Summary
Målet med denne protokollen er å oppnå høy integritet RNA prøver fra innstigning Ganglion isolert fra unfixed, fersk resected menneskelige tarmen tissue bruker laser fange microdissection (LCM). Denne protokollen involverer forberede flash-frosne prøver av menneskelige tarmen tissue, og kryosnitt, ethanolic flekker og dehydrering, LCM, og RNA utvinning.
Abstract
Formålet med denne metoden er å få høy integritet RNA prøver fra innstigning Ganglion fra unfixed, fersk resected menneskelige tarmen tissue bruker laser fange microdissection (LCM). Vi har identifisert fem trinn i arbeidsflyten som er avgjørende for å få RNA isolerer fra innstigning Ganglion med tilstrekkelig høy kvalitet og kvantitet for RNA-seq. Først når du forbereder tarmen tissue, må hvert utvalg ha alle overflødig væske fjernet av blotting før sammenslåing serosa som mulig langs bunnen av stor base muggsopp. Eksempler er så raskt frosset på toppen av en blanding av tørris og 2-methylbutane. Andre ved snitting vevet, er det viktig å plassere cryomolds slik at intestinal deler parallell full flyet myenteric plexus, og dermed gir det største arealet på enteric Ganglion per lysbilde. Tredje, under LCM, polyetylen napthalate (PENN)-membran lysbilder tilbyr den største hastighet og fleksibilitet i beskriver ikke-uniform former av innstigning Ganglion når innstigning Ganglion. Fjerde, tydelig visualisering av innstigning Ganglion i inndelinger, etanol-kompatible fargestoffer, som Cresyl Violet, tilbyr utmerket bevaring av RNA integritet i forhold til vandig fargestoffer. Til slutt, for utvinning av RNA fra fanget Ganglion, vi observerte forskjeller mellom kommersielle RNA utvinning kits som gitt overlegen RNA antall og kvalitet, mens de eliminerer DNA forurensning. Optimalisering av disse faktorene i gjeldende protokollen sterkt akselererer arbeidsflyten og gir enteric Ganglion utvalg eksepsjonelle RNA kvalitet og kvantitet.
Introduction
Denne metoden er utformet for å få høy kvalitet RNA eksempler på enteric Ganglion fra menneskelige tarmen tissue bruker laser fange microdissection (LCM). Protokollen beskrevet her er optimalisert for å gi tilstrekkelig RNA kvalitet og gir for RNA sekvensering (RNA-seq) og er ment å brukes med fersk resected, unfixed, flash-frosne menneskelige tarmen tissue.
Funksjonell gastrointestinal og gut motilitet lidelser påvirke en av hver fire personer i USA. Det enteric nervesystemet (ENS), også referert til som den andre hjerne1, er ofte på midten av disse lidelsene, som spiller en avgjørende rolle i tarmen homeostase og motilitet. Manipulering av gut motilitet er vanligvis begrenset til kirurgisk fjerning av aganglionic/noncontractile vev, kronisk kosttilskudd modifikasjoner eller medisiner. Overraskende, gjenstår den fulle transcriptome av voksen ENS å være sekvensert, sterkt begrenser vår evne til å identifisere molekyler innenfor ENS som kan være målrettet pharmaceutically eller brukes i stamcelleforskningen terapi.
Det er relativt få metoder for å isolere RNA fra menneskelige enteric Ganglion. Den første tilnærmingen, celle dissosiasjon2, krever høy inkubasjon temperaturer og lange inkubasjonstiden ganger; både som er kjent for å fremme RNA fornedrelse og endre transcriptome2,3. En alternativ tilnærming, LCM, mer pålitelig bevarer transcriptome og beskytter RNA integritet. Selv om flere studier har brukt LCM samle Ganglion frisk-frosne menneskelige tarmen tissue4,5,6, disse var enten hemmet av dårlig RNA kvalitet og kvantitet, var ganske arbeidskrevende, eller nødvendig endring av flekker eller RNA utvinning teknikker for å arbeide i våre hender. Andre LCM protokollene designet for å bevare RNA som ble funnet i LCM produkt håndbøker gitt ytterligere forbedringer7,8, men tilpasning var nødvendig når isolering av innstigning Ganglion8, 9. disse grunner vi utviklet en optimalisert protokoll basert på disse ressursene som gir vesentlig kvantiteter av høy integritet fra menneskelige enteric Ganglion, har en relativt rask arbeidsflyt og gir konsekvent resultater en stor Antallet eksempler.
I denne studien presenterer vi et sammendrag av optimalisert prosedyrer som letter isolering av høy integritet RNA fra innstigning Ganglion fra resected menneskelige tarmen tissue. Vår metode inneholder fem viktige aspekter. Første, fersk resected, unfixed menneskelige tarmen prøver skal trimmes størrelse, har alle fuktighet fjernes med et laboratorium vev og flate i en stor base mold før flash-Underkjølt på toppen av en blanding av tørris og 2-methylbutane (2 MB). Andre, histologic deler av tarmen bør være forberedt på å få full flyet myenteric plexus på et lysbilde, som tilbyr en stor nyttelast på enteric Ganglion. Suksess med dette trinnet er i stor grad avhengig av vev forberedelsesprosessen. Tredje krever uensartet strukturen til Ganglion i ENS bruk av polyetylen napthalate (PENN) membran lysbilder6, som tilbyr størst fart og presisjon under LCM prosessen. Fjerde, etanol-kompatibel fargestoffer, som Cresyl Violet, bør brukes å bevare RNA integritet når flekker enteric Ganglion. Sist, RNA utvinning prosessen er avgjørende for å lykkes med RNA-Seq. Vi søkte en RNA utvinning tilnærming som produserer høy RNA integritet, maksimerer RNA gir når du starter med små samlinger av innstigning Ganglion, eliminerer DNA forurensning og beholder så mange RNA arter som mulig.
Samlet optimalisering av disse faktorene studien sterkt akselererer arbeidsflyten og gir eksempler på enteric Ganglion med eksepsjonell RNA kvantitet og kvalitet. Resultatene har vært stort sett konsekvent blant en stor gruppe av prøver, indikerer konsistensen av denne tilnærmingen. Videre har vi brukt disse metodene til vellykket sekvens dusinvis av RNA prøver fra innstigning Ganglion. Strategiene uthevet her kan også være bredt tilpasset for å utføre LCM av ønsket Ganglion eller kjerner tilleggsutstyret og sentralnervesystemet og andre tilfeller krever isolering av høy kvalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller beskrevet her er godkjent av den Vanderbilt University institusjonelle Review Board (IRB).
1. forberedelse før vev ankomst
- Riktig IRB godkjenning og koordinere med menneskelige orgel donasjon byråer å få ferske resected, unfixed tarmen tissue fra givere som oppfyller alle forskningene kriteriene nødvendig for å studere.
Merk: Denne protokollen kan tilpasses for bruk med mus og andre gnager modeller.- Umiddelbart etter fjerning av hvert intestinal segment, grundig rødme lumen kjølt PBS eller vev-lagringsmedium for å fjerne gjenværende luminal materiale og avføring.
- Etter spyling og forkaster avfall i en passende biohazard mottaket, dukke vevet i et tilstrekkelig antall vev-lagringsmedium (for eksempel 3 - 5 ganger volumet av tarmen tissue) og lagre i individuelt-merket, vanntett plast beholdere, neddykket i isen eller nedkjølt før bruk).
- Prosessen vevet 18-26 timer fra tidspunktet for samling å hindre betydelig RNA degradering.
Merk: Avhengig av renslighet av intestinal segmentet og lagring, kan det være mulig å utvide vår foreslåtte fristen.
- Forberede alle materialer som trengs for menneskelig vev samling på forhånd, som angitt i denne protokollen (se Tabell for materiale for mer detaljerte produktinformasjon). Kontroller at alle nødvendige personlig verneutstyr er slitt hele tiden.
- Forberede tørris bøtter med en tørris slurry som vist i figur 1.
- Knuse nok tørris for å fylle 4 standard sirkulær is bøtter og en rektangulær is bøtte. En av kulene vanligvis bør ha liten (11 x 21 cm) laboratorium vev plassert på overflaten av tørris. Bruk nye, uåpnede esker med laboratoriet vev.
- Gjøre en tørris slurry ved powderizing 2 L tørris i en ren rektangulære is bøtte.
- Legg pre kjølt 2 MB opp til overflaten av tørris. Litt blanding og flat slurry med en pipette tips dekselet figur overflaten av gjødsel i en kanal omgitt av større biter av tørris langs sidene av rektangulære bøtte.
- Plasser flere tynne blokker av tørre isen langs kantene på isen bøtte å oppmuntre rask frysing. Det skal være plass til ≥4 grunnleggende former å passe løst i tørris slurry bøtte på et gitt tidspunkt.
- Eventuelt fylt stabel is bøtte i en rektangulær is bøtte ¼ med tørris. Plasseringen hjelper bedre isolere tørris gjødsel og forhindrer at behovet for hyppige justeringer av tørris og 2 MB under prosedyren.
- Plasser tørris bøtter i et samlebånd i følgende rekkefølge: 1) tørris slurry bøtte, 2) laboratorium vev-tørr is bøtte, 3 og 4) normalt tørre isen bøtter, 5) rektangulære tørris bøtte (figur 1A).
2. utarbeidelse av Flash-frosne menneskelige tarmen Tissue
Merk: Hele denne prosessen kan ta mellom 45-80 minutter per intestinal segmentet, avhengig av tarmen tissue kvaliteten. Vi anbefaler også å samle kvalitetskontroll prøver å vurdere RNA kvalitet og histology før du fortsetter med LCM.
- Fyll en stor skuff med våt is og plasser kirurgisk skjærebrett oppå tørris.
- Chill en 500-mL og 100 mL kanner for lagring av vev og trimmet segmenter i kalde lagringsløsning i dette oppsettet. Pre chill base former på skjærebrett slik at de er klar til å motta vev.
- Ved mottak av fersk tarmen tissue, hell av media som transporteres vevet og beholde den i de pre kjølt kanner. La noen plass i disse kanner for midlertidig lagring av tarmen tissue og trimmet deler, som tilberedes i de etterfølgende trinnene.
- Kuttet intestinal segmentet til en lengde på ca 20 cm, som gir rikelig vev (40-60 cm2) til å generere RNA for nedstrøms programmer og kvalitetskontroll prøver. Avhengig av vev integritet, kan det være mulig å oppnå RNA isolasjon for nedstrøms behandling med en mye mindre lengde (dvs. 5 cm av tarmen).
- Trim vekk liggende under adipose og bindevev fra tarmen med kirurgisk saks. Gjenværende adipose langs den intestinal serosa kompromisser muligheten til å fullstendig flat vev i de etterfølgende trinnene. Nøye klippe vevet, for å unngå skår serosa under fjerning av fett og bindevev, som kan strukturelt skade myenteric plexus eller utsiden av vev flat ujevnt snitting.
- Gjøre en langsgående snitt langs hele lengden av tarmen prøven, fortrinnsvis på stedet av hvem vedlegg.
- Dissekere bort og kast de tenia coli fra kolon, slik at det flater lettere, ved frigis fra spenning.
- Splay tarmen mucosa-siden ned på en avkjølt skjærebrett og skjær 1,25 cm brede strimler fra hele lengden av vev.
Merk: Tarmen tissue ofte utvides etter beskjæring, så denne størrelsen skal justeres tilsvarende. - Lagre strimler i kjølt vev-lagringsløsning.
Merk: Vi bruker Belzer UW kjølelager løsning fordi det har lang holdbarhet, er relativt kostnadseffektivt og kan lagres ved romtemperatur inntil nødvendig. - Fjerne en vev stripe fra kald oppbevaring løsning og skjær den i segmenter ~1.5-2 cm lang.
- Raskt blot intestinal segmentene på en stabel med laboratoriet kluter, å fjerne overflødig væske og forhindre dannelsen av iskrystaller langs den intestinal serosa under flash frysepunktet. Hvis vev ikke er tilstrekkelig tørket, vil det være vanskelig å få høy kvalitet deler fra myenteric plexus.
- Lå den uten intestinal stykker mucosa-siden på en pre kjølt, store, engangs plast base mold (37 mm x 24 x 5 mm).
- Nøye flat hvert segment lett strekker vev over overflaten av base mold og bruker buet tang til å forsiktig trykke ned og utvise eventuelle luftbobler som kan være fanget under serosa. Merk at vevet utvider under sammenslåing. Eventuelt trim segmenter og klipp gjenværende prøvene med en mindre størrelse.
Merk: Hvis vevet er over-strekkes, vil dette fordreie myenteric plexus. Etter at alle luftbobler fjernes, vurdere tykkelsen på prøven før frysing. Hvis nødvendig, trykk kantene av prøven innover til intestinal prøven tilnærminger opprinnelige tykkelsen. - Plass lastet base mold på overflaten av tørris, 2 MB slurry. Vevet bør helt fryse innen 30-60 s, avhengig av størrelsen og tykkelsen av intestinal segmentet.
- Tørr nederst base mold å fjerne gjenværende 2 MB av raskt gni base mold på laboratoriet vev pre kjølt i andre bøtte med tørris.
- Overføre tørket prøven til tredje karet av tørre isen og begrave den under overflaten av tørris til den er klar til å være innpakket.
- Raskt observere nederst i base formen før innpakning, for å undersøke kvaliteten på prøven forberedelse. Noter alle prøver som ikke ser flatt eller har store luftbobler, som dette bør unngås og kryosnitt og LCM.
- Pakk prøven i forhåndsinnstilte merket aluminiumsfolie som er lagt oppå tørris i en bøtte slik at innpakning av vev oppstår mens holdes helt frossen.
- Pakk prøven med et lag med plastfolie, minimere vev dehydrering under lagring på-80 ° C.
- Lagre prøver i rektangulære bøtte før de er klare til å bli flyttet til fryseren.
- Pre etiketten og pre chill fryser bokser på-80 ° C for umiddelbar oppbevaring av prøver etter samling.
- Ta en liten del av hvert intestinal segment for vurdering av RNA integritet før gjennomfører LCM.
- Før etiketten en 2-mL RNase gratis rør for hvert segment, fylt med ≥500 µL av lyseringsbuffer. Vi anbefaler å bruke RNA utvinning Kit "D", oppført i Tabell for materiale.
- Homogenize en liten (2 x 2 mm) stykke av tarmen i en standard vev mikro-homogenizer (20-40 s, gjenstår ingen vev biter). Deretter umiddelbart fryse RNA lysate på tørris og store-80 ° c før du fortsetter med RNA utvinning.
- Eventuelt legge noen av delene i vev frysing medium (TFM) som en sikkerhetskopi. Forberede vev deler på nøyaktig samme måte som beskrevet i denne delen, men dukke prøver TFM innen base mold før flash frysepunktet.
3. og kryosnitt
- Før og kryosnitt, forberede alle nødvendige materialer for flekk og dehydrering og overføre de ønskede vevsprøver fra-80 ° C fryseren i en bøtte med tørris.
- Klargjør kryostaten for bruk ved å sette til optimal kutte temperatur (-18-22 ° c) og tørke ned overflater med 100% etanol og behandling av bladet og penselen brett med RNase dekontaminering løsning.
- For å følge beste utvalget til chuck, bruker du følgende tilnærming.
- Plasser tang i tørris minst 30 før pakke dem ut intestinal prøven og plassere den på overflaten av tørris serosa-side-fordel.
- Hell en 3-5 mm haug av vev frysing medium (TFM) på en stor kryostaten prøveholder og øyeblikkelig overføre intestinal prøve serosa-side-fordel på TFM.
- Raskt overføre prøveholderen til tørris og dekk med powderized tørris etter tillater TFM overholder utvalget for 2-5 s ved romtemperatur. Påse at TFM under flyet myenteric plexus.
Merk: Ideelt den ytre overflaten av tarmen vil fullstendig overholder TFM før TFM begynner å fryse uten tiner prøven.
- Montere prøveholderen i kryostatens prøvehodet og justere prøven med kryostaten bladet, slik at flyet myenteric plexus vil være parallell til knivbladene.
- Angi snittetykkelsen kryostaten til 8 µm. Formålet med perfekt justering prøven er å få størst mulig areal på myenteric plexus på hvert lysbilde. Denne tykkelsen anbefales vanligvis for både menneskelige og gnager vev, men kan justeres, etter behov.
- Delen gjennom serosa og langsgående muskel fram myenteric plexus.
- Du finner myenteric plexus, montere et eksempel delen på et lysbilde og flekken delen med en vandig fargestoff, som 1% Cresyl fiolett eller toluidine blå, etc.
- Se avsnittet under lys mikroskop på 40-2000 X forstørrelse å identifisere krysset mellom langsgående og sirkulære muscle lagene. Mikroskopet parametere er gitt i Tabellen for materiale. På starten av skjæring, merkes serosa av tilstedeværelsen av bindevev. Noen gjenværende hvem fett kan også finnes langs serosa. Et ark av ytre langsgående muskel laget deretter begynner. Når grensen mellom langsgående og sirkulære muscle lagene er nådd, vil en del av de enteric Ganglion observeres.
Merk: I de neste flere inndelingene, myenteric plexus vil bli veldig tydelig, med store swaths av Ganglion er til stede i ett enkelt avsnitt (figur 2C). Hvis vevet ikke er helt flat ved snitting, vil så bare en del av Ganglion være tilstede i hver del på et gitt tidspunkt. Noen ganger kan intestinal prøven ha en iboende ujevn myenteric plexus, til tross for vevet vises helt flat. Dette gjelder særlig for tolvfingertarmen prøver. I vår erfaring, disse prøvene kan ta mye lengre tid å behandle med LCM, men tilstrekkelig RNA kan samles i én enkelt dag økt. Den nøyaktige plasseringen av myenteric plexus kan variere betydelig mellom eksempler, basert på vevet og sin forberedelse før frysing.
- Begynne å samle inn føljetong seksjoner for LCM, med optimale samlinger gir størst antall nevroner og glia per lysbilde. Avhengig av arealet av prøven, kan inndelingene kombineres til ett lysbilde ved PENN-membran.
- Montere delene på pennen membran lysbilder, kjølt kort i 5-10 s kryostaten. Når du monterer, skal vevet smelte bare maksimalt bevare RNA integritet.
4. farging
Merk: En oversikt over farging prosessen, se Tabell1. Alle løsninger brukes tilberedes i 50-mL konisk standarder. Vises ikke behandle utsiden av rør med RNase dekontaminering løsning å forbedre resultatene (data ikke vist).
- Forberede en mettet løsning av 4% Cresyl violet i 95% etanol minst en dag i forveien og fullt re suspendere den Cresyl violet før lasting sprøyten.
Merk: Konsentrasjonen av etanol må senkes for effektiv flekker, som beskrevet under diskusjon. Vi har ikke testet om bruker 50% eller 75% etanol under fargingen betydelig reduserer RNA integritet. Cresyl violet er lys-sensitive, og bør derfor beskyttes mot lys. - Etter montering delene av myenteric plexus inn i lysbildet, umiddelbart dukke lysbildet i konisk ampuller med 95% etanol (pre kjølt på 20 ° C) for 30 s.
- Hvis inndelingene ikke fullt ut overholder lysbildet i forrige trinn, litt varm bunnen av lysbildet med en hansker hånd (laboratorium tømming bør være plassert i mellom lysbildet og hanske) for full tilslutning før submerging i 95% etanol. Denne løsningen kan brukes om igjen for minst 3-6 lysbilder uten å redusere RNA integritet.
- Lå det skyve opp på en lab tørke plassert på toppen av en pre-behandlet, RNase-fri beholder8.
- Pre-fylle en 3-mL sprøyte med 4% Cresyl fiolett og fest filtere 0,2-µm sprøyten.
Merk: Vi anbefaler celluloseacetat filter. - Bruke 6-10 dråper flekken direkte på vev avsnitt8 og ruge for 10-30 s, eller til tilstrekkelig fargestoff beholdes når de farget. Mens flekker, forsiktig rotere beholderen lysbilde for hånd for å sikre at delene vev er jevnt belagt med flekken.
- Hell av flekken og umiddelbart de flekken lysbildet i ampuller med 75% etanol. Gjentatte ganger dykke lysbildet til overflødig fargestoff har hovedsakelig sivet ut av prøven. Dette kan ta mellom 10-20 s.
- Fullfør de flekker av gjentatte ganger dipping eksemplet i ampuller med 95% etanol for 10 s. Submerge prøven gjentatte ganger til alle overflødig flekker er fjernet.
- Endre hele destaining, etter behov for å optimalisere den flekker av Ganglion. Hvis for mye flekken er fjernet, prøven blir for gjennomsiktig, og det kan være vanskelig å visualisere
Merk: Denne fargeprotokoll er optimalisert basert på flere publikasjoner5,8,10,11 som kreves endring før tilfredsstillende resultater var oppnådd. Derfor skal konsentrasjonen av etanol brukes i fargestoff og under destaining endres, når nødvendig, å få et optimalt resultat.
- Endre hele destaining, etter behov for å optimalisere den flekker av Ganglion. Hvis for mye flekken er fjernet, prøven blir for gjennomsiktig, og det kan være vanskelig å visualisere
5. dehydrering
- Umiddelbart dukkert lysbildet i 100% etanol 2 - 3 ganger, totalt 10-20 s.
- Senk lysbildet i vannfri 100% etanol minst 30 s. Vannfri etanol er meget hygroskopisk, legge molekylær sikter (8-12 mesh) til ampullen av 100% etanol før starten av fremgangsmåten for å fjerne noen absorbert vann og dermed mer fullstendig tørke eksempel5.
- Gjentatte ganger dukkert lysbildet i xylen for 15-20 s. Dette trinnet fjerner fullt lag av etanol på lysbildet. Legge til molekylær sikter forhånd rørene av xylen, til fullt adsorberes overflødig etanol og vann molekyler5.
FORSIKTIG: Xylenes er klassifisert som en irriterende for øyne og øvre luftveier og brukes på kjemiske avtrekksvifte. - Senk lysbildet i xylen (med molekylær sikter, 8-12 maske) i minst 10 min.
Merk: En kort pause kan tas etter dette trinnet hvis nødvendig. Prøver kan bli værende i xylen for 4-5 timer uten skadelige effekter for flekker, LCM eller RNA avkastning/integritet. - Frivillig, individuelt forberede flere flere lysbilder på dette punktet. Hvis forbereder en ny runde med lysbilder etter fullført LCM på alle ferdige lysbilder, måtte vevet i kryostaten være refaced, på grunn av dehydrering av vevet overflaten. Én til fire inndelinger må forkastes før brukbare deler kan samles.
6. laser fange Microdissection (LCM)
- Fjern lysbildet fra xylen og air-dry det i kjemisk avtrekksvifte i minst 1 Sett inn en patron av LCM caps i LCM mikroskop scenen. Laste inn lysbildet på scenen og få en oversikt over bildet av lysbildet.
- Identifisere ønsket plassering LCM og belaste en cap på lysbildet.
- Juster infrarød (IR) laser og justere makt og varighet for å gjøre en 20-30 µm diameter fange spot.
- Finn ultrafiolett (UV) laser og sette en passende hastighet og intensitet.
- Skissere de ønsket ganglia å bli samlet med LCM programvaren, og pass på å bo innenfor grensen området collectable på cap (avbildet i lysbilde-oversikt over programmet som en grønn sirkel).
- I hver av spor, justere IR flekker slik at det er minst én IR spot hver 100-500 µm.
- Trykk på IR/UV kuttet for å fortsette med samling av alle merkede Ganglion.
- Når samlinger er fullført, må du enten flytte lokket til en ny plassering og gjenta samlingen prosessen eller undersøke LCM hetten på QC stasjonen når hetten er tilstrekkelig fylt med Ganglion (eller inntil 60-80 minutter anbefalte fristen nås).
- Hvis rusk finnes på cap, tørk den bort med en tynn pensel som er pre-behandlet med RNase dekontaminering løsning, skylles med nuclease-fritt vann, og tørket helt.
- Undersøke nøye hetten av øye eller med forstørrelse under en lysende felt mikroskop for å sikre alle rester er fjernet. Hvis rusk ikke kan fjernes gjennom bruk av pre-behandlet pensel, bruk en fin pipette tips (RNase-ledig) for å skrape bort rusk.
- Sikre lokket på en 0,5 mL microfuge rør fylt med 230 µL av RNA lyseringsbuffer (Buffer RLT RNA utvinning Kit "B", med β-mercaptoethanol lagt i en konsentrasjon av 10 µL/mL).
- Invertere cap, kort vortex og ruge ved romtemperatur for 30 min.
- Sentrifuge på ≥ 5000 x g for 5 min og deretter overføre microfuge rør til tørr is.
Merk: Protokollen kan pauses her. RNA lysates kan lagres ved-80 ° C uten en betydelig effekt på RNA fornedrelse i minst 1 uke. Hvis RNA isolasjon utføres samme dag, deretter chill prøvene på is til de er klare for utvinning. - Utføre alle ekstra samlingene i den anbefalte grensen for maksimal tid på 80-90 min etter fjerner lysbildet fra xylen. Som dehydrert delene blir utsatt for luftfuktighet, kan RNases gradvis bli reaktivert. Begrense samling perioden kan minimere slike effekter og maksimalt bevare RNA integritet.
7. RNA isolasjon
- Forberede en RNase-fri arbeidsstasjon RNA utdrag.
- Forberede alle rør og reagenser i henhold til veiledningen for RNA utvinning Kit.
Merk: Det finnes mange kits tilgjengelig for RNA isolasjon etter LCM, har vi hatt best suksess ved hjelp av RNA utvinning Kit "B", vises i listen materialer. Se figur 5 for en side-ved-side-sammenligning av RNA utvinning reagenser. - Fjern prøver fra-80 ° C fryseren og raskt tine i et 37 ° C vannbad.
- Umiddelbart vortex tint prøver for 2-3 s å jevnt distribuere guanidinium thiocyanate salter.
- Kombiner hvert utvalg med en lik mengde 70% etanol. Basseng 2 eller flere lysates sammen, om nødvendig, å nå en tilstrekkelig RNA konsentrasjon.
- Fortsette etter produsentens instruksjoner i brukerhåndboken for RNA utpakkingen, ved hjelp av protokollen som er optimalisert for microdissected prøver.
- Elute RNA på det siste trinnet i minimum anbefalt volum av nuclease-fritt vann (14 µL).
- Etter RNA isolasjon, aliquot 1-2 µL av fra hvert utvalg i en ny pre merket RNase-fri rør for vurdering/kvalitet kvalitetskontroll med en microfluidics enhet som kan visualisere små mengder av som en Bioanalyzer. Aliquot en ekstra 1 µL i et separat rør for kvantifisering med en høy følsomhet RNA kvantifisering kit.
- Justere disse trinnene etter behov for å få en tilstrekkelig mengde RNA for nedstrøms (dvs., samle et større antall LCM caps før RNA ekstraksjon).
- Store RNA ved-80 ° C til å samle nok prøver for nedstrøms.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har gjort flere forbedringer til eksisterende protokoller som aktiverer relativt rask innsamling av innstigning Ganglion fra menneskelige tarmen prøver ved LCM, møte standardene for RNA-Seq. Først optimalisert vi frysing av tarmen tissue segmenter i store base mugg plassert på overflaten av en blanding av tørris i 2 MB (figur 1B). Beste suksess og kryosnitt og påfølgende LCM ble oppnådd ved å legge intestinal segmenter flatt i en base mold, overfor mucosa side opp (tall 1B-1 C). Kontroller at base formene er så flat som mulig ved basen, som noen kurvatur vil gjøre det mye vanskeligere å få et stort tverrsnitt av myenteric plexus. Dette resulterer i vev som er enkelt delt på 8-µm tykkelse (figur 1E) og gir en fullstendig eliminering av TFM fra farging prosessen. Vi fant at TFM forstyrrer farging prosessen og dermed tilslører identifikasjon av innstigning Ganglion. Posisjonering vevet i denne retning også unngår snitting gjennom mucosa, som har et høyt innhold av RNases12, selv om erfaring, ser det ut til at bruk av ethanolic flekker i stor grad hemmer disse RNases. I tilfeller der TFM eller Optimal kutte temperatur (OCT) medium er nødvendig, vi fant det mest pålitelige å først flate prøven nederst på base mold og deretter legge til TFM mold etter dette trinnet (figur 1D). Dette etterlater et "vindu" der tarmen kan visualiseres enkelt, gjør det enkelt å justere prøven og produsere deler som er helt parallelt med myenteric plexus (figur 1E).
Utarbeidelse av cryosections langs ned lengden på tarmen i en retning parallelt med den myenteric plexus (figur 2A), genererer delene som den største delen av innstigning Ganglion per lysbilde vises på flekker) Figur 2 C). når nærmer seg myenteric plexus (figur 2C), på apposition av langsgående og sirkulære muscle lagene (figur 2B), 6-12 føljetong delene kan være samlet (figur 2A, langsgående) som inneholder store swaths av innstigning Ganglion (figur 2C). LCM caps kan lastes kapasitet med en enkelt delen (Figur 4D). I kontrast, når forbereder tverrgående deler av fersk-frosne tarmen (tall 2A-2B), er det bare et lite område av myenteric plexus på hvert lysbilde (figur 2B). Svært få enteric ganglia kan hentes fra tverrgående vev seksjoner, som resulterer i større tiden investert og høyere kostnader per prøve samlet. Parallell-skjæring tilnærmingen bruker mindre enn en femtedel av antall LCM caps og lysbilder med tverrgående deler og stor grad akselererer samlingen prosessen.
Før LCM, må prøver være farget og fullt dehydrert for å unngå RNase aktivitet under LCM samling. Vi utviklet et eksperiment for å direkte sammenligne effekten av vandig flekker vs ethanolic flekker på RNA integritet. I dette eksperimentet, to intestinal delene ble montert sammen i ett lysbilde og ble behandlet på en av fire måter, med n = 2-3 biologiske gjentak per gruppe. I den første gruppen, frisk intestinal inndelinger ble ikke montert på et lysbilde og hver ble direkte overført til RNA lyseringsbuffer ved hjelp av RNase-fri pinsett pre kjølt på tørris (Figur 3A). For alle gjenstående grupper, var deler overholder et lysbilde, behandlet, skrapes bort fra lysbildet med en RNase dekontaminering løsning-behandlet barberblad og overført til RNA lyseringsbuffer med RNase-gratis tang. En standard mikro-homogenizer ble brukt til å fullt lyse prøvene i alle grupper. I den andre gruppen, lysbildene ble behandlet gjennom alle trinnene, men ingen fargestoff ble brukt under farging prosedyren (Figur 3B). Gruppen tre ble behandlet med protokollen beskrevet ovenfor, bruker 4% Cresyl fiolett farge (Figur 3C). I fjerde gruppen brukte en vandig flekken, toluidine blå, mens du følger protokollen for en vandig-basert flekker kit med en blanding av toluidine blå og hematoxylin (Figur 3D). Etter utpakking RNA, som beskrevet, ble RNA kvalitet vurdert med en Bioanalyzer. Den eneste forskjellen mellom vandige og ethanolic Fargeprotokoller var tillegg av to vann incubations (30 s hver), umiddelbart før og etter farging, som kreves for opptak og oppbevaring av fargestoffet. Vi fant ut at prosessen med å overholde vev deler på lysbildet og behandling med dehydrering trinn førte til en liten, uunngåelig reduksjon av RNA kvalitet (tall 3A-3B), men at flekker med ethanolic fargestoff, Cresyl violet, ikke lenger redusere RNA kvalitet (Figur 3C). Derimot førte vandig fargestoff, toluidine blue, til betydelig RNA fornedrelse, sannsynligvis på grunn av utvidet vandig eksponering som tillater endogene RNase aktivitet (Figur 3D).
De unike figurene av innstigning Ganglion utgjør problemer for standard IR-LCM med konvensjonelle glass lysbilder6 (Figur 4A). Når du bruker PENN-membran lysbilder (Figur 4B), følges prøver et tynt ark som er løsrevet fra fleste av objektglass. UV laser skjærer gjennom både prøve og PENN membran, som resulterer i fullstendig brøkdel av Ganglion fra lysbildet (Figur 4C) og full tilslutning til LCM cap (Figur 4D). Strukturer av ønsket størrelse og form (> 10-15 µm) kan være fullstendig og nøyaktig samlet (Figured 4E-4 H). For eksempler med færre Ganglion per seksjon være cap flyttet ≥ fire ganger før innsamling. I dette tilfellet minimerer montering to til tre deler per lysbilde bruk av PENN-membran lysbilder.
Når isolere RNA fra LCM prøver for RNA-seq, er målet å oppnå høyest mulig RNA kvalitet og kvantitet, mens de eliminerer alle genomic DNA (gDNA). For å identifisere en ideell RNA isolasjon prosedyre, vi utført en head-to-head sammenligning med en RNA utvinning Kit "A" (figur 5et), RNA utvinning Kit "B" (figur 5B) eller RNA utvinning metoden "C" med opprydding av RNA prøvene av RNA utvinning Kit "B" (figur 5C). Etter prosessering prøver med den optimaliserte Cresyl violet flekker protokollen, ble LCM brukt for oppsamling standardisert sirkulær (diameter på 500 µm) av tarmen tissue, tatt fra langsgående muskel laget. Hver cap ble randomisert til hver av de tre RNA isolasjon gruppene, plasseres oppå en 0,5 mL microfuge tube forhåndsutfylt med respektive lyseringsbuffer fra hver pakke. Instruksjoner ble fulgt akkurat som beskrevet for hver pakke, RNA utvinning Kit "A" lyseringsbuffer krever inkubasjon på 42 ° C for 30 min. For andre kits, ble romtemperatur inkubasjon brukt for 30 min. Alle prøvene var kort vortexed på tillegg til lyseringsbuffer. Prøvene ble deretter kjølt på is inntil utdrag ble utført samme dag (n = 4). Vi fant at RNA utvinning Kit "B" med en på-kolonne DNA fordøyelsen trinn resulterte i høyeste RNA kvaliteten og kvantiteten mens effektivt eliminere gDNA (tall 5A-5 C). Viktigere, lyses RNA lyseringsbuffer levert av RNA utvinning Kit "B" fullt fanget Ganglion når innstigning Ganglion (figur 5D).
I gjennomsnitt har våre prøver en RIN 7.49 + 0.53 (tabell 2). RIN scorene til større enn 6-7 anses tilstrekkelig kvalitet for RNA-seq (avhengig av spesifikke RNA profilen)13, gir oss tillit at våre prøver er av tilstrekkelig kvalitet for RNA-seq. vurderer at RIN for disse prøvene, ved mottak, har varierte fra 7,4 til 9.5, disse resultatene indikerer at våre optimalisert protokollen gir utmerket bevaring av RNA integritet. Representant RNA resultatene fra prøvene sendt til RNA-seq er avbildet i Tallene 6A-6 C. Resultater fra RNA-seq viser at våre prøver ble vellykket sekvensert og har en beskjeden 3-end skjevhet (figur 6D). Vanligvis foretrukket en større 3-bias i prøver med lavere RIN14; Denne effekten er moderat reflektert i våre prøver. Til tross for dette var observerte genet biotypes hovedsakelig konsekvent blant alle prøvene (figur 6E), som indikerer data pålitelighet.
Figur 1 . Optimal frysing av tarmen tissue. (A) tørr is bøtter er forberedt for avbildet; Jeg) tørris slurry, ii) laboratorium vev plassert på toppen tørris, iii) midlertidig lagring bøtte, iv) innpakning bøtte, v) før fryser lagring bøtte, vi) før fryser lagring overflyt bøtte. (B) vi optimalisert frysing av vev segmenter i store base mugg plassert på overflaten av en blanding av tørris og 2-methylbutane. (C) en nærmere opp bilde av en fullt frosset prøve, observert i oppsettet vises i panelet B. Intestinal segmenter legges flatt i en base mold opp. mucosa-side. (D) denne frysing metoden kan lett tilpasses for bruk med TFM forbereder vev på samme måte, men å legge TFM til base mold før frysing. Resulterende prøven vil ha en helt flatt myenteric plexus, med en serosa som kan visualiseres lett. (E) begge vev forberedelse tilnærminger produserer utmerket vev deler anbefalt 8-µm tykkelsen. Prosedyren bruker TFM er avbildet her. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Riktig retning av tarmen tissue gir deler rik på enteric Ganglion. Når du forbereder standard tverrgående tverrsnitt av fersk-frosne tarmen (A, B), er det bare et lite område av myenteric plexus (B) på hvert lysbilde. Svært få enteric ganglia kan samles per lysbilde, tidkrevende og kostbare. I kontrast, gir forbereder langsgående deler i flyet av myenteric plexus (C), et mye større areal av Ganglion (C). Deler av myenteric plexus hentes starter fra serosa og snitting innover gjennom langsgående muskelen (B). Når du nærmer deg myenteric plexus, ved krysset av langsgående og sirkulære muskel laget (B), kan 6-12 føljetong inndelinger samles. Hver langsgående delen av myenteric plexus inneholder store swaths av innstigning Ganglion (representert i C med en modifisert flekker prosedyre, uten xylen, fortrinnsvis stain på Ganglion). LCM caps kan være fylt til kapasitet med en enkelt vev-delen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Flekker med en etanol-kompatible fargestoff forbedrer RNA kvaliteten. RNA kvalitet ble målt ved Bioanalyzer og representant to prøvene fra hver gruppe vises. Første RNA kvalitet målt fra friske, umontert deler (A, ingen behandling), hadde en RNA integritet rekke (RIN) 8.65 ± 0,07. Deler montert og behandlet gjennom alle trinnene, men uten flekk (B), var RIN 7.95 ± 0,35. Når farging med 4% Cresyl violet ble lagt til dehydrering trinnene, var det en ubetydelig effekt på RIN, med en gjennomsnittlig RIN på 7.87 ± 0,35 (C). I sammenligning førte bruk av vandig flekken, toluidine blå (T-blå) og tillegg av nødvendige skyllinger i prosedyren (D) vesentlig redusert RNA kvalitet, med en RIN på 6.45 ± 0,21. Hver gruppe besto av n = 3 biologiske gjentak unntatt "Ingen behandling" og "T-Blue"(n=2). RINs rapporteres her som gjennomsnittlig ± standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . PENN membran LCM lysbilder aktiverer presis samlinger av innstigning Ganglion. Bruker vanlig glass objektglass samle enteric Ganglion via LCM tendens til å resultere i uønsket vev pickup (A). De røde sirklene (30 µm i diameter) angir størrelsen på IR MFM flekker brukes under samling. Den hvite pilen viser en ganglion samling som trakk opp en del av tilstøtende muscularis. Med PENN-membran lysbilder (B) følges prøver et tynt ark som er løsrevet fra fleste av objektglass. Når kutte med UV-LCM laser, både prøve og PENN membranen er skiver, som resulterer i fullstendig brøkdel av Ganglion fra lysbildet uansett ganglion figur (C), og overholdelse LCM hetten når fjernet fra utvalget (D ). Strukturer av ønsket størrelse og form ≥10-15 µm kan fullstendig og nøyaktig samlet [(E), innledende vev påslag; (F) IR og UV laser cutting fullført. (G) LCM cap fjernet fra delen], som visualisert på LCM cap (H). Flekkete bakgrunnen i panelet H er iboende til hetten og ikke uønsket debris. Grønne sirkler blå trådkorset i paneler Eh er en del av programmet LCM og er plassholdere for i UV og IR lasere, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Velge en optimal RNA isolering kit. RNA integritet resultatene vises etter en samtidige sammenligning av tre forskjellige RNA isolering prosedyrer. To representant tomter fra hver gruppe vises for å illustrere variasjon som kan forekomme mellom prøver behandles parallelt. RNA utvinning Kit "A" (A) produsert prøver med en RIN 6.83 + 0,65 gitt moderat RNA avkastning og tenderte til å ha DNA forurensning, til tross for utfører en på-kolonne DNase fordøyelsen. RNA utvinning Kit "B" (B) resulterte i den høyeste målte RIN, på 8.3 ± 0.1. Mens fenol-baserte RNA utvinning metoden "C" (etterfulgt av opprydding av RNA prøvene RNA utvinning Kit "B") (C) syntes å eliminere gDNA og hadde en RIN 7.5 + 0.26, var det store forurensende band, som kan være et resultat av smelting av den lim polymer fra LCM hetten under RNA lysis trinn. Videre var RNA avkastning fra RNA utvinning Kit "A" og utvinning metoden "C" konsekvent lavere enn ved RNA utvinning Kit "B". Viktigere, RNA lyseringsbuffer levert av RNA utvinning Kit "B". (med ekstra β-mercaptoethanol) lyses fullt de fanget Ganglion (D). Hver gruppe hadde n = 3 biologiske gjentak og presenteres her som mener ± standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Representant resultater. Når pooling to caps enteric Ganglion per prøve, vi får tilstrekkelig mengder RNA for RNA-seq (> 1 ng) sammen med utmerket RNA kvalitet. Representant RNA tomter vises for et utvalg med en RIN 8.3 (A), 7.5 (B) og 6,9 (C). RNA-seq data ble kjørt gjennom en kvalitetsvurdering programmer, kjøre i R. (D) slutten-bias handlingen angir at prøvene var vellykket sekvensert og har en beskjeden 3-end skjevhet. (E) gen biotype handlingen representerer også at sekvensering resultatene er hovedsakelig konsekvent blant eksemplene. Sammen har vi hatt en > 95% suksessrate generere prøver brukbare for RNA-Seq Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Trinn | Varighet | Formål |
| 95% etanol (-20 oC) | 30 s | Fiksering |
| 4% cresyl Violet i 95% etanol | 10-30 s | Flekk |
| 75% etanol (med gjentatte dipping) | 15-25 s | Fjern flekk |
| 95% etanol (med gjentatte dipping) | 5-15 s | Fjern flekk |
| 100% etanol | 15 s | Dehydrering |
| 100% etanol (vannfri) | 30 s | Dehydrering |
| Xylen (med gjentatte dipping) | 15-20 s | Dehydrering |
| Xylen | > 10 min | Dehydrering |
| Air-Dry | 1-3 min | Fordampning av xylen |
Tabell 1. Beising og dehydrering protokoll oversikt. Denne tabellen beskriver våre optimalisert fargeprotokoll. Merk at alle etanol-kompatible flekker kan brukes til å erstatte Cresyl violet, hvis det gir bedre resultater. I noen tilfeller må varighetene for flekker og destaining bli forlenget eller forkortet. Vanligvis, jo lengre vil fiksering tid, desto raskere vev bli fullt farget. Vi har ikke merket noen reduksjon i RNA integritet etter å bruke ampuller opptil 3 ganger når forbereder lysbilder fra samme vev segmentet.
| Donor | Vev | RIN |
| F | Kolon | 7.1, 7.4, 7.2 |
| M | Ileum | 7.2, 6,9, 7,8 |
| M | Tolvfingertarmen | 8.2, 7.4, 7.7 |
| Ileum | 7.4, 7.6, 7.3 | |
| Kolon | 7.7, 7,8, 7.3 | |
| F | Tolvfingertarmen | 7.1, 7.3, 6,9 |
| Ileum | 7.8, 7.9, 7.6 | |
| Kolon | 7.3, 8.0, 7.5 | |
| M | Ileum | 6.9, 6,7, 6,9 |
| Kolon | 6.8, 6.4, 6.6 | |
| M | Ileum | 7.2, 7.3, 7.6 |
| Kolon | 6.7, 7.6, 7.7 | |
| M | Ileum | 8.3, 7,8, 7.4 |
| Kolon | 7.0, 7.4, 7.0 | |
| F | Tolvfingertarmen | 8.3, 8,8, 8.0 |
| Ileum | 8.1, 8.0, 7,8 | |
| Kolon | 8.4, 8.6, 7.1 |
Tabell 2. Representant RNA integritet resultater. Prøvene vises i denne tabellen alle Hentet fra menneskelige enteric Ganglion. Alle valgte prøver har tilstrekkelig RNA kvalitet og kvantitet for RNA-seq analyse. Den gjennomsnittlige RIN alle prøvene i denne tabellen er 7.49 ± 0.53. RNA konsentrasjon ble også målt ved hjelp av RiboGreen Quant-iT analysen og alle prøver vises i i denne tabellen har møtt minimale antallet som kreves for våre RNA-seq (> 1 ng) eksperimenter. Mindre mengder kan brukes, avhengig av pre forsterkning prosedyren. Men er slike prosedyrer mer pålitelig når man forventer det å være store forskjeller i genuttrykk mellom eksempler eller grupper som sammenlignes; ellers kan disse resultatene maskere sant forskjeller i noen RNA-seq-programmer. Det anbefales derfor vanligvis starte med mer materiale når mulig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne fremgangsmåten kan effektiv innsamling av mange enteric Ganglion som kilde å utlede RNA for RNA-seq. Her har vi akselerert prosessene som er beskrevet i eksisterende protokoller samtidig bevare maksimalt RNA integritet. Som alle trinnene i denne fremgangsmåten er avhengige av hverandre, er det viktig at alle problemer bli eliminert fra starten av studien, og at alle prøvene er forberedt som tilsvarende til hverandre som mulig, å få pålitelig RNA-seq.
Fra starten av prosedyren, kan RNA integritet bli negativt påvirket hvis tidsintervallet (kald iskemiske tid) mellom samling av vev på tidspunktet for orgel donasjon og mottak av vev for behandling i laboratoriet er for lang. Gitt denne bekymringen, var vi overrasket over at høy kvalitet RNA kan fremdeles hentes fra intestinal prøver selv etter 24 timer for kald iskemiske tid. Når intestinal prøvene er kjølt og lagret riktig i kjølelager løsning, er det superb beskyttelse av vev integritet og RNA kvalitet. Vi krever at intestinal vevet spyler ved samling av orgel samling teamet, begrense eksponering av tarmen fordøyelsesenzymer, RNases og andre molekyler som kan påvirke RNA kvalitet i denne perioden. Vi har funnet at når intestinal prøven ikke spyler helt, kan dette betydelig redusere utvalgets RIN.
Bruke vår optimalisert prosedyre for å forberede tarmen tissue prøver, er vi unngå innebygging prøver i TFM. Fordi TFM samhandler med etanol og xylen til en mørk brun bunnfall som forstyrrer visualisering av innstigning Ganglion, foretrekker vi utelate det fra våre prøver. Men når du arbeider med tarmen tissue mus eller andre arter, kan utelukkelse av TFM ikke være mulig. I dette tilfellet har vi eksperimentert med å fjerne TFM fra en adhered del på et lysbilde. Hvis vevet har et tilstrekkelig areal, kan etanol (kjølt på 20 ° C) være dryppet på lysbildet med en overføring pipette å raskt løse TFM, slik at den kan fjernes med tang. Dryppende etanol på lysbildene unngå akkumulering av TFM i ampullen av etanol, som kan forverre browning effekten når lysbilder blir behandlet.
Under flash-frysing favoriserer vi bruker en tørris slurry med 2 MB, i stedet for 100% etanol, fordi 2 MB lett fordamper under landing på overflaten av vev. Etanol tendens til å fordampe saktere, spesielt kombinert med TFM, danner en kjemisk slam på vev blokken som ikke kan fjernes enkelt. Både etanol og 2 MB pleier å fizz og splatter kraftig når fryser i små frysing beholdere, fordi den lille mengden tørris gjødsel har en lav spesifikk varmekapasitet. I stedet bruker en stor rektangulær bøtte fylt med powderized tørris gir en stor nedkjøling masse og hindrer temperatursvingninger mens vev blir frosset.
Som nevnt, er det noen ganger lettere å få sammenhengende ark med enteric Ganglion fra noen vevsprøver i forhold til andre. Forståelig, den generelle hastigheten på LCM er underlagt variasjoner avhengig av egenskapene til kilde vev eller intestinal regionen blir samplet. Derfor er det ofte best å forberede mange frisk-frosne prøver på utbruddet. Vi har vanligvis funnet at totalt 20 samplinger segment av tarmen (~ 2 cm x 1,5 cm, hver) er langt mer enn nok å tilby rikelig RNA for nedstrøms programmer. Hvis bare en liten mengde tarmen tissue er tilgjengelig, anbefaler vi imidlertid Minimumslengden på 5 cm. Med vår tilnærming, vil laveste avkastning som skulle hentes variere fra 18-30 ng av som ytterligere beskrives nedenfor. Minimum 5 cm lengde reduseres potensielt, avhengig av programmet, spesielt hvis høyere mengder cDNA preamplification brukes. Disse parameterne ble ikke testet i denne studien. For eksempel har enteric Ganglion blitt samlet fra full-tykkelse intestinal biopsi prøver (2 cm x 2 cm) for bruk med qPCR4.
Som vi viser i denne studien, tilbyr bruk av etanol-kompatible fargestoff, Cresyl violet, mye bedre beskyttelse av RNA integritet enn vandig flekken, toluidine blå. Når neddykket i etanol, blitt RNases inaktiv5,15. RNases kan imidlertid fortsatt få funksjonen når utsettes for vann7,15. Når flekker med vandig fargestoffer, må vevet utsettes for nuclease-fritt vann for nesten 1 min9, som fører til betydelig RNA degradering. Når du bruker toluidine blå vev flekker, kunne vi ikke redusere eksponering vann før og etter farging, fordi slike endringer også redusert opptak og oppbevaring av toluidine blå, henholdsvis. Et lignende problem oppstod også med en hematoxylin-baserte fargestoff9. I endret protokollen beskrevet her, unngår farging med Cresyl violet direkte eksponering av intestinal prøvene til vann, og dermed maksimalt bevare RNA integritet. Disse resultatene eliminere behovet for ytterligere RNase hemmere av flekker løsningen. Vi fant at slike hemmere er ineffektiv ved muliggjør bruk av vandig fargestoff, toluidine blue, som det interfered med både opptak og oppbevaring av fargestoffet.
Når først optimalisere våre fargeprotokoll, vi klarte ikke å reprodusere resultatene i andre protokoller og rapporter5,7,8,11. Grunnen til dette er uklart, fant vi flere faktorer som førte til strid fargestoff-opptak og oppbevaring. For eksempel selv om visse protokoller har med hell farget tissue benytter Cresyl violet i 100% etanol8 eller 75% etanol5, sammenlignet fargestoff bare svakt merket Ganglion eller hadde høy bakgrunn, med benytter Cresyl violet i 95% etanol. Sist, andelen Cresyl violet brukes i flekker løsningen er også svært viktig. De fleste protokollene anbefaler en 1% Cresyl violet løsning7,8, men denne konsentrasjonen gi ikke pålitelig farging i våre hender, selv etter farging seksjoner for opptil 2 min. Vi hadde best suksess flekker med en avklart mettet flekker løsning på 4% Cresyl violet11 på prøven gjennom sterile sprøyter filter8. Mettet løsningen gjør mye mer rask farging av prøven, i så lite som 10-15 s. før fiksering av eksemplet i kjølt 95% etanol (ved 20 ° C) gir en rask opptak flekken.
En annen rapporten fant at enteric Ganglion var mest tydelig beiset i fersk-frosne menneskelige tarmen deler kombineres Cresyl violet med eosin i en 75% etanol løsning5. Vi fant imidlertid at eosin gjort det vanskeligere å identifisere Ganglion og det Cresyl fiolett, alene, tilbyr overlegen gjenkjenning. I en annen studie, ble det funnet at en bufferløsning Cresyl violet gitt konsekvent flekker resultater for livmorkreft vev10. Vi fant imidlertid dette ikke tilbyr noen forbedringer for menneskelige tarmen tissue og også kan ikke implementeres når 95% etanol flekker løsning.
Vi har testet en rekke forhold som kan protokollen midlertidig og fortsette senere. Mange protokoller foreslå snitting lysbilder forhånd og re fryse dem på-80 ° C umiddelbart etter montering på lysbilde5,9. Med denne tilnærmingen, flekker og LCM kan deretter gjenopptas innen neste uke, tilbyr stor fleksibilitet. Men ikke bare dette sterkt forstyrre flekker; Det har også redusert RNA integritet i våre hender (data ikke vist). For å omgå dette problemet, anbefaler Grover et al. flekker og dehydrating delene før lagring i fryseren11. Med denne tilnærmingsmåten er lysbilder farget og dehydrert (som i tabell 1) til 100% vannfri etanol trinn (protocol delen 5.2). Deretter prøver er ruges i andre ampuller med 100% vannfri etanol i 10 min og overføres umiddelbart til en konisk rør med tørkemiddel gel, som deretter kjølt på tørris og overført til-80 ° C fryseren. Når du fjerner prøver fra fryseren, senkes lysbilder umiddelbart i 100% vannfri etanol for 30 s og Air-tørket før å utføre LCM11. Dessverre, i våre hender denne tilnærmingen redusert RIN med 0,6 0,8 (data ikke vist). Vi derfor tydde til å utføre alle snitting flekker og LCM på samme dag for å oppnå maksimal RNA integritet i våre forhold. Dette viser seg for å være en tidkrevende prosess, men 10-14 LCM caps kan fylles under en hel dags arbeid.
Det mest pålitelige punktet der våre protokollen kan pauses er xylen inkubasjon trinn. Lysbildene har stått i xylen (med molekylær sikter) for opp til 4-5 h uten noen tilsynelatende effekt på RNA integritet. Vi har funnet at når tre lysbilder tilberedes samtidig, alle kan behandles med LCM innenfor dette tidsrommet, selv om en time pause er nødvendig. Et alternativ er å la overflaten tørke ut lysbildene etter farging og dehydrering delaktivitetene i et vakuum-forseglet exicator16, men vi har ikke ennå forsøkt denne tilnærmingen.
RNA isolasjon er enda et avgjørende skritt i prosedyren, med de viktigste faktorer som: å oppnå maksimal mulig avkastningen av beholde hele spekteret av RNA (uten tap av mindre RNA)17,18, og fullstendig eliminere genomisk DNA eksempel17. I våre hender gitt RNA utvinning Kit "B" det beste resultatet med våre prøver, som det tilbys større avkastning og var effektiv genomisk DNA eliminering. Våre observasjoner om forskjellene gir RNA utvinning reagenser er i samsvar med tidligere rapporter17,18. Men er det også mange LCM studier som har rapportert suksess med andre RNA utvinning reagenser19,20. Tidligere rapporter tyder også på at de kolonnen RNA utvinning prosessene tilbyr bedre oppbevaring av små RNA molekyler enn fenol-baserte RNA utvinning metoder18 som små RNA molekyler kan gå tapt i nedbryting under RNA nedbør trinn.
Vi observerte at RNA lysis buffere som bruker guanidinium thiocyanate med ekstra β-mercaptoethanol er svært effektiv på å fjerne alle fanget Ganglion fra LCM hetten (figur 5D). Mens de fleste LCM protokoller ikke foreslå vortexing den lysate, har vi funnet at dette gir gode resultater og ikke resultere i RNA degradering. Det gir også en enda større sannsynlighet at alle fanget Ganglion frigis fra hetten for RNA utvinning. Benytter disse metoder, få vi vanligvis RNA avkastning fra LCM av innstigning Ganglion i området fra 1,8 til 18 ng/cm2 av tarmen tissue, avhengig av hvor mange Ganglion finnes på et bestemt lysbilde. Vår RNA-seq prosedyre krever en minimum input av 10 ng, men andre prosedyrer kan ha mye lavere RNA input hvis en sekvensering behandling omfatter et større antall pre forsterkning sykluser. Det samlede arealet av vev lagret forberedelse og flash fryse prosessen er 40-60 cm2, som gir rikelig RNA cDNA biblioteket prep og lav-input RNA-Seq programmer.
Mens vår prosedyre er designet for innsamling av hele enteric Ganglion, kan tilnærming lett endres for innsamling av enkelt nerveceller eller glia, eventuelt5. Men fordi glial behandler tett inkluderes ensheath nevroner i ENS, glial RNA sammen med RNA fanget neurons, om enn på lavere teller. Dette reiser spørsmål når du prøver å identifisere neuronal transkripsjoner uttrykt på et lavt kopi nummer. Encellede RNA-seq gir den beste presisjon og gjenkjenning i denne forbindelse, men krever neurons å være skilt fra tarmen tissue, beiset med pan-nevrale markører, og isolert med flowcytometri21 eller identifisert fra hele-tarm dissociations etter sortering med bioinformatikk tilnærminger. Ulempen med de fleste dissosiasjon studier er at de fleste protokollene krever at prøven være ruges i romtemperatur eller 37 ° C i lengre perioder, som er kjent for å forandre transcriptome3. Nylig kalde aktive protease fra Bacillus licheniformis har blitt brukt for generering av enkeltcelle suspensjoner for musen vev og det kan være mulig å bruke dette enzymet for av menneskelig vev på 4 ° C22. Til slike optimalisering oppnås, er LCM av fersk frosne menneskelig vev en robust måte å fange RNA for expression profilering av perifere nervesystemet elementer som enteric Ganglion.
I sammendraget, har vi utviklet en pålitelig og konsekvent protokoll for innsamling av RNA fra menneskelige enteric Ganglion. Vi har optimalisert utarbeidelse av menneskelige tarmen tissue, flekker, LCM prosessen og RNA utvinning basert på mange publikasjoner og protokoller. Vi har også vist påliteligheten av denne tilnærmingen i samle RNA prøver av tilstrekkelig RNA kvalitet for RNA-Seq. Denne protokollen kan brukes bredt vev innhentes fra pasienter med en rekke gastrointestinale sykdommer og kan lett tilpasses for bruk med gnager modeller, og dermed tilby en pålitelig strategi for utvikling av romanen therapeutics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til givere og deres familier som gjorde dette arbeidet mulig. Vi takker også hjelp av personalet ved International Institute of Medicine og Tennessee Donor tjenester for å hjelpe koordinere samling av vev som er brukt i denne studien. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 til EMS2 og stipend støtte fra NIH T32-DK007673 til AMZ. Vi er takknemlige til ansatte i Vanderbilt translasjonsforskning patologi delte ressursen tilgang til MFM Instrument og råd om vev forberedelse. Vanderbilt vev patologi delte ressursen støttes delvis av NIH tilskudd P30-CA068485-14 og U24-DK059637-13. Vi takker genomet Technology Access Center i genetikk ved Washington University School of Medicine for hjelp med genomisk analyse. GTAC støttes delvis NCI Cancer Center støtte Grant #P30 CA91842 til Siteman Cancer Center og IKT/CTSA Grant #UL1TR002345 fra National Center for forskning ressurser (NCRR), en komponent av National Institutes of Health (NIH) og NIH Veikart for medisinsk forskning. Denne publikasjonen er ansvar forfatterne, og nødvendigvis representerer ikke offisielle visningen av NCRR eller NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
- Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
- Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
- PALM Protocols - RNA handling. , ZEISS. Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011).
- Schlaudraff, F. L. M. Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015).
- Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
- Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
- Potter, S. S., Brunskill, E. W.
- Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
- Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
- Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
