Summary
El objetivo de este protocolo es obtener muestras de RNA de alta integridad de ganglios entéricos aislados del tejido intestinal humano no fijado, recién resecado usando el microdissection de la captura de láser (LCM). Este protocolo implica preparación de flash-congeladas muestras de tejido intestinal humano, cryosectioning, coloración etanólico y deshidratación, LCM y la extracción de RNA.
Abstract
El propósito de este método es obtener muestras de RNA de alta integridad de ganglios entéricos de interpretaciones, recién resecado tejido intestinal humano usando el microdissection de la captura de láser (LCM). Hemos identificado cinco pasos en el flujo de trabajo que son cruciales para la obtención de RNA aislados de ganglios entéricos con suficiente calidad y cantidad de RNA-seq. En primer lugar, preparar el tejido intestinal, cada muestra debe tener todo exceso de líquido eliminado por borrar antes de aplanar la serosa tanto como sea posible a través del fondo de grandes moldes base. Las muestras entonces se congelan rápidamente encima de una mezcla de hielo seco y 2-Metilbutano. En segundo lugar, al seccionar los tejidos, es importante posicionar cryomolds para que las secciones intestinales paralelas el plano completo del plexo mientérico, produciendo así la mayor superficie de ganglios entéricos por diapositiva. Tercero, en la LCM, polietileno napthalate (PEN)-diapositivas de membrana ofrecen la mayor velocidad y flexibilidad en las formas no uniformes de ganglios entéricos el recoger los ganglios entéricos. En cuarto lugar, para la clara visualización de ganglios entéricos dentro de las secciones, colorantes compatibles con etanol, como el violeta de cresilo, ofrecen excelente preservación de la integridad del RNA en relación con tintes acuosos. Finalmente, para la extracción del ARN de los ganglios capturados, observamos diferencias entre los kits comerciales de extracción RNA que rindieron superior cantidad de RNA y de calidad, eliminando la contaminación del ADN. Optimización de estos factores en el protocolo actual en gran medida acelera el flujo de trabajo y da muestras de los ganglios entéricos con excepcional calidad de RNA y la cantidad.
Introduction
Este método está diseñado para obtener muestras de RNA de alta calidad de ganglios entéricos de tejido intestinal humano usando el microdissection de la captura de láser (LCM). El protocolo descrito aquí ha sido optimizado para proporcionar suficiente RNA calidad y rendimientos para ARN de secuencia (RNA-seq) y está destinado a ser utilizado con tejido intestinal humano recién resecado, interpretaciones, flash-congeladas.
Trastornos de la motilidad gastrointestinal y tripas funcionales afectan uno de cada cuatro personas en los Estados Unidos. El sistema nervioso entérico (ENS), también conocido como el segundo cerebro1, es a menudo en el centro de estos trastornos, como juega un papel fundamental en la homeostasis intestinal y la motilidad. Manipulación de la motilidad intestinal generalmente está limitado a la resección quirúrgica del tejido agangliónico/noncontractile, modificación dietética crónica y/o medicamentos. Sorprendentemente, el transcriptoma completo de la ENS adultos queda ser secuenciado, limitando enormemente nuestra capacidad para identificar las moléculas dentro de la ENS que pueden ser dirigidos farmacéuticamente o utilizados en terapias con células madre.
Hay relativamente pocos métodos para aislar RNA ganglios entéricos humanos. El primer enfoque, disociación celular2requiere incubación altas temperaturas y tiempos de incubación; tanto que se conocen para promover la degradación del RNA y alterar el transcriptoma2,3. Un enfoque alternativo, LCM, más confiablemente conserva el transcriptoma y protege la integridad del RNA. Aunque varios estudios han utilizado LCM para recoger los ganglios del tejido intestinal humano fresco congelado4,5,6, estos enfoques tampoco fueron obstaculizados por la pobre cantidad y calidad de RNA, eran muy intensivas, o necesaria modificación de la tinción o técnicas de extracción de RNA para trabajar en nuestras manos. Otros protocolos de LCM diseñados para la preservación de RNA que se encuentran en productos de LCM manuales proporcionan mejoras adicionales7,8, pero la adaptación era necesario cuando se aplica al aislamiento de los ganglios entéricos8, 9. por estas razones, hemos desarrollado un protocolo optimizado basado en estos recursos que rinde cantidades sustanciales de RNA de alta integridad de ganglios entéricos humanos, tiene un flujo de trabajo relativamente rápido y produce resultados consistentes a través de una gran número de muestras.
En este estudio, presentamos una sinopsis de los procedimientos optimizados que facilitan el aislamiento de ARN de alta integridad de ganglios entéricos de tejido intestinal humano resecado. Nuestro método incorpora cinco aspectos importantes. Primeras, recién resecado, interpretaciones muestras intestinales humanas deben recortarse en tamaño, tienen todo el exceso de humedad quitada con un pañuelo de laboratorio y aplastada en un molde grande de base antes de la congelación de flash encima de una mezcla de hielo seco y 2-Metilbutano (2 MB). En segundo lugar, histologic secciones del intestino deben estar preparadas para obtener el plano completo del plexo mientérico en un portaobjetos, que ofrece una gran capacidad de carga de ganglios entéricos. Éxito con este paso depende en gran medida del proceso de preparación del tejido. En tercer lugar, la estructura no uniforme de los ganglios en la ENS requiere el uso de polietileno napthalate (PEN) membrana diapositivas6, que ofrecen la mayor velocidad y precisión durante el proceso de la LCM. Tintes en cuarto lugar, compatible con etanol, como el violeta de cresilo, puede usarse para preservar la integridad del RNA mientras manchaba los ganglios entéricos. Por último, el proceso de extracción de RNA es fundamental para un resultado exitoso con RNA-seq. Buscamos un enfoque de extracción de RNA que produce alta integridad del RNA, maximiza rendimientos RNA cuando a partir de pequeñas colecciones de ganglios entéricos, elimina la contaminación de ADN y conserva especies de RNA como muchos como sea posible.
Tomados en conjunto, optimización de estos factores en el presente estudio grandemente acelera el flujo de trabajo y da muestras de ganglios entéricos con la excepcional cantidad de RNA y la calidad. Resultados han sido en gran parte constantes entre un grupo considerable de muestras, indicando que la consistencia de este enfoque. Además, hemos utilizado estos enfoques secuenciar con éxito decenas de muestras de RNA de los ganglios entéricos. Las estrategias aquí destacadas también ampliamente adaptables para la realización de LCM de deseada de los ganglios o núcleos de periférico y sistema nervioso central y otros casos que requieren el aislamiento del ARN de alta calidad.
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Protocol
Se describen aquí todos los protocolos han sido aprobados por la Vanderbilt University institucional de junta (IRB).
1. preparación antes de la llegada de tejido
- Obtener la aprobación IRB apropiado y coordinar con agencias de donación de órganos humanos para obtener tejido intestinal recién resecado, interpretaciones de los donantes que cumplen todos los criterios de investigación para el estudio.
Nota: Este protocolo puede ser adaptado para su uso con ratones y otros roedores modelos.- Inmediatamente tras la resección de cada segmento intestinal, deje correr el lumen con PBS frío o medio de almacenamiento de tejido para quitar el material residual luminal o heces.
- Después de lavado y desechar los residuos en un receptáculo biológico apropiado, sumergir el tejido en un volumen suficiente de tejido de almacenamiento medio (por ejemplo, 3 - 5 veces el volumen del tejido intestinal) y guardar en plástico a prueba de agua etiquetadas individualmente contenedores, sumergidos en hielo o refrigerado hasta su uso).
- Proceso el tejido dentro de 18-26 horas desde el momento de la recogida para evitar la degradación de RNA substancial.
Nota: Dependiendo de la limpieza del segmento intestinal y de almacenamiento de información, es posible prorrogar el plazo sugerido.
- Preparar todos los materiales necesarios para la recolección de tejido humano por adelantado, como se indica en el presente Protocolo (consulte la Tabla de materiales para información más detallada). Asegúrese de que todos los necesarios equipos de protección personal se usa en todo momento.
- Preparar cubos de hielo seco con una mezcla de hielo seco como se muestra en la figura 1.
- Aplastar el suficiente hielo seco para llenar 4 cubos de hielo circular estándar y un cubo de hielo rectangular. Uno de los cubos estándar debe tener laboratorio pequeño (11 x 21 cm) tejidos colocan en la superficie del hielo seco. Si es posible, utilizar cajas nuevas, sin abrir de los tejidos de laboratorio.
- Hacer una mezcla de hielo seco por powderizing 2 L de hielo seco en un cubo de hielo rectangular limpio.
- Añadir previamente refrigerado 2 MB hasta la superficie del hielo seco. Ligeramente la mezcla y aplanar la mezcla usando una tapa de caja de punta de pipeta a la superficie de la forma de la mezcla en un canal rodeado de grandes piezas de hielo seco a lo largo de los lados de la cubeta rectangular.
- Lugar varios bloques finas de hielo seco a lo largo de los bordes de la cubeta de hielos para fomentar la congelación más rápida. Debe haber espacio para moldes base de ≥4 caber holgadamente en el cubo de mezcla de hielo seco en un momento dado.
- Opcionalmente, pila el cubo de hielo dentro de otro cubo de hielo rectangular llena ¼ con hielo seco. Esta posición ayuda a aislar mejor la mezcla de hielo seco y evita la necesidad de ajustes frecuentes de hielo seco y 2 MB durante el procedimiento.
- Coloque los cubos de hielo seco en una línea de montaje en el siguiente orden: 1) hielo seco mezcla cubo, cubo de hielo 2) laboratorio tejido seco, 3 y 4) normales seco cubos de hielo, cubo de hielo seco 5) rectangular (figura 1A).
2. preparación del tejido Intestinal humano congelado de Flash
Nota: Todo este proceso puede tomar entre 45-80 minutos por el segmento intestinal, dependiendo de la calidad del tejido intestinal. También se recomienda recoger muestras de control de calidad para evaluar la calidad del RNA y la histología antes de proceder a la LCM.
- Llenar una bandeja grande con hielo mojado y coloque las tablas de corte quirúrgico sobre el hielo seco.
- En esta configuración, chill un vasos de precipitado de 500 mL y 100 mL para almacenar los segmentos cortados y tejidos en la solución de almacenamiento en frío. Base pre-chill moldes en las placas de corte para que estén listos para recibir el tejido.
- Al recibir el tejido intestinal fresco, retirar de los medios de comunicación en la que el tejido es transportado y retener en los vasos previamente enfriados. Deje algún espacio en estos vasos para el almacenamiento temporal del tejido intestinal y segmentos recortados, que se prepararán en los pasos posteriores.
- Cortar el segmento intestinal a una longitud de aproximadamente 20 cm, que proporciona un amplio tejido (40-60 cm2) para generar RNA para aplicaciones posteriores y las muestras de control de calidad. Dependiendo de la integridad del tejido, puede ser factible realizar aislamiento de RNA para el procesamiento de aguas abajo con una longitud mucho más pequeña (es decir, 5 cm de intestino).
- Corte lejos adiposo y tejido conectivo del intestino con tijeras quirúrgicas. Adiposo a lo largo de la serosa intestinal residual pone en peligro la capacidad de aplanar totalmente tejido en pasos posteriores. Recorte cuidadosamente el tejido, para evitar mellar la serosa durante la extracción de grasa y tejido conectivo, que estructuralmente puede dañar el plexo mientérico o hacer el exterior del tejido aplanar irregularmente para seccionamiento.
- Haga una incisión longitudinal a lo largo de toda la longitud de la muestra intestinal, preferentemente en el sitio de fijación mesentérica.
- Disecar y descartar la tenia coli del colon, por lo que se aplana más fácilmente, al ser liberado de la tensión.
- Splay el lado de la mucosa del intestino hacia abajo sobre una tabla de corte frío y cortar tiras de 1,25 cm de ancho de toda la longitud del tejido.
Nota: Tejido Intestinal a menudo se expande después de recortar, por lo que este tamaño debe ajustarse en consecuencia. - Almacenar temporalmente las tiras en solución de tejido-almacenamiento refrigerado.
Nota: Usamos solución de almacenamiento en frío Belzer UW porque tiene una larga vida útil, es relativamente económica y puede ser almacenado a temperatura ambiente hasta que se necesite. - Retire una tira de tejido de la solución de almacenamiento en frío y cortar en segmentos ~1.5-2 cm largo.
- Secar rápidamente los segmentos intestinales en una pila de trapos de laboratorio, para eliminar el exceso de líquido y prevenir la formación de cristales de hielo a lo largo de la serosa intestinal durante la congelación de flash. Si el tejido no se seca suficientemente, será difícil obtener secciones de alta calidad desde el plexo mientérico.
- Haceos el borrado piezas intestinal mucosa-lado en un pre-frío, grande, desechable plástico molde básico (37 x 24 x 5 mm).
- Alisar cuidadosamente cada segmento ligeramente estirando el tejido sobre la superficie del molde base y usando fórceps curvado suavemente presione hacia abajo y expulsar cualquier burbuja de aire que puede quedar atrapado debajo de la serosa. Tenga en cuenta que el tejido se expande y aplanar. Si es necesario, recortar los segmentos y corte las muestras restantes en un tamaño más pequeño.
Nota: Si el tejido está sobrecargado, esto distorsionará el plexo mientérico. Después se eliminan todas las burbujas de aire, evaluar el espesor de la muestra antes de la congelación. Si es necesario, empuje los bordes del interior de muestras hasta la muestra intestinal acerca a su grosor original. - Coloque el molde base cargado sobre la superficie del hielo seco, mezcla de 2 MB. El tejido debe congelarse completamente en 30-60 s, dependiendo del tamaño y grosor del segmento intestinal.
- Secar la parte inferior del molde base quitar residual 2-MB frotando rápidamente el molde básico de los tejidos de laboratorio previamente enfriados en el segundo cubo de hielo seco.
- Transferir la muestra seca a la tercera tina de hielo seco y enterrarlo debajo de la superficie del hielo seco hasta que esté listo para ser envuelto.
- Observar rápidamente la parte inferior del molde base antes de envolver, para examinar la calidad de la preparación de la muestra. Tome nota de las muestras que no aparecen planas o burbujas de aire grandes, como estas deben evitarse para cryosectioning y LCM.
- Envolver la muestra en papel de aluminio previamente marcados que se pone en la cima de hielo seco en un cubo para que la envoltura de tejido se produce mientras se mantiene completamente congelado.
- Envolver la muestra con una capa de envoltura de plástico, para reducir al mínimo la deshidratación de tejidos durante el almacenamiento a-80 ° C.
- Almacenar las muestras en el cubo rectangular hasta que están listos para el congelador.
- La etiqueta y enfriado previamente cajas de congelador a-80 ° C para almacenamiento inmediato de muestras después de la recolección.
- Tomar una pequeña porción de tejido de cada segmento intestinal para la evaluación de la integridad del RNA antes de realizar la LCM.
- La etiqueta de un tubo libre de Rnasa de 2mL para cada segmento, con ≥500 μl de tampón de lisis. Recomendamos utilizar el Kit de extracción de ARN "D", figuran en la Tabla de materiales.
- Homogeneizar un pedazo pequeño (2 mm x 2 mm) del intestino en un micro-homogeneizador de tejidos estándar (20-40 s, hasta que no queden trozos de tejido). Entonces, inmediatamente congelar el ARN lisado en hielo seco y conservar a-80 ° C hasta proceder a la extracción de RNA.
- Opcionalmente, incruste algunas de las secciones en el medio de congelación de tejido (TFM) como una copia de seguridad. Preparar las secciones de tejido de la misma manera exacta descrita en esta sección, pero sumergir las muestras en TFM dentro el molde base antes de la congelación de flash.
3. Cryosectioning
- Antes de cryosectioning, preparar todos los materiales necesarios para la coloración y la deshidratación y transferir las muestras de tejido deseada del congelador de-80 ° C en un cubo de hielo seco.
- Preparar el criostato para uso a la temperatura de corte óptimo (-18 a-22 ° C) y limpiar las superficies con etanol al 100% y tratamiento de la hoja y bandeja con solución de descontaminación de Rnasa del cepillo.
- Para adherir mejor la muestra de la tirada, utilice el siguiente enfoque.
- Colocar pinzas en hielo seco durante al menos 30 s antes de abrir la muestra intestinal y colocándola en la superficie del hielo seco serosa-lado-para arriba.
- Verter un montículo de 3-5 mm de medio de congelación de tejido (TFM) sobre un soporte de muestra grande criostato y transferir inmediatamente la muestra intestinal serosa hacia arriba en el TFM.
- Transferir rápidamente las mordazas al hielo seco y cubrir con hielo seco molida después de permitir que el TFM para adherirse a la muestra para s 2-5 a temperatura ambiente. Asegúrese de que el TFM permanezca por debajo del plano del plexo mientérico.
Nota: Idealmente, la superficie externa de la mucosa intestinal completamente adherirá a TFM antes TFM comienza a congelar sin descongelación de la muestra.
- Monte el soporte del espécimen en cabeza del espécimen del criostato y alinear a la pieza con la hoja del criostato, tal que el plano del plexo mientérico será paralelo a la cuchilla de corte.
- Establecer el espesor de seccionamiento en el criostato a 8 μm. El propósito de alinear perfectamente la muestra es obtener la mayor superficie posible del plexo mientérico en cada diapositiva. Este espesor se recomienda para tejidos humanos y roedores, pero se puede ajustar según sea necesario.
- Sección a través de la serosa y longitudinal del músculo hasta alcanzar el plexo mientérico.
- Para localizar el plexo mientérico, montar una sección de la muestra sobre un portaobjetos y mancha la sección con un colorante acuoso, como el 1% de violeta de cresilo o azul de toluidina, etcetera.
- Ver la sección de un microscopio óptico con aumento de 40-2000 X para identificar a la unión entre las capas musculares longitudinal y circular. Parámetros del microscopio se encuentran en la Tabla de materiales. Al principio de seccionamiento, la serosa se caracterizará por la presencia de tejido conectivo. Algunos remanente de la grasa mesentérica también puede estar presente a lo largo de la serosa. Entonces comienza una hoja de la capa muscular longitudinal externa. Al llega a la frontera entre las capas musculares longitudinal y circular, se observará una porción de los ganglios entéricos.
Nota: En las siguientes secciones varias, el plexo mientérico se convertirá en muy evidente, con grandes áreas de los ganglios que están presentes dentro de una sola sección (figura 2C). Si el tejido no es completamente plano al principio de seccionamiento, sólo una parte de los ganglios estará presente en cada sección en un momento dado. A veces, la muestra intestinal puede tener un plexo mientérico inherentemente desigual, a pesar de los tejidos que aparecen perfectamente plana. Esto es especialmente cierto para las muestras de duodeno. En nuestra experiencia, estas muestras pueden tomar mucho más tiempo para procesar con LCM, pero suficiente RNA puede ser recogida dentro de sesión de un día. La ubicación exacta del plexo mientérico puede variar considerablemente entre las muestras, basadas en el tejido y su preparación antes de la congelación.
- Comenzar a colectar las secciones seriales para LCM, con colecciones óptimo proporcionando el mayor número de neuronas y glia por diapositiva. Dependiendo de la superficie de la muestra, se pueden combinar varias secciones en una sola diapositiva PEN-membrana.
- Monte las secciones sobre diapositivas de membrana de pluma, enfriadas brevemente en el criostato para s 5-10. Durante el montaje, el tejido se derrite sólo ligeramente, máximo preservar integridad del RNA.
4. coloración
Nota: Para tener una visión general del proceso de tinción, refiérase a la tabla 1. Utilizadas todas las soluciones se preparan en frascos cónicos de 50 mL estándar. Tratar la parte exterior de los tubos con solución de descontaminación de ARNasas no parece mejorar los resultados (datos no mostrados).
- Preparar una solución saturada de violeta de cresilo de 4% en etanol al 95% por lo menos un día de anticipación y resuspender completamente el violeta de cresilo antes de cargar la jeringa.
Nota: La concentración de etanol deba reducirse para tinción efectiva, como se describe en la sección de discusión. No hemos probado si el uso de etanol 50% o 75% durante la tinción perceptiblemente reduce integridad del RNA. Violeta de cresilo es sensible a la luz y por lo tanto debe ser protegido de la luz. - Después de montar las secciones del plexo mientérico en el portaobjetos, inmediatamente sumerja el portaobjetos en un frasco cónico de etanol al 95% (previamente enfriada a-20 ° C) durante 30 s.
- Si las secciones no adhirió completamente a la diapositiva en el paso anterior, calentar ligeramente la parte inferior de la corredera con una mano enguantada (una toallita de laboratorio debe ser colocado entre la diapositiva y guante), para la completa adherencia antes de sumergirse en etanol al 95%. Esta solución puede ser reutilizada por al menos 3-6 diapositivas sin reducir la integridad del RNA.
- Poner la diapositiva hacia arriba en un paño de laboratorio colocado encima de un recipiente previamente tratadas, libres de Rnasa8.
- Llenar una jeringa de 3mL con 4% violeta de cresilo y acoplar un filtro de jeringa de 0,2 μm.
Nota: Se recomiendan filtros de acetato de celulosa. - 6-10 gotas de tintura directamente sobre el tejido las secciones8 e incube durante 10-30 s, o hasta que suficiente tinte se mantiene cuando la manchada. Mientras que la coloración, gire suavemente el contenedor de la diapositiva con la mano para asegurarse de que las secciones de tejido son uniformemente cubiertas con manchas.
- Vierta fuera de la mancha e inmediatamente la mancha de la diapositiva en un frasco de etanol al 75%. Varias veces sumergir el portaobjetos hasta que el exceso de tinte en su mayoría ha filtrado de la muestra. Esto puede tomar entre 10-20 s.
- Finalizar la tinción sumergiendo repetidamente la muestra en un frasco de etanol al 95% para 10 s. Sumerja la muestra varias veces hasta que se ha quitado toda mancha exceso.
- Modificar la duración de la extracción, según sea necesario, para optimizar la tinción de los ganglios. Si se retira demasiada mancha, la muestra se convierte también transparente y pueden ser difícil de visualizar
Nota: Este protocolo de tinción se ha optimizado basado en varias publicaciones5,8,10,,11 que requiere modificación antes de que se obtuvieron resultados satisfactorios. Por lo tanto, la concentración de etanol utilizado en el tinte y durante el proceso de extracción debe ser modificada, cuando sea necesario, para obtener un resultado óptimo.
- Modificar la duración de la extracción, según sea necesario, para optimizar la tinción de los ganglios. Si se retira demasiada mancha, la muestra se convierte también transparente y pueden ser difícil de visualizar
5. deshidratación
- Inmediatamente sumerja el portaobjetos en etanol al 100% 2 - 3 veces, para un total de 10-20 s.
- Sumerja el portaobjetos en etanol anhidro 100% para al menos 30 s. Como el etanol anhidro es muy higroscópico, añadir tamices moleculares (8-12 mesh) al frasco de etanol al 100% antes de iniciar el procedimiento para eliminar toda el agua absorbido y por lo tanto más totalmente deshidratar la muestra5.
- Sumergir varias veces el portaobjetos en xileno para 15-20 s. Este paso elimina completamente la capa de etanol en la diapositiva. Añadir tamices moleculares antes de tiempo en los tubos de xileno, para absorber completamente el exceso agua y etanol moléculas5.
PRECAUCIÓN: Xilenos se clasifican como irritante a los ojos y tracto respiratorio superior y deben utilizarse en una campana de humos químicos. - Sumerja el portaobjetos en xileno (con tamices moleculares, malla de 8-12) durante al menos 10 minutos.
Nota: Puede tomarse un breve descanso después de este paso, si es necesario. Las muestras pueden dejarse en xileno para 4-5 horas sin efectos perjudiciales a la coloración, rendimiento e integridad de LCM o ARN. - Opcionalmente, individualmente preparar varias diapositivas adicionales en este momento. Si prepara una segunda ronda de diapositivas después de completar la LCM en todas las diapositivas preparadas, el tejido en el criostato deba ser rectificado, debido a la deshidratación de la superficie del tejido. Uno a cuatro secciones deben descartarse antes de secciones usables se pueden recoger.
6. Microdissection de la captura de láser (LCM)
- Quitar la corredera de xileno y secado con aire en una campana de vapores químicos durante al menos 1 min Inserte un cartucho de casquillos LCM en la platina del microscopio LCM. Cargar la diapositiva en el escenario y adquirir una imagen Resumen de la diapositiva.
- Identificar la ubicación deseada para la LCM y carga una tapa en la diapositiva.
- Alinee el laser infrarrojo (IR) y ajustar su poder y duración para hacer un 20-30 μm de diámetro captura punto.
- Ubique el láser (UV) ULTRAVIOLETA y establecer una velocidad de corte adecuada y la intensidad.
- Esquema de los ganglios deseados para ser recogido con el software de la LCM, asegurándose de que permanezca dentro del límite de la zona de coleccionable en la tapa (representada en la descripción de la diapositiva del programa como un círculo verde).
- En cada uno de los rastros, ajustar los puntos de IR que hay al menos uno IR punto cada 100-500 μm.
- Presione el botón de corte de IR/UV para continuar con la colección de todos los ganglios marcados.
- Una vez que se completen colecciones, mueva la tapa a una nueva ubicación y repetir el proceso de recolección o examinar la tapa de la LCM en la estación de control de calidad una vez que la tapa está suficientemente lleno con los ganglios (o hasta que se alcanza el límite de tiempo recomendado de 60-80 minutos).
- Si desechos están presentes en la tapa, limpie lejos usando un pincel de punta fina que ha sido previamente tratado con solución de descontaminación de Rnasa, enjuagarse con agua libre de nucleasas y completamente secas.
- Cuidadosamente examine la tapa por el ojo o con aumentos en un microscopio de campo brillante para todos los desechos se ha eliminado. Si los desechos no pueden sacarse a través del uso de la brocha previamente tratada, luego use una pipeta fina (libre de ARNasas) para Raspe los residuos.
- Asegure la tapa en un tubo de microcentrífuga de 0, 5 mL llenado con 230 μl de tampón de lisis de RNA (RLT Buffer del Kit de extracción de ARN "B", con β-mercaptoetanol añadido a una concentración de 10 μl/mL).
- Invierta la tapa, brevemente vortex e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Centrifugar a ≥ 5.000 x g por 5 min y entonces traslado la microcentrífuga tubo para hielo seco.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. Lisados de RNA pueden almacenarse a-80 ° C sin un efecto sustancial sobre la degradación del RNA durante al menos 1 semana. Si aislamiento de RNA se lleva a cabo el mismo día, luego enfriar las muestras en hielo hasta que estén listos para la extracción. - Realizar todas las colecciones adicionales dentro del límite de tiempo máximo recomendado de 80-90 min después de retirar la corredera del xileno. Como las secciones deshidratadas están expuestas a la humedad ambiente, RNasas gradualmente pueden ser reactivados. Limitar el periodo de recolección puede reducir al mínimo esos efectos y máximo preservar la integridad del RNA.
7. aislamiento de RNA
- Preparar un sitio de trabajo libre de Rnasa para extracciones de RNA.
- Preparar todos los tubos y los reactivos según el manual para el Kit de extracción de ARN.
Nota: Si bien hay muchos kits disponibles para el aislamiento de RNA después de LCM, hemos tenido mejor éxito utilizando el Kit de extracción de ARN "B", aparece en la lista de materiales. Vea la figura 5 para una comparación lado a lado de los reactivos de extracción de RNA. - Extraer muestras del congelador de-80 ° C y descongelar rápidamente en un baño de agua de 37 ° C.
- Inmediatamente vortex descongelar las muestras para 2-3 s distribuir las sales de guanidinio tiocianato.
- Combinar cada muestra con un volumen igual de etanol al 70%. La piscina juntos, lisados de 2 o más si es necesario, para alcanzar una suficiente concentración de RNA.
- Proceder según las instrucciones del fabricante en el manual para el proceso de extracción de RNA, utilizando el protocolo optimizado para microdissected muestras.
- Eluir el RNA en el paso final en el volumen mínimo recomendado de agua libre de nucleasas (14 μL).
- Tras aislamiento de RNA, alícuota 1-2 μl de ARN de cada muestra en un nuevo previamente etiquetado tubo libre de Rnasa calidad evaluación/control de calidad con un dispositivo de microfluidos que puede visualizar pequeñas cantidades de RNA, como un equipo Bioanalyzer. Alícuota un adicional 1 μL en un tubo separado para la cuantificación con un kit de cuantificación de RNA de alta sensibilidad.
- Ajustar estos pasos, según sea necesario, para obtener una cantidad suficiente de RNA para análisis posteriores (es decir., un mayor número de tapones de LCM antes de la extracción de RNA de la piscina).
- Tienda de ARN a-80 ° C hasta recoger suficientes muestras para posteriores análisis.
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Representative Results
Hemos hecho varias mejoras en los protocolos que permiten la colección relativamente rápida de ganglios entéricos de muestras intestinales humanas usando LCM, cumpliendo con los estándares para RNA-seq. En primer lugar, hemos optimizado la congelación rápida de los segmentos de tejido intestinal en grandes moldes de base colocados en la superficie de una mezcla de hielo seco en 2 MB (figura 1B). Se obtuvo el mejor éxito durante cryosectioning y LCM posterior colocando segmentos intestinales planos dentro de un molde base, frente a la mucosa hacia arriba (figuras 1B-1C). Que sean los moldes base tan planos como sea posible en la base, como cualquier curvatura hará mucho más difícil obtener una muestra representativa grande de plexo mientérico. Este enfoque genera tejido que fácilmente se secciona a 8 μm de grosor (figura 1E) y permite la eliminación completa de TFM del proceso de tinción. Se encontró que TFM interfiere con el proceso de tinción y por lo tanto oculta la identificación de ganglios entéricos. Colocación del tejido en esta orientación también evita Seccionando a través de la mucosa, que tiene un alto contenido de RNasas12, aunque por nuestra experiencia, parece el uso de manchas etanólico inhibe en gran medida estas RNasas. En los casos donde TFM o temperatura óptima de corte medio (OCT) es necesario, nos pareció más confiable primero aplanar la muestra en la parte inferior del molde base y luego añadir el TFM al molde después de este paso (figura 1D). Esto deja una "ventana" en el que el intestino puede visualizarse fácilmente, haciéndola fácil de alinear a la muestra y producir secciones que son completamente paralelas al plexo mientérico (figura 1E).
Preparación de cryosections longitudinalmente a lo largo del intestino en una orientación paralela al del plexo mientérico (figura 2A), genera las secciones en que la mayor zona de ganglios entéricos por diapositiva son visibles con tinción) Figura 2 C). cuando se aproxime el plexo mientérico (figura 2C), en la aposición de las capas musculares longitudinal y circular (figura 2B), 6-12 secciones seriales pueden ser recogidos (figura 2A, longitudinal) contienen grandes áreas de los ganglios entéricos (figura 2C). Tapas de LCM se pueden cargar a la capacidad de utilizar una sola sección (figura 4D). En contraste, durante la preparación de secciones transversales del intestino congelado (figuras 2A-2B), es sólo una pequeña área del plexo mientérico en cada diapositiva (figura 2B). Muy pocos ganglios entéricos pueden recogerse de las secciones transversales de tejido, resultando en mayor tiempo invertido y mayor costo por muestra total. El enfoque de seccionamiento en paralelo utiliza menos de una quinta parte del número de caps de LCM y diapositivas en comparación con secciones transversales y acelera considerablemente el proceso de recolección.
Antes de LCM, muestras manchadas y completamente deshidratadas para evitar actividad Rnasa durante la recogida de la LCM. Hemos diseñado un experimento para comparar directamente el efecto de manchas acuosas vs etanol manchas sobre la integridad del RNA. En este experimento, dos secciones intestinales se montaron juntos en una sola diapositiva y se procesaron en una de cuatro maneras, con n = 2-3 biológicos repeticiones por grupo. En el primer grupo, secciones intestinales frescas no se montaron sobre un portaobjetos y cada uno fue transferido directamente en tampón de lisis de RNA usando fórceps libre de Rnasa, previamente enfriado en hielo seco (figura 3A). Para todos los grupos restantes, secciones fueron adheridas a una diapositiva, procesadas, raspadas de la diapositiva usando una hoja de afeitar tratados con solución de Rnasa descontaminación y transferidas al tampón de lisis de RNA con pinzas libre de Rnasa. Un homogeneizador de micro estándar fue utilizado Lyse totalmente las muestras en todos los grupos. En el segundo grupo, las diapositivas fueron procesadas a través de todos los pasos, pero tinte no fue utilizado durante el procedimiento de tinción (figura 3B). Grupo tres se procesó con el protocolo descrito, utilizando tintura de violeta de cresilo en 4% (figura 3C). En el cuarto grupo, se utilizó una tinción acuosa, azul de toluidina siguiendo el protocolo para un kit de tinción de base acuosa con una mezcla de azul de toluidina y la hematoxilina (figura 3D). Después de la extracción de RNA, como se describe, se evaluó calidad de RNA con un Bioanalyzer. La única diferencia entre el acuoso y etanólico protocolos de tinción fue la adición de dos incubaciones de agua (30 s cada uno), inmediatamente antes y después de la tinción, que es necesaria para la absorción y retención del tinte. Encontramos que el proceso de adhesión de las secciones de tejido a la diapositiva y procesamiento con los pasos de deshidratación condujo a una reducción leve, inevitable de la calidad del RNA (figuras 3A-3B), pero que de tinción con el colorante etanol, cresil violeta, no más reducir la calidad del RNA (figura 3C). En contraste, la tintura acuosa, azul de toluidina, condujo a sustancial degradación de RNA, probablemente debido a exposición prolongada acuosa que permite la actividad de Rnasa endógena (figura 3D).
Las únicas formas de ganglios entéricos plantean dificultades para IR-LCM estándar con vidrio convencional diapositivas6 (figura 4A). Cuando utilice diapositivas PEN-membrana (figura 4B), las muestras se adhieren a una hoja fina que se extrae de la mayoría de lo portaobjetos de vidrio. El láser UV atraviesa la muestra y la membrana de la pluma, dando lugar a la separación completa de los ganglios de la diapositiva (figura 4C) y el cumplimiento completo de la tapa de LCM (figura 4D). Deseado de las estructuras de cualquier tamaño y forma (> 10-15 μm) puede ser completamente y precisamente recogidos (Cifrado 4E-4 H). Algunas muestras con menos ganglios por sección, la tapa puede ser ≥ movido cuatro veces antes de recoger. En este caso, dos o tres secciones por diapositiva de montaje minimiza el uso de diapositivas PEN-membrana.
Al aislar el RNA de muestras de LCM para RNA-seq, el objetivo es obtener la mayor calidad posible de RNA y la cantidad, eliminando el ADN todos genómico (gDNA). Para identificar un procedimiento ideal de aislamiento de RNA, se realizó una comparación directa con un Kit de extracción de ARN "A" (figura 5A), Kit de extracción de ARN "B" (figura 5B), o método de extracción de ARN "C" con la limpieza de las muestras de RNA por Kit de extracción de ARN "B" (figura 5C). Después de procesar las muestras con el violeta de cresilo optimizado protocolo de tinción, LCM fue utilizado para recolectar muestras circular estandarizadas (de 500 μm de diámetro) del tejido intestinal, tomado de la capa longitudinal del músculo. Cada tapa se asignaron al azar a cada uno de los tres grupos de aislamiento de RNA, se coloca encima de un tubo de microcentrífuga de 0.5-mL Prellenado con el tampón de lisis respectivo de cada kit. Se siguen las instrucciones exactamente como se describe para cada kit, con Kit de extracción de ARN "Un" tampón de lisis que requieren incubación a 42 ° C durante 30 minutos. De los otros kits, temperatura de incubación fue utilizado durante 30 minutos. Todas las muestras fueron brevemente agitó a además de tampón de lisis. Muestras fueron luego enfriadas en hielo hasta que las extracciones se llevaron a cabo el mismo día (n = 4). Nos encontramos con que Kit de extracción de ARN "B" con un paso de digestión de DNA en columna dio lugar a la más alta calidad de RNA y la cantidad, eliminando con eficacia gDNA (figuras 5A-5C). Lo importante es el tampón de lisis de RNA proporcionado por el Kit de extracción de ARN "B" totalmente descompone mediante lisis los ganglios capturados al recoger los ganglios entéricos(figura 5).
En promedio, nuestras muestras de tienen un RIN de 7.49 ± 0,53 (tabla 2). Partituras RIN mayor de 6-7 se consideran de suficiente calidad para RNA-seq (según el perfil específico de RNA)13, que nos da confianza de que nuestras muestras son de suficiente calidad para RNA-seq. teniendo en cuenta que el RIN para estas muestras, una vez recibida, ha sido de 7.4 a 9.5, estos resultados indican que nuestro protocolo optimizado proporciona excelente preservación de la integridad del RNA. Resultados de calidad representativos del RNA de muestras presentadas para RNA-seq se representan en las Figuras 6A-6 C. Resultados de RNA-seq demuestran que nuestras muestras se secuenciaron con éxito y tienen un sesgo modesto 3'-end (figura 6D). Por lo general, un sesgo al más grande en 3' es favorecido en muestras con bajo RIN14; moderado, este efecto se refleja en nuestras muestras. A pesar de esto, los biotipos de gene observadas fueron en gran parte constantes entre todas las muestras (figura 6E), que indica la confiabilidad de los datos.
Figura 1 . Congelación de tejido intestinal óptima. Cubos de hielo seco (A) están dispuestos en el orden representado; i) mezcla de hielo seco, los tejidos de laboratorio ii) colocados sobre hielo seco, cubo de almacenamiento iii) temporal, iv) envoltura cubo, v) pre-congelador cubo, cubo de desbordamiento vi) pre-congelador. (B) hemos optimizado la congelación rápida de segmentos de tejido en grandes moldes de base colocados en la superficie de una mezcla de hielo seco y 2-Metilbutano. (C) A imagen de más arriba de un espécimen totalmente congelado, observado en la configuración que se muestra en el panel B. Intestinal segmentos se colocan acostadas en un molde de base hacia la mucosa del lado arriba. (D) este método de congelación puede ser fácilmente adaptado para su uso con TFM por preparar el tejido de la misma forma, pero añadiendo TFM al molde base antes de congelarlos. La muestra resultante tendrá un plexo mientérico completamente plana, con una serosa que puede visualizarse fácilmente. (E) ambos preparación de tejido enfoques producen secciones del tejido excelente en el espesor recomendado 8 μm. Aquí se muestra el procedimiento con TFM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Orientación adecuada del tejido intestinal proporciona secciones ricas en ganglios entéricos. Durante la preparación de secciones transversales estándar del intestino congelado (A, B), hay solamente un área pequeña del plexo mientérico (B) presente en cada diapositiva. Muy pocos ganglios entéricos pueden recogerse por portaobjetos, que es lento y costoso. En contraste, la preparación de secciones longitudinales en el plano del plexo mientérico (C), ofrece un área superficial mucho mayor de ganglios (C). Secciones de plexo mientérico se obtienen a partir de la serosa y seccionamiento hacia adentro a través del músculo longitudinal (B). Cuando se aproxima el plexo mientérico, en el cruce de la capa de músculo longitudinal y circular (B), pueden recogerse las secciones seriales del 6-12. Cada sección longitudinal del plexo mientérico contiene grandes áreas de los ganglios entéricos (representados en C, utilizando un procedimiento de tinción modificado, sin xileno, preferentemente manchar los ganglios). Tapas de LCM pueden llenarse a capacidad usando una sección de tejido único. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Tinción con un colorante compatible con etanol mejora la calidad del RNA. Calidad de RNA fue medido por el equipo Bioanalyzer y se muestran resultados representativos de dos muestras de cada grupo. Calidad de RNA inicial había medida de frescas, sin montar las secciones (A, sin tratamiento), tenía un número de la integridad del RNA (RIN) de 8.65 ± 0.07. Para las secciones montadas y procesados a través de todos los pasos, pero sin la mancha (B), RIN era 7.95 ± 0.35. Cuando la tinción con violeta de cresilo 4% fue agregado a los pasos de deshidratación, hubo un efecto insignificante sobre el RIN, con un RIN promedio de 7,87 ± 0.35 (C). En comparación, el uso de la mancha acuosa, azul de toluidina (T-azul) y la adición de enjuagues de agua necesaria para el procedimiento (D) resultó sustancialmente reducida calidad de RNA, con un RIN de 6.45 ± 0.21. Cada grupo estaba formado por n = 3 réplicas biológicas excepción de "No tratamiento" y "T-Blue"(n=2). RINs se divulgan aquí como media ± desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Diapositivas de LCM de membrana de pluma permiten colecciones precisa de ganglios entéricos. Uso de portaobjetos de vidrio ordinario para recoger los ganglios entéricos por LCM tiende a resultar en la recolección de tejido no deseado (A). Los círculos rojos (30 μm de diámetro) indican el tamaño de los puntos de IR LCM utilizados durante el proceso de recolección. La flecha blanca indica una colección de ganglio que tiró un pedazo de tejido muscular adyacente. Diapositivas de pluma-membrana (B), las muestras se adhieren a una hoja fina que se extrae de la mayoría de lo portaobjetos de vidrio. Al cortar con el láser UV-LCM, la muestra y la membrana de la pluma son rebanados, dando por resultado la separación completa de los ganglios de la diapositiva, independientemente de la forma del ganglio (C) y completan adhesión a la tapa del LCM cuando quita de la muestra (D ). Estructuras de cualquiera desea μm de tamaño y forma ≥10-15 puede completamente y precisamente recogidos [(E), inicial del tejido mark-up; Corte del laser (F) IR y UV completada; LCM (G) tapa quitar de sección], como se visualiza en la tapa de LCM (H). El fondo moteado en panel H es inherente a la tapa y no desechos no deseados. La retícula de círculos verdes azul en los paneles E-H es parte del programa de LCM y marcadores de posición para los láseres UV e IR, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Selección de un óptimo equipo de aislamiento de RNA. Se muestran resultados de integridad del RNA después de una comparación simultánea de los tres diferentes procedimientos de aislamiento de RNA. Dos parcelas representativas de cada grupo se muestran para ilustrar la variabilidad que puede ocurrir entre muestras procesadas en paralelo. Kit de extracción de ARN "A" (A) produjo muestras con un RIN de 6,83 ± 0,65 y rendimientos moderados de RNA y tendían a tener contaminación del ADN, a pesar de realizar una digestión de la ADNsa de en columna. Kit de extracción de ARN "B" (B) resultó en el mayor medido RIN, a 8,3 ± 0,1. Mientras que el método de extracción de ARN fenol-basado "C" (seguido por la limpieza de las muestras de RNA con Kit de extracción de ARN "B") (C) parece eliminar gDNA y tenía un RIN de 7,5 ± 0.26, hubo grandes contaminantes de bandas, que puedan haber resultado de la fusión de la polímero adhesivo de la tapa del LCM durante el paso de lisis de RNA. Además, los rendimientos de Kit de extracción de ARN "A" y "C" método de extracción de RNA eran consistentemente más bajos que los obtenidos por el Kit de extracción de ARN "B". Lo importante, el RNA tampón de lisis suministrado por Kit de extracción de ARN "B". (con añadido β-mercaptoetanol) totalmente descompone mediante lisis los ganglios capturados (D). Cada grupo tenía n = 3 réplicas biológicas y se presenta aquí como media ± desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . Resultados representativos. Cuando agrupación de dos tapas de ganglios entéricos por muestra, se obtienen cantidades suficientes de ARN para RNA-seq (> 1 ng) junto con la excelente calidad de RNA. Parcelas representativas de RNA se muestran para una muestra con un RIN de 8.3 (A), 7.5 (B) y 6.9 (C). RNA-seq datos fueron funcionados a través de un programa de evaluación de la calidad, en R. (D) la trama de final sesgo indica que las muestras se secuenciaron con éxito y tienen un sesgo modesto extremo 3'. (E) la trama de biotipo gene también representa que los resultados de secuenciación concuerdan en gran medida entre las muestras. En total, hemos tenido una > tasa de éxito de 95% en la generación de muestras utilizables para RNA-Seq haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Paso | Duración | Propósito |
| Etanol al 95% (-20 oC) | 30 s | Fijación |
| Violeta de cresilo de 4% en etanol al 95% | 10-30 s | De la mancha |
| 75% etanol (con inmersión repetida) | 15-25 s | De la mancha |
| 95% etanol (con inmersión repetida) | 5-15 s | De la mancha |
| 100% etanol | 15 s | Deshidratación |
| 100% etanol (anhidro) | 30 s | Deshidratación |
| Xileno (con inmersión repetida) | 15-20 s | Deshidratación |
| Xileno | > 10 minutos | Deshidratación |
| Deje secar al aire | 1-3 min. | Evaporación de xileno |
Tabla 1. Tinción y Resumen del Protocolo de deshidratación. Esta tabla describe nuestro protocolo de tinción optimizado. Tenga en cuenta que mancha cualquier compatible con etanol puede utilizarse en sustitución de violeta de cresilo, si ofrece mejores resultados. En algunos casos, la duración de la coloración y extracción tendrá que ser extendido o acortado. Generalmente, cuanto más el tiempo de fijación, el más rápido el tejido será completamente mancharse. No hemos notado una reducción de la integridad del RNA después de volver a usar frascos hasta 3 veces durante la preparación de los portaobjetos del mismo segmento de tejido.
| Donantes | Tejido | RIN |
| F | Colón | 7.1, 7.4, 7.2 |
| M | Íleon | 7.2, 6.9 7.8 |
| M | Duodeno | 8.2, 7.4, 7.7 |
| Íleon | 7.4, 7.6 y 7.3 | |
| Colón | 7.7, 7.8, 7.3 | |
| F | Duodeno | 7.1, 7.3, 6.9 |
| Íleon | 7.8, 7.9, 7.6 | |
| Colón | 7.3, 8.0, 7.5 | |
| M | Íleon | 6.9, 6.7, 6.9 |
| Colón | 6.8, 6.4, 6.6 | |
| M | Íleon | 7.2, 7.3, 7.6 |
| Colón | 6.7, 7.6, 7.7 | |
| M | Íleon | 8.3, 7.8, 7.4 |
| Colón | 7.0, 7.4 7.0 | |
| F | Duodeno | 8.3, 8.8 8.0 |
| Íleon | 8.0, 8.1, 7.8 | |
| Colón | 8.4, 8.6 7.1 |
Tabla 2. Resultados representativos en RNA integridad. Las muestras que aparecen en esta tabla se obtuvieron de los ganglios entéricos humanos. Todas las muestras seleccionadas tienen suficiente calidad de RNA y cantidad para el análisis de RNA-seq. El RIN promedio de todas las muestras listadas en esta tabla es 7.49 ± 0,53. Concentración de RNA también se midió usando el análisis Quant-iT RiboGreen y todas las muestras que se muestra en esta tabla han reunido la cantidad mínima necesaria para nuestro RNA-seq (> 1 ng) experimentos. Pequeñas cantidades pueden utilizarse, dependiendo del procedimiento de amplificación previa. Sin embargo, tales procedimientos son más confiables cuando uno espera hay ser grandes diferencias en la expresión génica entre las muestras o grupos que se comparan; de lo contrario estos resultados pueden enmascarar diferencias verdaderas en algunas aplicaciones de RNA-seq. Por lo tanto, se recomienda generalmente comenzar con más material cuando sea posible.
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Discussion
Este procedimiento permite la eficiente recopilación de numerosos ganglios entéricos como fuente para obtener RNA para RNA-seq. Aquí, hemos acelerado los procesos descritos en los protocolos existentes al máximo preservar integridad del RNA. Como todos los pasos de este procedimiento son interdependientes, es importante eliminar todos los problemas desde el inicio del estudio y que todas las muestras se preparan como semejantemente uno al otro como sea posible, para obtener confiable RNA-seq.
Desde el inicio del procedimiento, integridad del RNA puede ser afectada negativamente si el intervalo de tiempo (tiempo frío isquémico) entre colección de tejido en el momento de la donación de órganos y recibo de tejido para su procesamiento en el laboratorio es demasiado largo. Dada esta preocupación, nos sorprendió que RNA de alta calidad todavía puede ser extraído de muestras intestinales, incluso después de 24 horas de frío isquémica. Cuando las muestras intestinales son enfriadas y almacenadas adecuadamente en la solución de almacenamiento en frío, hay excelente protección de la integridad del tejido y calidad de RNA. Se requiere que el tejido intestinal es lavado en colección por el equipo de colección de órgano, para limitar la exposición del intestino a las enzimas digestivas, RNasas y otras moléculas que podrían tener impacto calidad de RNA durante este período. Hemos encontrado que cuando la muestra intestinal no se vacía completamente, esto puede reducir considerablemente RIN de la muestra.
Con nuestro procedimiento optimizado para la preparación de las muestras de tejido intestinal, que son capaces de evitar incorporar muestras en TFM. Porque TFM interactúa con etanol y xileno para formar un precipitado marrón oscuro que interfiere con la visualización de ganglios entéricos, preferimos excluir de nuestras muestras. Sin embargo, cuando se trabaja con tejido intestinal de ratones u otras especies, la exclusión de TFM no es posible. En este caso, hemos experimentado con la eliminación de TFM de una sección adherida sobre un portaobjetos. Si el tejido tiene una superficie suficiente, etanol (frío a-20 ° C) puede ser gotee sobre el portaobjetos con una pipeta de transferencia para fijar rápidamente el TFM, lo que le permite eliminar con fórceps. Gotas de etanol sobre las diapositivas evita la acumulación de TFM en el frasco de etanol, que puede exacerbar el efecto dorado cuando se procesan varias diapositivas.
Durante la congelación de flash, privilegiamos usando una mezcla de hielo seco con 2 MB, en lugar de etanol al 100%, pues 2 MB se evapora fácilmente al aterrizar en la superficie del tejido. Etanol tiende a evaporar más lentamente, especialmente cuando se combina con TFM, formando un residuo químico en el bloque de tejido que no se pueden quitar fácilmente. Etanol y la MB 2 tienden a fizz y Gore vigorosamente al congelar en pequeños recipientes de congelación, porque el pequeño volumen de la mezcla de hielo seco tiene una capacidad de bajo calor específico. En su lugar, utilizando una cubeta rectangular grande con hielo seco molida proporciona una masa grande de refrigeración y evita las fluctuaciones de temperatura y es congelar el tejido.
Como se mencionó, a veces es más fácil obtener hojas continuas de ganglios entéricos de algunas muestras de tejido en relación con otros. Lógicamente, la velocidad general de LCM está sujeta a variabilidad dependiendo de las características del tejido de origen o la región intestinal siendo muestreado. Por esta razón, a menudo es mejor preparar muchas muestras frescas congeladas en el inicio. Generalmente encontramos que un total de 20 muestras por segmento de intestino (~ 2 cm x 1,5 cm, cada uno) es mucho más que suficiente para proporcionar suficiente RNA para aplicaciones posteriores. Sin embargo, si sólo existe una pequeña longitud de tejido intestinal, se recomienda una longitud mínima de 5 cm. Con nuestro enfoque, el rendimiento más bajo que se obtendría sería entre 18-30 ng de ARN, como se explica a continuación. La longitud mínima de 5 cm se puede potencialmente reducir, dependiendo de la aplicación, especialmente si se utilizan altas cantidades de preamplificación de cDNA. Estos parámetros no fueron probados en el presente estudio. Por ejemplo, los ganglios entéricos han sido recogidos de muestras de biopsia intestinal de espesor completo (2 x 2 cm) para el uso con qPCR4.
Como demostramos en este estudio, el uso del tinte compatible con etanol, cresil violeta, ofrece mejor protección de la integridad del RNA que la mancha acuosa, azul de toluidina. Cuando sumergida en etanol, RNasas se vuelven inactivos5,15. Sin embargo, RNasas todavía pueden recuperar su función una vez expuesta al agua7,15. Cuando la coloración con tintes acuosos, el tejido debe estar expuesto a agua libre de nucleasa para casi 1 min9, que conduce a la degradación de RNA substancial. Cuando se utiliza la tinción de toluidina azul tejido, hemos podido reducir la exposición al agua antes y después de la tinción, ya que dichas modificaciones también reducción la absorción y retención de toluidina azul, respectivamente. También se ha encontrado un problema similar con un tinte a base de hematoxilina9. En el protocolo modificado descrito aquí, tinción con violeta de cresilo evita la exposición directa de las muestras intestinales de agua, lo máximo preservar integridad del RNA. Estos resultados eliminan la necesidad de inhibidores de la Rnasa adicionales en la solución de tinción. Encontramos que estos inhibidores son ineficaces en la que permite el uso de la tintura acuosa, azul de toluidina como interfirió con la absorción y retención del tinte.
Cuando inicialmente optimizando nuestro protocolo de tinción, que fueron incapaces de reproducir los resultados obtenidos en otros protocolos y reporta5,7,8,11. Mientras que la razón de esto es confusa, encontramos varios factores que llevaron a inconsistente teñir-absorción y retención. Por ejemplo, aunque ciertos protocolos con éxito han manchado tejido con violeta de cresilo en 100% etanol8 o en etanol 75%5, el tinte sólo débilmente marcados los ganglios o tenía antecedentes de alta, en comparación con uso de cresil violeta en etanol al 95%. Por último, el porcentaje de cresil violeta utilizado en la solución de tinción es también muy importante. Mayoría de los protocolos recomienda un 1% solución violeta de cresilo en7,8, pero esta concentración no presentó coloración confiable en nuestras manos, incluso después de la tinción de secciones de hasta 2 minutos. Hemos tenido éxito mejor tinción con una solución de coloración saturada clarificada del 4% de violeta de cresilo11 aplicado a la muestra a través de un filtro de jeringa estéril8. Esta solución saturada permite mucho más rápido de tinción de la muestra, en tan poco como 10-15 s. fijación previa de la muestra en etanol al 95% frío (a-20 ° C) permite una absorción más rápida de la mancha.
Otro informe encuentra que los ganglios entéricos más claramente fueron manchados en secciones intestinales humanas fresco congelado cuando se combina el violeta de cresilo con eosina en una solución de etanol 75%5. Sin embargo, encontramos que según hace más difícil identificar los ganglios y eso violeta de cresilo, sola, ofrece detección superior. En un estudio, se encontró que una solución violeta de cresilo previstas consistentes resultados de tinción de tejidos de cáncer de endometrio10. Sin embargo, encontramos esto no ofreció ninguna mejora para el tejido intestinal humano y también podría no aplicarse cuando se utiliza etanol al 95% para la solución de tinción.
Hemos probado una serie de condiciones en que el protocolo puede pausado y reanudado más tarde. Muchos protocolos indican secciones de diapositivas antes de tiempo y volver a congelarlas a-80 ° C inmediatamente después del montaje en la diapositiva5,9. Con este enfoque, la coloración y la LCM puede entonces reanudar la próxima semana, ofreciendo gran flexibilidad. Sin embargo, no sólo esto grandemente interferir con la tinción; también redujo la integridad del RNA en nuestras manos (datos no mostrados). Para evitar este problema, Grover et al. recomendamos coloración y deshidratación de las secciones antes de almacenar en el congelador11. En este enfoque, son manchadas y deshidratados (como en la tabla 1) hasta el paso de etanol anhidro 100% (protocolo sección 5.2). Luego, las muestras se incuban en un segundo frasco de etanol anhidro 100% por 10 min y se transfieren inmediatamente a un tubo cónico con gel desecante, que es enfriada en hielo seco y transferido en el congelador de-80 ° C. Al extraer muestras del congelador, diapositivas se introducen inmediatamente en etanol anhidro 100% para 30 s y secado al aire antes a realizar LCM11. Por desgracia, en nuestras manos, este enfoque reducido RIN de 0.6-0.8 (datos no mostrados). Por lo tanto recurrió a realizar todo seccionamiento, coloración y LCM en el mismo día con el fin de obtener la máxima integridad del RNA en nuestras condiciones. Esto resulta para ser un proceso desperdiciador de tiempo, pero 10-14 casquillos de LCM pueden llenarse durante trabajo un día completo de.
El punto más confiable en el que puede hacer una pausa nuestro protocolo es el paso de incubación de xileno. Diapositivas se han quedado en xileno (con tamices moleculares) para hasta 4-5 h sin ningún efecto aparente sobre la integridad del RNA. Hemos encontrado que cuando se preparan tres diapositivas a la vez, todo puede ser procesado con LCM en este plazo, aunque es necesario un descanso de hora. Una opción alternativa es desecar diapositivas después de la coloración y deshidratación pasos dentro de un exicator sellados16, pero todavía no hemos intentado este acercamiento.
Aislamiento de RNA es otro paso crucial en el procedimiento, con los más importantes factores ser: obtener el máximo rendimiento posible del ARN, el espectro completo del RNA (sin pérdida de especies más pequeñas de RNA)17,18, de retención y eliminar por completo de ADN genómico de la muestra17. En nuestras manos, Kit de extracción de ARN "B" proporciona el mejor resultado con nuestras muestras, ya que ofrece mayores rendimientos y fue más eficiente en la eliminación de ADN genómico. Nuestras observaciones sobre las diferencias en rendimientos entre reactivos de extracción de RNA están consistentes con informes anteriores17,18. Sin embargo, también hay muchos estudios de LCM que han divulgado éxito con otros RNA extracción reactivos19,20. Informes anteriores indican también que los procesos de extracción de RNA base de columna ofrecen mejor retención de pequeñas moléculas de ARN que de métodos de extracción de ARN fenol-basado18 como pequeñas moléculas de ARN se pueden perder en el sobrenadante durante la precipitación de RNA a unos pasos.
Observamos que los almacenadores intermediarios de la lisis RNA que utilizan tiocianato de guanidinio, con agregados de β-mercaptoetanol es altamente eficaz en remover todos los ganglios capturados de la tapa del LCM(figura 5). Mientras que la mayoría protocolos LCM no sugieren Vortex lisado, hemos encontrado que produce excelentes resultados y no lleva a la degradación del RNA. También proporciona una probabilidad aún mayor que todos los capturaron los ganglios se liberará de la tapa para la extracción de RNA. Utilizando estos métodos, generalmente obtenemos rendimientos del RNA de LCM de ganglios entéricos en el rango de 1.8 a 18 ng/cm2 de tejido intestinal, dependiendo de cuántos ganglios están presentes en una diapositiva determinada. Nuestro procedimiento de RNA-seq requiere una entrada mínima de 10 ng ARN, pero otros procedimientos pueden tener mucho RNA inferior si el procesamiento de una secuencia incluye un mayor número de ciclos de amplificación previa. La superficie total del tejido almacenada de la preparación y el proceso de congelación flash es 40-60 cm2, que proporciona un amplio RNA para cDNA biblioteca y aplicaciones de RNA-Seq de bajos insumos.
Mientras que nuestro procedimiento es diseñado para la colección de ganglia entérico enteras, el enfoque puede ser fácilmente modificado para la colección de neuronas individuales, o glia, si desea5. Sin embargo, debido a procesos gliales densamente ensheath neuronas de la ENS, RNA glial será incluidas junto con el ARN de neuronas capturados, aunque en cuentas más bajas. Esto plantea problemas cuando se intenta identificar neuronales transcripciones expresadas en un número de copia baja. Sola célula RNA-seq ofrece la mejor precisión y detección en este sentido, pero requiere las neuronas disociarse del tejido intestinal, teñidas con marcadores pan-neuronal y aislado con citometría de flujo21 o identificado de conjunto intestinal dissociations después de clasificar con la bioinformática enfoques. La desventaja de la mayoría de los estudios disociación es que la mayoría de los protocolos requiere que la muestra se incubó a temperatura ambiente o 37 ° C por períodos prolongados, que se sabe alteran el transcriptoma3. Recientemente, la proteasa activa fría del bacilo licheniformis se ha utilizado para la generación de suspensiones celulares solo para tejidos de ratón y es posible aplicar esta enzima para la disociación de los tejidos humanos a 4 ° C22. Hasta que se logra tal optimización, LCM de tejido humano congelado fresco es un medio sólido para captura RNA para los perfiles de expresión de los elementos del sistema nervioso periférico como ganglios entéricos.
En Resumen, hemos desarrollado un protocolo confiable y consistente para la colección de ARN desde los ganglios entéricos humanos. Hemos optimizado la preparación de tejido intestinal humano, tinción, proceso de LCM y basado en numerosas publicaciones y protocolos de la extracción de RNA. También hemos demostrado la fiabilidad de este enfoque en la recolección de las muestras de RNA de suficiente calidad de RNA para RNA-seq. Este protocolo se puede aplicar ampliamente a los tejidos de pacientes con un número de enfermedades gastrointestinales y puede ser fácilmente adaptado para el uso con modelos de roedores, lo que ofrece una estrategia confiable para el desarrollo de nuevas terapias.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a los donantes y sus familias que hicieron posible este trabajo. También agradecemos la asistencia de personal en el Instituto Internacional de medicina y servicios de donantes de Tennessee para ayudar a coordinar colección de tejido utilizado en este estudio. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los institutos nacionales de salud, NIH OT2-OD023850 a EMS2 y estipendio apoyo de NIH T32-DK007673 al AMZ. Agradecemos al personal de Vanderbilt traslacional patología compartida del recurso de acceso al instrumento de LCM y asesoramiento sobre la preparación de tejido. El recurso de compartido de patología de tejido Vanderbilt es apoyado en parte por subvenciones de NIH P30-CA068485-14 y U24-DK059637-13. Agradecemos el genoma tecnología centro de acceso en el Departamento de genética de la escuela de medicina de la Universidad de Washington ayuda con análisis genomic. El GTAC es parcialmente apoyado por NCI cáncer centro apoyo beca #P30 CA91842 al centro de cáncer Siteman y por TIC/CTSA Grant #UL1TR002345 del centro nacional para recursos de investigación (NCRR), un componente de los institutos nacionales de salud (NIH) y los NIH Hoja de ruta para la investigación médica. Esta publicación es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de NCRR o NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
- Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
- Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
- PALM Protocols - RNA handling. , ZEISS. Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011).
- Schlaudraff, F. L. M. Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015).
- Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
- Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
- Potter, S. S., Brunskill, E. W. Laser capture. Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).
- Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
- Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
- Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
