Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य लेजर कैप्चर microdissection (LCM) का उपयोग कर स्थिर, हौसले से संप्रदाय मानव आंत्र ऊतक से पृथक दर्जी गैंग्लिया से उच्च अखंडता आरएनए नमूने प्राप्त करने के लिए है । इस प्रोटोकॉल मानव आंत्र ऊतक, cryosectioning, इथेनॉल धुंधला और निर्जलीकरण, LCM, और आरएनए निष्कर्षण के फ्लैश जमे हुए नमूनों की तैयारी शामिल है ।
Abstract
इस विधि का उद्देश्य लेजर कैप्चर microdissection (LCM) का उपयोग कर स्थिर, हौसले से संप्रदाय मानव आंत्र ऊतक से एकत्र दर्जी गैंग्लिया से उच्च अखंडता आरएनए नमूने प्राप्त करने के लिए है । हम आरएनए प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि कार्यप्रवाह में पांच चरणों की पहचान की है पर्याप्त रूप से उच्च गुणवत्ता और आरएनए-seq के लिए मात्रा के साथ दर्जी गैंग्लिया से अलग. आंतों के ऊतकों की तैयारी करते हैं, सबसे पहले, प्रत्येक नमूना बड़े बेस मोल्ड के तल भर में जितना संभव हो serosa समतल करने से पहले सोख्ता द्वारा हटाया सभी अतिरिक्त तरल होना चाहिए । नमूने तो जल्दी सूखी बर्फ और 2-methylbutane का एक घोल के ऊपर जमे हुए हैं । दूसरा, जब ऊतक अनुभाग, यह स्थिति cryomolds इतना महत्वपूर्ण है कि आंत्र वर्गों myenteric जाल के समानांतर पूर्ण विमान है, जिससे स्लाइड प्रति एंट्रेंस गैंग्लिया की सबसे बड़ी सतह क्षेत्र उपज । तीसरा, LCM के दौरान, पॉलीथीन napthalate (कलम)-झिल्ली स्लाइड प्रवेश गैंग्लिया के गैर-यूनिफ़ॉर्म आकार जब प्रवेश गैंग्लिया इकट्ठा करने में सबसे बड़ी गति और लचीलापन प्रदान करते हैं । चौथा, वर्गों के भीतर प्रवेश गैंग्लिया के अलग दृश्य के लिए, Cresyl वायलेट की तरह इथेनॉल-संगत रंजक, जलीय रंगों के सापेक्ष आरएनए अखंडता के उत्कृष्ट संरक्षण प्रदान करते हैं । अंत में, पर कब्जा कर लिया गैंग्लिया से आरएनए के निष्कर्षण के लिए, हम वाणिज्यिक आरएनए निष्कर्षण किट है कि बेहतर आरएनए मात्रा और गुणवत्ता की उपज के बीच मतभेद मनाया, जबकि डीएनए संदूषण को नष्ट करने. वर्तमान प्रोटोकॉल में इन कारकों का अनुकूलन बहुत कार्यप्रवाह और पैदावार असाधारण आरएनए गुणवत्ता और मात्रा के साथ दर्जी गैंग्लिया नमूनों में तेजी लाने ।
Introduction
इस विधि लेजर कैप्चर microdissection (LCM) का उपयोग कर मानव आंत्र ऊतक से उच्च गुणवत्ता आरएनए नमूने दर्जी गैंग्लिया प्राप्त करने के लिए बनाया गया है । यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-seq) के लिए पर्याप्त आरएनए गुणवत्ता और पैदावार प्रदान करने के लिए अनुकूलित किया गया है और हौसले से संप्रदाय, स्थिर, फ्लैश-जमे हुए मानव आंत्र ऊतक के साथ इस्तेमाल किया जा करने के लिए इरादा है ।
कार्यात्मक जठरांत्र और आंत गतिशीलता विकारों संयुक्त राज्य अमेरिका में हर चार लोगों में से एक को प्रभावित । यह पेट homeostasis और गतिशीलता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, क्योंकि यह भी दूसरा1मस्तिष्क के रूप में संदर्भित, प्रवेश तंत्रिका तंत्र (िनों), अक्सर इन विकारों के केंद्र में है । आंत गतिशीलता के हेरफेर आम तौर पर aganglionic के सर्जिकल लकीर के लिए प्रतिबंधित किया गया है/noncontractile ऊतक, जीर्ण आहार संशोधन और/ आश्चर्य की बात है, वयस्क िनों के पूर्ण transcriptome के लिए अनुक्रम, बहुत िनों है कि दवा या स्टेम सेल उपचार में उपयोग किया जा सकता है के भीतर अणुओं की पहचान करने की क्षमता सीमित रहता है ।
मानव प्रवेशात्मक गैंग्लिया से आरएनए अलग करने के लिए अपेक्षाकृत कुछ तरीके हैं. पहला दृष्टिकोण, सेल पृथक्करण2, उच्च गर्मी तापमान और लंबे समय से मशीन समय की आवश्यकता है; दोनों जिनमें से आरएनए क्षरण को बढ़ावा देने और transcriptome2,3को बदलने के लिए जाना जाता है । एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, LCM, और अधिक मज़बूती से transcriptome को बरकरार रखता है और आरएनए अखंडता की रक्षा करता है । हालांकि कई अध्ययनों से ताजा जमे हुए मानव आंत्र ऊतक4,5,6से गैंग्लिया इकट्ठा करने के लिए LCM का इस्तेमाल किया है, इन तरीकों या तो गरीब आरएनए गुणवत्ता और मात्रा में बाधा थे, काफी श्रम प्रधान थे, या दाग या आरएनए निष्कर्षण तकनीकों के संशोधन की जरूरत हमारे हाथ में काम करने के लिए । आरएनए के संरक्षण के लिए डिजाइन किए गए अन्य LCM प्रोटोकॉल जो LCM उत्पाद नियमावली में पाए गए हैं,7,8अतिरिक्त सुधार प्रदान किए गए हैं, लेकिन अनुकूलन की जरूरत थी जब दर्ज की गई गैंग्लिया8के अलगाव के लिए लागू है, 9. इन कारणों के लिए, हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है कि मानव प्रवेश गैंग्लिया से उच्च अखंडता आरएनए की पर्याप्त मात्रा में पैदावार इन संसाधनों के आधार पर विकसित की है, एक अपेक्षाकृत तेजी से कार्यप्रवाह है, और एक बड़े पैमाने पर लगातार परिणाम पैदा करता है नमूनों की संख्या ।
इस अध्ययन में, हम अनुकूलित प्रक्रियाओं का एक सार प्रस्तुत करते हैं जो कि संप्रदायिक मानव आंत्र ऊतक से मंगवाया गया गैंग्लिया से उच्च अखंडता वाली आरएनए के अलगाव को सुकर बनाता है । हमारी विधि पांच महत्वपूर्ण पहलुओं को शामिल । पहले, हौसले से संप्रदाय, स्थिर मानव आंतों के नमूनों के आकार के लिए छंटनी की जानी चाहिए, सभी अतिरिक्त नमी एक प्रयोगशाला ऊतक के साथ हटा दिया है और एक बड़े बेस मोल्ड में समतल से पहले फ्लैश ठंड सूखी बर्फ और 2 के एक घोल के ऊपर-methylbutane (2-एमबी) । दूसरा, आंत के histologic वर्गों के लिए एक स्लाइड है, जो प्रवेश गैंग्लिया की एक बड़ी पेलोड प्रदान करता है पर myenteric जाल का पूरा विमान प्राप्त करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए । इस कदम के साथ सफलता काफी हद तक ऊतक तैयार करने की प्रक्रिया पर निर्भर है । तीसरा, िनों में गैंग्लिया की वर्दी संरचना पॉलीथीन napthalate (पेन) झिल्ली स्लाइड6, जो LCM प्रक्रिया के दौरान सबसे बड़ी गति और परिशुद्धता की पेशकश के उपयोग की आवश्यकता है । चौथा, इथेनॉल-संगत रंजक, जैसे Cresyl वायलेट, के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए आरएनए अखंडता की रक्षा करते हुए प्रवेश गैंग्लिया धुंधला । पिछले, आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया आरएनए-Seq के साथ एक सफल परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है । हम एक आरएनए निष्कर्षण दृष्टिकोण है कि उच्च आरएनए अखंडता का उत्पादन की मांग की, जब प्रवेश गैंग्लिया के छोटे से संग्रह के साथ शुरू आरएनए पैदावार को अधिकतम, डीएनए संदूषण समाप्त, और संभव के रूप में कई आरएनए प्रजातियों के रूप में बरकरार रखती है ।
एक साथ ले लिया, वर्तमान अध्ययन में इन कारकों का अनुकूलन बहुत कार्यप्रवाह और असाधारण आरएनए मात्रा और गुणवत्ता के साथ दर्जी गैंग्लिया के नमूने पैदावार में बढ़ौतरी । परिणाम काफी हद तक नमूनों की एक बड़ा समूह के बीच संगत किया गया है, इस दृष्टिकोण की निरंतरता का संकेत है । इसके अलावा, हम सफलतापूर्वक प्रवेश गैंग्लिया से आरएनए के नमूने के दर्जनों अनुक्रम के लिए इन तरीकों का इस्तेमाल किया है । यहां पर प्रकाश डाला रणनीति भी मोटे तौर पर वांछित गैंग्लिया या परिधीय और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और अंय उच्च गुणवत्ता आरएनए के अलगाव की आवश्यकता के मामलों के नाभिक के LCM प्रदर्शन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
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Protocol
यहां बताए गए सभी प्रोटोकॉल को वेंडरबिल्ट यूनिवर्सिटी इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (आईआरबी) ने मंजूरी दे दी है ।
1. ऊतक आगमन से पहले तैयारी
- उचित आईआरबी अनुमोदन प्राप्त करने और मानव अंग दान एजेंसियों के साथ समंवय करने के लिए नए सिरे से संप्रदाय, दाताओं कि सभी अनुसंधान अध्ययन के लिए आवश्यक मानदंडों को पूरा करने से ठीक आंत्र ऊतक प्राप्त करने के लिए ।
नोट: यह प्रोटोकॉल चूहों और अन्य कुतर मॉडलों के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।- प्रत्येक आंत्र खंड के लकीर पर तुरंत, अच्छी तरह से ठंडा पंजाब या ऊतक के साथ लुमेन फ्लश-भंडारण माध्यम अवशिष्ट चमकदार सामग्री या मल को दूर करने के लिए ।
- निस्तब्धता और एक उचित गैर-जोखिम संदूक में अपशिष्ट त्यागने के बाद, ऊतक के एक पर्याप्त मात्रा में ऊतक-भंडारण मध्यम जलमग्न (जैसे 3-5 बार आंतों के ऊतकों की मात्रा) और व्यक्तिगत रूप से लेबल में स्टोर, पानी तंग प्लास्टिक कंटेनरों, बर्फ में जलमग्न या उपयोग तक प्रशीतित) ।
- संग्रह के समय से 18-26 घंटे के भीतर ऊतक की प्रक्रिया को पर्याप्त आरएनए क्षरण को रोकने के लिए ।
नोट: आंतों खंड और भंडारण की सफाई पर निर्भर करता है, यह हमारे सुझाव दिया समय सीमा का विस्तार करने के लिए संभव हो सकता है.
- पहले से मानव ऊतक संग्रह के लिए आवश्यक सभी सामग्री तैयार करें, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में दर्शाया गया है (अधिक विस्तृत उत्पाद जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें) । सुनिश्चित करें कि सभी आवश्यक व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण हर समय पहना जाता है ।
- एक सूखी बर्फ के घोल के साथ सूखी बर्फ की बाल्टी तैयार के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है ।
- क्रश पर्याप्त सूखी बर्फ 4 मानक परिपत्र बर्फ बाल्टी और एक आयताकार बर्फ बाल्टी भरने के लिए । एक मानक बाल्टी छोटे (11 x 21 सेमी) प्रयोगशाला के ऊतकों सूखी बर्फ की सतह पर रखा जाना चाहिए । यदि संभव हो तो, प्रयोगशाला के ऊतकों के नए, खुले बक्से का उपयोग करें ।
- एक साफ आयताकार बर्फ की बाल्टी में सूखी बर्फ के 2 एल powderizing द्वारा एक सूखी बर्फ का घोल बनाओ ।
- सूखी बर्फ की सतह के लिए पूर्व ठंडा 2-एमबी जोड़ें । थोड़ा मिश्रण और एक पिपेट टिप बॉक्स का उपयोग कर घोल समतल एक आयताकार बाल्टी के पक्षों के साथ सूखी बर्फ के बड़े टुकड़े से घिरा चैनल में घोल की सतह के आकार को कवर ।
- बर्फ की बाल्टी के किनारों के साथ सूखी बर्फ के कई पतले ब्लॉकों प्लेस के लिए और अधिक तेजी से ठंड प्रोत्साहित करते हैं । वहां ≥ 4 आधार molds के लिए कमरे में एक निश्चित समय पर सूखी बर्फ घोल बाल्टी में शिथिल फिट होना चाहिए ।
- वैकल्पिक रूप से, एक और आयताकार बर्फ सूखी बर्फ के साथ ¼ भर बाल्टी के भीतर बर्फ की बाल्टी ढेर । इस स्थिति बेहतर सूखी बर्फ के घोल को बचाने में मदद करता है और सूखी बर्फ की लगातार समायोजन और 2-एमबी प्रक्रिया के दौरान की आवश्यकता को रोकता है ।
- स्थिति सूखी बर्फ बाल्टी में एक विधानसभा लाइन में निंनलिखित क्रम में: 1) सूखी बर्फ घोल बाल्टी, 2) प्रयोगशाला ऊतक-सूखी बर्फ बाल्टी, 3 और 4) सामांय सूखी बर्फ बाल्टी, 5) आयताकार सूखी बर्फ बाल्टी (1 आंकड़ाएक) ।
2. फ्लैश-जमे हुए मानव आंत्र ऊतक की तैयारी
नोट: यह पूरी प्रक्रिया आंतों के ऊतकों की गुणवत्ता पर निर्भर करता है, आंत्र खंड प्रति 45-80 मिनट के बीच ले सकते हैं । हम भी LCM के साथ आगे बढ़ने से पहले आरएनए गुणवत्ता और प्रोटोकॉल का आकलन करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों को इकट्ठा करने की सिफारिश.
- सूखी बर्फ के ऊपर गीला बर्फ और जगह सर्जिकल काटने बोर्डों के साथ एक बड़ी ट्रे भरें ।
- इस सेटअप में, ठंडा एक ५०० मिलीलीटर और १००-एमएल यूरिन कोल्ड स्टोरेज सॉल्यूशन में टिशू और ट्रिम किए गए सेगमेंट के भंडारण के लिए । काटने बोर्डों पर पूर्व चिल बेस मोल्ड ताकि वे ऊतक प्राप्त करने के लिए तैयार हैं ।
- ताजा आंत्र ऊतक प्राप्त करने पर, मीडिया जिसमें ऊतक ले जाया जाता है और यह पूर्व ठंडा यूरिन में बनाए रखने के लिए बंद डालो । आंतों के ऊतकों और ट्रिम किए गए सेगमेंट के अस्थायी भंडारण के लिए इन यूरिन में कुछ कमरे छोड़ दें, जो बाद के चरणों में तैयार किया जाएगा ।
- लगभग 20 सेमी, जो बहाव अनुप्रयोगों और गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों के लिए आरएनए उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त ऊतक (40-60 cm2) प्रदान करता है की एक लंबाई करने के लिए आंत्र खंड में कटौती । ऊतक अखंडता पर निर्भर करता है, यह एक बहुत छोटे लंबाई (यानी, आंत के 5 सेमी) के साथ बहाव प्रसंस्करण के लिए आरएनए अलगाव को पूरा करने के लिए संभव हो सकता है ।
- सर्जिकल कैंची का उपयोग आंत से दूर वसा और संयोजी ऊतक ट्रिम कर दीजिए । आंतों serosa साथ अवशिष्ट वसा क्रमिक चरणों में ऊतक पूरी तरह से समतल करने की क्षमता समझौता । ध्यान से ऊतक ट्रिम, इसलिए के रूप में वसा और संयोजी ऊतक, जो संरचनात्मक रूप से myenteric जाल नुकसान या ऊतक के बाहरी कर सकते है हटाने के दौरान serosa निक से बचने के लिए असमान रूप से अनुभाग के लिए समतल ।
- mesenteric लगाव की साइट पर अधिमानतः आंतों के नमूने की पूरी लंबाई के साथ एक अनुदैर्ध्य चीरा बनाओ ।
- दूर काटना और बृहदांत्र से tenia कोलाई त्यागें, ताकि यह अधिक आसानी से समतल, पर तनाव से जारी किया जा रहा है ।
- Splay आंत म्यूकोसा-एक ठंडा काटने बोर्ड पर नीचे की ओर और ऊतक की पूरी लंबाई से १.२५ सेमी चौड़ा स्ट्रिप्स कटौती ।
नोट: आंतों के ऊतकों अक्सर ट्रिमिंग के बाद फैलता है, इसलिए इस आकार तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए । - अस्थाई रूप से ठंडा ऊतक-भंडारण समाधान में स्ट्रिप्स स्टोर ।
नोट: हम Belzer UW कोल्ड स्टोरेज सॉल्यूशन का उपयोग करते है क्योंकि यह एक लंबा शैल्फ जीवन है, अपेक्षाकृत लागत प्रभावी है और जरूरत होने तक कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है । - शीत भंडारण समाधान से एक ऊतक पट्टी निकालें और यह क्षेत्रों में कटौती ~ 1.5-2 सेमी लंबा ।
- जल्दी प्रयोगशाला पोंछे के ढेर पर आंत्र क्षेत्रों दाग, अतिरिक्त तरल को हटाने और फ्लैश-ठंड के दौरान आंत्र serosa के साथ बर्फ क्रिस्टल के गठन को रोकने के लिए । ऊतक पर्याप्त रूप से सूख नहीं है, तो यह myenteric जाल से उच्च गुणवत्ता वाले वर्गों को प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो जाएगा ।
- एक पूर्व ठंडा, बड़े, डिस्पोजेबल प्लास्टिक बेस मोल्ड (३७ मिमी x 24 मिमी x 5 मिमी) पर blotted आंत्र टुकड़े म्यूकोसा-पक्ष करना ।
- ध्यान से हल्के से आधार मोल्ड की सतह पर ऊतक खींच और घुमावदार संदंश का उपयोग करने के लिए धीरे नीचे प्रेस और किसी भी हवा के बुलबुले कि serosa के नीचे फंस सकता है निष्कासित द्वारा प्रत्येक खंड समतल । ध्यान रखें कि ऊतक समतल करते समय फैलता है । यदि आवश्यक हो, तो सेगमेंट ट्रिम करें और बचे हुए नमूनों को छोटे आकार में काटें ।
नोट: यदि ऊतक से अधिक फैला है, यह myenteric जाल विकृत होगा । सभी हवाई बुलबुले निकाल दिए जाते हैं के बाद, ठंड से पहले नमूने की मोटाई का आकलन. यदि आवश्यक हो, नमूना आवक के किनारों पुश जब तक आंत्र नमूना अपने मूल मोटाई दृष्टिकोण । - सूखी बर्फ की सतह पर भरी हुई बेस मोल्ड प्लेस, 2-एमबी घोल । ऊतक 30-60 एस के भीतर पूरी तरह से स्थिर होना चाहिए, आकार और आंत्र खंड की मोटाई पर निर्भर करता है ।
- सूखी बर्फ की दूसरी बाल्टी में ठंडा प्रयोगशाला के ऊतकों पर बेस मोल्ड जल्दी से रगड़ द्वारा अवशिष्ट 2-एमबी निकालने के लिए आधार मोल्ड के नीचे सूखा ।
- सूखी बर्फ के तीसरे टब में सूखे नमूने हस्तांतरण और यह सूखी बर्फ की सतह के नीचे दफन जब तक यह लपेटा जा करने के लिए तैयार है ।
- जल्दी आधार मोल्ड के नीचे लपेटने से पहले निरीक्षण, नमूना तैयारी की गुणवत्ता की जांच करने के लिए । किसी भी नमूने है कि फ्लैट दिखाई नहीं देते या बड़े हवाई बुलबुले, के रूप में इन cryosectioning और LCM के लिए बचा जाना चाहिए के नोट बनाओ ।
- पूर्व में नमूना लपेटें एल्यूमीनियम पंनी कि एक बाल्टी में सूखी बर्फ के ऊपर रखी है ताकि ऊतक के लपेटन होता है, जबकि पूरी तरह से जमे रखा जा रहा है ।
- -८० डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के दौरान ऊतक निर्जलीकरण को कम करने के लिए, प्लास्टिक लपेटो की एक परत के साथ नमूना लपेटें ।
- आयताकार बाल्टी में नमूनों की दुकान जब तक वे फ्रीजर के लिए ले जाया जा करने के लिए तैयार हैं ।
- पूर्व लेबल और पूर्व चिल फ्रीजर बक्से पर-८० ° c संग्रह के बाद नमूनों के तत्काल भंडारण के लिए ।
- LCM आयोजित करने से पहले आरएनए अखंडता के आकलन के लिए प्रत्येक आंत्र खंड से ऊतक का एक छोटा सा हिस्सा ले लो ।
- पूर्व लेबल एक 2-एमएल RNase-प्रत्येक खंड के लिए मुफ्त ट्यूब, lysis बफर के ≥ ५०० µ एल से भरा । हम सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध आरएनए निष्कर्षण किट "डी" का उपयोग करने की सलाह देते हैं ।
- Homogenize एक मानक ऊतक सूक्ष्म homogenizer में आंत का एक छोटा (2 मिमी x 2 मिमी) टुकड़ा (20-40 एस, जब तक कोई ऊतक हिस्सा रह) । फिर, आरएनए lysate को सूखी बर्फ पर तुरंत फ्रीज़ करें और शाही सेना निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ने तक-८० ° c पर स्टोर करें ।
- वैकल्पिक रूप से, एक पीठ के रूप में ऊतक ठंड मध्यम (TFM) में वर्गों में से कुछ एंबेड । इस खंड में वर्णित ठीक उसी तरह ऊतक वर्गों तैयार है, लेकिन TFM में आधार मोल्ड के भीतर नमूने फ्लैश-ठंड से पहले जलमग्न ।
3. Cryosectioning
- cryosectioning से पहले, धुंधला और निर्जलीकरण के लिए सभी आवश्यक सामग्री तैयार करने और सूखी बर्फ की एक बाल्टी में-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से वांछित ऊतक नमूने हस्तांतरण ।
- इष्टतम काटने के तापमान (-18 से-22 डिग्री सेल्सियस) के लिए सेट करके उपयोग के लिए cryostat तैयार करने और नीचे पोंछते १००% इथेनॉल के साथ सतहों और ब्लेड और RNase के साथ ब्रश ट्रे उपचार दूषण समाधान ।
- सबसे अच्छा चक करने के लिए नमूना का पालन करने के लिए, निंनलिखित दृष्टिकोण का उपयोग करें ।
- सूखी बर्फ में संदंश आंतों के नमूने unwrapping से पहले और सूखी बर्फ serosa की सतह पर रखने के लिए जगह है ।
- एक बड़े cryostat नमूना धारक पर ऊतक ठंड मध्यम (TFM) के एक 3-5 मिमी टीले डालो और तुरंत आंत्र नमूना serosa-पक्ष-अप TFM पर स्थानांतरण ।
- जल्दी से बर्फ सूखी और TFM के लिए नमूना का पालन करने के लिए अनुमति देने के बाद पाउडर सूखी बर्फ के साथ कवर करने के लिए नमूना धारक हस्तांतरण 2-5 s कमरे के तापमान पर । सुनिश्चित करें कि TFM myenteric जाल के विमान के नीचे रहता है ।
नोट: आदर्श रूप में, आंतों की श्लेष्मा झिल्ली की बाहरी सतह पूरी तरह से TFM का पालन करने से पहले TFM नमूने के गल बिना फ्रीज करने के लिए शुरू होता है ।
- cryostat के नमूना सिर में नमूना धारक माउंट और cryostat ब्लेड के साथ नमूना संरेखित करें, इस तरह कि myenteric जाल के विमान काटने ब्लेड के समानांतर हो जाएगा ।
- cryostat पर खोदी गई मोटाई को 8 µm पर सेट करें । पूरी तरह से नमूना संरेखित का उद्देश्य प्रत्येक स्लाइड पर myenteric जाल का सबसे बड़ा संभव सतह क्षेत्र प्राप्त करने के लिए है । इस मोटाई आम तौर पर दोनों मानव और मूषक ऊतक के लिए सिफारिश की है, लेकिन समायोजित किया जा सकता है, के रूप में की जरूरत है ।
- serosa और अनुदैर्ध्य मांसपेशी myenteric जाल तक पहुंचने तक अनुभाग के माध्यम से ।
- myenteric जाल का पता लगाने के लिए, एक स्लाइड पर एक नमूना अनुभाग माउंट और एक जलीय डाई के साथ अनुभाग दाग, इस तरह के रूप में 1% Cresyl वायलेट या toluidine नीला, आदि
- अनुदैर्ध्य और परिपत्र मांसपेशी परतों के बीच जंक्शन की पहचान करने के लिए 40-2000X आवर्धन पर एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत अनुभाग देखें । माइक्रोस्कोप मापदंडों सामग्री की तालिकामें प्रदान की जाती हैं । अनुभागीकरण के प्रारंभ में, serosa संयोजी ऊतक की उपस्थिति के द्वारा चिह्नित किया जाएगा । कुछ शेष mesenteric फैट भी serosa के साथ मौजूद हो सकता है । बाहरी अनुदैर्ध्य मांसपेशी परत की एक चादर तो शुरू होता है । एक बार अनुदैर्ध्य और परिपत्र मांसपेशी परतों के बीच सीमा तक पहुंच गया है, प्रवेश गैंग्लिया के एक भाग मनाया जाएगा ।
नोट: अगले कई वर्गों में, myenteric जाल बहुत स्पष्ट हो जाएगा, गैंग्लिया के बड़े swaths के साथ एक ही खंड (चित्रा 2सी) के भीतर उपस्थित किया जा रहा है । यदि खंड के शुरू में ऊतक पूरी तरह से सपाट नहीं है, तो गैंग्लिया के केवल एक भाग एक निश्चित समय पर प्रत्येक अनुभाग में मौजूद होंगे । कई बार, आंतों के नमूने एक स्वाभाविक असमान myenteric जाल हो सकता है, ऊतक पूरी तरह से दिखने फ्लैट के बावजूद. यह ग्रहणी नमूनों के लिए विशेष रूप से सच है । हमारे अनुभव में, इन नमूनों LCM के साथ प्रक्रिया करने के लिए ज्यादा समय लग सकता है, लेकिन पर्याप्त आरएनए एक दिन के सत्र के भीतर एकत्र किया जा सकता है । सटीक स्थान myenteric जाल के नमूनों के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं, के आधार पर ऊतक और इसकी तैयारी ठंड से पहले.
- LCM के लिए धारावाहिक वर्गों का संग्रह शुरू, इष्टतम संग्रह के साथ न्यूरॉन्स और स्लाइड प्रति glia की सबसे बड़ी संख्या प्रदान. नमूना की सतह क्षेत्र के आधार पर, एकाधिक अनुभागों को किसी एकल पेन-झिल्ली स्लाइड पर संयोजित किया जा सकता है.
- कलम झिल्ली स्लाइड पर वर्गों माउंट, cryostat में संक्षेप में 5-10 s के लिए ठंडा । जब बढ़ते, ऊतक केवल थोड़ा पिघला, अधिक से अधिक आरएनए अखंडता संरक्षण करना चाहिए ।
4. सना
नोट: धुंधला होने की प्रक्रिया के ओवरव्यू के लिए, तालिका 1देखें । उपयोग किए गए सभी समाधान मानक ५०-एमएल शंकु शीशियों में तैयार कर रहे हैं । RNase संक्रमण समाधान के साथ ट्यूबों के बाहर के इलाज के परिणाम में सुधार करने के लिए प्रकट नहीं होता है (डेटा नहीं दिखाया गया है).
- ९५% इथेनॉल में 4% Cresyl वायलेट के एक संतृप्त समाधान पहले से कम एक दिन में तैयार है और पूरी तरह से फिर से Cresyl वायलेट निलंबित सिरिंज लोड करने से पहले ।
नोट: इथेनॉल की एकाग्रता को प्रभावी धुंधलान के लिए कम करने की आवश्यकता हो सकती है, जैसा कि चर्चा अनुभाग में वर्णित है । हम परीक्षण नहीं किया है कि दाग के दौरान ५०% या ७५% इथेनॉल का उपयोग काफी आरएनए अखंडता कम कर देता है । Cresyl वायलेट प्रकाश के प्रति संवेदनशील है और इस प्रकार प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए । - स्लाइड पर myenteric जाल के बढ़ते वर्गों के बाद, तुरंत ९५% इथेनॉल की एक शंकु शीशी में स्लाइड (पूर्व ठंडा-20 डिग्री सेल्सियस) 30 एस के लिए जलमग्न ।
- यदि वर्गों को पूरी तरह से पिछले कदम में स्लाइड का पालन नहीं किया, थोड़ा एक दस्ताने हाथ के साथ स्लाइड के नीचे गर्म (एक प्रयोगशाला पोंछ में रखा जाना चाहिए-स्लाइड और दस्ताने के बीच), ९५% इथेनॉल में विलय से पहले पूर्ण पालन के लिए । यह समाधान आरएनए अखंडता को कम करने के बिना कम से कम 3-6 स्लाइड के लिए फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है ।
- स्लाइड फ़ेस-अप एक पूर्व इलाज, RNase-मुक्त कंटेनर8के ऊपर रखा एक प्रयोगशाला पोंछे पर रखना ।
- पूर्व एक 3 मिलीलीटर 4% Cresyl वायलेट के साथ सिरिंज भरें और एक ०.२-µm सिरिंज फिल्टर संलग्न ।
नोट: हम फाइबर एसीटेट फिल्टर की सलाह देते हैं । - दाग की 6-10 बूँदें सीधे ऊतक वर्गों पर लागू करें8 और 10-30 एस के लिए गर्मी, या जब तक पर्याप्त डाई बनाए रखा है जब de-सना हुआ. जबकि धुंधला, धीरे हाथ से स्लाइड कंटेनर को घुमाएगी सुनिश्चित करने के लिए कि ऊतक वर्गों समान रूप से दाग के साथ लेपित हैं ।
- बंद दाग डालो और तुरंत de-दाग ७५% इथेनॉल की एक शीशी में स्लाइड । अतिरिक्त डाई ज्यादातर नमूने से दूर रिसाव है जब तक बार-बार स्लाइड जलमग्न. यह 10-20 s के बीच ले सकता है ।
- डे-दाग को अंतिम रूप देने के लिए ९५% इथेनॉल के एक शीशी में नमूना 10 एस के लिए बार-बार सूई के नमूने जब तक सभी अतिरिक्त दाग हटा दिया गया है ।
- गैंग्लिया के दाग को अनुकूलित करने के लिए, आवश्यकतानुसार, धुंधला अवधि संशोधित करें । यदि बहुत अधिक दाग हटा दिया जाता है, नमूना भी पारदर्शी हो जाता है और यह कल्पना करने के लिए मुश्किल हो सकता है
नोट: यह दाग प्रोटोकॉल कई प्रकाशनों के आधार पर अनुकूलित किया गया है5,8,10,11 जो संतोषजनक परिणाम से पहले आवश्यक संशोधन प्राप्त किया गया । इसलिए, डाई में इस्तेमाल किया इथेनॉल की एकाग्रता और धुंधला प्रक्रिया के दौरान संशोधित किया जाना चाहिए, जब आवश्यक हो, एक इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए.
- गैंग्लिया के दाग को अनुकूलित करने के लिए, आवश्यकतानुसार, धुंधला अवधि संशोधित करें । यदि बहुत अधिक दाग हटा दिया जाता है, नमूना भी पारदर्शी हो जाता है और यह कल्पना करने के लिए मुश्किल हो सकता है
5. निर्जलीकरण
- तुरंत १००% इथेनॉल 2-3 बार में स्लाइड डुबकी, 10-20 एस की कुल के लिए ।
- निर्जल में स्लाइड १००% इथेनॉल कम 30 एस के लिए जलमग्न । के रूप में निर्जल इथेनॉल बहुत हीड्रोस्कोपिक है, १००% इथेनॉल की शीशी के लिए आणविक छलनी (8-12 मेष) जोड़ने से पहले प्रक्रिया के शुरू करने के लिए किसी भी अवशोषित पानी हटाने और इस प्रकार अधिक पूरी तरह से निर्जलीकरण नमूना5।
- बार 15-20 एस के लिए xylene में स्लाइड डुबकी । यह चरण पूरी तरह से स्लाइड पर इथेनॉल की परत निकालता है. आणविक छलनी xylene की नलियों को समय से आगे जोड़ें, पूरी तरह से adsorb अतिरिक्त इथेनॉल और पानी के अणुओं5।
चेतावनी: Xylenes आंखों और ऊपरी श्वसन तंत्र के लिए एक अड़चन के रूप में वर्गीकृत कर रहे है और एक रासायनिक धुएं डाकू में इस्तेमाल किया जाना चाहिए । - xylene में स्लाइड (आणविक छलनी, 8-12 मेष के साथ) कम से कम 10 मिनट के लिए जलमग्न ।
नोट: यदि जरूरत हो तो इस कदम के बाद एक संक्षिप्त विराम लिया जा सकता है । नमूनों को xylene में 4-5 घंटे के लिए हानिकारक प्रभाव के बिना दाग, LCM या आरएनए उपज/ - वैकल्पिक रूप से, व्यक्तिगत रूप से इस बिंदु पर कई अतिरिक्त स्लाइड तैयार । सभी तैयार की गई स्लाइड्स पर LCM को पूरा करने के बाद स्लाइड्स का दूसरा राउंड तैयार करते हैं, तो टिशू की सतह के निर्जलीकरण के कारण cryostat में टिश्यू को फिर से अंकित करना पड़ सकता है । एक से चार अनुभागों को उपयोगी अनुभागों को एकत्र करने से पहले छोड़ दिए जाने की आवश्यकता हो सकती है ।
6. लेजर कैप्चर Microdissection (LCM)
- xylene और हवा से स्लाइड निकालें-यह एक रासायनिक धुएं के हुड में सूखी से कम 1 मिनट के लिए । LCM माइक्रोस्कोप चरण में LCM टोपियां के एक कारतूस डालें । स्लाइड को चरण पर लोड करें और स्लाइड की एक ओवरव्यू छवि पाएँ.
- LCM के लिए इच्छित स्थान को पहचानें और स्लाइड पर एक कैप लोड करें ।
- अवरक्त (आईआर) लेजर संरेखित करें और अपनी शक्ति और अवधि के लिए एक 20-30 µm व्यास कब्जा जगह बनाने के लिए समायोजित करें ।
- पराबैंगनी (यूवी) लेजर का पता लगाने और एक उचित काटने की गति और तीव्रता सेट ।
- LCM सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एकत्र किए जाने वाले इच्छित गैंग्लिया को बाह्यरेखांकित करें, कैप पर संग्रहणीय क्षेत्र की सीमा के भीतर रहना सुनिश्चित करें (सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम की स्लाइड अवलोकन में एक हरे वृत्त के रूप में दर्शाया गया).
- प्रत्येक अंश में, ir धब्बे को समायोजित करें, जैसे कि हर 100-500 µm में कम से एक ir स्थान है ।
- सभी चिह्नित गैंग्लिया के संग्रह के साथ आगे बढ़ने के लिए IR/यूवी कट बटन दबाएँ ।
- एक बार संग्रह पूरा कर रहे हैं, या तो एक नए स्थान के लिए टोपी कदम और संग्रह की प्रक्रिया को दोहराने या LCM टोपी की जांच QC स्टेशन पर एक बार टोपी पर्याप्त गैंग्लिया से भरा है (या जब तक 60-80 मिनट की सिफारिश की समय सीमा तक पहुंच गया है) ।
- यदि मलबे टोपी पर मौजूद हैं, इसे दूर पोंछ एक ठीक का उपयोग तूलिका कि पूर्व गया है RNase दूषण समाधान के साथ इलाज किया, nuclease के साथ कुल्ला मुक्त पानी, और पूरी तरह से सूख गया ।
- ध्यान से आँख से टोपी की जांच करें या एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत आवर्धन के साथ सभी मलबे को हटा दिया गया है सुनिश्चित करने के लिए. यदि मलबे पूर्व इलाज तूलिका के उपयोग के माध्यम से नहीं हटाया जा सकता है, तो एक ठीक पिपेट टिप का उपयोग करें (RNase मुक्त) दूर मलबे परिमार्जन ।
- एक ०.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब आरएनए lysis बफर के २३० µ एल से भरा पर टोपी को सुरक्षित (आरएनए निष्कर्षण किट से बफर RLT "बी", β-mercaptoethanol के साथ 10 µ एल के एक एकाग्रता में जोड़ा/
- टोपी उलटा, संक्षेप भंवर, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
- 5 मिनट के लिए ≥ ५,००० x g पर केंद्रापसारक और फिर सूखी बर्फ के लिए microfuge ट्यूब हस्तांतरण ।
नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । आरएनए lysates-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है पर एक पर्याप्त प्रभाव के बिना आरएनए गिरावट के लिए न्यूनतम 1 सप्ताह. आरएनए अलगाव एक ही दिन किया जाता है, तो वे निष्कर्षण के लिए तैयार कर रहे हैं जब तक बर्फ पर नमूनों ठंडा. - xylene से स्लाइड को हटाने के बाद 80-90 मिनट की अनुशंसित अधिक से अधिक समय सीमा के भीतर सभी अतिरिक्त संग्रह करते हैं । के रूप में निर्जलित वर्गों परिवेश आर्द्रता को उजागर कर रहे हैं, RNases धीरे से सक्रिय हो सकता है । संग्रह अवधि सीमित इस तरह के प्रभाव को कम करने और अधिक से अधिक आरएनए अखंडता की रक्षा कर सकते हैं ।
7. आरएनए अलगाव
- आरएनए निकालने के लिए एक RNase-मुक्त कार्यस्थान तैयार करें ।
- आरएनए निष्कर्षण किट के लिए मैनुअल के अनुसार सभी ट्यूबों और रिएजेंट्स तैयार करें ।
नोट: जबकि आरएनए अलगाव LCM निम्नलिखित के लिए उपलब्ध कई किट हैं, हम सबसे अच्छा आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर सफलता मिली है "बी", सामग्री की सूची में सूचीबद्ध. आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट की एक साथ-साथ तुलना के लिए चित्रा 5 देखें । - एक ३७ ° c पानी स्नान में-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर और तेजी से गल से नमूने निकालें ।
- तुरंत भंवर गल नमूने 2-3 एस के लिए समान रूप से guanidinium thiocyanate साल्ट वितरित करने के लिए ।
- ७०% इथेनॉल के एक बराबर मात्रा के साथ प्रत्येक नमूना गठबंधन । पूल 2 या अधिक lysates एक साथ, यदि आवश्यक हो, एक पर्याप्त आरएनए एकाग्रता तक पहुंचने के लिए ।
- microdissected नमूनों के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग, आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया के लिए मैनुअल में निर्माता के निर्देशों के अनुसार आगे बढ़ें ।
- nuclease के न्यूनतम अनुशंसित मात्रा में अंतिम चरण में Elute आरएनए-मुक्त पानी (14 µ l).
- शाही सेना अलगाव के बाद, aliquot 1-2 µ एल आरएनए के एक नए पूर्व लेबल RNase-मुफ्त ट्यूब एक microfluidics डिवाइस है कि आरएनए की छोटी मात्रा में, इस तरह के एक के रूप में कल्पना कर सकते हैं के साथ गुणवत्ता नियंत्रण के लिए में प्रत्येक नमूने से एक उच्च संवेदनशीलता आरएनए ठहराव किट के साथ ठहराव के लिए एक अलग ट्यूब में एक अतिरिक्त 1 µ l Aliquot ।
- इन चरणों को समायोजित करें, आवश्यकतानुसार, बहाव विश्लेषण के लिए आरएनए की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए (यानी, आरएनए निष्कर्षण से पहले LCM कैप्स की एक बड़ी संख्या पूल).
- बहाव विश्लेषण के लिए पर्याप्त नमूनों का संग्रह जब तक-८० ° c पर आरएनए स्टोर.
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Representative Results
हम मौजूदा प्रोटोकॉल है कि LCM का उपयोग कर मानव आंत्र नमूनों से प्रवेश गैंग्लिया के अपेक्षाकृत तेजी से संग्रह सक्षम करने के लिए कई सुधार किए हैं, आरएनए-Seq के लिए मानकों की बैठक । सबसे पहले, हम 2-एमबी (चित्रा 1ख) में सूखी बर्फ का एक घोल की सतह पर रखा बड़े आधार मोल्ड में आंत्र ऊतक क्षेत्रों के तेजी से ठंड अनुकूलित । cryosectioning और बाद के LCM के दौरान सबसे अच्छी सफलता आंतों एक आधार मोल्ड के भीतर फ्लैट क्षेत्रों बिछाने से प्राप्त किया गया था, म्यूकोसा का सामना करना पड़-साइड (आंकड़े 1b-1C) । यह सुनिश्चित करें कि आधार मोल्ड के रूप में आधार पर संभव के रूप में फ्लैट हैं, किसी भी वक्रता के रूप में यह बहुत अधिक मुश्किल myenteric जाल के एक बड़े पार अनुभाग प्राप्त करने के लिए कर देगा । ऊतक कि आसानी से 8-µm मोटाई (चित्रा 1ई) में खोदी है और धुंधला प्रक्रिया से TFM के पूर्ण उंमूलन के लिए अनुमति देता है में यह दृष्टिकोण परिणाम है । हमने पाया है कि TFM धुंधला प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप और इस तरह प्रवेश गैंग्लिया की पहचान अस्पष्ट । इस उंमुखीकरण में ऊतक स्थिति भी श्लेष्मा झिल्ली, जो RNases12के एक उच्च सामग्री है के माध्यम से अनुभाग से बचा जाता है, हालांकि हमारे अनुभव से, यह प्रतीत होता है कि इथेनॉल के दाग का उपयोग काफी हद तक इन RNases को रोकता है । मामलों में जहां TFM या इष्टतम काटने तापमान (OCT) मध्यम की जरूरत है, हम यह सबसे पहले बेस मोल्ड के नीचे नमूना समतल करने के लिए और फिर इस कदम (चित्रा 1डी) निंनलिखित मोल्ड को TFM जोड़ने के लिए विश्वसनीय पाया । यह एक "खिड़की" जिसमें आंत आसानी से visualized किया जा सकता है छोड़ देता है, यह आसान नमूना संरेखित करने के लिए और वर्गों है कि पूरी तरह से myenteric जाल (चित्रा 1ई) के समानांतर है उपज बना ।
myenteric जाल (चित्रा 2ए) के समानांतर अभिविंयास में आंत की लंबाई नीचे cryosections longitudinally की तैयारी, वर्गों में जो स्लाइड प्रति प्रवेश गैंग्लिया का सबसे बड़ा क्षेत्र धुंधला पर दिखाई दे रहे है उत्पंन ( चित्रा 2 ग). जब myenteric जाल आ (चित्रा 2सी), अनुदैर्ध्य और परिपत्र मांसपेशी परतों के apposition पर (चित्रा 2ख), 6-12 धारावाहिक वर्गों एकत्र किया जा सकता है (चित्रा 2ए, अनुदैर्ध्य) जिसमें एंट्रेंस गैंग्लिया के बड़े swaths होते हैं (चित्रा 2सी). LCM कैप्स एक एकल खंड (चित्रा 4डी) का उपयोग कर क्षमता को लोड किया जा सकता है । इसके विपरीत, जब ताजा जमी आंत के अनुप्रस्थ वर्गों (आंकड़े 2a-2 बी) की तैयारी, वहां केवल myenteric जाल के एक छोटे से क्षेत्र प्रत्येक स्लाइड (चित्रा 2ख) पर मौजूद है । बहुत कुछ दर्जी गैंग्लिया अनुप्रस्थ ऊतक वर्गों से एकत्र किया जा सकता है, अधिक से अधिक समय निवेश और नमूना समग्र प्रति उच्च लागत में जिसके परिणामस्वरूप । समानांतर-खंड दृष्टिकोण LCM टोपियां और अनुप्रस्थ वर्गों के साथ तुलना में स्लाइड की संख्या के एक से कम पांचवें का उपयोग करता है और बहुत संग्रह की प्रक्रिया में तेजी लाने ।
LCM से पहले, नमूने दाग और पूरी तरह से LCM संग्रह के दौरान RNase गतिविधि से बचने के लिए निर्जलित होना चाहिए । हम सीधे आरएनए अखंडता पर इथेनॉल दाग बनाम जलीय दाग के प्रभाव की तुलना करने के लिए एक प्रयोग बनाया है । इस प्रयोग में, दो आंत्र अनुभाग एक ही स्लाइड पर एक साथ माउंट किए गए थे और चार तरीकों में से एक में संसाधित किए गए थे, n = 2-3 प्रति समूह के साथ जैविक प्रतिकृति । पहले समूह में, ताजा आंत्र वर्गों एक स्लाइड पर घुड़सवार नहीं थे और प्रत्येक सीधे आरएनए lysis बफर में हस्तांतरित किया गया था RNase मुक्त संदंश पूर्व सूखी बर्फ पर ठंडा (चित्रा 3ए) का उपयोग कर । शेष सभी समूहों के लिए, अनुभाग एक स्लाइड के लिए पालन किया गया, संसाधित, एक RNase दूषण समाधान-इलाज उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर स्लाइड से बंद परिमार्जन, और RNase मुक्त संदंश के साथ आरएनए lysis बफर को हस्तांतरित. सभी समूहों में नमूनों को पूरी तरह लाइसे करने के लिए एक स्टैंडर्ड माइक्रो-homogenizer का इस्तेमाल किया गया । दूसरे समूह में, स्लाइड सभी चरणों के माध्यम से संसाधित किए गए थे, लेकिन कोई डाई धुंधला प्रक्रिया (चित्रा 3बी) के दौरान इस्तेमाल किया गया था । समूह तीन प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित के साथ कार्रवाई की थी, 4% Cresyl वायलेट डाई (चित्रा 3सी) का उपयोग कर । चौथे समूह में, एक जलीय दाग, toluidine नीले, जबकि एक जलीय आधारित धुंधला किट toluidine नीले और hematoxylin (चित्रा 3डी) का एक मिश्रण का उपयोग कर के लिए प्रोटोकॉल के बाद इस्तेमाल किया गया था । आरएनए निकालने के बाद, वर्णित के रूप में, आरएनए गुणवत्ता एक विश्लेषक के साथ मूल्यांकन किया गया था. जलीय और इथेनॉल धुंधला प्रोटोकॉल के बीच अंतर केवल दो पानी की गर्मी के अलावा था (30 एस प्रत्येक), तुरंत पहले और धुंधला है, जो और डाई की प्रतिधारण के लिए आवश्यक है के बाद । हमने पाया है कि स्लाइड और निर्जलीकरण चरणों के साथ प्रसंस्करण के लिए ऊतक वर्गों का पालन करने की प्रक्रिया में एक मामूली, आरएनए गुणवत्ता की अपरिहार्य कमी (आंकड़े 3-बी) के लिए नेतृत्व किया, लेकिन है कि इथेनॉल डाई, Cresyl वायलेट के साथ धुंधला, आगे नहीं आरएनए गुणवत्ता (चित्रा 3सी) को कम करें । इसके विपरीत, जलीय डाई, toluidine नीले, पर्याप्त शाही सेना गिरावट के लिए नेतृत्व किया, की संभावना विस्तारित जलीय जोखिम के कारण है कि परमिट अंतर्जात RNase गतिविधि (चित्रा 3डी) ।
प्रवेश गैंग्लिया के अद्वितीय आकार पारंपरिक ग्लास6 स्लाइड के साथ मानक आईआर-LCM के लिए कठिनाइयों मुद्रा (चित्रा 4ए) । पेन-झिल्ली स्लाइड (चित्रा 4बी) का उपयोग करते समय, नमूने कांच स्लाइड के बहुमत से अलग है कि एक पतली चादर के लिए पालन कर रहे हैं । यूवी लेजर दोनों नमूना और पेन झिल्ली के माध्यम से कटौती, स्लाइड से गैंग्लिया की पूरी टुकड़ी में जिसके परिणामस्वरूप (चित्रा 4सी) और LCM टोपी के लिए पूर्ण पालन (चित्रा 4डी). किसी भी वांछित आकार और आकार की संरचना (> 10-15 µm) पूरी तरह से और ठीक हो सकता है एकत्र (4E-4H लगा) । अनुभाग प्रति कम गैंग्लिया के साथ कुछ नमूनों के लिए, टोपी इकट्ठा करने से पहले चार बार ≥ ले जाया जा सकता है । इस स्थिति में, प्रति स्लाइड दो से तीन अनुभाग बढ़ते पेन-झिल्ली स्लाइड का उपयोग कम करता है ।
आरएनए-seq के लिए LCM नमूनों से आरएनए को अलग करते समय, सभी जीनोमिक डीएनए (gDNA) को नष्ट करते हुए उच्चतम संभव आरएनए गुणवत्ता और मात्रा प्राप्त करने के लिए लक्ष्य है. एक आदर्श आरएनए अलगाव प्रक्रिया की पहचान करने के लिए, हम एक आरएनए निष्कर्षण किट के साथ एक सिर से सिर तुलना प्रदर्शन "एक" (चित्रा 5ए), आरएनए निष्कर्षण किट "बी" (चित्रा 5ख), या आरएनए निष्कर्षण विधि "सी" साफ-आरएनए नमूने के ऊपर के साथ द्वारा आरएनए निष्कर्षण किट "बी" (चित्रा 5सी). अनुकूलित Cresyl बैंगनी दाग प्रोटोकॉल के साथ नमूनों के प्रसंस्करण के बाद, LCM अनुदैर्ध्य मांसपेशी परत से लिया, आंतों के ऊतकों के मानकीकृत परिपत्र नमूने (५०० µm के व्यास) इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । प्रत्येक टोपी बेतरतीब ढंग से तीन आरएनए अलगाव समूहों में से प्रत्येक को सौंपा गया था, एक ०.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब पूर्व प्रत्येक किट से संबंधित lysis बफर के साथ भरा के ऊपर रखा जा रहा है । निर्देशों का पालन बिल्कुल के रूप में एक किट के लिए वर्णित के रूप में, आरएनए निष्कर्षण किट के साथ "एक" lysis 30 मिनट के लिए ४२ ° c पर मशीन की आवश्यकता बफर । अंय किट के लिए, कमरे के तापमान मशीन 30 मिनट के लिए इस्तेमाल किया गया था । सभी नमूनों संक्षेप lysis बफर के अलावा पर भंवर थे । नमूने तो बर्फ पर ठंडा थे जब तक निकालने के एक ही दिन आयोजित किए गए (n = 4) । हमने पाया है कि आरएनए निष्कर्षण किट "बी" एक पर कॉलम डीएनए पाचन कदम के साथ सबसे अधिक आरएनए गुणवत्ता और मात्रा में प्रभावी ढंग से gDNA को नष्ट करने के परिणामस्वरूप (आंकड़े 5 ए-5C). महत्वपूर्ण बात, आरएनए lysis आरएनए निष्कर्षण किट द्वारा प्रदान की बफर "बी" पूरी तरह से कब्जा कर लिया गैंग्लिया जब दर्जी गैंग्लिया (चित्रा 5डी) का संग्रह lyses.
औसतन, हमारे नमूनों में ७.४९ ± ०.५३ (तालिका 2) का रिण है । 6-7 से अधिक के रिण स्कोर आरएनए-seq के लिए पर्याप्त गुणवत्ता के समझा रहे हैं (विशिष्ट आरएनए प्रोफाइल पर निर्भर करता है)13, हमें विश्वास है कि हमारे नमूने आरएनए-seq के लिए पर्याप्त गुणवत्ता के हैं दे रही है । विचार है कि इन नमूनों के लिए रिण, रसीद पर, ७.४ से ९.५ तक की दूरी पर है, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि हमारे अनुकूलित प्रोटोकॉल आरएनए अखंडता का उत्कृष्ट संरक्षण प्रदान करता है । आरएनए-seq के लिए प्रस्तुत नमूनों से प्रतिनिधि आरएनए गुणवत्ता परिणाम 6A-6C आंकड़ोंमें दर्शाया गया है । आरएनए-seq से परिणाम प्रदर्शित करता है कि हमारे नमूने सफलतापूर्वक अनुक्रम और एक मामूली 3 '-अंत पूर्वाग्रह (चित्रा 6डी) किया गया । आम तौर पर, एक बड़ा 3 '-पूर्वाग्रह कम रिण14के साथ नमूनों में इष्ट है; यह प्रभाव मामूली हमारे नमूनों में परिलक्षित होता है । इस के बावजूद, मनाया जीन प्रकार के सभी नमूनों (चित्रा 6ई) के बीच काफी हद तक संगत थे, डेटा की विश्वसनीयता का संकेत है ।
चित्रा 1 . आंत्र ऊतक के इष्टतम ठंड । (क) सूखी बर्फ की बाल्टी को चित्रित क्रम में तैयार किया जाता है; i) सूखी बर्फ का घोल, ii) प्रयोगशाला के ऊतकों सूखी बर्फ के ऊपर रखा, iii) अस्थायी भंडारण बाल्टी, चतुर्थ) लपेटन बाल्टी, v) पूर्व फ्रीजर भंडारण बाल्टी, छठी) पूर्व फ्रीजर भंडारण ओवरफ्लो बाल्टी. (ख) हम सूखी बर्फ और 2-methylbutane का एक घोल की सतह पर रखा बड़े आधार मोल्ड में ऊतक क्षेत्रों के तेजी से ठंड अनुकूलित । (ग) एक पूरी तरह से जमे हुए नमूने की एक करीब-ऊपर की छवि, पैनल में दिखाया सेटअप में मनाया B. आंतों क्षेत्रों एक आधार म्यूकोसा का सामना करना पड़ मोल्ड में फ्लैट रखी हैं । (घ) इस ठंड विधि को TFM के साथ प्रयोग के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है उसी तरह से ऊतक तैयार करके, लेकिन ठंड से पहले TFM को जोड़ने के आधार मोल्ड । परिणामी नमूना एक पूरी तरह से फ्लैट myenteric जाल, एक serosa है कि आसानी से visualized किया जा सकता है के साथ होगा । (ङ) दोनों ऊतक तैयारी दृष्टिकोण की सिफारिश की 8 µm मोटाई पर उत्कृष्ट ऊतक वर्गों का उत्पादन । TFM का उपयोग कर प्रक्रिया यहां दर्शाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 . आंतों के ऊतकों का उचित अभिविन्यास वर्गों में प्रवेश गैंग्लिया अमीर प्रदान करता है. जब मानक अनुप्रस्थ पार की तैयारी ताजा-जमी आंत के वर्गों (ए, बी), वहां केवल myenteric जाल के एक छोटे से क्षेत्र (ख) प्रत्येक स्लाइड पर मौजूद है । बहुत कुछ दर्जी गैंग्लिया स्लाइड प्रति एकत्र किया जा सकता है, जो समय लेने वाली और महंगा है । इसके विपरीत, myenteric जाल (सी) के विमान में अनुदैर्ध्य वर्गों की तैयारी, गैंग्लिया (सी) के एक बहुत बड़ा सतह क्षेत्र प्रदान करता है । myenteric जाल के वर्गों serosa और अनुदैर्ध्य मांसपेशी (बी) के माध्यम से आवक अनुभाग से शुरू करके प्राप्त कर रहे हैं । जब myenteric जाल आ, अनुदैर्ध्य और परिपत्र मांसपेशी परत (ख) के जंक्शन पर, 6-12 धारावाहिक वर्गों एकत्र किया जा सकता है । myenteric जाल के प्रत्येक अनुदैर्ध्य अनुभाग में प्रवेश गैंग्लिया के बड़े swaths (सी में प्रतिनिधित्व किया है, एक संशोधित धुंधला प्रक्रिया का उपयोग कर, xylene बिना, तरजीही दाग गैंग्लिया) । LCM कैप्स एक एकल ऊतक अनुभाग का उपयोग कर क्षमता के लिए भरा जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 . एक इथेनॉल संगत डाई के साथ धुंधला आरएनए गुणवत्ता में सुधार । आरएनए गुणवत्ता के द्वारा मापा गया था और प्रत्येक समूह से दो नमूनों के प्रतिनिधि परिणाम प्रदर्शित किए जाते हैं । प्रारंभिक आरएनए गुणवत्ता ताजा, अनमाउंटेड वर्गों से मापा (एक, कोई इलाज नहीं), ८.६५ ± ०.०७ की एक आरएनए अखंडता संख्या (रिण) था. वर्गों के लिए घुड़सवार और सभी कदम के माध्यम से संसाधित है, लेकिन दाग (ख) के बिना, रिण ७.९५ ± ०.३५ था । जब 4% Cresyl वायलेट के साथ धुंधला निर्जलीकरण चरणों में जोड़ा गया था, वहां रिण पर एक नगण्य प्रभाव था, ७.८७ ± ०.३५ (सी) के एक औसत रिण के साथ । इसकी तुलना में, जलीय दाग का उपयोग, toluidine नीले (टी-नीला), और प्रक्रिया को आवश्यक पानी कुल्ला के अलावा (D) ६.४५ ± ०.२१ के एक रिण के साथ काफी कम आरएनए गुणवत्ता के परिणामस्वरूप, । प्रत्येक समूह के शामिल n = 3 जैविक प्रतिकृति के अलावा "कोई उपचार" और "T-नीला" (n = 2) । कुल्ला ± मानक विचलन मतलब के रूप में यहां की सूचना है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 . पेन झिल्ली LCM स्लाइडें प्रवेश गैंग्लिया का सटीक संग्रह सक्षम करें । LCM के माध्यम से प्रवेशात्मक गैंग्लिया इकट्ठा करने के लिए नियमित रूप से कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग अवांछित ऊतक पिक (ए) में परिणाम के लिए जाता है. लाल हलकों (व्यास में 30 µm) IR LCM संग्रह प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया स्थानों के आकार का संकेत मिलता है । सफेद तीर एक नाड़ीग्रंथि संग्रह है कि आसन्न muscularis ऊतक का एक टुकड़ा खींच इंगित करता है । पेन-झिल्ली स्लाइड (बी) के साथ, नमूनों एक पतली चादर है कि कांच स्लाइड के बहुमत से अलग है का पालन कर रहे हैं । जब यूवी LCM लेजर के साथ काटने, दोनों नमूना और पेन झिल्ली कटा हुआ, स्लाइड से गैंग्लिया की पूरी टुकड़ी में जिसके परिणामस्वरूप, नाड़ीग्रंथि आकार (सी) की परवाह किए बिना, और LCM टोपी का पूरा पालन जब नमूना से हटा दिया (डी ). किसी भी वांछित आकार और आकार ≥ 10-15 µm की संरचनाओं पूरी तरह से और ठीक एकत्र कर सकते हैं [(ई), प्रारंभिक ऊतक मार्क अप; (च) IR और यूवी लेजर काटना पूर्ण; (G) LCM कैप अनुभाग से निकाला गया], LCM कैप (H) पर विज़ुअलाइज़ के रूप में । पैनल एच में धब्बेदार पृष्ठभूमि टोपी के लिए अंतर्निहित है और अवांछित मलबे नहीं है । पैनलों ई एच में हरे घेरे नीले क्रॉसहेयर LCM कार्यक्रम का हिस्सा हैं और क्रमशः यूवी और IR पराबैंगनीकिरण के लिए प्लेसहोल्डर हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5 . एक इष्टतम आरएनए अलगाव किट का चयन. आरएनए अखंडता परिणाम तीन अलग आरएनए अलगाव प्रक्रियाओं की एक समवर्ती तुलना के बाद दिखाया जाता है । प्रत्येक समूह से दो प्रतिनिधि भूखंडों के समांतर में संसाधित नमूनों के बीच हो सकता है कि परिवर्तनशीलता को समझाने के लिए प्रदर्शित किए जाते हैं । आरएनए निष्कर्षण किट "a" (a) ६.८३ ± ०.६५ की एक रिण के साथ नमूनों का उत्पादन किया और मध्यम आरएनए पैदावार प्रदान की है, और एक पर स्तंभ DNase पाचन प्रदर्शन के बावजूद डीएनए संदूषण है करने के लिए खड़ा था । आरएनए निष्कर्षण किट "बी" (ख) ८.३ ± ०.१ में उच्चतम मापा रिण के परिणामस्वरूप,. जबकि phenol आधारित आरएनए निष्कर्षण विधि "सी" (साफ-आरएनए निष्कर्षण किट "बी") (ग) के साथ आरएनए नमूने के बाद gDNA को खत्म करने के लिए दिखाई दिया और ७.५ ± ०.२६ का रिण था, वहां बड़े प्रदूषित बैंड, जो के पिघलने से हुई हो सकता था आरएनए lysis कदम के दौरान LCM कैप से चिपकने वाला बहुलक । इसके अलावा, आरएनए से शाही सेना निष्कर्षण किट "एक" और निष्कर्षण विधि "सी" आरएनए निष्कर्षण किट "बी" द्वारा प्राप्त उन से लगातार कम थे. महत्वपूर्ण बात, आरएनए lysis आरएनए निष्कर्षण किट "बी" द्वारा प्रदान की बफर । (साथ जोड़ा गया β-mercaptoethanol) पूरी तरह से lyses कैप्चर किए गए गैंग्लिया (D). प्रत्येक समूह n = 3 जैविक प्रतिकृति थी और यहां प्रस्तुत के रूप में ± मानक विचलन मतलब है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 6 . प्रतिनिधि परिणाम । नमूना प्रति गैंग्लिया के दो टोपियां पूलिंग करते हैं, हम आरएनए-seq (> 1 एनजी) के लिए उत्कृष्ट आरएनए गुणवत्ता के साथ के लिए आरएनए के पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करते हैं । प्रतिनिधि आरएनए भूखंड ८.३ (क), ७.५ (ख), और ६.९ (सी) के रिण के साथ एक नमूने के लिए दिखाए जाते हैं. आरएनए-seq डेटा एक गुणवत्ता मूल्यांकन कार्यक्रम, आर में चलाने के माध्यम से चला रहे थे (घ) अंत-पूर्वाग्रह भूखंड नमूने सफलतापूर्वक अनुक्रम और एक मामूली 3 ' अंत पूर्वाग्रह है कि इंगित करता है. (ङ) जीन प्रकार की साजिश भी है कि अनुक्रमण परिणाम काफी हद तक नमूनों के बीच संगत कर रहे है का प्रतिनिधित्व करता है । कुल में, हम एक > 95% आरएनए के लिए प्रयोग करने योग्य नमूने पैदा करने में सफलता दर-Seq कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए किया है ।
| चरण | अवधि | उद्देश्य |
| ९५% इथेनॉल (-20 ओसी) | 30 एस | निर्धारण |
| ९५% इथेनॉल में 4% Cresyl वायलेट | 10-30 s | दाग |
| ७५% इथेनॉल (सूई दोहराया के साथ) | 15-25 s | डे-दाग |
| ९५% इथेनॉल (सूई दोहराया के साथ) | 5-15 s | डे-दाग |
| १००% इथेनॉल | 15 एस | निर्जलीकरण |
| १००% इथेनॉल (निर्जल) | 30 एस | निर्जलीकरण |
| Xylene (दोहराया की सूई के साथ) | 15-20 s | निर्जलीकरण |
| Xylene | > 10 मिनट | निर्जलीकरण |
| एयर-ड्राई | 1-3 मिनट | xylene का वाष्पीकरण |
तालिका 1. धुंधला और निर्जलीकरण प्रोटोकॉल सिंहावलोकन । इस तालिका हमारे अनुकूलित दाग प्रोटोकॉल रूपरेखा । ध्यान दें कि किसी भी इथेनॉल संगत दाग Cresyl वायलेट बदलने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, अगर यह बेहतर परिणाम प्रदान करता है । कुछ मामलों में, धुंधला और धुंधला होने की अवधि को बढ़ाया या छोटा करने की आवश्यकता होगी । आम तौर पर, अब निर्धारण समय, तेजी से ऊतक पूरी तरह से दाग हो जाएगा । हम एक ही ऊतक खंड से स्लाइड तैयार करते समय 3 बार के लिए फिर से शीशियों का उपयोग करने के बाद आरएनए अखंडता में कोई कमी पर ध्यान नहीं दिया है ।
| दाता | ऊतक | Rin |
| एफ | बृहदान्त्र | ७.१, ७.४, ७.२ |
| एम | लघ्वान्त्र | ७.२, ६.९, ७.८ |
| एम | ग्रहणी | ८.२, ७.४, ७.७ |
| लघ्वान्त्र | ७.४, ७.६, ७.३ | |
| बृहदान्त्र | ७.७, ७.८, ७.३ | |
| एफ | ग्रहणी | ७.१, ७.३, ६.९ |
| लघ्वान्त्र | ७.८, ७.९, ७.६ | |
| बृहदान्त्र | ७.३, ८.०, ७.५ | |
| एम | लघ्वान्त्र | ६.९, ६.७, ६.९ |
| बृहदान्त्र | ६.८, ६.४, ६.६ | |
| एम | लघ्वान्त्र | ७.२, ७.३, ७.६ |
| बृहदान्त्र | ६.७, ७.६, ७.७ | |
| एम | लघ्वान्त्र | ८.३, ७.८, ७.४ |
| बृहदान्त्र | ७.०, ७.४, ७.० | |
| एफ | ग्रहणी | ८.३, ८.८, ८.० |
| लघ्वान्त्र | ८.१, ८.०, ७.८ | |
| बृहदान्त्र | ८.४, ८.६, ७.१ |
तालिका 2. प्रतिनिधि आरएनए अखंडता परिणाम । इस तालिका में प्रदर्शित किए गए नमूने सभी मानव एंट्रेंस गैंग्लिया से प्राप्त किए गए थे. सभी चयनित नमूनों आरएनए-seq विश्लेषण के लिए पर्याप्त आरएनए गुणवत्ता और मात्रा है । इस सारणी में सूचीबद्ध सभी नमूनों का औसत रिण ७.४९ ± ०.५३ है । आरएनए एकाग्रता भी RiboGreen क्वांट का उपयोग कर मापा गया था-यह परख और सभी नमूनों में प्रदर्शित इस तालिका में हमारे आरएनए-seq (> 1 एनजी) प्रयोगों के लिए आवश्यक न्यूनतम मात्रा से मुलाकात की है. छोटी मात्रा, पूर्व प्रवर्धन प्रक्रिया के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, इस तरह की प्रक्रियाओं और अधिक विश्वसनीय है जब एक की उंमीद वहां नमूनों या समूहों के बीच जीन अभिव्यक्ति में बड़े मतभेद होने की तुलना में किया जा रहा है; अंयथा इन परिणामों के कुछ आरएनए-seq अनुप्रयोगों में सच मतभेद मुखौटा कर सकते हैं । इसलिए यह आम तौर पर अधिक सामग्री के साथ शुरू जब संभव सिफारिश की है ।
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Discussion
यह प्रक्रिया आरएनए-seq के लिए आरएनए प्राप्त करने के लिए एक स्रोत के रूप में कई एंट्रेंस गैंग्लिया के कुशल संग्रह को सक्षम बनाता है । यहां, हम मौजूदा प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रक्रियाओं तेज है, जबकि अधिक से अधिक आरएनए अखंडता संरक्षण । इस प्रक्रिया में सभी चरणों के रूप में निर्भर हैं, यह महत्वपूर्ण है कि सभी मुद्दों के अध्ययन की शुरुआत से समाप्त हो और यह है कि सभी नमूनों के रूप में इसी तरह के रूप में तैयार कर रहे है संभव के रूप में एक दूसरे के लिए, विश्वसनीय आरएनए-seq प्राप्त करने के लिए ।
प्रक्रिया की शुरुआत से, आरएनए अखंडता नकारात्मक प्रभाव हो सकता है, तो अंग दान और प्रयोगशाला में प्रसंस्करण के लिए ऊतक की प्राप्ति के समय ऊतक के संग्रह के बीच समय अंतराल (शीत कोरोनरी समय) बहुत लंबा है । इस चिंता को देखते हुए हमें आश्चर्य है कि उच्च गुणवत्ता आरएनए अभी भी आंतों के नमूनों से निकाला जा सकता है ठंड कोरोनरी समय के 24 घंटे के बाद । जब आंतों के नमूनों ठंडा और ठंडा भंडारण समाधान में ठीक से संग्रहीत कर रहे हैं, वहाँ ऊतक अखंडता और आरएनए गुणवत्ता की शानदार सुरक्षा है । हम की आवश्यकता है कि आंत्र ऊतक संग्रह पर अंग संग्रह टीम द्वारा निकाली है, आंत के जोखिम को सीमित करने के लिए पाचन एंजाइमों, RNases और अन्य अणुओं है कि इस अवधि के दौरान आरएनए गुणवत्ता प्रभाव सकता है. हमने पाया है कि जब आंतों नमूना पूरी तरह से फ्लश नहीं है, यह काफी है नमूना रिण को कम कर सकते हैं ।
आंतों के ऊतकों के नमूनों की तैयारी के लिए हमारे अनुकूलित प्रक्रिया का उपयोग करना, हम TFM में embedding नमूनों से बचने में सक्षम हैं । क्योंकि TFM इथेनॉल और xylene के साथ बातचीत के लिए एक गहरे भूरे रंग की हाला कि प्रवेश गैंग्लिया के दृश्य में हस्तक्षेप के रूप में, हम इसे अपने नमूनों से छोड़कर पसंद करते हैं । हालांकि, जब चूहों या अन्य प्रजातियों से आंतों के ऊतकों के साथ काम करना, TFM के अपवर्जन संभव नहीं हो सकता है । इस स्थिति में, हमने स्लाइड पर एक पालन अनुभाग से TFM को निकालने के साथ प्रयोग किया है । यदि ऊतक एक पर्याप्त सतह क्षेत्र है, इथेनॉल (पर ठंडा-20 डिग्री सेल्सियस) एक स्थानांतरण पिपेट के साथ स्लाइड पर dripped जा सकता है जल्दी से TFM को ठीक करने के लिए, यह संदंश के साथ हटाया जा करने की अनुमति । स्लाइड पर इथेनॉल टपकाव इथेनॉल की शीशी के भीतर TFM के संचय से बचा जाता है, जो भूरे प्रभाव जब एकाधिक स्लाइड संसाधित किया जा रहा है ख़राब कर सकते हैं ।
फ्लैश-ठंड के दौरान, हम 2 एमबी के साथ एक सूखी बर्फ के घोल का उपयोग कर एहसान, बजाय १००% इथेनॉल, क्योंकि 2-एमबी आसानी से जब ऊतक की सतह पर उतरने के वाष्पित हो जाता है । इथेनॉल के लिए और अधिक धीरे लुप्त हो जाता है, खासकर जब TFM के साथ संयुक्त, ऊतक ब्लॉक है कि आसानी से हटाया नहीं जा सकता है पर एक रासायनिक कीचड़ के गठन । दोनों इथेनॉल और 2-एमबी फिज़ और सख्ती से छींटे जब छोटे ठंड कंटेनरों में ठंड, क्योंकि सूखी बर्फ के घोल की छोटी मात्रा में एक कम विशिष्ट गर्मी क्षमता है करते हैं । इसके बजाय, एक बड़े आयताकार पाउडर सूखी बर्फ से भरा बाल्टी का उपयोग एक बड़े शीतलक मास प्रदान करता है और तापमान में उतार चढ़ाव से बचाता है, जबकि ऊतक जम जा रहा है ।
के रूप में उल्लेख किया है, यह कई बार दूसरों के सापेक्ष कुछ ऊतक नमूने से प्रवेश गैंग्लिया के सतत चादरें प्राप्त करने के लिए आसान है । जाहिर है, LCM की कुल गति स्रोत ऊतक या आंतों क्षेत्र की विशेषताओं के आधार पर परिवर्तनशीलता के अधीन है नमूना किया जा रहा है । इस कारण से, यह अक्सर सबसे अच्छी शुरुआत में कई ताजा जमे हुए नमूने तैयार करने के लिए है । हम आम तौर पर पाया है कि आंत के खंड प्रति 20 नमूनों की कुल (~ 2 सेमी x १.५ सेमी, प्रत्येक) दूर बहाव अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त आरएनए प्रदान करने के लिए पर्याप्त से अधिक है । हालांकि, अगर केवल आंतों के ऊतकों की एक छोटी सी लंबाई उपलब्ध है, हम 5 सेमी की एक ंयूनतम लंबाई की सिफारिश । हमारे दृष्टिकोण के साथ, सबसे कम उपज है कि प्राप्त किया जाएगा 18-30 आरएनए के एनजी से रेंज होगा, के रूप में आगे की चर्चा की । न्यूनतम 5 सेमी लंबाई संभवतः कम किया जा सकता है, आवेदन पर निर्भर करता है, खासकर यदि सीडीएनए का अधिक मात्रा में उपयोग किया जाता है । वर्तमान अध्ययन में इन मापदंडों का परीक्षण नहीं किया गया । उदाहरण के लिए, qPCR4के साथ उपयोग के लिए दर्जी गैंग्लिया पूर्ण मोटाई आंत्र बायोप्सी नमूनों (2 सेमी x 2 सेमी) से एकत्र किया गया है ।
जैसा कि हम इस अध्ययन में प्रदर्शन, इथेनॉल संगत डाई, Cresyl बैंगनी, जलीय दाग, toluidine नीले रंग की तुलना में आरएनए अखंडता की बेहतर सुरक्षा प्रदान करता है का उपयोग करें । जब इथेनॉल में जलमग्न, RNases5,15निष्क्रिय हो जाते हैं । हालांकि, RNases अभी भी एक बार पानी7,15को उजागर समारोह हासिल कर सकते हैं । जब जलीय रंजक के साथ धुंधला, ऊतक nuclease को उजागर किया जाना चाहिए-लगभग 1 मिनट9के लिए मुफ्त पानी, जो पर्याप्त शाही सेना गिरावट की ओर जाता है । जब toluidine नीले ऊतक धुंधला का उपयोग कर, हम से पहले और धुंधला के बाद पानी के लिए जोखिम को कम करने में असमर्थ थे, क्योंकि इस तरह के संशोधनों को भी कम और toluidine नीले रंग की अवधारण, क्रमशः कमी । एक ऐसी ही समस्या hematoxylin आधारित डाई9के साथ भी सामने आई थी । संशोधित प्रोटोकॉल में यहां वर्णित, Cresyl वायलेट के साथ धुंधला पानी के लिए आंतों के नमूनों के प्रत्यक्ष जोखिम से बचा जाता है, जिससे अधिक से अधिक आरएनए अखंडता संरक्षण । इन परिणामों के दाग समाधान में अतिरिक्त RNase अवरोधकों के लिए की आवश्यकता को समाप्त । हमने पाया है कि इस तरह के अवरोधकों जलीय डाई, toluidine नीले रंग के उपयोग को सक्षम करने में अप्रभावी हैं, के रूप में यह दोनों के साथ हस्तक्षेप और डाई की अवधारण ।
जब शुरू में हमारे धुंधला प्रोटोकॉल का अनुकूलन, हम अंय प्रोटोकॉल और रिपोर्ट5,7,8,11में प्राप्त परिणामों को पुन: पेश करने में असमर्थ थे । हालांकि इस के लिए कारण स्पष्ट नहीं है, हम कई कारकों है कि असंगत डाई-ऊपर ले जाने और प्रतिधारण करने के लिए नेतृत्व पाया । उदाहरण के लिए, हालांकि कुछ प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक १००% इथेनॉल8 में या ७५% इथेनॉल5में Cresyl वायलेट का उपयोग ऊतक, डाई ही बेहोशी गैंग्लिया लेबल या उच्च पृष्ठभूमि था, ९५% इथेनॉल में Cresyl बैंगनी का उपयोग करने की तुलना में दाग है । पिछले, धुंधला समाधान में इस्तेमाल Cresyl वायलेट का प्रतिशत भी बहुत महत्वपूर्ण है । अधिकांश प्रोटोकॉल एक 1% Cresyl वायलेट समाधान7,8की सिफारिश है, लेकिन इस एकाग्रता विश्वसनीय हमारे हाथ में धुंधलाना प्रदान नहीं किया, यहां तक कि 2 मिनट के लिए धुंधला वर्गों के बाद । हम सबसे अच्छी सफलता की एक स्पष्ट संतृप्त 4% Cresyl वायलेट11 एक बाँझ सिरिंज फ़िल्टर8के माध्यम से नमूने के लिए आवेदन के धुंधला समाधान के साथ धुंधला । यह संतृप्त समाधान बहुत अधिक तेजी से नमूने के दाग में सक्षम बनाता है, के रूप में छोटे रूप में 10-15 s. पूर्व में नमूना के निर्धारण में ठंडा ९५% इथेनॉल (पर-20 डिग्री सेल्सियस) में सक्षम बनाता है एक और अधिक तेजी से तेज दाग की.
एक अंय रिपोर्ट में पाया गया कि एंट्रेंस गैंग्लिया सबसे अलग ताजा जमे हुए मानव आंत्र वर्गों में दाग जब एक ७५% इथेनॉल समाधान5में eosin के साथ Cresyl वायलेट संयोजन थे । लेकिन, हमने पाया है कि eosin इसे और अधिक कठिन गैंग्लिया की पहचान और कि Cresyl वायलेट, अकेले, बेहतर पता लगाने प्रदान करता है बनाया है । एक अलग अध्ययन में यह पाया गया कि एक बफर Cresyl वायलेट समाधान एंडोमेट्रियल कैंसर ऊतक10के लिए लगातार धुंधला परिणाम प्रदान की । लेकिन, हमने पाया यह मानव आंत्र ऊतक के लिए कोई सुधार की पेशकश नहीं किया और भी लागू नहीं किया जा सकता है जब धुंधला समाधान के लिए ९५% इथेनॉल का उपयोग कर ।
हमने कई स्थितियों का परीक्षण किया है जिसमें प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है और बाद में फिर से शुरू किया गया है । कई प्रोटोकॉल समय से आगे की स्लाइड्स का सुझाव देते हैं और स्लाइड5,9पर बढ़ते जाने के तुरंत बाद उन्हें-८० ° c पर फिर से जमने की सलाह देती हैं. इस दृष्टिकोण के साथ, धुंधला और LCM तो अगले सप्ताह के भीतर फिर से शुरू किया जा सकता है, महान लचीलापन दे रही है । हालांकि, न केवल यह बहुत धुंधला के साथ हस्तक्षेप किया; यह भी हमारे हाथ में आरएनए अखंडता कम (डेटा नहीं दिखाया गया है) । इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए ग्रोवर एट अल. को फ्रीजर11में भंडारण से पहले वर्गों धुंधला और निर्जलीकरण की सिफारिश । इस दृष्टिकोण में, स्लाइड दाग और निर्जलित (के रूप में तालिका 1में) १००% निर्जल इथेनॉल कदम (प्रोटोकॉल अनुभाग ५.२) तक कर रहे हैं । फिर, नमूने 10 मिनट के लिए १००% निर्जल इथेनॉल की एक दूसरी शीशी में गर्मी और जलशुष्कक जेल है, जो फिर सूखी बर्फ पर ठंडा और-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित कर दिया है के साथ एक शंकु ट्यूब के लिए तुरंत स्थानांतरित कर रहे हैं । जब फ्रीजर से नमूनों को हटाने, स्लाइड तुरंत १००% निर्जल इथेनॉल में 30 एस और हवा के लिए11LCM प्रदर्शन करने से पहले सूख में डूब रहे हैं । दुर्भाग्य से, हमारे हाथ में, इस दृष्टिकोण 0.6-0.8 (डेटा नहीं दिखाया गया है) द्वारा रिण कम कर दिया । इसलिए हम अपनी स्थितियों में अधिक से अधिक आरएनए अखंडता प्राप्त करने के क्रम में एक ही दिन में सभी अनुभाग, धुंधला, और LCM प्रदर्शन करने के लिए सहारा दिया । यह एक समय लेने वाली प्रक्रिया साबित होती है, लेकिन एक पूरे दिन के काम के दौरान 10-14 LCM कैप्स को भरा जा सकता है ।
सबसे विश्वसनीय बिंदु जिस पर हमारे प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है xylene मशीन कदम पर है । स्लाइड xylene में छोड़ दिया गया है (आणविक छलनी के साथ) के लिए 4-5 एच के लिए आरएनए अखंडता पर कोई स्पष्ट प्रभाव के बिना । हमने पाया है कि जब एक समय में तीन स्लाइडें तैयार की जाती हैं, तो सभी को इस समय सीमा के भीतर LCM के साथ संसाधित किया जा सकता है, भले ही एक घंटा विराम की आवश्यकता हो । एक वैकल्पिक विकल्प के लिए एक निर्वात-सील exicator16के भीतर धुंधला और निर्जलीकरण कदम के बाद स्लाइड desiccate है, लेकिन हम अभी तक इस दृष्टिकोण का प्रयास नहीं किया है ।
आरएनए अलगाव अभी तक की प्रक्रिया के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम है, सबसे महत्वपूर्ण कारकों के साथ किया जा रहा है: आरएनए के अधिकतम संभव उपज प्राप्त करने, आरएनए के पूर्ण स्पेक्ट्रम को बनाए रखने (छोटे आरएनए प्रजातियों की हानि के बिना)17,18, और नमूना17से जीनोमिक डीएनए को पूरी तरह से नष्ट । हमारे हाथों में, आरएनए निष्कर्षण किट "बी" हमारे नमूनों के साथ सबसे अच्छा परिणाम प्रदान की है, क्योंकि यह अधिक से अधिक पैदावार की पेशकश की और जीनोमिक डीएनए उंमूलन में अधिक कुशल था । आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट के बीच पैदावार में अंतर के बारे में हमारी टिप्पणियों पूर्व रिपोर्ट17,18के साथ संगत कर रहे हैं । हालांकि, वहां भी कई LCM अध्ययन है कि अंय आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट19,20के साथ सफलता की सूचना दी है । पूर्व रिपोर्टों भी संकेत मिलता है कि स्तंभ आधारित आरएनए निष्कर्षण प्रक्रियाओं phenol आधारित आरएनए निष्कर्षण तरीकों18 से छोटे आरएनए के अणुओं की बेहतर प्रतिधारण प्रदान करते हैं के रूप में छोटे आरएनए अणु supernatant में आरएनए वर्षण के दौरान खो सकते हैं चरणों.
हमने देखा है कि आरएनए lysis बफ़र्स जोड़ा β-mercaptoethanol के साथ guanidinium thiocyanate का उपयोग करें गैंग्लिया टोपी (चित्रा 5डी) से सभी कब्जा कर लिया LCM को दूर करने में अत्यधिक प्रभावी है । जबकि सबसे LCM प्रोटोकॉल lysate भंवर का सुझाव नहीं है, हमने पाया है कि इस उत्कृष्ट परिणाम पैदा करता है और आरएनए क्षरण में परिणाम नहीं है । यह भी एक भी अधिक संभावना है कि सभी पर कब्जा कर लिया गैंग्लिया आरएनए निष्कर्षण के लिए टोपी से जारी किया जाएगा प्रदान करता है । इन तरीकों का प्रयोग, हम आम तौर पर १.८ की रेंज में दर्जी गैंग्लिया के LCM से आरएनए पैदावार प्राप्त करने के लिए 18 एनजी/सेमी2 आंतों के ऊतकों, पर निर्भर करता है कि कितने गैंग्लिया किसी दिए गए स्लाइड पर मौजूद हैं । हमारी आरएनए-seq प्रक्रिया 10 एनजी आरएनए के एक न्यूनतम इनपुट की आवश्यकता है, लेकिन एक अनुक्रमण प्रसंस्करण पूर्व प्रवर्धन चक्र की अधिक से अधिक संख्या में शामिल हैं, तो अन्य प्रक्रियाओं बहुत कम आरएनए इनपुट हो सकता है । तैयारी और फ्लैश-ठंड प्रक्रिया से संग्रहीत ऊतक की कुल सतह क्षेत्र 40-60 सेमी2है, जो सीडीएनए पुस्तकालय तैयारी और कम इनपुट आरएनए-Seq अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त आरएनए प्रदान करता है ।
जबकि हमारी प्रक्रिया पूरी दर्जी गैंग्लिया के संग्रह के लिए डिज़ाइन किया गया है, दृष्टिकोण आसानी से एकल ंयूरॉंस के संग्रह के लिए संशोधित किया जा सकता है, या glia, यदि वांछित5। हालांकि, क्योंकि glial िनों के घनी ensheath न्यूरॉन्स प्रक्रियाओं, glial आरएनए कैप्चर न्यूरॉन्स की आरएनए के साथ शामिल किया जाएगा, हालांकि कम गिनती पर. यह मुद्दों को उठाती है जब न्यूरॉन एक कम कॉपी संख्या में व्यक्त टेप की पहचान करने की कोशिश कर रहा । एकल सेल आरएनए-seq इस संबंध में सबसे अच्छा सटीक और पता लगाने प्रदान करता है, लेकिन न्यूरॉन्स आंतों के ऊतकों से असंबद्ध होने की आवश्यकता है, पैन के साथ दाग-न्यूरॉन्स मार्कर, और प्रवाह के साथ अलग-cytometry21 या पूरी आंतों से पहचान bioinformatics दृष्टिकोण के साथ छंटाई के बाद dissociations । सबसे पृथक्करण अध्ययन के नकारात्मक पक्ष यह है कि अधिकांश प्रोटोकॉल की आवश्यकता है कि नमूना कमरे के तापमान या ३७ डिग्री सेल्सियस पर विस्तारित अवधि, जो transcriptome3को बदलने के लिए जाना जाता है के लिए हो सकता है । हाल ही में, बैसिलस licheniformis से ठंड सक्रिय चिढ़ाने माउस के ऊतकों के लिए एक सेल निलंबन की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया गया है और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर मानव ऊतक के पृथक्करण के लिए इस एंजाइम को लागू करने के लिए संभव हो सकता है22. जब तक ऐसे अनुकूलन पूरा हो गया है, ताजा जमे हुए मानव ऊतक के LCM एक मजबूत करने के लिए प्रवेश गैंग्लिया तरह परिधीय तंत्रिका तंत्र तत्वों की रूपरेखा अभिव्यक्ति के लिए आरएनए पर कब्जा करने का मतलब है ।
संक्षेप में, हम मानव दर्जी गैंग्लिया से आरएनए के संग्रह के लिए एक विश्वसनीय और लगातार प्रोटोकॉल विकसित किया है । हम मानव आंत्र ऊतक, धुंधला, LCM प्रक्रिया की तैयारी अनुकूलित है, और आरएनए कई प्रकाशनों और प्रोटोकॉल के आधार पर निष्कर्षण । हम भी आरएनए-Seq के लिए पर्याप्त आरएनए गुणवत्ता की आरएनए नमूने एकत्रित करने में इस दृष्टिकोण की विश्वसनीयता का प्रदर्शन किया है. इस प्रोटोकॉल जठरांत्र रोगों की एक संख्या के साथ रोगियों से एकत्र ऊतकों को मोटे तौर पर लागू किया जा सकता है और आसानी से कुतर मॉडल के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिससे उपंयास चिकित्सकीय के विकास के लिए एक विश्वसनीय रणनीति की पेशकश की ।
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Disclosures
लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.
Acknowledgments
हम दानदाताओं और उनके परिवार वालों के आभारी हैं जिन्होंने यह काम संभव बनाया । हम भी इस अध्ययन में प्रयुक्त ऊतक के समंवय संग्रह में मदद करने के लिए चिकित्सा और टेनेसी दाता सेवाओं के अंतरराष्ट्रीय संस्थान में कर्मचारियों की सहायता की सराहना करते हैं । यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों, NIH OT2-OD023850 ईएमएस2 और NIH T32-DK007673 से AMZ करने के लिए वजीफा समर्थन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । हम LCM साधन और ऊतक तैयार करने पर सलाह के लिए उपयोग के लिए वेंडरबिल्ट शोधों पैथोलॉजी साझा संसाधन के कर्मचारियों के लिए आभारी हैं । वेंडरबिल्ट ऊतक विकृति साझा संसाधन NIH अनुदान P30-CA068485-14 और U24-DK059637-13 द्वारा भाग में समर्थित है । हम जीनोमिक विश्लेषण के साथ मदद के लिए वाशिंगटन विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन में आनुवंशिकी विभाग में जीनोम प्रौद्योगिकी का उपयोग केंद्र का शुक्र है । GTAC आंशिक रूप से NCI कैंसर केंद्र सहायता अनुदान द्वारा समर्थित है #P30 CA91842 Siteman कैंसर केंद्र के लिए और आईसीटी/CTSA अनुदान #UL1TR002345 से राष्ट्रीय अनुसंधान संसाधन के लिए केंद्र (NCRR), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) के एक घटक है, और NIH चिकित्सा अनुसंधान के लिए रोडमैप । यह प्रकाशन पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि NCRR या NIH के सरकारी दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
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