום | 7.2, 6.9, 7.8 |
| M | תריסריון | 8.2, 7.4, 7.7 |
| המעי העקום | 7.4, 7.6, 7.3 | |
| המעי הגס | 7.7, 7.8, 7.3 | |
| F | תריסריון | 7.1, 7.3, 6.9 |
| המעי העקום | 7.8, 7.9, 7.6 | |
| המעי הגס | 7.3 8.0, 7.5 | |
| M | המעי העקום | 6.9, 6.7, 6.9 |
| המעי הגס | 6.8, 6.4, 6.6 | |
| M | המעי העקום | 7.2, 7.3, 7.6 |
| המעי הגס | 6.7, 7.6, 7.7 | |
| M | המעי העקום | 8.3, 7.8, 7.4 |
| המעי הגס | 7.0, 7.4, 7.0 | |
| F | תריסריון | 8.3, 8.8, 8.0 |
| המעי העקום | 8.1, 8.0, 7.8 | |
| המעי הגס | 8.4, 8.6, 7.1 |
בטבלה 2. רנ א נציג תוצאות תקינות. הדגימות המוצגים בטבלה זו התקבלו מן הגרעינים המעית אנושי. כל הדגימות שנבחרו יש מספיק RNA איכות וכמות לניתוח RNA-seq. רין הממוצע של כל הדגימות שמפורטים בטבלה זו הוא 7.49 ± 0.53. ריכוז ה-RNA נמדדה גם באמצעות וזמינותו RiboGreen חשבים-iT ו כל הדגימות המוצגים בטבלה זו פגשו את כמות מינימלית הדרושה שלנו RNA-seq (> 1 ng) ניסויים. כמויות קטנות יותר יכול לשמש, בהתאם לנוהל קדם הגברה. עם זאת, הליכים כאלה אמינים יותר כאשר אני מצפה שם כדי להיות הבדלים גדולים בביטוי הגנים בין דוגמאות או קבוצות שמשווים; אחרת התוצאות הללו מטשטשים ההבדלים נכון ביישומים מסוימים RNA-seq. לכן מומלץ בדרך כלל להתחיל עם חומר נוסף כאשר הדבר אפשרי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הליך זה מאפשר את האוסף יעיל של הגרעינים המעית רבים כמקור להפקת RNA עבור ה-RNA-תת סעיף. כאן, אנחנו האיץ את התהליכים המתוארים הפרוטוקולים הקיימים תוך שמירה מקסימאלית RNA שלמות. כמו כל השלבים בהליך זה תלויות זו בזו, זה חשוב כי כל הבעיות ניתן לסלק מן תחילת המחקר, כי כל דוגמאות מוכנות באופן דומה כמו אחד לשני ככל האפשר, כדי להשיג אמין RNA-תת סעיף.
מתחילת ההליך, שלמות RNA יכול מושפעים באופן שלילי אם מרווח הזמן (זמן איסכמי קר) בין אוסף של רקמות בזמנו של תרומת איברים וקבלה של רקמות לצורך עיבוד במעבדה ארוך מדי. לאור חשש זה, היינו מופתעים כי באיכות גבוהה עדיין רנ א ניתן מדגימות המעי גם לאחר 24 שעות של זמן איסכמי קר. כאשר הדגימות מעיים מקורר ומאוחסנים כראוי בפתרון אחסון הקרה, יש הגנה מעולה של רקמות תקינות ואיכות RNA. אנו דורשים כי רקמת המעי התרוקן על אוסף של צוות אוסף של איברים, כדי להגביל את החשיפה של המעי אנזימי עיכול, RNases של מולקולות אחרות אשר יכול להשפיע על איכות ה-RNA בתקופה זו. מצאנו כי כאשר הדגימה מעיים לא התרוקן לחלוטין, זה להפחית באופן משמעותי רין של הדגימה.
באמצעות ההליכים ממוטב עבור הכנת דגימות רקמה מעיים, אנו מסוגלים להימנע מהטבעת דגימות ב TFM. כי TFM אינטראקציה עם אתנול וביו -קסילן לטופס של התמיסה חום כהה המפריע החזיית המעית הגרעינים, אנו מעדיפים למעט זה מן הדגימות שלנו. עם זאת, בעת עבודה עם רקמת המעי עכברים או מינים אחרים, הכללת TFM לא ייתכן. במקרה זה, אנחנו ניסויים עם הסרת TFM מקטע מודבקת בשקופית. אם הרקמה יש פני שטח מספיק, יכול מטפטף אתנול (מקורר ב-20 ° C) על גבי השקופית עם פיפטה העברת לתקן במהירות את TFM, ומאפשרת יוסרו עם מלקחיים. מטפטף אתנול על השקופיות מונע ההצטברות של TFM בתוך הבקבוקון של אתנול, יכול להחריף את האפקט browning כאשר שקופיות מרובות המעובדות.
במהלך פלאש-לקפוא, תעדיף באמצעות slurry קרח יבש עם 2 MB, יותר מאשר 100% אתנול, כי 2 MB מתאדה בקלות בעת נחיתה על פני השטח של הרקמה. אתנול נוטה להתאדות יותר לאט, במיוחד בשילוב עם TFM, ויוצרים של בוצה כימי על הבלוק רקמות שלא ניתן להסיר בקלות. אתנול וביו -2 MB נוטים הג'ין מתיז נמרצות כשהוא קפוא מכולות מקפיא קטן, כי כמות קטנה slurry קרח יבש בעל קיבולת חום ספציפיות נמוכה. במקום זאת, באמצעות דלי מלבני גדול מלא בקרח יבש powderized מספק מסה קירור גדולים, מונעת תנודות הטמפרטורה בזמן הרקמה להיות קפוא.
כאמור, זה לפעמים קל יותר להשיג יריעות רציפה של הגרעינים המעית של דגימות רקמה ביחס לאחרים. מובן, המהירות הכללית של הפונקציה LCM הוא להשתנות בהתאם המאפיינים של רקמת המקור או את אזור המעי להיות שנדגמו. מסיבה זו, מומלץ לעיתים קרובות להכין דוגמאות רבות מוקפאות הזקיקים. בדרך כלל אנחנו גילינו כי סך של 20 דוגמאות לכל קטע של המעי (~ 2 ס"מ x 1.5 ס מ, כל) מספיקה הרבה יותר מאשר לספק RNA בשפע ליישומים במורד הזרם. עם זאת, אם רק באורך קטנה של רקמת המעי זמין, אנו ממליצים באורך מינימלי של 5 ס מ. בגישה שלנו, התשואה הנמוכה ביותר זה מתקבלת יהיו בטווח של 18-30 ננוגרם של RNA, כמו עוד נדון להלן. אורך מינימלי של 5 ס מ יכול פוטנציאלית להיות מופחת, בהתאם ליישום, במיוחד אם כמויות גבוהות יותר של cDNA preamplification משמשים. פרמטרים אלה לא נבדקו במחקר הנוכחי. לדוגמה, הגרעינים המעית שנגבה מדגימות ביופסיה המעי מלא-עובי (2 ס"מ על 2 ס"מ) לשימוש עם qPCR4.
כפי נדגים במחקר זה, השימוש לצבוע התואמים לאתנול, Cresyl, ויולט, מציע הגנה הרבה יותר של RNA שלמות מאשר הכתם מימית, טולדין כחול. . מוסתר אתנול, RNases הופכים לא פעילים5,15. עם זאת, RNases עדיין יכול להחזיר פונקציה התקדמנו מים7,15. כאשר מכתים עם צבעי מימית, הרקמה חייבת להיות חשופה ללא נוקלאז מים כמעט 1 דקות9, מה שמוביל השפלה RNA משמעותי. בעת שימוש טולדין כחול צביעת רקמות, הצלחנו לצמצם את החשיפה למים לפני ואחרי מכתים, כי שינויים אלה גם להפחית את ספיגת ושמירה של טולדין כחול, בהתאמה. בעיה דומה התגלתה גם עם צבע מבוסס hematoxylin9. בפרוטוקול ששונה המתוארים כאן, צביעת בויולט Cresyl מונע חשיפה ישירה של הדגימות מעיים למים, ובכך מקסימאלית שמירה על תקינות RNA. תוצאות אלו יבטל את הצורך של מעכבי RNase נוספים בפתרון מוכתמים. מצאנו כי מעכבי כאלה אינם יעילים-ומאפשר שימוש לצבוע מימית, טולדין כחול, כמו זה הפריע ספיגת והן השמירה של לצבוע.
כאשר בתחילה מיטוב פרוטוקול מכתימים שלנו, אנחנו לא הצליחו לשחזר את התוצאות המתקבלות פרוטוקולים אחרים ודוחות5,7,8,11. בעוד הסיבה לכך היא לא ברורה, מצאנו מספר גורמים שהובילו ספיגת צבע לא עקבי ושמירה. לדוגמה, למרות פרוטוקולים מסוימים יש צבעונית בהצלחה רקמות באמצעות Cresyl סגול ב- 100% אתנול8 או ב- 75% אתנול5, לצבוע רק באופן עמום עם התווית הגרעינים או היה רקע גבוה, לעומת שימוש Cresyl, ויולט 95% אתנול. בפעם האחרונה, האחוז של ויולט Cresyl בשימוש הפתרון מכתימים הוא גם מאוד חשוב. ברוב הפרוטוקולים ממליצים7,8פתרון סגול Cresyl 1%, אבל הריכוז הזה לא סיפק מכתים אמין בידיים שלנו, גם לאחר צביעת מקטעים עבור עד 2 דקות. הייתה לנו הצלחה הטוב מכתים עם תמיסה בהירה מכתימים רוויה של 4% Cresyl, ויולט11 להחיל את הדגימה דרך מסנן סטרילי מזרק8. פתרון רווי זה מאפשר מכתים הרבה יותר מהירה של המדגם, ב קטנה כמו 10-15 ס קדם קיבוע של המדגם צוננת אתנול 95% (ב-20 ° C) מאפשרת ספיגה מהירה יותר של הכתם.
דוח אחר מצא כי הגרעינים המעית היו הכי מובהק צבעונית מוקפאות מקטעים מעיים אנושיים כאשר שילוב של Cresyl סגול עם אאוזין ב 75% אתנול פתרון5. עם זאת, מצאנו כי אאוזין עשה את זה יותר קשה לזהות את הגרעינים, ויולט Cresyl הזה, לבד, מציע איתור מעולה. במחקר אחר, התברר כי פתרון Cresyl, ויולט במאגר סיפק תוצאות עקביות מכתימים רקמת סרטן רירית הרחם10. עם זאת, מצאנו זה לא הציע שום שיפור עבור רקמה אנושית מעיים, גם ואינן מיושמות בעת שימוש אתנול 95% עבור הפתרון מוכתמים.
בדקנו מספר תנאים בו הפרוטוקול יכול להיות מושהה, חודשה במועד מאוחר יותר. פרוטוקולים רבים מציע חלוקתה שקופיות מבעוד מועד מחדש להקפיא אותם ב-80 מעלות צלזיוס מיד לאחר הרכבה על גבי שקופית5,9. עם זה מתקרב, מכתים, הפונקציה LCM יכולה אז להתחדש בשבוע הקרוב, מציע גמישות רבה. עם זאת, לא רק זה מאוד להפריע מכתימה; זה גם מופחת RNA שלמות בידיים שלנו (נתונים לא מוצג). כדי לעקוף בעיה זו, גרובר. et al. ממליץ על צביעת dehydrating הסעיפים לפני אחסון המקפיא11. בגישה זו, שקופיות צבעונית, מיובש (כמו טבלה 1) עד השלב נטול מים אתנול 100% (פרוטוקול בסעיף 5.2). לאחר מכן, דגימות מודגרת בבקבוקון השני של אתנול 100% נטול מים למשך 10 דקות, מועברים מיד צינור חרוטי עם ג'ל סופג לחות, אשר לאחר מכן מקורר על קרח יבש, העבירו למקפיא-80 ° C. בעת הסרת דגימות מהמקפיא, שקופיות מיד טובע אתנול 100% נטול מים עבור 30 s ואוויר יבש מראש לביצוע LCM11. למרבה הצער, בידיים שלנו, גישה זו מופחת רין על ידי 0.6-0.8 (נתונים לא מוצג). אנחנו ולכן נקטו לביצוע כל חלוקתה מכתים, הפונקציה LCM באותו יום כדי להשיג שלמות RNA מקסימלי בתנאים שלנו. זו מוכיחה להיות תהליך ממושך, אבל יכול להיות מלא 10-14 LCM כמוסות במהלך העבודה של יום שלם.
הנקודה הכי אמין שבו ניתן להשהות פרוטוקול שלנו היא בשלב הדגירה קסילן. שקופיות נותרו קסילן (עם הנפות מולקולרי) עבור עד 4-5 שעות ללא השפעה ניכרת על תקינות RNA. מצאנו כי כאשר שלוש שקופיות מוכנים בכל פעם, כל ניתן לעבד עם הפונקציה LCM תוך זמן זה, אפילו אם שעה הפסקה נחוצה. אפשרות חלופית להתייבש השקופיות לאחר צביעת והתייבשות צעדים בתוך און exicator16, אבל לא כבר ניסינו בגישה זו.
בידוד ה-RNA היא עדיין צעד מכריע נוסף להליך, עם החשובים ביותר גורמים להיות: קבלת את התשואה אפשרי מקסימלי של RNA, שמירה על הקשת של RNA (ללא אובדן לזנים RNA קטנים)17,18, ו חיסול מוחלט של ה-DNA גנומי של מדגם ה-17. בידיים שלנו, ערכת חילוץ RNA "B" סיפק את התוצאה הטובה ביותר עם הדגימות שלנו, כפי שהוא הציע התשואות גדול היה יעיל יותר ב חיסול הדנ א הגנומי. התצפיות שלנו לגבי הבדלי התשואות בין ריאגנטים מיצוי ה-RNA הם עקביים עם17,מוקדמת דוחות18. עם זאת, ישנם גם מחקרים LCM רבים דיווחו על הצלחה עם אחרים RNA החילוץ ריאגנטים19,20. דוחות קודמים גם לציין כי תהליכי מיצוי ה-RNA מבוססי עמודה מציעים שמירה טובה יותר של מולקולות RNA קטנות יותר מבוסס-פנול החילוץ-RNA שיטות18 כמו מולקולות RNA קטנות יכול ללכת לאיבוד בתוך תגובת שיקוע במהלך RNA משקעים שלבים.
הבחנו כי מאגרי פירוק RNA להשתמש guanidinium thiocyanate עם β-mercaptoethanol נוסף הוא מאוד יעיל הסרת כל הגרעינים שנתפסו הכיפה LCM (איור 5D). בעוד ברוב הפרוטוקולים LCM אינם ממליצים על vortexing lysate, מצאנו כי זה מפיק תוצאות מצוינות, לא תגרום RNA השפלה. הוא גם מספק הסבירות גדול עוד יותר כי כל שבויי הגרעינים ישוחרר מן הכובע לחילוץ RNA. באמצעות שיטות אלה, אנו בדרך כלל להשיג תשואות RNA של LCM של הגרעינים המעית בטווח של 1.8 18 ng/cm2 של רקמת המעי, תלוי כמה גרעיני נוכחים בשקופית נתון. RNA-seq שלנו דורש קלט מינימום של 10 ng RNA, אך הליכים אחרים הרבה RNA התחתון קלט אם עיבוד רצף כולל מספר רב יותר של הגברה טרום מחזורי. פני השטח הכולל של רקמות המאוחסנים הכנה, תהליך קירור פלאש היא 40-60 ס מ2, אשר מספק RNA בשפע cDNA הספרייה במכינה ויישומים RNA-Seq קלט-נמוך.
בעוד את הנהלים שלנו מיועד עבור האוסף של כל המעית הגרעינים, הגישה ניתן בקלות לשנות עבור האוסף של נוירונים בודדים, או, עכשיו, דונלד במידת הצורך5. עם זאת, כי גליה תהליכים בצפיפות הנוירונים ensheath התרנגולות, RNA גליה יהיו כלולים יחד עם הרנ א של נוירונים שנתפסו, אמנם על ספירות התחתון. זה מעלה בעיות בעת ניסיון לזהות את התמלילים העצבית באה לידי ביטוי במספר נמוך עותק. תא בודד RNA-seq מציע את הדיוק הטוב ביותר ואת זיהוי בהקשר זה, אך דורש נוירונים לזהויות רקמת המעי, מוכתם עם סמנים עצביים-פאן, ולא מבודדים עם דנ21 או מזוהה מן השלם-מעיים dissociations לאחר מיון עם ביואינפורמטיקה גישות. החיסרון של רוב המחקרים דיסוציאציה היא כי ברוב הפרוטוקולים דורשים כי המדגם להיות מודגרות בטמפרטורת החדר או 37 ° C לתקופות ממושכות, אשר ידוע לשנות את transcriptome3. לאחרונה, פרוטאז קר-פעיל של Bacillus licheniformis שימש במשך דור של תא בודד המתלים העכבר לרקמות, ייתכן שתהיה אפשרות להחיל את אנזים זה על דיסוציאציה של רקמה אנושית בגיל 4 ° C22. עד כה אופטימיזציה היא מושלמת, הפונקציה LCM טריים קפואים רקמה אנושית היא אמצעי חזקים כדי ללכוד RNA עבור הביטוי בניית פרופיל של מערכת העצבים ההיקפית אלמנטים כמו גרעיני המעית.
לסיכום, פיתחנו פרוטוקול אמינה ועקבית של אוסף של RNA מן הגרעינים המעית אנושי. לנו יש אופטימיזציה ההכנה של רקמה אנושית מעיים, מכתים, הפונקציה LCM תהליך החילוץ-RNA בהתבסס על פרסומים ופרוטוקולים רבים. גם הראו את המהימנות של גישה זו באיסוף RNA דגימות של איכות RNA מספיק עבור ה-RNA-תת סעיף. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם באופן כללי רקמות שנאספו מחולים עם מספר רב של מחלות במערכת העיכול, ניתן בקלות להתאים לשימוש עם מודלים מכרסמים, ובכך מציע אסטרטגיה אמין להתפתחות של הריפוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
אנחנו אסירי תודה על התורמים ובני משפחותיהם אשר אפשרו את העבודה הזאת אנחנו מעריכים גם הסיוע של צוות המכון הבינלאומי לרפואה, טנסי סיפורים אישיים שעזרת אוסף קואורדינטות של רקמות השתמשו במחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מכוני הבריאות הלאומיים, NIH OT2-OD023850 לתמיכה2 וקצבה EMS של NIH T32-DK007673 כדי AMZ. אנחנו מודים לצוות של משאב משותף פתולוגיה ואנדרבילט Translational גישה לכלי LCM, ייעוץ על הכנת הרקמה. ואנדרבילט רקמות פתולוגיה משותפים המשאב נתמך בחלקה על ידי NIH מענקים P30-CA068485-14 ו- U24-DK059637-13. אנו מודים המרכז גישה הגנום טכנולוגיה במחלקה לגנטיקה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון על העזרה עם אנליזה גנומית. GTAC היא נתמכת באופן חלקי על ידי NCI סרטן מרכז תמיכה גרנט #P30 CA91842 כדי Siteman מרכז הסרטן ועל ידי ICTS/CTSA #UL1TR002345 מענק של המרכז הארצי עבור מחקר משאבים (NCRR), מרכיב של נבחרת מכונים לבריאות (NIH), וכן NIH מפת הדרכים למחקר רפואי. פרסום זה הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את התצוגה הרשמי של NCRR או NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
- Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
- Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
- PALM Protocols - RNA handling. , ZEISS. Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011).
- Schlaudraff, F. L. M. Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015).
- Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
- Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
- Potter, S. S., Brunskill, E. W.
- Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
- Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
- Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
