Summary
이 프로토콜의 목표에서 고정, 갓 절제 인간의 창 자 조직 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여 격리 장 중추에서 높은 무결성 RNA 샘플을 얻을 것입니다. 이 프로토콜 포함 플래시-냉동 인간 창 자 조직, cryosectioning, ethanolic 얼룩 및 탈수, LCM, 샘플 준비 및 RNA 추출.
Abstract
이 방법의 목적은 고정, 갓 절제 인간의 창 자 조직 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여에서 수집 하는 장 신경에서 높은 무결성 RNA 샘플을 얻을 것입니다. 5 단계 워크플로에서 RNA-이 대 한 충분히 높은 품질과 수량 장의 중추에서 RNA 분리를 얻기위한 중요 한를 확인 했습니다. 첫째, 준비할 때 장 조직, 각 샘플 아래쪽 큰 기본 금형의 가능한 serosa 병합 전에 blotting에 의해 제거 하는 모든 초과 액체를가지고 있어야 합니다. 다음 샘플 2 methylbutane 드라이 아이스의 슬러리 꼭대기 신속 하 게 고정 됩니다. 둘째, 조직 단면, 그것 장 섹션 슬라이드 당 장 신경의 가장 큰 표면 영역을 양보 함으로써 myenteric 총의 전체 평면 병렬 cryomolds 위치에 중요 하다. LCM, 폴 리 에틸렌 napthalate (펜) 중 세 번째-최고의 속도 장의 중추를 수집 하는 때 장 중추의 비균일 도형의 윤곽에 유연성을 제공 하는 막 슬라이드. 넷째, 섹션 내 장 신경의 고유한 시각화를 위한 Cresyl 바이올렛 같은 에탄올 호환 염료 수성 염료를 기준으로 RNA 무결성의 우수한 보존을 제공합니다. 마지막으로, 캡처된 중추에서 RNA 추출, 우리는 DNA 오염을 제거 하는 동안 우수한 RNA 수량 나왔고 상업적인 RNA 추출 키트와 품질, 차이점 관찰. 현재 프로토콜에서 이러한 요소의 최적화 크게 워크플로우를 가속화 하 고 뛰어난 RNA 품질 및 수량 장의 중추 샘플을 생성 합니다.
Introduction
이 메서드는 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여 인간의 창 자 조직에서 장의 중추의 높은-품질 RNA 샘플을 얻기 위해 설계 되었습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)에 대 한 충분 한 RNA 품질 및 수율을 제공 하도록 최적화 된 하며 갓 절제, 고정, 플래시-냉동 인간 창 자 조직으로 사용 될 것입니다.
기능성 위장 하 고 본질적인 운동 성 장애는 미국에서 4 명 중 하나에 영향을 줍니다. 장 신 경계 (ENS), 두 번째 뇌1라고도 종종 이러한 장애의 중심에 직감 항상성 및 운동에 중요 한 역할. 창 자 운동 성의 조작 일반적으로 aganglionic/noncontractile 조직, 만성 식이 수정 및/또는 약물의 외과 절제술으로 제한 되었습니다. 놀랍게도, 성인 팔의 전체 transcriptome 시퀀싱 할 약물 타겟 줄기 세포 치료에 활용 될 수 있는 ENS 내의 분자를 식별 하는 우리의 기능을 크게 제한 남아 있습니다.
인간의 장 중추에서 RNA를 분리 하는 데 상대적으로 몇 가지 방법이 있다. 첫 번째 접근 방법, 셀 분리2, 필요 높은 부 화 온도 및 긴 보육 시간; 모두는 RNA 저하를 촉진 하 고 변경 transcriptome2,3으로 알려져 있습니다. 다른 접근 방법, LCM, 더 안정적으로 transcriptome를 유지 하 고 RNA 무결성 보호. 이러한 방법 중 가난한 RNA 품질 및 수량에 의해 방해 했다, 아주 노동 집약, 여러 연구는 사용 하지만 LCM 신선한-냉동 인간 창 자 조직4,,56에서 중추를 수집, 또는 얼룩 또는 RNA 추출 기술을 우리의 손에서 일의 필요한 수정. LCM 제품 설명서 제공 장의 중추8, 의 분리에 적용 될 때 추가 개선7,8, 하지만 적응 필요에서 발견 된 다른 LCM 프로토콜 RNA를 보존 하기 위한 9. 이러한 이유로 우리는 최적화 된 프로토콜을 기반으로 이러한 리소스에는 인간의 장 중추에서 상당한 양의 높은 무결성 RNA 생성, 상대적으로 빠른 워크플로우, 그리고 대형에 걸쳐 일관 된 결과 생성을 개발 샘플의 수입니다.
이 연구에서 우리는 절제 인간의 창 자 조직에서 공급 하는 장 신경에서 높은 무결성 RNA의 분리를 용이 하 게 하는 최적화 된 절차의 개요를 제시. 우리의 방법 5 가지 중요 한 측면을 통합합니다. 첫째, 갓 절제, 고정 되지 않은 인간의 장 샘플 크기, 모든 과잉 습기 실험실 티슈로 제거 하 고 2-methylbutane (2 MB)과 드라이 아이스의 슬러리 꼭대기 플래시-냉동 하기 전에 큰 기본 몰드에 평평 하 게 손질 한다. 내장의 두 번째, 더 섹션 장의 중추의 큰 페이로드를 제공 하는 슬라이드에 myenteric 총의 전체 평면을 얻기 위해 준비 되어야 한다. 성공이 단계는 조직 준비 과정에 크게 의존 합니다. 셋째, 중추는 존재에의 비균일 구조 폴 리 에틸렌 napthalate (펜) 막 슬라이드6, LCM 과정에서 최고의 속도 정밀도 제공 하는 사용을 해야 합니다. Cresyl 바이올렛 등 4, 에탄올 호환 염료 장의 중추 얼룩 동안 RNA 무결성을 유지 하기 위해 사용 되어야 한다. 마지막으로, RNA 추출 과정은 RNA-시퀀스와 성공적인 결과 위해 중요 한 우리는 높은 RNA 무결성, 장 신경의 작은 컬렉션을 시작할 때 RNA 수율을 극대화, DNA 오염 제거 하 고 가능한 많은 RNA 종 유지 RNA 추출 방법을 모색.
함께 찍은, 현재 연구에서 이러한 요소의 최적화 크게 가속 워크플로 및 장의 중추 뛰어난 RNA 수량 및 품질의 샘플을 생성. 결과이 접근의 일관성을 나타내는 샘플의 상당한 그룹 간에 크게 일관 되었습니다. 또한, 이러한 접근 수십 장의 중추에서 RNA 샘플을 성공적으로 시퀀싱을 사용 했습니다. 여기에서 강조 하는 전략 수행 원하는 중추의 LCM 또는 주변 장치 및 중앙 신 경계와 높은-품질 RNA의 절연이 필요한 다른 경우의 핵에 대 한 광범위 하 게 적응 수 있습니다 또한.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 프로토콜에 의해는 밴 더 빌 트 대학 기관 평가 위원회 (IRB) 승인 있다.
1입니다. 조직 도착 전 준비
- 적절 한 IRB 승인을 하 고 연구에 필요한 모든 연구 조건을 만족 하는 기증자 로부터 갓 절제, 떼어낸 장 조직을 얻기 위해 인간 장기 기증 기관 조정.
참고:이 프로토콜 쥐 및 다른 설치류 모델 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다.- 즉시 각 장 세그먼트의 절제, 따라 철저 하 게 냉장된 PBS 또는 조직 저장 매체 잔여 luminal 자료 또는 배설물 제거 루멘 플러시.
- 홍 조 및 적절 한 생물 소켓에 폐기물 폐기, 후 충분 한 양의 조직을 저장 매체 (예: 3-5 회 장 조직의 볼륨)에서 조직 잠수함 하 고 개별적으로 표시, 방수 플라스틱에 저장 컨테이너, 얼음에 빠져들 또는 사용까지 냉장).
- 상당한 RNA 저하를 방지 하기 위해 컬렉션의 시간 18-26 시간 이내 조직 프로세스.
참고: 장 세그먼트 및 스토리지의 청결에 따라 수 있습니다 우리의 제안된 시간 제한 확장.
- 이 프로토콜에 표시 된 대로 사전에 인간의 조직 컬렉션에 필요한 모든 자료를 준비 (더 자세한 제품 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조). 개인 보호 장비는 착용 모든 필요한 모든 있는지 확인 합니다.
- 그림 1에서 보듯이 드라이 아이스 드라이 아이스 슬러리 함께 양동이 준비 합니다.
- 4 표준 원형 얼음 양동이 한 직사각형 얼음 양동이를 채우기 충분 한 드라이 아이스 크 러시. 표준 양동이 작은 (11 x 21 cm) 실험실 있어야 조직 드라이 아이스의 표면에 배치. 가능 하면 실험실 조직의 새로운, 미 개봉 된 상자를 사용 하 여.
- 깨끗 한 직사각형 얼음 양동이에 드라이 아이스의 2 L powderizing에 의해 드라이 아이스 슬러리를 확인 합니다.
- 드라이 아이스의 표면까지 미리 냉장된 2 MB 추가 합니다. 약간 혼합 하 고 사각형 양동이의 측면을 따라 드라이 아이스의 더 큰 조각에 의해 포위 하는 채널에 슬러리의 모양 표면에 피 펫 팁 박스 커버를 사용 하 여 슬러리를 평평 하 게.
- 더 빠른 냉동을 장려 하기 위해 얼음 양동이의 가장자리를 따라 드라이 아이스의 얇은 몇 블록을 배치 합니다. 주어진된 시간에 드라이 아이스 슬러리 양동이에 느슨하게 맞게 ≥4 기본 금형 위한 공간 이어야 한다.
- 선택적으로, 스택 다른 사각형 얼음 통에서 얼음 양동이 드라이 아이스와 함께 ¼ 가득. 이 위치 더 드라이 아이스 슬러리를 보 온 하는 데 도움이 절차 중 드라이 아이스와 2 MB의 빈번한 조정에 대 한 필요성을 방지 한다.
- 다음과 같은 순서로 조립 라인에 드라이 아이스 버킷 위치: 1) 드라이 아이스 슬러리 물통, 실험실 2) 조직-드라이 아이스 물통, 3 & 4) 일반 건조 얼음 양동이, 5) 직사각형 드라이 아이스 물통 (그림 1A).
2. 플래시-냉동 인간 창 자 조직 준비
참고:이 전체 과정은 장 조직 품질에 따라 장 세그먼트 당 45-80 분 사이 걸릴 수 있습니다. RNA 품질 및 조직학 LCM와 함께 진행 하기 전에 평가를 품질 관리 샘플 수집 것이 좋습니다.
- 젖은 얼음 대형 트레이 드라이 아이스 위에 외과 절단 보드를 놓습니다.
- 이 설치 프로그램에서 콜드 스토리지 솔루션에서 조직 및 트림된 세그먼트를 저장 하기 위한 500 mL 및 100 mL 비 커를 진정. 티슈를 받을 준비가 되도록 미리 진정 기지도 마에 주조한 다.
- 신선한 장 조직 받으면 부 조직 이송은 미디어 어 고 미리 냉장된 비 커에 그것을 유지. 장 조직 및 후속 단계에 대비해 트림된 세그먼트의 임시 저장소에 대 한 비이 커에 어떤 공간을 두십시오.
- 충분 한 조직 (40-60 cm2) 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 RNA를 생성 하 고 품질 관리 샘플 제공 하 약 20 cm의 길이를 장 세그먼트를 잘라. 조직의 무결성에 따라 훨씬 더 작은 길이 (즉, 내장의 5 cm) 다운스트림 처리에 대 한 RNA 격리를 달성 하기 위해 가능한 수 있습니다.
- 수술가 위를 사용 하 여 창 자에서 결합 조직과 멀리 지방 트림. 잔여 장 serosa 따라 많은 타협 완전히 평평 하 게 이후의 단계에서 조직 하는 능력. 신중 하 게 구조적으로 myenteric 총을 손상 하거나 단면에 고르게 평평 조직의 외관을 만들 수 있는 지방과 결합 조직의 제거 동안에 serosa nicking 피하기 조직, 정돈 한다.
- 첨부 파일 mesenteric의 사이트에서 선호 장 샘플의 전체 길이 따라 세로 절 개를 확인 합니다.
- 멀리 해 부 그리고 긴장에서 출시 되 고 시 더 쉽게 평면화 있도록 콜론에서 tenia 대장균을 삭제.
- 냉장된 절단 보드에 내장 점 막 쪽 아래로 퍼짐 그리고 조직의 전체 길이에서 1.25 cm 넓은 스트립.
참고: 장 조직 자주 확장, 트리밍 후 그래서이 크기를 적절 하 게 조정 해야 합니다. - 일시적으로 냉장된 조직-스토리지 솔루션에서 지구를 저장 합니다.
참고: 우리가 사용 하 여 Belzer UW 콜드 스토리지 솔루션 긴 선반의 생명이 있다, 상대적으로 비용 효율적 이며 필요할 때까지 실내 온도에 저장 될 수 있기 때문에. - 콜드 스토리지 솔루션에서 조직 스트립을 제거 하 고 길이 세그먼트 ~1.5-2 c m으로 잘라.
- 신속 하 게 실험실 물티슈, 과잉 액체를 제거 하 고 플래시 동결 중 장 serosa 따라 얼음 결정의 형성을 방지 하의 스택에 장 세그먼트 되 리. 조직 충분히 건조 하지 그것은 myenteric 총에서 높은-품질 섹션을 얻기 어려울 것 이다.
- 미리 냉장, 대형, 일회용 플라스틱 기본 몰드 (24 m m x 5 m m x 37)에 얼룩이 장 조각 점 막 측 하다.
- 신중 하 게 가볍게 기본 몰드의 표면 조직을 스트레칭 하 고 부드럽게 눌러는 serosa 아래 갇혀 있을 수 있습니다 모든 공기 방울을 추방 하 곡선된 겸 자 사용 하 여 각 세그먼트를 평평 하 게. 참고 병합 하는 동안 조직 확장입니다. 필요한 경우, 세그먼트를 트림 하 고 나머지 샘플 작은 크기로 잘라.
참고: 조직 이상 뻗어 이면이 myenteric 총을 왜곡 됩니다. 모든 기포를 제거한 후 동결 이전 샘플의 두께 평가 합니다. 필요한 경우 장 샘플 접근 그것의 원래 두께 때까지 견본 안쪽의 가장자리를 밀어. - 드라이 아이스, 2 MB 슬러리의 표면에 로드 기본 몰드를 놓습니다. 조직 크기와 장 세그먼트의 두께 따라 30-60 s 내에서 완전히 고정 해야.
- 드라이 드라이 아이스의 두 번째 양동이에 미리 냉장 실험실 조직에 신속 하 게 기본 몰드를 문 지르고 하 여 잔여 2 MB를 제거 하려면 기본 몰드의 하단.
- 드라이 아이스의 세번째 욕조에 말린된 샘플을 전송 하 고 포장 준비가 될 때까지 드라이 아이스의 표면 아래에 묻어.
- 신속 하 게 포장, 샘플 준비의 품질 검사를 하기 전에 기본 몰드의 하단을 관찰 합니다. 적어 평면 표시 하지 않거나 큰 기포가 샘플으로 이들은 cryosectioning와 LCM에 대 한 피해 야 한다.
- 완전히 냉동 보관 하는 동안 발생 하는 조직의 배치 되도록 양동이에 드라이 아이스 위에 누워 미리 레이블이 알루미늄 호 일에 샘플 랩.
- -80 ° c.에 저장 하는 동안 조직의 탈수를 최소화 하기 위해 플라스틱 랩의 레이어와 샘플 랩
- 그들은 냉동 고로 이동할 준비가 될 때까지 직사각형 통에 샘플을 저장 합니다.
- 레이블을 미리 고 사전 컬렉션 후 샘플의 즉시 저장-80 ° C에서 냉동 상자를 진정.
- LCM 실시 이전 RNA 무결성의 평가 대 한 각 장 세그먼트에서 조직의 작은 부분을 가져가 라.
- 사전 라벨 2 mL RNase 무료 튜브 각 세그먼트에 대 한 세포의 용 해 버퍼의 ≥500 µ L로 가득. RNA 추출 키트 재료의 테이블에에서 나열 된 "D"를 사용 하는 것이 좋습니다.
- 표준 조직 마이크로-균질 화기 (20-40 s, 아무 조직 덩어리 남아 때까지)에 장의 작은 (2mm x 2mm) 조각 균질 다음, 즉시 동결 RNA lysate 저장소-80 ° C에서 드라이 아이스에 RNA 추출 진행까지.
- 필요한 경우, 섹션의 일부에 포함 조직 동결 매체 (TFM) 백업으로. 이 섹션에 설명 된 정확한 같은 방법으로 조직 섹션을 준비 하지만 플래시 동결 이전 기본 금형 내의 TFM에 견본 잠수함.
3입니다. Cryosectioning
- Cryosectioning, 전에 얼룩과 탈수에 대 한 모든 필요한 자료를 준비 하 고 드라이 아이스의 양동이로-80 ° C 냉동 고에서 원하는 조직 샘플을 전송 합니다.
- 최적의 절삭 온도 (-18-22 ° c)을 100% 에탄올으로 표면 아래 닦아 하 고 블레이드를 치료에 의해 사용 하기 위해 cryostat 준비와 트레이 RNase 오염 솔루션.
- 가장 물림 쇠를 샘플 준수, 다음 방법을 사용 하십시오.
- 적어도 30 대 한 드라이 아이스에 집게를 장소 장 샘플을 unwrapping 및 드라이 아이스 serosa-사이드-최대의 표면에 그것을 배치 하기 전에 s.
- 큰 cryostat 견본 홀더에 조직 동결 매체 (TFM)의 3-5 m m 마운드를 부 어 하 고 즉시는 TFM에 장 샘플 serosa-사이드-최대 전송.
- 신속 하 게 전송 견본 홀더 드라이 아이스와 powderized 드라이 아이스와 함께 커버 실 온에서 2-5 s에 대 한 샘플에 TFM을 허용한 후에. TFM은 myenteric 총의 비행기 아래 유지할 것을 인식 하시길 바랍니다.
참고: 이상적으로, 창 자 점 막의 외부 표면 것입니다 완벽 하 게 준수는 TFM은 TFM 샘플의 해빙 없이 동결을 시작 하기 전에.
- Cryostat의 견본 머리에 견본 홀더 탑재와 myenteric 총의 평면 절단 블레이드에 평행 하 게 될 것입니다 되도록 cryostat 블레이드, 표본을 맞춥니다.
- 8 µ m cryostat에 단면 두께 설정 합니다. 완벽 하 게는 견본을 정렬의 목적 각 슬라이드에 myenteric 총의 가장 큰 가능한 노출 영역을 얻을 것입니다. 이 두께 일반적으로 설치류와 인간의 조직에 적합 하지만 필요에 따라 조정 될 수 있다.
- Serosa 경도 근육 myenteric 총을 도달할 때까지 통해 섹션.
- Myenteric 총을 찾으려면 슬라이드에 샘플 섹션을 탑재 하 고 1 %Cresyl 보라색 또는 톨루이 블루, 등수성 염료와 섹션을 얼룩.
- 경도 원형 근육 층 사이의 교차점을 식별 하기 위해 X 40-2000 확대 가벼운 현미경 아래 절을 참조. 현미경 매개 변수 테이블의 자료에 제공 됩니다. 단면화의 시작에는 serosa 결합 조직의 존재에 의해 표시 됩니다. 일부 남아 있는 mesenteric 지방에서 serosa 따라 존재 수도 있습니다. 외부 경도 근육 층의 시트는 다음 시작합니다. 경도 원형 근육 층 사이 경계에 도달 하면 장 신경의 일부를 관찰 됩니다.
참고: 다음의 몇 가지 섹션, myenteric 총 될 것입니다 매우 분명, 단일 섹션 (그림 2C) 내에서 존재 하는 신경의 큰 swaths. 조직에 없는 경우 완전히 평평한 단면 시작는 중추의 일부만 주어진된 시간에 각 섹션에 표시 됩니다. 때때로, 장 샘플 완벽 하 게 평평 하 게 나타나는 조직에도 불구 하 고 본질적으로 고르지 myenteric 총을 할 수 있습니다. 이것은 특히 십이지 샘플에 대 한 사실입니다. 우리의 경험에서 이러한 샘플 LCM, 처리 하는 데 시간이 더 오래 걸릴 수 있습니다 하지만 충분 한 RNA는 단 하루 세션 내에서 수집할 수 있습니다. Myenteric 총의 정확한 위치는 조직과 동결 이전 준비에 따라 샘플 사이 상당히 달라질 수 있습니다.
- 신경 및 슬라이드 당 명과 가장 많은 수를 제공 하는 최적의 컬렉션 lcm, 직렬 섹션을 수집 시작 합니다. 샘플의 표면적에 따라 여러 섹션 단일 펜 막 슬라이드에 결합할 수 있습니다.
- 짧게 5-10 s cryostat 냉장 펜 막 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다. 장착, 조직 해야 녹여 약간, 극대로 RNA 무결성을 유지 합니다.
4. 얼룩
참고: 얼룩 프로세스의 개요, 표 1을 참조. 모든 솔루션에 사용 되는 표준 50 mL 원뿔 튜브에는 준비가 되어 있습니다. RNase 오염 솔루션 튜브의 외부를 치료 결과 (데이터 표시 되지 않음)을 개선 하기 위해 표시 되지 않습니다.
- 최소 1 일 사전에 95% 에탄올에 4 %Cresyl 바이올렛의 포화 솔루션을 준비 하 고 완전히 다시 Cresyl 바이올렛 주사기를 로드 하기 전에 일시 중단.
참고: 에탄올의 농도 해야 효과적인 얼룩에 대 한 하향 조정 될 토론 섹션에 설명 된 대로 합니다. RNA 무결성 감소 크게 얼룩 동안 50% 또는 75% 에탄올을 사용 하 여 있는지 여부를 테스트 하지 했습니다. Cresyl 바이올렛 빛에 민감한 이며 따라서 빛 으로부터 보호 되어야 한다. - 슬라이드에 myenteric 총의 섹션을 장착 후 즉시 30 (사전-20 ° C에서 냉장) 95% 에탄올의 원뿔 유리병에 슬라이드를 잠수함 s.
- 섹션은 이전 단계에서 슬라이드에 완전히 고착 하지 않았다, 경우 약간 gloved 손 (실험실 지우기 한다 배치 사이 슬라이드와 장갑), 95% 에탄올에 잠수 하기 전에 전체 준수에 대 한 슬라이드의 하단을 따뜻한. 이 솔루션은 RNA 무결성을 감소 하지 않고 적어도 3-6 슬라이드 다시 사용 될 수 있습니다.
- 사전 처리, RNase 무료 컨테이너8위에 배치 실험실 지우기에 슬라이드 얼굴 위로 하다.
- 미리 4 %Cresyl 바이올렛과 3 mL 주사기를 0.2 µ m 주사기 필터 첨부.
참고: 셀 루 로스 아세테이트 필터를 좋습니다. - 6-10 방울 직접 조직 섹션8 에 얼룩을 적용 하 고 10-30 s, 또는 충분 한 염료까지 품 어 때 유지는 드 물. 얼룩, 하는 동안 부드럽게 손으로 조직 단면도 얼룩으로 입힌 균등 하 게 되도록 슬라이드 컨테이너 회전.
- 얼룩과 즉시 부 어 드 75% 에탄올의 유리병에 슬라이드 얼룩. 초과 염료는 주로 샘플의 새 어 때까지 반복적으로 슬라이드 잠수함. 이것은 10-20 s 사이 걸릴 수 있습니다.
- 취소 반복적으로 담거 서 95% 에탄올의 유리병에 샘플 10 s. Submerge 샘플에 대 한 반복 모든 초과 얼룩 제거 되었습니다 때까지 얼룩 마무리.
- 중추의 얼룩을 최적화 하기 위해 필요에 따라 destaining 기간을 수정 합니다. 너무 많은 얼룩을 제거 하는 경우 샘플 되 너무 투명 하 고 시각화 하는 것이 어려울 수 있습니다.
참고:이 얼룩 프로토콜 최적화 되었습니다 여러 간행물5,8,10,11 만족 스러운 결과 가져온 전에 수정 요구에 따라. 따라서, 염료 그리고 destaining 프로세스 동안 사용 되는 에탄올의 농도 때 최적의 결과 얻기 위해 필요한에, 수정할 수 합니다.
- 중추의 얼룩을 최적화 하기 위해 필요에 따라 destaining 기간을 수정 합니다. 너무 많은 얼룩을 제거 하는 경우 샘플 되 너무 투명 하 고 시각화 하는 것이 어려울 수 있습니다.
5입니다. 탈수
- 바로 찍어 100% 에탄올에 슬라이드 2-3 번, 10-20 s의 총.
- 적어도 30 무수 100% 에탄올에 슬라이드 잠수함 s. 무수 에탄올은 매우 검 습기, 흡수 물을 제거 하 고 따라서 샘플5을 더 완전 하 게 탈수 하는 절차의 시작 전에 100% 에탄올의 유리병에 분자 체 (8-12 메시)를 추가 합니다.
- 반복 해 서 15-20 s 크 실 렌에 슬라이드 찍어. 이 단계는 완벽 하 게 슬라이드에 에탄올의 레이어를 제거합니다. 크 실 렌, 완전히 adsorb 초과 에탄올과 물 분자5의 튜브를 미리 분자 체를 추가 합니다.
주의: Xylenes 눈과 상부 호흡기 자극으로 분류 하 고 화학 증기 두건에서 사용 해야 합니다. - 적어도 10 분 동안 (분자 체, 8-12 메쉬)와 크 실 렌에 슬라이드 잠수함
참고: 필요한 경우이 단계 후 짧은 휴식을 취할 수 있습니다. 샘플 크 실 렌에 해로운 효과 없이 4-5 시간에 대 한 얼룩, LCM 또는 RNA 수율/무결성을 남아 있을 수 있습니다. - 선택적으로, 개별적으로 시점에서 몇 가지 추가 슬라이드를 준비 합니다. 모든 준비 슬라이드에 LCM을 완료 한 후 슬라이드의 두 번째 라운드를 준비 하는 경우는 cryostat에서 조직 수 표면이, 조직 표면의 탈수 때문에 해야 합니다. 1 ~ 4 섹션 사용할 섹션 수집 될 수 있습니다 전에 삭제 될 필요가 있습니다.
6. 레이저 캡처 기정 (LCM)
- 크 실 렌에서 슬라이드를 제거 하 고 LCM 현미경 단계에 LCM 캡의 적어도 1 분 삽입 카트리지를 위한 화학 증기 두건에서 건조. 무대에 슬라이드를 로드 하 고 슬라이드의 개요 이미지 확보.
- LCM에 대 한 원하는 위치를 확인 하 고 슬라이드에 모자를 로드 합니다.
- 적외선 (IR) 레이저를 정렬 하 고 그것의 전원 및 기간 20-30 µ m 직경 캡처 자리 수 있도록 조정 합니다.
- 자외선 (UV) 레이저를 찾아서 적절 한 절삭 속도 강도 설정 합니다.
- LCM 소프트웨어, 모자 (녹색 원으로 소프트웨어 프로그램의 슬라이드 개요에 묘사 된)에 수집 영역의 경계 내에 있는지를 사용 하 여 수집을 원하는 중추를 설명 합니다.
- 자취의 각각에 적어도 한 IR 자리 마다 100-500 µ m IR 명소를 조정 합니다.
- 모든 표시 된 중추의 컬렉션 진행 하 IR/UV 컷된 단추를 누릅니다.
- 컬렉션 완료 되 면 뚜껑을 새 위치로 이동 하 고 수집 프로세스를 반복 하거나 중추 (또는 60-80 분의 권장된 시간 제한에 도달할 때까지) 뚜껑 가득 충분히 일단 QC 역에 LCM 모자를 검사 합니다.
- 파편 모자에 있다면, 멀리 뾰족한 붓 미리 RNase 오염 제거 솔루션으로 치료, nuclease 무료 물으로 씻어 서 되었으며 완전히 건조를 사용 하 여 닦습니다.
- 조심 스럽게 눈으로 모자를 검사 또는 모든 파편 되도록 밝은 분야 현미경 확대와 함께 제거 되었습니다. 파편은 미리 치료 페인트 브러시를 사용 하 여 제거할 수 없습니다, 경우 파편 떨어져 긁어 미세 피 펫 팁 (RNase 무료)를 사용 합니다.
- 0.5 mL microfuge 관 RNA 세포의 용 해 버퍼 (RNA 추출 키트 "B", β-mercaptoethanol 10 µ L/mL의 농도에서 추가 버퍼 RLT)의 230 µ L로 가득에 모자를 보호 합니다.
- 모자, 짧게 소용돌이, 반전 하 고 30 분 동안 실 온에서 품 어.
- 5 분, 다음 전송은 microfuge 관 건조 얼음에 대 한 5000 x g ≥에 원심.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. RNA lysates 적어도 1 주 동안 RNA 저하에 상당한 영향 없이-80 ° C에 저장 될 수 있습니다. RNA 격리 같은 날 수행 하는 경우 다음 그들은 추출에 대 한 준비가 될 때까지 얼음에 샘플 진정. - 크 실 렌에서 슬라이드를 제거한 후 80-90 분의 권장된 최대 제한 시간 내에 모든 추가 컬렉션을 수행 합니다. 탈수 섹션 주위 습도에 노출은, RNases 수 점차적으로 되 고 다시 활성화. 컬렉션 기간 제한 같은 효과 최소화 하 고 최대한 RNA 무결성을 유지 수 있습니다.
7. RNA 격리
- RNA 추출 RNase 무료 워크스테이션 준비.
- 모든 튜브와 시 약 설명서에 따라 RNA 추출 키트에 대 한 준비.
참고: 많은 키트 RNA 격리 LCM을 다음에 사용할 수 있는 동안 우리는 최고의 성공이 있었다 RNA 추출 키트 "B", 재료 목록에 나열 된를 사용 하 여. RNA 추출 시 약의 측면-의해-측면 비교 그림 5 를 참조 하십시오. - -80 ° C 냉동 고에서 샘플을 제거 하 고 37 ° C 물 욕조에 급속 해 동.
- 균일 하 게 배포 guanidinium 안산 염 2-3 s에 대 한 즉시와 동 해 동 샘플.
- 각 샘플 70% 에탄올의 동등한 양으로 결합. 필요한 경우, 충분 한 RNA 농도 도달, 2 이상의 lysates 풀.
- Microdissected 샘플에 대 한 최적화 된 프로토콜을 사용 하 여 RNA 추출 과정에 대 한 설명서에는 제조업체의 지침에 따라 진행 합니다.
- 최소 권장된 물의 볼륨 nuclease 무료 (14 µ L)으로 마지막 단계에서 RNA을 elute.
- RNA 격리, 다음 aliquot에 새로운 각 샘플에서 RNA의 1-2 µ L 미리 표시 품질 평가/품질 관리에 대 한 RNase 무료 튜브 마이크로 장치는 Bioanalyzer 같은 RNA의 소량을 시각화 수 있는. 고감도 RNA 정량화 키트 정량화에 대 한 별도 튜브에 추가 1 µ L 약 수.
- 다음이 단계를 필요에 따라 조정, 다운스트림 분석에 대 한 충분 한 양의 RNA (즉., 이전 RNA 추출 LCM 모자 수 수영장).
- 다운스트림 분석에 대 한 충분 한 샘플을 수집까지-80 ° C에는 저장소 RNA
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Representative Results
기존 프로토콜 RNA-이 대 한 기준을 충족 하는 LCM을 사용 하 여 인간의 장 샘플에서 장의 중추의 상대적으로 빠른 컬렉션을 사용할 수 있는 여러 가지 개선을 하였습니다. 첫째, 우리는 2-mb (그림 1B) 드라이 아이스의 슬러리의 표면에 배치 하는 큰 기본 금형에서 장 조직 세그먼트의 급속 동결 최적화. Cryosectioning 및 후속 LCM 동안 최고의 성공 (1B-1 C 수치)를 점 막 쪽에 직면, 기본 금형 내 평면 장 세그먼트 누워 하 여 얻은 했다. 로 어떤 곡률을 myenteric 총의 큰 단면도를 훨씬 더 어렵게 만들 것입니다 기본 금형 기지, 가능한 평면 인지 확인 합니다. 이 이렇게 쉽게 8 µ m 두께 (그림 1E) 구분 및 착 색 과정에서 TFM의 완전 한 제거에 대 한 조직에서 발생 합니다. 우리 TFM 착 색 과정을 방해 하 고 따라서 장의 중추의 식별을 가린다는 발견. RNases12의 높은 콘텐츠는 점 막을 통해 단면 방지 또한이 방향에서 조직 위치, ethanolic 얼룩의 사용 이러한 RNases를 크게 억제 비록 우리의 경험에서 그것은 나타납니다. 경우에 어디 TFM 또는 최적의 절삭 온도 (10 월) 매체 필요, 우리는 그것을 가장 먼저 기본 몰드의 하단에 샘플을 평평 하 게 한 후 (그림 1D)이이 단계를 수행 하는 형에는 TFM 추가 신뢰할 수 있는 발견. 이것은 "창"는 내장 쉽게 구상 될 수 있다, 쉽게 표본 정렬 및 생산 myenteric 총 (그림 1E)에 완전히 평행한 섹션.
슬라이드 당 장 신경의 가장 큰 지역 (얼룩에 표시 되는 섹션을 생성 하는 myenteric 총그림 2(A), 평행한 오리엔테이션에서 내장의 길이 아래로 경도 cryosections의 준비 그림 2 C). myenteric 총 (그림 2C), 경도 원형 근육 층 (그림 2B)의 apposition에 접근, 6-12 직렬 섹션 수 있습니다 (그림 2A, 수집 장의 신경 (그림 2C)의 큰 swaths 포함 된 경도). LCM 모자 용량 단일 섹션 (그림 4D)를 사용 하 여 로드할 수 있습니다. 반면, 신선한 냉동 내장 (그림 2A 2B)의 가로 섹션을 준비할 때 myenteric 총 각 슬라이드 (그림 2B)에 작은 영역이입니다. 아주 몇 장의 중추 가로 조직 단면도, 큰 시간을 투자 하 고 전체 샘플 당 더 높은 비용에서 수집할 수 있습니다. 병렬 단면 접근 가로 섹션에 비해 LCM 모자와 슬라이드의 수의 1/5 미만 사용 하 고 크게 컬렉션 프로세스를 가속 한다.
LCM, 전에 샘플 스테인드 고 완전히 동안을 피하기 위해 RNase 활동 LCM 컬렉션 탈수 있습니다. 우리는 RNA 무결성에 ethanolic 얼룩 대 수성 얼룩의 효과 직접 비교 하는 실험을 설계. 이 실험에서 두 장 함께 단일 슬라이드에 거치 했다 섹션과 4 가지 방법 중 하나로 처리 된 n = 2-3 생물 복제 그룹 당. 첫 번째 그룹에서 신선한 장 섹션 슬라이드에 마운트되지 했다 고 각 직접 드라이 아이스(그림 3)에 미리 냉장 RNase 무료 집게를 사용 하 여 RNA 세포의 용 해 버퍼에 전송 했다. 모든 나머지 그룹에 대 한 섹션 슬라이드 준수, 처리는 RNase 오염 솔루션 치료 면도칼 블레이드를 사용 하 여 슬라이드에서 긁어 되었고 RNase 무료 집게 RNA 세포의 용 해 버퍼 전송. 표준 마이크로 균질 화기는 완전히 lyse 모든 그룹에서 샘플을 사용 되었다. 두 번째 그룹에서 슬라이드 모든 단계를 통해 처리 되었습니다 하지만 아무 염료 착 색 과정 (그림 3B) 사용 되었다. 그룹 3 4 %Cresyl 보라색 염료 (그림 3C)를 사용 하 여 위에서 설명한 프로토콜 처리 했다. 4 그룹에는 수성 얼룩, 블루, 톨루이 수성 기반 얼룩 키트 톨루이 파란색과 되며 (그림 3D)의 혼합물을 사용 하 여 프로토콜을 따르는 동안 사용 되었다. RNA을 추출한 후, 설명 된 대로 Bioanalyzer와 RNA 품질 평가 했다. Ethanolic 프로토콜을 얼룩이 지 수성 사이의 유일한 차이점은 두 개의 물 외피의 추가 (30 s 각), 즉시 전후 얼룩, 통풍 관 및 염료의 보존에 필요한입니다. 우리는 슬라이드에 조직 섹션을 준수 하 고 (그림 3A 3B), RNA 품질의 약간의 불가 피한 감소로 이끌어 탈수 단계 처리 과정을 발견 하지만 그 ethanolic 염료와 염색, Cresyl 자, 하지 않습니다 더 (그림 3C) RNA 품질을 줄일 수 있습니다. 대조적으로, 수성 염료, 톨루이 블루, 실질적인 RNA 저하, 내 생 RNase 활동 (그림 3D)을 허용 하는 확장된 수성 노출 때문일 지도.
장의 신경의 독특한 모양이 기존의 유리 슬라이드6 (그림 4)와 함께 표준 IR LCM에 대 한 어려움을 포즈. 펜 막 슬라이드 (그림 4B)를 사용할 때 샘플은 유리 슬라이드의 대부분에서 분리 하는 얇은 시트에 준수는 됩니다. UV 레이저 샘플 슬라이드 (그림 4C) 및 LCM 모자 (그림 4D) 전체 준수에서 중추의 완전 한 분리의 결과로 펜 막 통해 잘라냅니다. 구조 원하는 크기와 모양 (> 10-15 µ m) 될 수 있습니다 완전히 그리고 정확 하 게 수집 (Figured 4E-4 H). 섹션 당 적은 중추와 일부 샘플 뚜껑 수 있습니다 이동된 ≥ 4 번 수집 하기 전에. 이 경우에, 슬라이드 당 2 ~ 3 섹션 장착 펜 막 슬라이드를 사용 하 여를 최소화 합니다.
RNA-seq에 LCM 샘플에서 RNA를 분리 하는 경우 목표 모든 게놈 DNA (gDNA)를 제거 하는 동안 가장 높은 RNA 품질 및 수량을 얻을 것입니다. 이상적인 RNA 격리 절차를 식별 하기 위해 수행 하는 머리와 비교는 RNA 추출 키트 "A" (그림 5A), RNA 추출 키트 "B" (그림 5B), 또는 RNA 추출 방법 "C" RNA 샘플의 정리 RNA 추출 키트 "B" (그림 5C)에 의해 프로토콜을 얼룩이 지는 최적화 된 Cresyl 바이올렛으로 샘플을 처리 한 후 LCM 수집 장 조직, 경도 근육 층에서 찍은의 표준화 된 원형 샘플 (500 µ m의 직경) 사용 되었다. 각 모자는 각 키트에서 각각 세포의 용 해 버퍼 pre-filled 0.5 mL microfuge 관 위에 배치 되 고 3 개의 RNA 격리 그룹의 각각에 무작위로 할당 됩니다. 지침 30 분 동안 42 ° C에 외피를 요구 "A" 세포의 용 해 버퍼 RNA 추출 키트와 함께 각 키트에 대 한 설명 된 대로 정확 하 게 따라 했다. 다른 키트에 대 한 실내 온도 부 화는 30 분 동안 사용 되었다. 모든 샘플 vortexed 세포의 용 해 버퍼를 추가 시 간단 했다. 기사 같은 날 실시 했다 때까지 샘플 다음 얼음에 냉장 했다 (n = 4). 우리는 RNA 추출 키트 "B" 열에 DNA 소화 단계 (그림 5A-5 C) gDNA를 효과적으로 제거 하는 동안 가장 높은 RNA 품질 및 수량에 결과 발견. 중요 한 것은, RNA 추출 키트 "B"를 완벽 하 게 제공한 RNA 세포의 용 해 버퍼 장의 중추 (그림 5D) 수집 하는 때 캡처된 중추 lyses.
평균적으로, 우리의 샘플 7.49 ± 0.53 (표 2)의 린 있다. 린 점수 6-7 보다 큰 것으로 간주 됩니다 RNA-seq (에 따라 특정 RNA 프로 파일)13, 우리에 게 주는 충분 한 품질의 신뢰는 우리의 샘플 RNA-이 고려에 대 한 충분 한 품질의 메시지를 받으면이 샘플에 대 한 린 원거리는 9.5 7.4에서이 결과 나타냅니다 우리의 최적화 된 프로토콜 RNA 무결성의 우수한 보존을 제공 합니다. RNA-seq에 대 한 샘플에서 대표적인 RNA 품질 결과 그림 6A-6 C에 묘사 된다. RNA-seq 결과 우리의 샘플 성공적으로 시퀀싱 했다 입증 그리고 겸손 3'-끝 바이어스 (그림 6D). 일반적으로,는 더 큰 3' 바이어스 선호 샘플에 낮은 린14; 이 효과 우리의 샘플에 알맞게 반영 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 관찰 된 유전자 biotypes 모든 샘플 (그림 6E), 데이터의 신뢰성을 나타내는 중 주로 일관 했다.
그림 1 . 최적의 장 조직의 동결. (A) 마른 얼음 양동이 묘사; 순서로 준비가 나) 드라이 아이스 슬러리, 드라이 아이스, iii) 임시 저장 물통, iv) 포장 양동이, v) 사전 냉장고 저장 물통, vi) 사전 냉장고 저장소 오버플로 양동이 위에 배치 ii) 연구소 조직. (B) 우리는 드라이 아이스 및 2 methylbutane의 슬러리의 표면에 배치 하는 큰 기본 금형에서 조직 세그먼트의 급속 동결 최적화. 완전히 고정 표본, 세그먼트 점 막 쪽을 향하도록 기본 형에서 평면 레이아웃 패널 B. Intestinal 에서처럼 설치에서 관찰의 (C) 가까이 업 이미지. (D)이 동결 방법을 같은 방법으로 조직 준비 하지만 TFM 동결 하기 전에 기본 형에 추가 TFM 함께 사용 하기 위해 쉽게 적응 수 있습니다. 결과 샘플 쉽게 구상 될 수 있다 serosa와 완전히 플랫 myenteric 총이 있을 것 이다. (E) 모두 조직 준비 접근 권장된 8 µ m 두께에서 우수한 조직 단면도 생성합니다. TFM을 사용 하 여 프로시저 여기 그려져 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 장 조직의 올바른 방향 섹션 장의 중추에 풍부한 제공. 신선한 냉동 내장 (A, B)의 표준 가로 횡단면을 준비할 때만 myenteric 총 (B)에 각 슬라이드의 작은 영역이입니다. 아주 몇 장의 신경 소모 하 고 비용이 많이 드는 슬라이드 당 수집할 수 있습니다. 대조적으로, myenteric 총 (C)의 비행기에서 경도 섹션 준비 중추 (C)의 훨씬 더 큰 표면 영역을 제공 합니다. Myenteric 총의 serosa에서 시작 하 고 안쪽으로 경도 근육 (B)를 통해 단면으로 얻을 수 있습니다. Myenteric 총 경도 원형 근육 층 (B)의 접속점에 접근 하는 때 6-12 직렬 섹션을 수집할 수 있습니다. Myenteric 총의 각 경도 단원 (우선적으로 중추를 얼룩 없이 크 실 렌, 수정된 얼룩 프로시저를 사용 하는 c에서 대표) 장 신경의 큰 swaths 있습니다. LCM 모자 단일 조직 단면도 사용 하 여 용량을 채울 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . RNA 품질 향상 에탄올 호환 염료와 얼룩. RNA 품질은 Bioanalyzer에 의해 측정 되었다 고 각 그룹에서 두 샘플의 대표적인 결과 표시 됩니다. 초기 RNA 품질 신선, 볼륨이 섹션 (A, 치료)에서 측정, 8.65 ± 0.07 RNA 무결성 번호 (린) 했다. 탑재 및 얼룩 (B) 하지 않고 모든 단계를 통해 처리 섹션, 린 7.95 ± 0.35 이었다. 4 %Cresyl 바이올렛으로 얼룩이 지는 탈수 단계에 추가 될 때와 7.87 ± 0.35 (C)의 평균 린 린에 영향을 무시할 수 없었다. 비교에서는, 수성 얼룩, 톨루이 블루 (T-블루) 및 (D) 절차에 필요한 물 린스의 추가 사용 하 여 크게 감소 RNA 품질, 6.45 ± 0.21의 린 결과. 각 그룹 n의 구성 = "아니 치료" 및 "T-Blue"(n=2) 제외 3 생물 복제. 신장 보고는 평균 ± 표준 편차로 여기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 펜 막 LCM 슬라이드 장 신경의 정확한 컬렉션을 사용합니다. 원치 않는 조직 픽업 (A)에서 발생 하는 경향이 있다 LCM 통해 장의 중추를 수집 일반 유리 현미경 슬라이드를 사용 하 여. 빨간 원형 (직경에서 30 µ m) 수집 프로세스 동안 사용 되는 IR LCM 반점의 크기를 나타냅니다. 흰색 화살표는 인접 한 muscularis 직물의 조각을 뽑아 신경 절의 컬렉션을 나타냅니다. 펜-막 슬라이드 (B), 샘플은 유리 슬라이드의 대부분에서 분리 하는 얇은 시트에 준수는 됩니다. LCM UV 레이저 절단, 샘플 및 펜 막 신경 절의 모양 (C)에 슬라이드에서 중추의 완전 한 분리의 결과로 슬라이스 고 샘플 (D에서에서 제거 될 때 LCM 모자에 부착을 완료 ). 구조 원하는 크기와 모양 ≥10-15 µ m 수 완전히 그리고 정확 하 게 수집된 [(E), 초기 조직 마크 업; (F) IR 및 UV 레이저 절단 완료; (G) LCM 모자 섹션에서 제거], LCM 모자 (H)에 시각으로. 패널 H에에서 얼룩 덜 룩 한 배경 모자에 내재 하 고 원치 않는 파편 아니다. 패널 전자-H 에 녹색 서클 블루 십자선 LCM 프로그램의 일부 이며 각각 UV 및 IR 레이저에 대 한 자리 표시자입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 최적의 RNA 격리 키트 선택. RNA 무결성 결과 3 개의 다른 RNA 격리 절차의 동시 비교 후 표시 됩니다. 각 그룹에서 두 대표 작은 병렬로 처리 하는 샘플 간에 발생할 수 있는 변화를 설명 하기 위해 표시 됩니다. RNA 추출 키트 "는" (A) 샘플 6.83 ± 0.65의 린을 생산 하 고 적당 한 RNA 수율을 제공 DNA 오염에 열 DNase 소화를 수행 하는도 불구 하는 경향이. RNA 추출 키트 "B" (B) 8.3 ± 0.1에서 가장 높은 측정된 린 결과. 동안 페 놀 기반 RNA 추출 방법 "C" (뒤의 RNA 추출 키트 "B" RNA 샘플 정리) (C) 등장 gDNA를 제거 하 고 7.5 ± 0.26의 린 했다, 큰 밴드의 녹는에서 수는 오염 했다는 LCM 모자 RNA 세포 단계에서 접착제 중합체. 또한, RNA 수익률 RNA 추출 키트 "A" 및 추출 방법 "C"에서 지속적으로 RNA 추출 키트 "B"에 의해 얻은 그 보다 낮은 했다. 중요 한 것은, RNA 세포의 용 해 버퍼 RNA 추출 키트 "B"에서 제공입니다. (추가 된 β-mercaptoethanol)와 완벽 하 게 캡처된 중추 (D) lyses. 각 그룹 했다 n = 3 생물 복제 하 고 여기로 평균 ± 표준 편차 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 . 대표 결과. 샘플 당 장 신경의 2 개의 모자를 풀링할 때 우리 RNA-seq에 대 한 RNA의 충분 한 수량을 구하는 (> 1 ng) 함께 우수한 RNA 품질. 대표적인 RNA 플롯 8.3 (A), (B), 7.5 및 6.9 (C) 린와 샘플에 대 한 표시 됩니다. RNA-seq 데이터 품질 평가 프로그램, 끝-바이어스 플롯 나타냅니다 샘플 시퀀스 성공적으로 했다 겸손 한 3'-끝 바이어스 r (D) 실행을 통해 실행 했다. (E) 유전자 biotype 플롯 또한 시퀀싱 결과 크게 샘플 간에 일관 됩니다 나타냅니다. 총, 우리는 있 었는 > 95% 성공률 RNA-Seq 샘플 사용할 수 생성에 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 단계 | 기간 | 목적 |
| 95% 에탄올 (-20 oC) | 30 s | 고정 |
| 95% 에탄올에 4 %cresyl 바이올렛 | 10-30 s | 얼룩 |
| 75% 에탄올 (반복 하 게 찍기)을 | 15-25 s | 얼룩 제거 |
| 95% 에탄올 (반복 하 게 찍기)을 | 5-15 s | 얼룩 제거 |
| 100% 에탄올 | 15 s | 탈수 |
| 100% 에탄올 (무수) | 30 s | 탈수 |
| (반복 하 게 찍기)와 크 실 렌 | 15-20 s | 탈수 |
| 크 실 렌 | > 10 분 | 탈수 |
| 건조 | 1-3 분 | 크 실 렌의 증발 |
표 1입니다. 얼룩 및 탈수 프로토콜 개요. 이 테이블 설명 우리의 최적화 된 얼룩 프로토콜. 그것은 더 나은 결과 제공 하는 경우 Cresyl 바이올렛, 대체 하는 모든 에탄올 호환 얼룩를 사용할 수 있습니다. 경우에 따라 얼룩이 지 고 destaining의 기간 연장 또는 단축 해야 합니다. 일반적으로, 더 이상 고정 시간 빨리 조직 것입니다 완벽 하 게 얼룩이 질. 우리는 다시 사용 후 튜브를 3 번 같은 조직 세그먼트에서 슬라이드를 준비할 때 RNA 무결성에 감소를 발견 하지 않았습니다.
| 기증자 | 조직 | 린 |
| F | 콜론 | 7.1, 7.4, 7.2 |
| M | 회장 | 7.2, 6.9, 7.8 |
| M | 십이지 장 | 8.2, 7.4, 7.7 |
| 회장 | 7.4, 7.6 7.3 | |
| 콜론 | 7.7, 7.8, 7.3 | |
| F | 십이지 장 | 7.1, 7.3, 6.9 |
| 회장 | 7.8, 7.9, 7.6 | |
| 콜론 | 7.3, 8.0, 7.5 | |
| M | 회장 | 6.9, 6.7, 6.9 |
| 콜론 | 6.8, 6.4, 6.6 | |
| M | 회장 | 7.2, 7.3, 7.6 |
| 콜론 | 6.7, 7.6, 7.7 | |
| M | 회장 | 8.3, 7.8, 7.4 |
| 콜론 | 7.0, 7.4, 7.0 | |
| F | 십이지 장 | 8.3, 8.8, 8.0 |
| 회장 | 8.1, 8.0, 7.8 | |
| 콜론 | 8.4, 8.6, 7.1 |
표 2입니다. 대표적인 RNA 무결성 결과입니다. 이 테이블에 표시 하는 샘플 모든 인간의 장 중추에서 입수 했다. 모든 선택 된 샘플 충분 한 RNA 품질 있고 RNA-seq 분석에 대 한 수량. 이 테이블에 나열 된 모든 샘플의 평균 린 7.49 ± 0.53 이다. RNA 농도 또한 RiboGreen 양의 iT 분석 결과 사용 하 여 측정 및이 테이블에 표시 하는 모든 샘플 우리의 RNA-seq에 필요한 최소한의 수량을 만난 (> 1 ng) 실험. 작은 양이 사전 확대 절차에 따라 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 절차는 더 신뢰할 수 있는 샘플 사이의 유전자 발현에 큰 차이가 있을 또는 그룹 비교 되; 하나 거기에 기대 하는 경우 그렇지 않으면 이러한 결과 일부 RNA-seq 응용 프로그램에서 진정한 차이 마스크 수 있습니다. 그것은 따라서 일반적으로 권장 가능 하면 더 많은 자료와 함께 시작 하.
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Discussion
이 절차 RNA-이 대 한 RNA를 파생 하는 원본으로 수많은 장 중추의 효율적인 수집 가능 여기, 우리가 극대로 RNA 무결성을 유지 하면서 기존 프로토콜에서 설명 하는 프로세스를 가속 있다. 이 절차의 모든 단계는 상호 의존, 그것은 중요 한 연구의 개시에서 모든 문제를 제거 하 고는 모든 샘플 준비가 되어로 유사 하 게 다른 가능한 신뢰할 수 있는 RNA-이를
절차의 개시에서 RNA 무결성 수 있습니다 부정적인 영향을 받을 경우 실험실에서 처리를 위해 장기 기증 시 조직의 컬렉션 및 조직의 영수증 사이 시간 간격 (찬 허 혈 성 시간) 너무 깁니다. 이 문제를 감안할 때, 우리는 높은-품질 RNA 여전히에서 추출 수 있습니다 장 샘플 24 시간 냉 허 혈 성 후에 놀 랐 다. 장 샘플은 냉장 냉장 솔루션에 제대로 저장 때 조직의 무결성 및 RNA 품질의 최상의 보호가 이다. 장 조직 기관 컬렉션 팀 내장의 소화 효소, RNases 및이 기간 동안 RNA 품질에 영향을 줄 수 있는 다른 분자는 노출을 제한에 의해 수집 플러시 되도록 해야 합니다. 우리 장 표본 완전히 플러시되지 때이 크게 샘플의 린을 줄일 수 있습니다 발견 했다.
장 조직 샘플을 준비 하기 위한 우리의 최적화 된 절차를 사용 하 여, 우리 TFM에 샘플을 포함 하지 않도록 수 있습니다. TFM 에탄올과 자일 렌 장 중추의 시각화 방해 어두운 갈색 침전을 형성 하기 위하여 상호 작용을 하기 때문에 우리는 우리의 샘플에서 그것을 제외 하 고 선호 합니다. 그러나, 마우스 또는 다른 종에서 장의 조직으로 작업할 때 TFM 제외 가능한 않을 수 있습니다. 이 경우에, 우리 TFM 슬라이드에 준수 섹션에서 제거 실험을 했습니다. 조직에 충분 한 표면적, 경우 에탄올 (-20 ° C에서 냉장)에 수 있습니다 신속 하 게 집게로 제거 될 수 있도록 TFM을 해결 하기 위해 전송 피 펫과 슬라이드에 틈 다 떨어뜨린 수 있습니다. 떨어지는 슬라이드에 에탄올 에탄올, 여러 슬라이드 처리 되는 브라우닝 효과 악화 수 있는 유리병 안에 TFM의 축적을 방지 합니다.
플래시 동결, 동안 우리 부탁 보다는 100% 에탄올, 2-MB, 드라이 아이스 슬러리를 사용 하 여 2 MB 쉽게 직물의 표면에 착륙 할 때 증발 하기 때문에. 에탄올은 TFM, 쉽게 제거 될 수 없는 조직 블록에 화학 슬러지를 형성 결합 될 때 특히 더 느리게 증발 해 경향이 있다. 에탄올과 2 메가바이트 소 다 튄 적극적으로 작은 냉동 용기에 얼 때 드라이 아이스 슬러리의 작은 볼륨 낮은 비 열 용량을가지고 있기 때문에 하는 경향이 있다. 대신, powderized 드라이 얼음으로 채워진 큰 직사각형 양동이 사용 하 여 큰 냉각 질량을 제공 하 고 조직 고정 되는 동안 온도 동요를 방지.
앞에서 언급 했 듯이, 그것은 때때로 다른 사람을 기준으로 일부 조직 샘플에서 장의 중추의 지속적인 시트를 쉽게입니다. 당연 하 게도, LCM의 전반적인 속도 원본 조직 또는 샘플링 되 고 장 지역의 특성에 따라 변동 적용 됩니다. 이러한 이유로, 그것은 종종 최고의 개시에 많은 신선한 냉동 샘플을 준비 하입니다. 우리는 일반적으로 소장 (~ 2 cm x 1.5 cm, 각)의 세그먼트 당 20 샘플의 총 보다 훨씬 더 충분 한 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 충분 한 RNA를 제공 하는 발견. 그러나, 단지 장 조직의 작은 길이 사용할 수 있으면, 5 cm의 최소 길이 좋습니다. 우리의 방식으로 얻을 것 이다 가장 낮은 수익률 더 아래에 설명 하는 RNA의 18-30 ng에서 범위 것 이다. 최소 5cm 길이 잠재적으로 줄일 수 있습니다, 응용 프로그램에 따라 더 높은 양의 cDNA preamplification 사용 하는 경우에 특히. 이러한 매개 변수는 현재 연구에서 테스트 하지 했다. 예를 들어 장 중추 정량4와 함께 사용 하기 위해 전체 두께 장 생 검 견본 (2 x 2cm)에서 수집 되었습니다.
우리는이 연구에서 보여줍니다, 에탄올 호환 염료, 바이올렛, Cresyl 사용 하 여 RNA 무결성의 수성 얼룩, 톨루이 블루 보다 훨씬 더 나은 보호를 제공 합니다. 에탄올에 빠져들 때 RNases 비활성5,15된다. 그러나, RNases7,15물에 한 번 노출 기능을 회복 여전히 수 있습니다. 수성 염료와 얼룩 때 조직 거의 1 분9, 실질적인 RNA 저하에 이르게 nuclease 무료 물에 노출 되어야 합니다. 톨루이 블루 조직 얼룩을 사용 하 여, 우리가 하지 못했습니다 얼룩, 전후 물에 노출을 줄이기 위해 감소 때문에 이러한 수정 또한 통풍 관 및 블루, 톨루이의 보존 각각. 비슷한 문제가 되며 기반 염료9또한 발생 했습니다. 여기서 설명 하는 수정된 프로토콜에서 Cresyl 바이올렛으로 얼룩 방지 물, 장 샘플의 직접 노출 함으로써 극대로 RNA 무결성을 유지 합니다. 이 결과 얼룩 솔루션에 추가 RNase 억제제에 대 한 필요성을 제거합니다. 우리는 이러한 억제제는 통풍 관 및 염료의 방해로 수성 염료, 파란, 톨루이의 사용 효과 발견.
처음에 우리의 얼룩 프로토콜 최적화, 우리 다른 프로토콜에서 얻은 결과 재현 하지 못했습니다 하 고5,7,,811보고 합니다. 이 대 한 이유는 분명 하지 않다, 그러나 우리는 일관성 염료-이해 및 유지에는 여러 가지 요인 발견. 예를 들어 특정 프로토콜 또는 75% 에탄올5100% 에탄올8 에서 Cresyl 바이올렛을 사용 하 여 조직, 스테인드 성공적으로 있지만 염료 중추를 희미하게 표시 또는 높은 배경 했다만에 비해 95% 에탄올에 바이올렛 Cresyl를 사용 하 여. 마지막으로, 얼룩 솔루션에 사용 되는 Cresyl 바이올렛의 비율 또한 매우 중요 하다. 대부분 프로토콜 추천 1 %Cresyl 바이올렛 솔루션7,8, 하지만이 농도 최대 2 분에 대 한 섹션을 얼룩이 지기 후에 우리의 손에서 신뢰할 수 있는 얼룩 제공 하지 않았다. 우리는 최고의 성공 4%의 명확히 포화 얼룩 솔루션 얼룩 Cresyl 바이올렛11 살 균 주사기 필터8샘플에 적용 했다. 이 포화 솔루션 훨씬 더 급속 한 샘플의 얼룩이 있습니다, 그리고 작은 10-15 미 (-20 ° C)에서 냉장된 95% 에탄올에 샘플의 사전 정착 얼룩의 더 급속 한 통풍 관을 수 있습니다.
또 다른 보고서는 장의 중추 75% 에탄올 솔루션5에서 오신 Cresyl 바이올렛 결합 하는 때 신선한-냉동 인간 창 자 섹션에 얼룩진 가장 명백 하 게 했다 발견. 그러나, 우리는 오신 어렵게 더 중추를 식별 하 고 우수한 검색을 제공 하는 Cresyl 바이올렛, 혼자, 발견. 다른 연구에서는 버퍼링 된 바이올렛 Cresyl 솔루션 자궁내 막 암 조직10에 대 한 일관성 있는 얼룩 결과 제공으로 밝혀졌다. 그러나, 우리가 발견이 인간의 창 자 조직 어떤 향상을 제공 하지 않았다 또한 구현할 수 없는 얼룩 솔루션에 대 한 95% 에탄올을 사용 하는 경우.
수 있는 프로토콜 수 있습니다 일시 중지 되며 나중에 재개 조건 테스트 했습니다. 많은 프로토콜 제안 미리 슬라이드를 구분 하 고 다시 슬라이드5,9에 장착 후 즉시 그들을-80 ℃에서 동결. 이 접근, 얼룩 하 고 LCM 다음 다시 시작할 수 있습니다 다음 주 내에서 뛰어난 유연성을 제공 합니다. 그러나, 뿐만 아니라 않았다이 크게 방해 얼룩이 지기; 그것은 또한 우리의 손에 (데이터 표시 되지 않음)에 RNA 무결성을 감소. 이 문제를 회피, 그로버 외. 얼룩 및 저장 냉장고11에서 이전 섹션을 탈수 것이 좋습니다. 이 방법에서는, 슬라이드 스테인드 되며 ( 표 1)과 같이 100% 무수 에탄올 단계 (프로토콜 섹션 5.2)까지 탈수. 그리고 샘플 10 분 100%의 무수 에탄올의 두 번째 유리병에는 알을 품는 다음 드라이 아이스에 냉장 하 고-80 ° C 냉동 고로 전송 시키는 젤 원뿔 튜브에 즉시 전송 됩니다. 냉동 실에서 샘플을 제거 하는 경우 슬라이드는 즉시 LCM11수행에 30 s 고 air-dried 사전에 대 한 100%의 무수 에탄올에 침수. 불행히도, 우리의 손에서이 이렇게 감소 린 0.6-0.8 (데이터 표시 되지 않음). 우리는 따라서 수행 모든 단면, 얼룩, LCM 같은 날에 우리의 조건에서 최대한 RNA 무결성을 얻기 위해 resorted. 이것은 시간이 걸리는 과정일 증명 하지만 하루 종일 작업 하는 동안 10-14 LCM 모자를 채울 수 있습니다.
크 실 렌 인큐베이션 단계에서 우리의 프로토콜 수 있습니다 일시 중지는 가장 신뢰할 수 있는 지점이입니다. 슬라이드는 RNA 무결성에 어떤 명백한 효과 없이 최대 4-5 h (분자 체)와 크 실 렌에 남아 있다. 우리는 시간 휴식은 필요한 경우에 그 때 한 번에 3 개의 슬라이드 준비, 모두 처리할 수 LCM와이 기간 내에서 발견 했다. 대체 옵션 밀폐 exicator16, 내 얼룩과 탈수 단계 후 슬라이드를만 지정 하는 것 이지만, 우리가 아직이 접근을 시도 하지 않은.
RNA 격리 절차, 가장 중요 한 또 다른 중요 한 단계는 아직 되 고 요인: RNA, RNA (작은 RNA 종의 손실) 없이17,18의 전체 스펙트럼을 유지의 최대한 가능한 수확량을 얻기와 샘플17에서 게놈 DNA는 완전히 제거합니다. 우리의 손에서 RNA 추출 키트 "B" 더 큰 수익률을 제공 하 고 더 효율적으로 게놈 DNA 제거 했다 우리의 예제와 함께 최상의 결과 제공 합니다. RNA 추출 시 약 수율 차이 관한 우리의 관측은 이전 보고서17,18일치. 그러나, 다른 RNA 추출 시 약19,20성공을 보고 많은 LCM 연구도 있다. 이전 보고서는 RNA 추출 열 기반 프로세스 제공 페 놀 기반 RNA 추출 방법18 보다 작은 RNA 분자의 더 나은 보존 작은 RNA 분자 RNA 강 수 동안에 상쾌한에 손실 될 수 있습니다 나타낼 수도 단계입니다.
우리가 관찰 guanidinium 안산 추가 β-mercaptoethanol을 사용 하는 RNA 세포의 용 해 버퍼 LCM 모자 (그림 5D)에서 모든 캡처된 중추를 제거에 매우 효과적 이다. 동안 대부분 LCM 프로토콜 vortexing는 lysate를 제안 하지 않습니다, 우리는이 우수한 결과 생산 하 고 RNA 저하 초래 하지 않습니다 발견 했다. 그것은 또한 모든 중추를 캡처 더 큰 가능성 RNA 추출 모자에서 발표 될 예정 이다 제공 한다. 일반적으로 얼마나 많은 중추는 특정된 슬라이드에 따라 장 조직의 1.8 ~ 18 ng/c m2 의 범위에서 장의 중추의 LCM에서 RNA 수율을 얻을 이러한 방법을 사용 하 여, 우리. 우리의 RNA-seq 절차 10 ng RNA의 최소 입력을 필요로 하지만 다른 절차는 훨씬 낮은 RNA 시퀀싱 처리 사전 증폭 사이클의 큰 숫자를 포함 하는 경우 입력을 가질 수 있습니다. 조직 준비 및 플래시 동결 과정에서 저장의 총 표면적은 40-60 cm2, cDNA 라이브러리 준비 및 낮은 입력 RNA-Seq 응용 프로그램에 대 한 충분 한 RNA를 제공 하.
우리의 절차는 전체 장의 중추의 컬렉션에 대 한 설계는, 접근 수정할 수 있습니다 쉽게 단일 뉴런 또는 명과의 수집에 대 한 경우5. 그러나, glial 밀도가 처리 하기 때문에 팔, glial RNA의 ensheath 신경 포함 됩니다 캡처된 뉴런의 RNA와 낮은 수에서 이기는 하지만. 이 신경 성적 낮은 복사 번호 표시를 식별 하려고 할 때 문제를 발생 시킵니다. 단일 셀 RNA-seq 이와 관련, 최고의 정밀도 및 탐지를 제공 하지만 장 조직에서 해리, 팬-신경 마커, 물 및 절연 cytometry21 을 또는 전체 창 자에서 발견 신경 필요 생물 정보학으로 접근을 정렬 후 dissociations입니다. 대부분의 분리 연구의 단점은 대부분 프로토콜 샘플 실 온 또는 transcriptome3변경 알려져 있다 오랜된 시간 동안 37 ° C에서 알을 품는 필요. 최근에, 감기-활성 효소 균 licheniformis 에서 마우스 조직에 대 한 단일 셀 정지의 생성에 대 한 사용 되었습니다 그리고 4 ° C22에서 인간의 조직의 분리에 대 한이 효소를 적용할 수 있습니다. 이러한 최적화를 수행할 때까지 신선한 냉동된 인간의 조직의 LCM 식 장의 신경 같은 말 초 신 경계 요소의 프로 파일링에 대 한 RNA를 캡처하는 강력한 수단 이다.
요약, 우리는 인간의 장 중추에서 RNA의 컬렉션에 대 한 안정적이 고 일관 된 프로토콜을 개발 했습니다. 우리는 인간의 창 자, 얼룩, LCM 프로세스, 조직과의 수많은 간행물 및 프로토콜에 따라 RNA 추출 준비를 최적화 했습니다. 우리는 또한 RNA-이 대 한 충분 한 RNA의 RNA 샘플 수집에이 방법의 신뢰성을 증명 하고있다 이 프로토콜 다양 한 위장 질환을 가진 환자에서 수집 하는 조직에 광범위 하 게 적용할 수 있습니다 그리고 설치류 모델, 그로 인하여 새로운 치료제의 개발에 대 한 신뢰할 수 있는 전략을 제공 하는 사용 하기 위해 쉽게 적응 시킬 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
우리는 기증자와이 일을 가능 하 게 그들의 가족에 감사입니다. 우리는 또한 국제 의학 연구소 및 테네시 기증자 서비스 조직의이 연구에 사용 된 좌표 컬렉션을 돕는 직원의 도움을 주셔서 감사 합니다. 이 작품은 건강의 국가 학회, NIH OT2-OD023850 EMS2 와 봉급 지원 NIH에서 T32 일부-DK007673 AMZ 하에서 교부 금에 의해 지원 되었다. 우리는 밴 더 빌 트 변환 병리학 공유 리소스의 직원 조직 준비에 조언과 LCM 악기에 대 한 액세스 감사입니다. 밴 더 빌 트 조직 병리학 공유 리소스 NIH P30-CA068485-14 보조금과 U24-DK059637-13에 의해 부분에서 지원 됩니다. 우리는 게놈 분석에 대 한 게놈 기술 접근 센터 워싱톤 대학의과 대학에 유전학의 부에 감사합니다. GTAC는 부분적으로 지원 됩니다 Siteman 암 센터 NCI 암 센터 지원 그랜트 #P30 CA91842와 국립 센터에서 ICTS/CTSA 그랜트 #UL1TR002345 연구 자원 (NCRR), 국립 보건원 (NIH), 그리고 NIH의 구성 요소에 대 한 의료 연구에 대 한 로드맵입니다. 이 간행물은 전적으로 저자의 책임 고 반드시 NCRR 또는 NIH의 공식 보기를 대표 하지 않는다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
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