Summary
Målet med denne protokol er at få høj-integritet RNA prøver fra enterisk ganglier isoleret fra ikke optagne, frisk resektion menneskelige tarmens væv ved hjælp af laser fange microdissection (LCM). Denne protokol omfatter flash-frosset prøver af menneskelige tarmens væv, cryosectioning, ethanoliske farvning og dehydrering, LCM, og RNA udvinding.
Abstract
Formålet med denne metode er at få høj-integritet RNA prøver fra enterisk ganglier indsamlet fra optagne, frisk resektion menneskelige tarmens væv ved hjælp af laser fange microdissection (LCM). Vi har identificeret fem trin i arbejdsgangen, der er afgørende for at opnå RNA isolater fra enterisk ganglier med tilstrækkelig høj kvalitet og kvantitet for RNA-FF. Først, når du forbereder tarmens væv, hver prøve skal alle overskydende væske fjernes ved blotting før udfladning serosa så meget som muligt på tværs i bunden af store base forme. Prøverne er derefter hurtigt frosset på toppen af en opslemning af tøris og 2-methylbutane. For det andet ved skæring af væv, er det vigtigt at placere cryomolds, så tarm afsnit parallelle fuld flyet af den myenteric plexus, hvilket giver den største areal på enteriske ganglier pr. slide. Tredje, under LCM, polyethylen napthalate (PEN)-membran dias tilbyder den største hastighed og fleksibilitet i skitserer uensartet figurer af entero ganglier, når du indsamler enterisk ganglier. For det fjerde for særskilte visualisering af entero ganglier i sektioner tilbyder ethanol-kompatible farvestoffer, som Cresyl Violet, fremragende bevarelse af RNA integritet i forhold til vandige farvestoffer. Endelig, for udvinding af RNA fra erobrede ganglier, vi observerede forskelle mellem kommercielle RNA udvinding kits, der gav superior RNA mængde og kvalitet, samtidig fjerne DNA forurening. Optimering af disse faktorer i den nuværende protokol væsentligt accelererer arbejdsprocessen og udbytter enterisk ganglier prøver med ekstraordinære RNA kvalitet og kvantitet.
Introduction
Denne metode er designet til at opnå høj kvalitet RNA prøver af entero ganglier fra menneskelige tarmens væv ved hjælp af laser fange microdissection (LCM). Protokollen beskrevet her er blevet optimeret til at give tilstrækkelig RNA kvalitet og udbyttet for RNA sekventering (RNA-seq) og er beregnet til brug med frisk resektion, optagne, flash-frosset menneskelige tarmens væv.
Funktionelle mave og gut motilitetsforstyrrelser påvirker én af hver fire mennesker i USA. Det enteriske nervesystem (ENS), også kaldet den anden hjerne1, er ofte i midten af disse lidelser, der spiller en afgørende rolle i gut homøostase og motilitet. Manipulation af gut motilitet har generelt været begrænset til kirurgisk resektion af aganglionic/noncontractile væv, kronisk diætprodukter ændringer og/eller medicin. Overraskende, den fulde transkriptom af de voksne ENS er stadig at blive sekventeret, høj grad begrænser vores evne til at identificere molekyler i den ENS, der kan være målrettet farmaceutisk eller udnyttet i stamcelleterapier.
Der er relativt få metoder til isolering af RNA fra menneskelige enterisk ganglier. Den første fremgangsmåde, celle dissociation2, kræver høj inkubation temperaturer og lang inkubationstid gange; både som er kendt for at fremme RNA nedbrydning og ændre transkriptom2,3. En alternativ tilgang, LCM, mere pålideligt bevarer transkriptom og beskytter RNA integritet. Selv om flere undersøgelser har brugt LCM for at indsamle ganglier fra frisk frosset menneskelige tarmens væv4,5,6, disse tilgange var enten hæmmet af dårlige RNA kvalitet og kvantitet, var meget arbejdskrævende, eller behov for ændring af farvning eller RNA udvinding teknikker til at arbejde i vores hænder. Andre LCM protokoller designet til at bevare RNA, der blev fundet i LCM produkt manualer leveres yderligere forbedringer7,8, men tilpasning var nødvendig når anvendes til isolering af entero ganglier8, 9. af disse grunde har vi udviklet en optimeret protokol baseret på disse ressourcer, der giver betydelige mængder af høj-integritet RNA fra menneskelige enterisk ganglier, har en relativt hurtig arbejdsgang og producerer ensartede resultater på tværs af en stor antallet af prøver.
I denne undersøgelse præsenterer vi en synopsis af optimeret procedurer, som letter isolering af høj-integritet RNA fra enterisk ganglier stammer fra resektion menneskelige tarmens væv. Vores metode omfatter fem vigtige aspekter. Første, frisk resektion, ikke optagne menneskelige intestinal prøver skal trimmes til størrelse, har alle overskydende fugt fjernes med et laboratorium væv og fladtrykt i en stor base mug før flash-frysning på toppen af en opslemning af tøris og 2-methylbutane (2 MB). Andet, histologiske dele af tarmen skal være parat til at opnå det fulde plan af myenteric plexus på et dias, som giver en stor nyttelast på enteriske ganglier. Succes med dette trin er stort set afhængig af væv forberedelse proces. For det tredje kræver ganglier i ENS uensartet struktur brug af polyethylen napthalate (PEN) membran dias6, som tilbyder den største hastighed og præcision under LCM-processen. Fjerde, ethanol-kompatible farvestoffer, som Cresyl Violet, bør anvendes til at bevare RNA integritet mens farvning enterisk ganglier. Sidst, RNA udvinding proces er afgørende for et vellykket resultat med RNA-FF. Vi søgte en RNA udvinding tilgang, der producerer høj RNA integritet, maksimerer RNA udbytter, når du starter med små samlinger af entero ganglier, eliminerer DNA forurening og bevarer så mange RNA arter som muligt.
Tilsammen, optimering af disse faktorer i den nuværende undersøgelse væsentligt accelererer arbejdsprocessen og udbytter prøver af entero ganglier med ekstraordinære RNA kvantitet og kvalitet. Resultaterne har været stort set ensartet blandt en anselig gruppe af prøver, der angiver sammenhængen i denne tilgang. Yderligere, har vi brugt disse tilgange til med held sekvens snesevis af RNA prøver fra enterisk ganglier. De strategier, der er fremhævet her kan også tilpasses stort set til at udføre LCM af ønskede ganglier eller kerner af perifere og centrale nervesystem og andre sager, der kræver isolering af høj kvalitet RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller er beskrevet her er blevet godkendt af den Vanderbilt University institutionelle Review Board (IRB).
1. forberedelse væv ankomst
- Få ordentlig IRB godkendelse og koordinere med menneskeligt organ donation agenturer til at få frisk resektion, ikke optagne tarmens væv fra donorer, der opfylder alle forskning kriterier kræves for undersøgelsen.
Bemærk: Denne protokol kan være tilpasset til brug med mus og andre gnavere modeller.- Straks efter resektion af hver intestinal segment, grundigt skylle lumen med kølet PBS eller væv-opbevaring medium at fjerne resterende luminale materiale eller afføring.
- Efter skylning og kassere affald i en passende biologisk beholder, dykke væv i en tilstrækkelig mængde af væv-lagermedie (f.eks. 3 - 5 gange mængden af tarmens væv) og gemme i individuelt mærket, vandtæt plast beholdere, nedsænket i isen eller nedkølet indtil brug).
- Processen væv inden for 18-26 timer fra tidspunktet for indsamlingen til at forhindre betydelige RNA nedbrydning.
Bemærk: Afhængigt af renlighed af intestinal segment og opbevaring, kan det være muligt at forlænge vores foreslåede tidsfrist.
- Forberede alle nødvendige for humant væv samling på forhånd materialer som angivet i denne protokol (Se Tabel af materialer til mere detaljeret produktinformation). Sikre, at alle nødvendige personlige værnemidler er båret på alle tidspunkter.
- Forberede tøris spande sammen med en tøris gylle, som vist i figur 1.
- Knuse nok tøris til at fylde 4 standard cirkulære is spande og en rektangulær isspand. En af de standard spande bør have små (11 x 21 cm) laboratorium væv placeret på overfladen af tøris. Brug om muligt nye, uåbnede kasser af laboratoriet væv.
- Gøre en tøris gylle ved powderizing 2 L af tøris i en ren rektangulære isspand.
- Tilføje pre kølet 2 MB op til overfladen af tøris. Lidt mix og tromle gylle ved hjælp af en pipette tip box cover til figur overfladen af gylle i en kanal, omgivet af større stykker af tøris langs siderne af rektangulære spanden.
- Placer flere tynde blokke af tøris langs kanterne af isspand at tilskynde til mere hurtig nedfrysning. Der skal være plads til ≥4 base forme til at passe løst i tøris gylle spand på et givet tidspunkt.
- Du kan eventuelt fyldt stak isspand inden for en anden rektangulære isspand ¼ med tøris. Denne positionering hjælper bedre isolere tøris gylle og forhindrer behovet for hyppige tilpasninger af tøris og 2 MB under proceduren.
- Placer tøris spande i samlebånd i følgende rækkefølge: 1) tøris gylle spand, 2) laboratorium væv-dry ice spand, 3 & 4) normal tør is spande, 5) rektangulære tøris spand (fig. 1A).
2. forberedelse af Flash-frosset menneskelige tarmens væv
Bemærk: Hele denne proces kan tage mellem 45-80 min. pr. tarm segment, afhængigt af tarmens væv kvalitet. Vi anbefaler også indsamling af kvalitetskontrol prøver for at vurdere RNA kvalitet og histologi før igangsættelsen af LCM.
- Fyld en stor bakke med våde is og Placer kirurgisk skærebrætter på toppen af tøris.
- I denne opsætning, chill en 500 mL og 100 mL bægerglas til opbevaring af væv og klippede segmenter i cold storage-løsning. Pre chill base forme på opskæring bestyrelser, således at de er klar til at modtage væv.
- Ved modtagelse af frisk tarmens væv, hæld det medie, hvor vævet er transporteret og beholde den i de pre-kølet bægre. Lad nogle plads i disse bægre til midlertidig opbevaring af tarmens væv og klippede segmenter, der vil blive udarbejdet i efterfølgende trin.
- Skær den intestinale segment til en længde på ca 20 cm, hvilket giver rigelig væv (40-60 cm2) til at generere RNA til downstream applikationer og kvalitetskontrol prøver. Afhængigt af væv integriteten, kan det være muligt at udføre RNA isolering til downstream forarbejdning med en meget mindre længde (dvs. 5 cm af tarmen).
- Trim væk fedt og bindevæv fra tarmen ved hjælp af kirurgiske saks. Resterende fedt langs den intestinale serosa kompromiser evne til at helt flade væv i efterfølgende trin. Omhyggeligt trimme væv, for at undgå nicking serosa under fjernelse af fedt og bindevæv, som strukturelt kan skade myenteric plexus eller gør det ydre af væv flade ujævnt for skæring.
- Lave en langsgående indsnit langs hele længden af intestinal prøven, helst på stedet for mesenteriallymfeknuderne fastgørelse.
- Dissekere væk og kassér tenia coli fra tyktarmen, således at det flader mere let ved at blive frigivet fra spændinger.
- Splay i tarmen slimhinde-side ned på en kølet skærebræt og skær 1,25 cm hele strimler fra den fulde længde af væv.
Bemærk: Tarmens væv ofte udvider efter trimning, så denne størrelse bør justeres i overensstemmelse hermed. - Midlertidigt gemme strimler i kølet væv-storage-løsning.
Bemærk: Vi bruger Belzer UW cold storageløsning, fordi det har en lang holdbarhed, er forholdsvis omkostningseffektive og kan opbevares ved stuetemperatur indtil det skal bruges. - Fjerne en væv strip fra cold storage-løsning og skæres i segmenter ~1.5-2 cm lang.
- Hurtigt duppes de intestinale segmenter på en stak af laboratoriet klude, at fjerne overskydende væske og forhindre dannelsen af iskrystaller langs den intestinale serosa under flash-frysning. Hvis væv ikke tørres tilstrækkeligt, vil det være vanskeligt at opnå høj kvalitet sektioner fra myenteric plexus.
- Lægge duppes intestinal stykker slimhinde-side på en pre kølet, store, engangs plast base mug (37 mm x 24 mm x 5 mm).
- Omhyggeligt flade hvert segment af let strække væv over overfladen af den base mug og bruger buet pincet til at forsigtigt trykke ned og udvise eventuelle luftbobler, der kan være fanget under serosa. Bemærk, at vævet udvider samtidig udfladning. Hvis det er nødvendigt, trim segmenterne og skære de resterende prøver på en mindre størrelse.
Bemærk: Hvis væv er overbebyrdet, vil det fordreje myenteric plexus. Efter alle luftbobler er fjernet, vurdere tykkelsen af prøven før frysning. Hvis det er nødvendigt, skubbe kanterne af modellen indad, indtil den intestinale prøve nærmer sig sin oprindelige tykkelse. - Placer den indlæste base skimmel på overfladen af tøris, 2 MB gylle. Vævet bør helt fryse inden for 30-60 s, afhængig af størrelse og tykkelse af tarm-segmentet.
- Tør i bunden af formen base at fjerne resterende 2 MB ved hurtigt gnide den base mug på laboratoriet væv pre kølet i den anden spand af tøris.
- Overføre den tørrede prøve til den tredje balje med tøris og begrave det under overfladen af tøris, indtil det er klar til at blive ombrudt.
- Hurtigt observere i bunden af den base mug før indpakningen, for at undersøge kvalitet til forberedelse af prøven. Noter eventuelle prøver, der ikke vises flade eller har store luftbobler, som disse bør undgås for cryosectioning og LCM'EN.
- Wrap prøven i forvejen afmærket aluminiumsfolie, der er lagt på toppen af tøris i en spand, så at indpakning af væv opstår mens holdes helt frosset.
- Wrap prøve med et lag plast wrap, at minimere væv dehydrering under opbevaring ved-80 ° C.
- Opbevare prøver i den rektangulære spand, indtil de er klar til at blive flyttet til fryseren.
- Pre etiket og pre chill fryser kasser ved-80 ° C nemlig umiddelbar opbevaring af prøverne efter samling.
- Tage en lille del af væv fra hver intestinal segment for vurdering af RNA integritet inden udførelse LCM.
- Forud mærket en 2-mL RNase-fri slange i hvert segment, fyldt med ≥500 µL af lysisbuffer. Vi anbefaler at bruge RNA udvinding Kit "D", der er anført i Tabel af materialer.
- Omrystes en lille (2 mm x 2 mm) stykke af tarmen i en standard væv mikro-homogeniseringsapparat (20-40 s, indtil ingen væv klumper tilbage). Derefter straks fryse RNA lysate på tøris og opbevares ved-80 ° C indtil videre med RNA udvinding.
- Valgfrit, integrere nogle af sektionerne i væv indefrysning medium (TFM) som en back-up. Forberede væv sektioner på nøjagtig samme måde beskrevet i dette afsnit, men nedsænkes prøver i TFM inden for den base mug før flash-frysning.
3. Cryosectioning
- Før cryosectioning, forberede alle nødvendige materialer til farvning og dehydrering og overføre de ønskede vævsprøver fra-80 ° C fryser i en spand med tøris.
- Forbered kryostaterne til brug ved indstilling til optimal opskæring temperatur (– 18 til 22 ° C) og aftørring ned overflader med 100% ethanol og behandling af klingen og børster skuffe med RNase dekontaminering løsning.
- Brug følgende fremgangsmåde for at bedst overholder prøven til chuck.
- Placer pincet i tøris til mindst 30 s før udpakning den intestinale prøve og placere det på overfladen af tøris serosa-side-up.
- Hæld en 3-5 mm høj af væv indefrysning medium (TFM) ind på en stor kryostaten prøveholder og straks overføre intestinal prøve serosa-side-up på TFM.
- Hurtigt overføre præparatholderen til tøris og dække med powderized tøris efter at tillade TFM at tiltræde prøve for 2-5 s ved stuetemperatur. Sikre, at TFM forbliver under plan af myenteric plexus.
Bemærk: Ideelt, den ydre overflade af tarmslimhinden vil fuldt ud overholde TFM før TFM begynder at fryse uden optøning af prøven.
- Montere præparatholderen ind af kryostaten objekthovedet og justere modellen med kryostaten blade, sådan at flyet af myenteric plexus vil være parallel til kniven.
- Indstille skære tykkelse på kryostater til 8 µm. Formålet med perfekt justering af prøven er at opnå størst mulige areal af myenteric plexus på hvert dias. Denne tykkelse er generelt anbefales til både menneskelige og gnaver væv, men kan justeres efter behov.
- Afsnit igennem serosa og langsgående muskel indtil nå myenteric plexus.
- For at finde myenteric plexus, montere en prøve afsnit på et dias og plette afsnittet med en vandig farvestof, såsom 1% Cresyl violet eller toluidin blå, osv.
- Se afsnittet under et lysmikroskop på 40-2000 X forstørrelse at identificere krydset mellem de langsgående og cirkulær muskel lag. Mikroskop parametre findes i Tabel af materialer. Fra starten af skæring vil serosa være præget af tilstedeværelsen af bindevæv. Nogle resterende mesenteriallymfeknuderne fedt kan også findes langs serosa. Et ark af det ydre langsgående muskel lag derefter begynder. Når grænsen mellem langsgående og cirkulær muskel lag er nået, vil en del af de enteriske ganglier observeres.
Bemærk: I de næste flere afsnit, vil myenteric plexus bliver meget tydelig, med store skår af ganglier er til stede inden for et enkelt afsnit (figur 2C). Hvis væv ikke er helt flad i starten af skæring, vil så kun en del af dorsalrodsganglier være til stede i hvert afsnit på et givet tidspunkt. Sommetider, kan intestinal prøven have en ifølge sagens natur ujævn myenteric plexus, trods det væv, der optræder helt flad. Dette gælder især for duodenum prøver. Vores erfaring, disse prøver kan tage meget længere tid at behandle med LCM, men tilstrækkelig RNA kan indsamles inden for en enkelt dags session. Den nøjagtige placering af myenteric plexus kan variere betydeligt mellem prøver, baseret på væv og dens forberedelse før frysning.
- Begynde at indsamle seriel sektioner for LCM, med optimal samlinger giver det største antal af neuroner og glia pr. slide. Afhængigt af overfladearealet af prøven, kan flere sektioner kombineres til en enkelt PEN-membran dias.
- Montere sektioner på PEN membran dias, kølet kortvarigt i kryostaten for 5-10 s. Når du monterer, skal vævet smelte kun lidt maksimalt bevare RNA integritet.
4. farvning
Bemærk: En oversigt over farvning processen, se tabel 1. Alle løsninger anvendes tilberedes i standard 50 mL konisk hætteglas. Behandling af ydersiden af rør med RNase dekontaminering løsning synes ikke at forbedre resultater (data ikke vist).
- Forberede en mættet opløsning af 4% Cresyl violet i 95% ethanol mindst én dag i forvejen og fuldt genopslæmmes Cresyl violet forud for lastning sprøjten.
Bemærk: Koncentrationen af ethanol kan skal sænkes til effektiv farvning, som beskrevet i afsnittet diskussion. Vi har ikke testet om med 50% eller 75% ethanol under farvningen betydeligt reducerer RNA integritet. Cresyl violet er lysfølsomt og derfor bør beskyttes mod lys. - Efter montering af dele af myenteric plexus i diaset, straks nedsænkes dias i en konisk hætteglas med 95% ethanol (pre kølet ved-20 ° C) for 30 s.
- Hvis sektionerne ikke fuldt ud overholder slide i det forrige trin, lidt varme i bunden af dias med en behandskede hånd (en laboratorium tørre bør være placeret mellem diasset og handske), for fuld tilslutning før nedsænkning i 95% ethanol. Denne løsning kan genanvendes til mindst 3-6 dias uden at reducere RNA integritet.
- Lægge dias opad på en lab tørre placeret på toppen af en beholder forbehandlet, RNase-fri8.
- Forhånd udfylde en 3-mL sprøjte med 4% Cresyl violet og vedhæfte en 0,2 µm sprøjte filter.
Bemærk: Vi anbefaler celluloseacetat filtre. - Påfør 6-10 dråber af pletten direkte på væv afsnit8 og inkuberes i 10-30 s, eller indtil tilstrækkelig farvestof bevares når de farves. Mens farvning, rotere forsigtigt objektbeholderen dias i hånden for at sikre, at sektionerne væv jævnt overtrukket med pletten.
- Hæld pletten og straks fjerne pletten dias i et hætteglas med 75% ethanol. Gentagne gange dykke diaset, indtil den overskydende farvestof har for det meste sivede ud af prøven. Dette kan tage mellem 10-20 sek.
- Færdiggøre de-farvning af gentagne gange dypning prøven i et hætteglas med 95% ethanol for 10 s. Submerge prøven gentagne gange indtil alle overskydende pletten er blevet fjernet.
- Ændre en destaining varighed, for at optimere farvning af ganglier. Hvis for meget pletten er fjernet, prøven bliver alt for gennemsigtige og det kan være svært at visualisere
Bemærk: Denne farvning protokol er blevet optimeret baseret på flere publikationer5,8,10,11 der kræves ændring før tilfredsstillende resultater blev opnået. Derfor, koncentrationen af ethanol anvendes i farvestoffet og under destaining processen bør ændres, når det er nødvendigt, at opnå et optimalt resultat.
- Ændre en destaining varighed, for at optimere farvning af ganglier. Hvis for meget pletten er fjernet, prøven bliver alt for gennemsigtige og det kan være svært at visualisere
5. dehydrering
- Straks dyppe dias i 100% ethanol 2 - 3 gange, for et samlet beløb på 10-20 s.
- Dykke dias i vandfri 100% ethanol til mindst 30 s. Som vandfri ethanol er meget hygroskopisk, tilføje molekylære sigter (8-12 mesh) til hætteglas med 100% ethanol forud for starten af proceduren for at fjerne enhver absorberet vand og dermed mere fuldstændigt dehydrere prøve5.
- Gentagne gange dyppe dias i xylen til 15-20 s. Dette trin fjerner fuldt lag af ethanol på diaset. Tilføje molekylære sigter forud for tid til rør af xylen, at fuldt adsorberes overskydende ethanol og vand molekyler5.
Forsigtig: Xylener er klassificeret som en irriterende på øjne og øvre luftveje og bør anvendes i en kemisk stinkskab. - Dykke dias i xylen (med molekylær sigter, 8-12 mesh) i mindst 10 min.
Bemærk: En kort pause kan tages efter dette trin, hvis det er nødvendigt. Prøver kan være tilbage i xylen i 4-5 timer uden skadelige virkninger til farvning, LCM eller RNA udbytte/integritet. - Du kan vælge, individuelt udarbejde flere ekstra dias på dette punkt. Hvis forbereder en anden runde af dias efter endt LCM på alle rede dias, kan væv i kryostaterne skal være refaced på grund af dehydrering af væv overflade. En til fire sektioner skal kasseres, før brugbare dele kan blive indsamlet.
6. laser fange Microdissection (LCM)
- Fjern diasset fra xylen og lufttørre det i en kemisk stinkskab for mindst 1 min. Indsæt en patron LCM caps i LCM mikroskop fase. Indlæse diasset på scenen og erhverve en oversigt billede af diaset.
- Identificere den ønskede placering for LCM og indlæse en cap i diaset.
- Juster den infrarøde (IR) laser og justere sin styrke og varighed for at gøre en 20-30 µm diameter fange spot.
- Find den ultraviolette (UV) laser og sæt en passende skærehastighed og intensitet.
- Skitsere de ønskede ganglier skal indsamles ved hjælp af LCM software, og sørg for at holde sig inden for afgrænsningen af området indsamles på fælles landbrugspolitik (afbildet i dias-oversigt over software-program som en grøn cirkel).
- I hver af sporene, justere IR steder således, at der er mindst én IR øje på hver 100-500 µm.
- Tryk på knappen IR/UV-cut til at fortsætte med samlingen af alle markerede ganglier.
- Når samlinger er udført, enten flytte fælles landbrugspolitik til en ny placering og gentage indsamling proces eller undersøge LCM cap på QC stationen, når fælles landbrugspolitik er tilstrækkelig fyldt med ganglier (eller indtil den anbefalede frist på 60-80 minutter er nået).
- Hvis rester er til stede på fælles landbrugspolitik, tørre det væk ved hjælp af en bøde-tippes pensel, der har været forbehandlet med RNase dekontaminering løsning, skylles med nukleasen-gratis vand og helt tørret.
- Omhyggeligt undersøge fælles landbrugspolitik med det blotte øje eller med forstørrelse under en lysfelt mikroskop for at sikre, at alle rester er fjernet. Hvis resterne ikke kan fjernes ved brug af forbehandlet pensel, derefter bruge en fine pipette tip (RNase-fri) for at skrabe væk debris.
- Sikre fælles landbrugspolitik på en 0,5 mL mikrofuge rør fyldt med 230 µL af RNA lysisbuffer (Buffer RLT fra RNA udvinding Kit "B", med β-mercaptoethanol tilsat i en koncentration på 10 µL/mL).
- Invertere cap, kort vortex, og der inkuberes ved stuetemperatur i 30 min.
- Centrifugeres ved ≥ 5000 x g til 5 min og derefter overføre mikrofuge tube til tøris.
Bemærk: Protokollen kan pause her. RNA lysates kan opbevares ved-80 ° C uden en betydelig effekt på RNA nedbrydning i mindst 1 uge. Hvis RNA isolering udføres samme dag, derefter chill prøver på is, indtil de er klar til udvinding. - Udføre alle yderligere samlinger inden for det anbefalede maksimale frist på 80-90 min. efter fjerner diasset af xylen. Som afsnittene dehydreret udsættes for omgivende luftfugtighed, kan RNases gradvist blive genaktiveret. Begrænse perioden samling kan minimere sådanne virkninger og maksimalt bevare RNA integritet.
7. RNA isolering
- Forberede en RNase-fri arbejdsstation til RNA ekstraktioner.
- Forberede alle rør og reagenser ifølge manualen til RNA udvinding Kit.
Bemærk: Mens der er mange kits til rådighed for RNA isolering efter LCM, har vi haft bedste succes ved hjælp af RNA udvinding Kit "B", der er opført på listen over materialer. Se figur 5 for en side-by-side sammenligning af RNA udvinding reagenser. - Fjerne prøver fra-80 ° C fryser og hurtigt optø i et 37 ° C vandbad.
- Straks vortex optøede prøver til 2-3 s at jævnt distribuere guanidinium kaliumthiocyanat salte.
- Kombinere hver prøve med et lige saa stort volumen af 70% ethanol. Samle 2 eller flere lysates, hvis det er nødvendigt, at nå en tilstrækkelig RNA-koncentration.
- Fortsætte ifølge producentens instruktioner i manualen til udpakningen RNA ved hjælp af den protokol, der er optimeret til microdissected prøver.
- Elueres RNA på det sidste trin i den mindste anbefalede mængde nukleasen-gratis vand (14 µL).
- Efter RNA isolering, alikvot 1-2 µL af RNA fra hver prøve ind i en ny forud mærket RNase-fri rør for kvalitet vurdering/kvalitetskontrol med en mikrofluidik enhed, der kan visualisere små mængder af RNA, som en Bioanalyzer. Alikvot en yderligere 1 µL ind i en separat rør for kvantificering med en høj følsomhed RNA kvantificering kit.
- Justere disse trin, for at opnå en tilstrækkelig mængde af RNA for downstream analyse (dvs., pool et større antal LCM caps før RNA udvinding).
- Butik RNA ved-80 ° C indtil nok prøveudtagning for downstream analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har foretaget flere forbedringer af eksisterende protokoller, der aktiverer den relativt hurtig indsamling af entero ganglier fra menneskelige intestinal prøver ved hjælp af LCM, opfylder standarderne for RNA-FF. Først, vi optimeret til hurtig nedfrysning af tarmens væv segmenter i store base forme placeret på overfladen af en opslemning af tøris i 2 MB (figur 1B). Den bedste succes under cryosectioning og efterfølgende LCM blev opnået ved at lægge intestinal segmenter fladt inden for en base mug, vender slimhinde-side op (tal 1B-1 C). Sikre, at basen formene er så fladt som muligt på basen, som enhver krumning vil gøre det langt vanskeligere at opnå en stor tværsnit af myenteric plexus. Denne metode resulterer i væv, der er nemt i snit på 8 µm tykkelse (figur 1E) og giver mulighed for komplet fjernelse af TFM fra farvning processen. Vi fandt, at TFM forstyrrer farvning processen og dermed tilslører identifikation af entero ganglier. Positionering af væv i denne retning også undgår skæring gennem slimhinden, som har et højt indhold af RNases12, selv om det fremgår af vores erfaring, at brugen af ethanoliske pletter i høj grad hæmmer disse RNases. I tilfælde hvor TFM eller Optimal opskæring temperatur (OCT) medium er nødvendigt, vi fandt det mest pålidelige første flade eksemplet nederst i formen base og derefter tilføje TFM til skimmel efter dette trin (fig. 1D). Dette efterlader et "vindue", hvor tarmen kan visualiseres let, hvilket gør det nemt at justere modellen og producerer sektioner, der er helt parallel til myenteric plexus (figur 1E).
Forberedelse af snit frosset organmateriale langs ned på længden af tarmen i en retning parallelt med myenteric plexus (fig. 2A), genererer afsnit som det største område af entero ganglier pr. slide er synlige ved farvning) Figur 2 C). Når du nærmer myenteric plexus (figur 2C), ved anbringelse af de langsgående og cirkulær muskel lag (figur 2B), 6-12 serie sektioner kan være indsamlet (figur 2A, langsgående) der indeholder store skår af entero ganglier (figur 2C). LCM caps kan være lastet til kapacitet ved hjælp af en enkelt sektion (figur 4D). I modsætning hertil ved udarbejdelsen af tværgående sektioner af frisk frosset tarmen (tal 2A-2B), er der kun et lille område af myenteric plexus stede på hvert dias (figur 2B). Meget få enterisk ganglier kan indsamles fra tværgående væv afsnit, hvilket resulterer i større tid investeret og højere omkostninger pr. prøve samlet. Metoden med parallel-skæring bruger mindre end en femtedel af antallet LCM caps og dias i forhold til tværgående sektioner og accelererer stærkt indsamling proces.
Før LCM, skal prøver farves og fuldt dehydreret undgå RNase aktivitet under LCM samling. Vi har udviklet et eksperiment at direkte sammenligne effekten af vandige pletter vs ethanoliske pletter på RNA integritet. I dette eksperiment, to tarm dele blev monteret sammen på et enkelt dias og blev behandlet på fire måder, med n = 2-3 biologiske replikater pr. gruppe. I den første gruppe, friske tarm afsnit var ikke monteret på et dias og hver blev direkte overført til RNA lysisbuffer ved hjælp af RNase-fri pincet pre kølet på tøris (fig. 3A). For alle resterende grupper, var sektioner levet op til et dias, forarbejdet, skrabes fra dias ved hjælp af en RNase dekontaminering løsning-behandlede barberblad og overført til RNA lysisbuffer med RNase-fri pincet. En standard mikro-homogeniseringsapparat blev brugt til helt lyse prøver i alle grupper. I den anden gruppe, diasene var behandlet gennem alle trin, men ingen dye blev brugt under proceduren farvning (fig. 3B). En gruppe tre blev behandlet med protokollen beskrevet ovenfor, ved hjælp af 4% Cresyl violet farvestof (figur 3C). I den fjerde gruppe anvendtes en vandig bejdse, toluidin blå, mens efter protokol for en vandig-baserede farvning kit ved hjælp af en blanding af toluidin blå og hæmatoxylin (figur 3D). Efter uddrager RNA, som beskrevet, blev RNA kvalitet vurderet med et Bioanalyzer. Den eneste forskel mellem den vandige og ethanoliske farvning protokoller var tilføjelsen af to vand inkubationer (30 s hver), umiddelbart før og efter farvning, der er påkrævet for optagelse og fastholdelse af farvestoffet. Vi fandt, at processen med vedhængende væv sektioner til diaset og behandling med dehydrering skridt førte til en svag, uundgåelige nedsættelse af RNA kvalitet (tal 3A-3B), men at farvning med de ethanoliske farvestof, Cresyl violet, ikke gør yderligere reducere RNA kvalitet (figur 3C). I modsætning, førte den vandige farvestof, toluidin blå, til betydelig RNA nedbrydning, sandsynligvis på grund af udvidede vandig eksponering, der tillader endogene RNase aktivitet (figur 3D).
Unik figurerne af entero ganglier frembyde vanskeligheder for standard IR-LCM med konventionelle glas dias6 (figur 4A). Når du bruger PEN-membran dias (fig. 4B), overholdes prøver til en tynd plade, der er løsrevet fra fleste af glas dias. UV-laser skærer igennem både prøve- og PEN membran, som resulterer i den komplette udstationering af dorsalrodsganglier fra dias (fig. 4C) og fuld overholdelse af LCM cap (figur 4D). Strukturer af en ønsket størrelse og form (> 10-15 µm) kan være fuldstændigt og præcist indsamlet (Figured 4E-4 H). For nogle prøver med færre ganglier pr. afsnit, kan fælles landbrugspolitik være flyttet ≥ fire gange før indsamling. I dette tilfælde minimerer montering to til tre sektioner pr. slide brugen af PEN-membran dias.
Når isolere RNA fra LCM prøver for RNA-FF., er målet at opnå den højest mulige RNA kvalitet og mængde, samtidig fjerne alle genomisk DNA (gDNA). For at identificere en ideel RNA isolering procedure, vi udførte en head-to-head sammenligning med en RNA udvinding Kit "A" (figur 5A), RNA udvinding Kit "B" (figur 5B), eller RNA ekstraktion metode "C" med oprensning af RNA prøver af RNA udvinding Kit "B" (figur 5C). Efter forarbejdning prøver med optimeret Cresyl violette pletter protokol, blev LCM brugt til at indsamle standardiseret cirkulære prøver (diameter 500 µm) af tarmens væv, taget fra den langsgående muskel lag. Hver cap blev randomiseret til hver af de tre RNA isolering grupper, at blive placeret på toppen af en 0,5 mL mikrofuge rør fyldt med de respektive lysisbuffer fra hvert kit. Vejledningen blev fulgt nøjagtigt som beskrevet for hver kit, med RNA udvinding Kit "En" lysisbuffer kræver inkubation ved 42 ° C i 30 min. For de andre kits, blev stuetemperatur inkubation brugt til 30 min. Alle prøver blev kort vortexed ved tilføjelse til lysisbuffer. Prøverne blev derefter kølet på is indtil ekstraktioner blev udført samme dag (n = 4). Vi fandt, at RNA udvinding Kit "B" med en på kolonnen DNA fordøjelsen trin resulterede i højeste RNA kvalitet og kvantitet samtidig effektivt fjerne gDNA (tal 5A-5 C). Vigtigere, lyses RNA lysisbuffer leveres af RNA udvinding Kit "B" fuldt de erobrede ganglier når indsamling enterisk ganglier (fig. 5D).
I gennemsnit har vores prøver en RIN 7.49 ± 0,53 (tabel 2). RIN scores på mere end 6-7 anses af tilstrækkelig kvalitet for RNA-seq (afhængigt af den specifikke RNA profil)13, giver os tillid til at vores prøver er af tilstrækkelig kvalitet for RNA-FF. overvejer at RIN for disse prøver, ved modtagelsen, har varierede fra 7,4 til 9.5, disse resultater viser, at vores optimeret protokol giver fremragende bevarelse af RNA integritet. Repræsentative RNA kvalitetsresultater fra prøveemner, RNA-seq er afbildet i Tal 6A-6 C. Resultater fra RNA-seq vise, at vores prøver med succes blev sekventeret og har et beskedent 3'-enden bias (figur 6D). Generelt, en større 3'-bias er begunstiget i prøver med lavere RIN14; denne effekt er moderat afspejles i vores prøver. På trods af dette var observerede gene biotypes stort set ensartet blandt alle prøver (fig. 6E), der angiver pålideligheden af dataene.
Figur 1 . Optimal nedfrysning af tarmens væv. (A) tør is spande er rede i rækkefølgen afbildet; Jeg) tøris gylle, ii) laboratorium væv placeret på toppen af tøris, iii) midlertidig opbevaring spand, iv) indpakning spand, v) før fryseren opbevaring spand, vi) før fryseren opbevaring overløb spand. (B) vi optimeret Hurtig nedfrysning af væv segmenter i store base forme placeret på overfladen af en opslemning af tøris og 2-methylbutane. (C) en tættere-up billede af en fuldt frosset prøvemateriale, observeret i opsætningen af vist i panelet B. Intestinal segmenter er lagt fladt i en base mug opad slimhinde-side. (D) denne frysemetode kan være let tilpasses til brug med TFM ved at forberede væv på samme måde, men tilføjer TFM til den base mug før frysning. Den resulterende prøve vil have en helt flad myenteric plexus, med en serosa, der nemt kan visualiseres. (E) begge væv forberedelse tilgange producere fremragende væv sektioner på den anbefalede 8 µm tykkelse. Procedure ved hjælp af TFM er afbildet her. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Ordentlig orientering af tarmens væv giver sektioner rig på enteriske ganglier. Når du forbereder standard tværgående tværsnit af frisk frosset tarmen (A, B), er der kun et lille område af myenteric plexus (B) findes på hvert dias. Meget få enterisk ganglier kan indsamles per slide, som er tidskrævende og dyrt. Derimod tilbyder henvistes længdesnit i flyet af myenteric plexus (C), et meget større areal af ganglier (C). Sektioner af myenteric plexus er opnået ved at starte fra serosa og skæring indad gennem den langsgående muskel (B). Når man nærmer sig myenteric plexus, ved krydset af langsgående og cirkulær muskel lag (B), kan 6-12 serie sektioner afhentes. Hver længdesnit af myenteric plexus indeholder store skår af entero ganglier (repræsenteret i C, ved hjælp af en modificeret farvnings-procedure, uden xylol, til fortrinsvis bejdse ganglierne). LCM caps kan være fyldt op til kapacitet ved hjælp af en enkelt væv sektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Farvning med en ethanol-kompatible farvestof forbedrer kvaliteten af RNA. RNA kvalitet blev målt ved Bioanalyzer og repræsentative resultater af to prøver fra hver gruppe vises. Indledende RNA kvalitet målt fra frisk, umonterede dele (A, ingen behandling), havde en RNA integritet nummer (RIN) på 8.65 ± 0,07. For sektioner monteret og behandles gennem alle trin, men uden plet (B), var RIN 7,95 ± 0,35. Når farvning med 4% Cresyl violet blev føjet til dehydrering skridt, var der en ubetydelig effekt på RIN, med en gennemsnitlig RIN 7.87 ± 0,35 (C). I sammenligning resulterede brugen af vandige pletten, toluidin blå (T-blå) og tilføjelsen af kræves vand skylninger procedure (D) i betydeligt reduceret RNA kvalitet, med en RIN 6,45 ± 0,21. Hver gruppe bestod af n = 3 biologiske flergangsbestemmelser med undtagelse af "No behandling" og "T-Blue"(n=2). Aani er rapporteret her som gennemsnit ± standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . PEN membran LCM dias aktiverer præcise samlinger af entero ganglier. Ved hjælp af regelmæssig glas objektglas til at indsamle enterisk ganglier via LCM tendens til at resultere i uønskede væv pickup (A). De røde cirkler (30 µm i diameter) angiver størrelsen af IR LCM steder bruges i forbindelse med indsamlingen proces. Den hvide pil angiver en ganglion samling, der trak op et stykke tilstødende muscularis væv. Med PEN-membran dias (B) overholdes prøver til en tynd plade, der er løsrevet fra fleste af glas dias. Når du skærer med UV-LCM laser, både prøve- og PEN membran er skåret, hvilket resulterer i den komplette udstationering af dorsalrodsganglier fra dias, uanset ganglion form (C), og komplet overholdelse af LCM cap når fjernet fra stikprøven (D ). Strukturer af en ønsket størrelse og form ≥10-15 µm kan fuldstændigt og præcist indsamlede [(E), oprindelige væv mark-up; (F) IR og UV-laser opskæring afsluttet; (G) LCM cap fjernet fra afsnittet], som visualiseret på LCM cap (H). Plettet baggrunden i panelet H er uløseligt forbundet med fælles landbrugspolitik og ikke uønsket debris. Grønne cirkler blå sigtekornet i paneler E-H er en del af programmet LCM og er pladsholdere for UV og IR lasere, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . At vælge en optimal RNA isolering kit. RNA integritet resultater er vist efter en samtidige sammenligning af tre forskellige RNA isolering procedurer. To repræsentative parceller fra hver gruppe vises for at illustrere den variation, der kan opstå mellem prøver behandles parallelt. RNA udvinding Kit "A" (A) fremstilles prøver med en RIN 6,83 ± 0,65 og forudsat moderat RNA udbytter og tendens til at have DNA forurening, trods udfører en på kolonnen DNase fordøjelsen. RNA udvinding Kit "B" (B) resulterede i den højeste målte RIN på 8,3 ± 0,1. Mens phenol-baserede RNA ekstraktion metode "C" (efterfulgt af oprensning af RNA prøver med RNA udvinding Kit "B") (C) syntes at eliminere gDNA og havde en RIN 7,5 ± 0,26, var der store forurener bands, som kan have medført fra smeltning af den klæbende polymer fra LCM cap under trinnet RNA lysering. Yderligere, RNA udbytter fra RNA udvinding Kit "A" og ekstraktion metode "C" var konsekvent lavere end dem, der opnås af RNA udvinding Kit "B". Vigtigere, at RNA lysisbuffer leveres af RNA udvinding Kit "B". (med ekstra β-mercaptoethanol) lyses fuldt de erobrede ganglier (D). Hver gruppe havde n = 3 biologiske replikater og præsenteres her som gennemsnit ± standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Repræsentative resultater. Når samle to caps af entero ganglier pr. prøve, vi får tilstrækkelige mængder af RNA til RNA-seq (> 1 ng) sammen med fremragende RNA kvalitet. Repræsentative RNA parceller er vist et eksempel med en RIN 8.3 (A), 7.5 (B) og 6,9 (C). RNA-seq data blev kørt gennem en kvalitetsvurdering programmer, køres i R. (D) handlingen ende-bias angiver, at prøverne var med held sekventeret og har et beskedent 3'-enden bias. (E) gen biotype plot repræsenterer også, at sekventering resultater er i høj grad ensartet blandt prøverne. I alt har vi haft en > 95% succesrate i at generere prøver anvendelige for RNA-Seq venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Trin | Varighed | Formål |
| 95% ethanol (-20 oC) | 30 s | Fiksering |
| 4% cresyl Violet i 95% Ethanol | 10-30 s | Pletten |
| 75% ethanol (med gentagne dypning) | 15-25 s | De-pletten |
| 95% ethanol (med gentagne dypning) | 5-15 s | De-pletten |
| 100% ethanol | 15 s | Dehydrering |
| 100% ethanol (vandfri) | 30 s | Dehydrering |
| Xylol (med gentagne dypning) | 15-20 s | Dehydrering |
| Xylen | > 10 min | Dehydrering |
| Lufttørre | 1-3 min | Fordampning af xylen |
Tabel 1. Farvning og dehydrering protokol oversigt. Denne tabel beskriver vores optimeret farvnings-protokollen. Bemærk, at enhver ethanol-kompatible pletten kan bruges til at erstatte Cresyl violet, hvis det giver bedre resultater. I nogle tilfælde, vil varigheden af farvning og affarvning skal forlænges eller forkortes. Generelt, jo længere vil fiksering tid, jo hurtigere det væv blive fuldt farves. Vi har ikke bemærket nogen reduktion i RNA integritet efter genbrug af hætteglas op til 3 gange under udarbejdelsen af dias fra det samme væv segment.
| Donor | Væv | RIN |
| F | Tyktarmen | 7.1, 7.4, 7.2 |
| M | Ileum | 7.2, 6.9, 7,8 |
| M | Duodenum | 8.2, 7.4, 7,7 |
| Ileum | 7.4, 7.6, 7.3 | |
| Tyktarmen | 7.7, 7,8, 7.3 | |
| F | Duodenum | 7.1, 7.3, 6.9 |
| Ileum | 7.8, 7.9, 7,6 | |
| Tyktarmen | 7.3, 8.0, 7,5 | |
| M | Ileum | 6.9, 6.7, 6.9 |
| Tyktarmen | 6.8, 6.4, 6.6 | |
| M | Ileum | 7.2, 7.3, 7,6 |
| Tyktarmen | 6.7, 7.6, 7,7 | |
| M | Ileum | 8.3, 7,8, 7.4 |
| Tyktarmen | 7.0, 7.4, 7.0 | |
| F | Duodenum | 8.3, 8,8, 8.0 |
| Ileum | 8.1, 8.0, 7,8 | |
| Tyktarmen | 8.4, 8.6, 7.1 |
Tabel 2. Repræsentative RNA integritet resultater. De dataindsamlinger, der vises i denne tabel blev alle opnået fra menneskelige enterisk ganglier. Alle stikprøver har tilstrækkelig RNA kvalitet og kvantitet for RNA-seq analyse. Den gennemsnitlige RIN af alle prøver, der er anført i denne tabel er 7.49 ± 0,53. RNA koncentration blev også målt ved hjælp af RiboGreen Quant-iT analysen og alle dataindsamlinger, der vises i i denne tabel har mødt den minimale mængde, der kræves for vores RNA-seq (> 1 ng) eksperimenter. Mindre mængder kan bruges, afhængigt af proceduren forud forstærkning. Men sådanne procedurer er mere pålidelige, når man forventer der skal være store forskelle i genekspression mellem prøver eller grupper der sammenlignes; ellers kan disse resultater maskere sande forskelle i nogle RNA-seq programmer. Det er derfor generelt anbefales at starte med mere materiale når det er muligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne procedure giver mulighed for effektiv indsamling af mange enteriske ganglier som en kilde til at udlede RNA til RNA-FF. Her har vi fremskyndet de processer, der er skitseret i eksisterende protokoller samtidig maksimalt bevare RNA integritet. Alle trin i denne procedure er indbyrdes afhængige, er det vigtigt, at alle emner fjernes fra starten af undersøgelsen, og at alle prøver er forberedt så ligeledes til hinanden som muligt, at opnå pålidelige RNA-FF.
Fra starten af proceduren, kan RNA integritet blive negativt påvirket hvis tidsintervallet (kold iskæmisk tid) mellem indsamling af væv i forbindelse med organdonation og modtagelse af væv til behandling i laboratoriet er for lang. Givet denne bekymring, var vi overraskede over, at høj kvalitet RNA stadig kan udvindes fra tarm prøver selv efter 24 timer af kolde iskæmisk tid. Når de intestinale prøver er kølet og gemmes korrekt i cold storage-løsning, er der fremragende beskyttelse af væv integritet og RNA kvalitet. Vi kræver, at tarmens væv er skyllet efter indsamling af orgel samling team, at begrænse eksponering af tarmen til fordøjelsesenzymer, RNases og andre molekyler, der kunne påvirke RNA kvalitet i denne periode. Vi har fundet, at når den intestinale modellen ikke er helt skyllet, dette kan markant reducere den prøve RIN.
Ved hjælp af vores optimeret procedure for at forberede intestinal vævsprøver, kan vi undgå indlejring prøver i TFM. Fordi TFM interagerer med ethanol og xylen til at danne en mørk brun bundfald, der forstyrrer visualisering af entero ganglier, foretrækker vi udelukke den fra vores prøver. Dog, når du arbejder med tarmens væv fra mus eller andre arter, udelukkelse af TFM kan ikke være muligt. I dette tilfælde har vi eksperimenteret med at fjerne TFM fra en overholdt afsnit på et dias. Hvis væv har et tilstrækkeligt areal, kan ethanol (kølet ved-20 ° C) dryppede i diaset med en overførsel pipette til hurtigt fix TFM, så den kan fjernes med pincet. Dryp ethanol på dias undgår ophobning af TFM i hætteglas med ethanol, hvilket kan forværre browning effekten, når der behandles flere dias.
Under flash-frysning favoriserer vi bruger en tøris gylle med 2 MB, snarere end 100% ethanol, fordi 2 MB let fordamper ved landing på overfladen af vævet. Ethanol har tendens til at fordampe langsomt, især når den kombineres med TFM, danner en kemisk slam på væv blok, der ikke kan fjernes nemt. Både ethanol og 2 MB tendens til at boblevand og splatter kraftigt når nedfrysningen i små beholdere med frysning, fordi den lille mængde af tøris gylle har en lav specifik varmekapacitet. I stedet, ved hjælp af en stor firkantet spand fyldt med powderized tøris giver en stor afkøling masse og forhindrer temperatursvingninger, mens vævet er ved at blive frosset.
Som nævnt, er det nogle gange lettere at få kontinuerlig ark af entero dorsalrodsganglier fra nogle vævsprøver i forhold til andre. Forståeligt nok, kan den samlede hastighed af LCM variabilitet afhængigt af de særlige kendetegn ved kilden væv eller tarm regionen bliver udtaget. Derfor er det ofte bedst at forberede mange frisk frosset prøverne ved starten. Generelt har vi fundet, at ialt 20 prøver pr. segment af tarmen (~ 2 cm x 1,5 cm, hver) er langt mere end tilstrækkeligt til at give rigelig RNA for efterfølgende ansøgninger. Hvis kun en lille længde af tarmens væv er tilgængelig, anbefaler vi dog en mindstelængde på 5 cm. Med vores tilgang, ville det laveste udbytte, der ville være opnået spænder fra 18-30 ng af RNA, som yderligere drøftet nedenfor. Mindst 5 cm længde kan potentielt blive reduceret, afhængigt af programmet, især hvis større mængder af cDNA preamplification bruges. Disse parametre var ikke testet i den aktuelle undersøgelse. For eksempel er enterisk ganglier blevet indsamlet fra fuld-tykkelse tarm biopsi prøver (2 cm x 2 cm) til brug med qPCR4.
Som vi viser i denne undersøgelse, tilbyder anvendelse af ethanol-kompatible farvestof, Cresyl violette, langt bedre beskyttelse af RNA integritet end vandige pletten, toluidin blå. Når nedsænket i ethanol, bliver RNases inaktive5,15. RNases kan dog stadig genvinde funktion en gang udsat for vand7,15. Når farvning med vandig farvestoffer, skal vævet udsættes for nukleasen-gratis vand i næsten 1 min9, hvilket fører til betydelig RNA nedbrydning. Når du bruger toluidin blå væv farvning, var vi ude af stand til at reducere eksponeringen for vand før og efter farvning, fordi sådanne ændringer også reduceret optagelse og fastholdelse af toluidin blå, henholdsvis. Et lignende problem blev også mødt med en hæmatoxylin-baserede farvestof9. I den ændrede protokol beskrevet her, undgår farvning med Cresyl violet direkte eksponering af de intestinale prøver til vand, dermed maksimalt bevare RNA integritet. Disse resultater eliminere behovet for yderligere RNase hæmmere i Farvningsopløsningen. Vi fandt, at sådanne hæmmere er ineffektive på at brugen af vandige farvestoffet, toluidin blå, som det blandede sig med både optagelse og fastholdelse af farvestoffet.
Når i første omgang optimere vores farvning protokol, vi var ude af stand til at reproducere resultaterne af andre protokoller og rapporter5,7,8,11. Grunden til dette er uklare, fandt vi flere faktorer, der førte til inkonsekvent dye-optagelse og retention. For eksempel, selv om visse protokoller har med held farves væv ved hjælp af Cresyl violet i 100% ethanol8 eller i 75% ethanol5, farvestoffet kun svagt mærket ganglier eller havde høje baggrund, i forhold til ved hjælp af Cresyl violet i 95% ethanol. Sidst, procentdelen af Cresyl violet bruges i Farvningsopløsningen er også meget vigtigt. De fleste protokoller anbefales en 1% Cresyl violet løsning7,8, men denne koncentration giver ikke pålidelige farvning i vores hænder, selv efter farvning sektioner for op til 2 min. Vi havde bedste succes farvning med en afklaret mættede Farvningsopløsningen 4% Cresyl violet11 anvendes til prøven gennem en steril sprøjte filter8. Denne mættet opløsning giver mulighed for meget hurtigere farvning af prøven, i så lidt som 10-15 s. før fiksering af prøven i kølet 95% ethanol (ved-20 ° C) giver mulighed for en mere hurtig udbredelse af pletten.
En anden rapport fandt, at enterisk ganglier var mest udpræget farves i frisk frosset menneskelige tarm afsnit, når man kombinerer Cresyl violet med eosin i 75% ethanol løsning5. Dog fandt vi at eosin gjort det sværere at identificere ganglier og at Cresyl violet, alene, tilbyder overlegen registrering. I en anden undersøgelse, blev det konstateret, at en Cresyl violet bufferopløsning fastsatte endometriecancer væv10konsekvent farvning resultaterne. Imidlertid fandt vi det ikke giver nogen forbedring for menneskelige tarmens væv og også kunne ikke gennemføres, når du bruger 95% ethanol til Farvningsopløsningen.
Vi har testet en række betingelser i protokollen kan pause og genoptages på et senere tidspunkt. Mange protokoller foreslå skæring dias før tid og igen frysning dem ved-80 ° C umiddelbart efter montering på dias5,9. Med denne tilgang, farvning og LCM'EN kan derefter genoptages inden for den næste uge, tilbyder stor fleksibilitet. Dog ikke kun dette meget forstyrre farvning; Det har også reduceret RNA integritet i vores hænder (data ikke vist). For at omgå dette problem, anbefaler Grover et al. farvning og tørring sektioner inden deponering i fryseren11. I denne tilgang er dias farves og dehydreret (som i tabel 1) op til 100% vandfrit ethanol trin (protokollen afsnit 5.2). Derefter prøverne inkuberes i en anden hætteglas med 100% vandfrit ethanol i 10 min og overføres straks til en konisk slange med tørremiddel gel, som derefter kølet på tøris og overført til-80 ° C fryser. Når du fjerner prøver fra fryseren, er dias straks nedsænket i 100% vandfrit ethanol til 30 s og lufttørret forudgående at udføre LCM11. Desværre, i vores hænder denne tilgang reduceret RIN med 0,6-0,8 (data ikke vist). Vi derfor tyet til at udføre alle skæring, farvning og LCM'EN i samme dag for at opnå maksimal RNA integritet i vores forhold. Dette viser sig for at være en tidskrævende proces, men 10-14 LCM caps kan udfyldes under en hel dags arbejde.
Den mest pålidelige punkt hvor vores protokol kan afbrydes midlertidigt er på trinnet xylen inkubation. Dias er blevet efterladt i xylen (med molekylær sigter) for op til 4-5 h uden nogen synlig effekt på RNA integritet. Vi har fundet, at når tre dias er udarbejdet på et tidspunkt, alle kan behandles med LCM inden for denne tidsramme, selvom et Times pause er nødvendig. En alternativ mulighed er at udtørre dias efter farvning og dehydrering delaktiviteter i en vakuum-forseglet exicator16, men vi har endnu ikke forsøgt denne tilgang.
RNA isolering er endnu et afgørende skridt til proceduren, med de vigtigste faktorer at være: at opnå den maksimal mulige udbytte af RNA, bevarer det fulde spektrum af RNA (uden tab af mindre RNA arter)17,18, og helt at eliminere genomisk DNA fra prøven17. I vores hænder leveret RNA udvinding Kit "B" det bedste resultat med vores prøver, som det tilbudt større udbytter og var mere effektiv på genomisk DNA afskaffelse. Vores bemærkninger vedrørende forskelle i udbyttet mellem RNA udvinding reagenser er i overensstemmelse med tidligere rapporter17,18. Der er dog også mange LCM undersøgelser, der har rapporteret succes med andre RNA udvinding reagenser19,20. Forudgående rapporter også viser, at kolonne-baserede RNA udvinding processer tilbyder bedre fastholdelse af små RNA molekyler end phenol-baserede RNA udvinding metoder18 som små RNA molekyler kan gå tabt i supernatanten under RNA nedbør trin.
Vi observerede, at RNA lysis buffere, der bruger guanidinium kaliumthiocyanat med tilføjet β-mercaptoethanol er meget effektiv til at fjerne alle tilfangetagne ganglier fra LCM cap (fig. 5D). Mens de fleste LCM protokoller ikke foreslå vortexing de lysate, har vi fundet at dette producerer fremragende resultater og ikke resulterer i RNA nedbrydning. Det giver også en endnu større sandsynlighed for, at alle erobrede ganglier vil blive frigivet fra fælles landbrugspolitik for RNA udvinding. Ved hjælp af disse metoder, få vi generelt RNA udbytter fra LCM af entero ganglier i rækken af 1,8 til 18 ng/cm2 af tarmens væv, afhængigt af hvor mange ganglier er til stede på et bestemt dias. Vores RNA-seq procedure kræver et minimum input af 10 ng RNA, men andre procedurer kan have meget lavere RNA input hvis en sekventering behandling omfatter et større antal pre forstærkning cyklusser. Det samlede overfladeareal af væv gemt fra forberedelse og flash-frysning proces er 40-60 cm2, som giver rigelig RNA til cDNA bibliotek prep og lav-input RNA-Seq applikationer.
Mens vores procedure er designet til indsamling af hele enterisk ganglier, kan metoden let ændres til indsamling af enkelt neuroner og glia, hvis det ønskes5. Men fordi glial processer tæt ensheath neuroner i ENS, glial RNA bliver inkluderet sammen med RNA erobrede neuroner, om end på et lavere tæller. Dette rejser spørgsmål, når de forsøger at identificere neuronal udskrifter udtrykt på en lav kopi nummer. Encellede RNA-seq tilbyder den bedste præcision og registrering i denne henseende, men kræver neuroner til at være adskilt fra den intestinale væv, farves med pan-neuronal markører, og isoleret med flowcytometri21 eller identificeret fra hele-tarm dissociations efter sortering med Bioinformatik tilgange. Ulempen ved de fleste dissociation undersøgelser er, at de fleste protokoller kræver, at prøven være inkuberes ved stuetemperatur og 37 ° C i længere perioder, som er kendt for at ændre transkriptom3. For nylig, kolde-aktive protease fra Bacillus licheniformis har været anvendt til generering af enkelt celle suspensioner for musen væv og det kan være muligt at anvende dette enzym til dissociation af humant væv på 4 ° C22. Indtil sådanne optimering er opnået, er LCM friske frosne menneskelige væv en robust betyder at fange RNA til udtryk profilering af perifere nervesystem elementer som enterisk ganglier.
I sammendrag, har vi udviklet en pålidelig og konsekvent protokollen for samlingen af RNA fra menneskelige enterisk ganglier. Vi har optimeret forberedelse af menneskelige tarmens væv, farvning, LCM proces og RNA udvinding baseret på talrige publikationer og protokoller. Vi har også vist pålideligheden af denne tilgang i indsamling af RNA prøver af tilstrækkelig høj kvalitet RNA til RNA-FF. Denne protokol kan anvendes bredt til væv indsamlet fra patienter med en række gastrointestinale sygdomme og let kan tilpasses til brug med gnavere modeller, dermed tilbyder en pålidelig strategi til udvikling af nye lægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for donorerne og deres familier, der har gjort dette arbejde muligt. Vi værdsætter også hjælp fra personalet på International Institute of Medicine og Tennessee Donor tjenester for at hjælpe koordinere indsamling af væv, der anvendes i denne undersøgelse. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 til EMS2 og stipendium opbakning fra NIH T32-DK007673 til AMZ. Vi er taknemmelige for personale på Vanderbilt translationel patologi delt ressource adgang til LCM Instrument og rådgivning om væv forberedelse. Den Vanderbilt væv patologi delt ressource er delvist understøttet af NIH tilskud P30-CA068485-14 og U24-DK059637-13. Vi takker genom teknologi adgang Center i Institut for Genetik på Washington University School of Medicine for hjælp med genomisk analyse. GTAC er delvist støttet af NCI Cancer Center støtte Grant #P30 CA91842 til Siteman Cancer Center og ikt/CTSA Grant #UL1TR002345 fra det nationale Center for forskning ressourcer (NCRR), en del af National Institutes of Health (NIH) og NIH Køreplan for medicinsk forskning. Denne publikation er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle visning af NCRR eller NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
- Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
- Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
- PALM Protocols - RNA handling. , ZEISS. Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011).
- Schlaudraff, F. L. M. Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015).
- Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
- Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
- Potter, S. S., Brunskill, E. W.
- Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
- Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
- Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
