Summary
Bu iletişim kuralı, enterik gangliyon lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak sabitlenmemiş, taze rezeke insan bağırsak dokusundan izole yüksek bütünlük RNA örnekleri almak için hedeftir. Bu protokol flaş donmuş örnekleri insan bağırsak dokusu, cryosectioning, ethanolic boyama ve dehidratasyon, LCM, hazırlanıyor içerir ve RNA çıkarma.
Abstract
Bu yöntemin amacı enterik gangliyon lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak sabitlenmemiş, taze rezeke insan bağırsak dokusu toplanan yüksek bütünlük RNA örnekleri elde etmektir. Biz RNA yalıtır enterik gangliyon yeterince yüksek kalite ve miktar üzerinden RNA-devamı için almak için çok önemli beş adım iş akışında belirledik Öncelikle, bağırsak dokusu hazırlanırken, her örnek serosa mümkün olduğu kadar büyük temel kalıpları alt kısmında düzleştirme önce Blot tarafından kaldırıldı tüm aşırı sıvı olması gerekir. Örnekleri daha sonra hızlı bir şekilde Kuru buz ve 2-methylbutane bir bulamaç donmuş. İkinci olarak, ne zaman doku kesit, cryomolds bağırsak bölümler böylece slayt başına enterik gangliyon en büyük yüzey alanı verimli myenteric pleksus tam boyutunda paralel şekilde konumlandırmak önemlidir. LCM, polietilen napthalate (kalem) sırasında üçüncü-membran slaytlar teklif en büyük hız ve enterik gangliyon toplarken enterik gangliyon üniform olmayan şekiller anahat oluşturma esnekliği. Dördüncü olarak, enterik gangliyon bölümleri içinde farklı görselleştirme için etanol uyumlu boya, kresil mor gibi sulu boya göre RNA bütünlüğünü mükemmel koruma sunuyoruz. Son olarak, yakalanan gangliyon gelen RNA çıkarılması için biz DNA kirlenme ayrıcılıklarına olan üstün RNA miktarı vermiştir ticari RNA ayıklama kitleri ve kalite arasındaki farklar görülmektedir. Geçerli protokol bu faktörlerin en iyi duruma getirme büyük ölçüde iş akışını hızlandırır ve enterik gangliyon örnekler olağanüstü RNA kalite ve miktar ile verimleri.
Introduction
Bu yöntem yüksek kaliteli RNA örnekleri enterik gangliyon lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak insan bağırsak dokusundan elde etmek için tasarlanmıştır. Burada açıklanan Protokolü (RNA-seq) sıralama RNA için yeterli RNA kalite ve verim sağlamak için en iyi duruma getirilmiş ve taze rezeke, sabitlenmemiş, flaş donmuş insan bağırsak dokusu ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır.
Fonksiyonel gastrointestinal ve gut motilite bozuklukları her dört kişi Amerika Birleşik Devletleri'nde etkiler. Gut homeostazı ve hareketliliği çok önemli bir rol oynar gibi enterik sinir sistemi (ENS), ikinci beyin1olarak da sık sık bu bozuklukların merkezinde bulunur. Bağırsakları manipülasyon genellikle cerrahi rezeksiyon aganglionic/noncontractile doku, kronik diyet değişiklik ve/veya ilaçlar için sınırlama getirildi. Doğal olarak, Yetişkin ENS tam transcriptome sıralı için büyük ölçüde molekülleri pharmaceutically hedef veya kök hücre tedavileri içinde kullanılan ENS içinde tanımlama yeteneği bizim sınırlama kalır.
RNA insan enterik gangliyon izole için nispeten daha az sayıda yöntem vardır. İlk yaklaşım, hücre ayrılma2, yüksek inkübasyon sıcaklığı ve uzun bir kuluçka kez gerektirir; hem hangisinin RNA bozulma teşvik ve transcriptome2,3alter bilinmektedir. Alternatif bir yaklaşım, LCM, daha güvenilir bir şekilde transcriptome korur ve RNA bütünlüğünü korur. Her ne kadar birçok araştırma-si olmak kullanılmış LCM gangliyon taze donmuş insan bağırsak dokusu4,5,6toplamak için bu yaklaşımlar ya zavallı RNA kalite ve miktar tarafından engel, oldukça emek yoğun, ya da boyama veya RNA ayıklama teknikleri bizim ellerimizde çalışmak için değişiklik gerekli. Ek geliştirmeler7,8, ama uyum ihtiyaç vardı enterik gangliyon8, yalıtım için uygulandığında kılavuzları sağlanan LCM ürün bulundu RNA korumak için tasarlanmış diğer LCM protokolleri 9. bu nedenle, o yüksek bütünlük RNA'ın önemli miktarlar insan enterik gangliyon verimleri, nispeten hızlı bir iş akışı olan ve büyük bir tutarlı sonuçlar bu kaynaklara göre en iyi duruma getirilmiş bir protokol geliştirdiğimiz örnekleri sayısı.
Bu çalışmada, enterik gangliyon rezeke insan bağırsak dokusundan kaynaklandığı gelen yüksek bütünlük RNA izolasyonu kolaylaştırmak en iyi duruma getirilmiş yordamlar bir özetini sunuyoruz. Bizim Yöntem beş önemli yönleri içerir. İlk, taze rezeke, sabitlenmemiş insan bağırsak örnekleri kesilmiş boyutu için bir laboratuvar doku ile kaldırıldı ve flash-dondurucu bir bulamaç Kuru buz ve 2-methylbutane (2 MB) üstüne önce büyük bir temel kalıp basık tüm aşırı nem. İkinci, histolojik kesitler bağırsak myenteric pleksus enterik gangliyon büyük bir yük sunmaktadır bir slaytta tam boyutunda elde etmek için hazırlanmalıdır. Başarı ile bu adım doku hazırlık süreci büyük ölçüde bağlıdır. Üçüncü olarak, ENS gangliyon nonuniform yapısını en büyük hız ve kesinlik LCM işlemi sırasında sunan polietilen napthalate (kalem) membran slaytlar6, kullanımını gerektirir. Dördüncü olarak, etanol uyumlu boya, kresil mor gibi enterik gangliyon boyama sırasında RNA bütünlüğünü korumak için kullanılır. Son, RNA ayıklama işlemi RNA-devamı ile başarılı bir sonuç için önemlidir Biz yüksek RNA bütünlük üretir, enterik gangliyon küçük koleksiyonları ile başlatma sırasında RNA verimi en üst düzeye çıkarır, DNA kirlenme ortadan kaldırır ve mümkün olduğunca çok sayıda RNA türler korur bir RNA ayıklama yaklaşım aradı.
Birlikte ele alındığında, mevcut çalışmada bu faktörlerin en iyi duruma getirme büyük ölçüde iş akışını hızlandırır ve olağanüstü RNA miktarı ve kalitesi ile enterik gangliyon örnekleri verir. Sonuçlar büyük ölçüde bu yaklaşım tutarlılığını gösteren örnekleri, oldukça büyük bir grup arasında tutarlı olmuştur. Ayrıca, başarılı bir şekilde enterik gangliyon RNA örnekleri onlarca sıralamak için bu yaklaşımlar kullandık. Burada vurgulanan stratejileri de genel olarak istenen gangliyon LCM veya periferik ve santral sinir sistemi ve yüksek kaliteli RNA izolasyonu gerektiren diğer durumlarda çekirdekleri gerçekleştirmek için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm iletişim kuralları Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB tarafından) onaylanmış olması.
1. doku varıştan hazırlık
- Uygun IRB onay aldıktan ve bunlar çalışma için gerekli tüm araştırma ölçütlere uyan donör taze rezeke, sabitlenmemiş bağırsak dokusu elde etmek için insan organ bağışı kuruluşları ile koordine.
Not: Bu protokol fareler ve diğer kemirgen modelleri ile kullanmak için adapte edilebilir.- Hemen rezeksiyon bağırsak her segmentin luminal malzeme veya dışkı kaldırmak için soğutulmuş PBS ve doku BIRIMI lümen kanül.
- Sonra kızarma ve atık bir uygun biohazard receptacle atarak, doku-depolama ortamına (örneğin, 3 - 5 kez bağırsak doku hacmi) yeterli bir cilt dokusunda daldırın ve tek tek etiketli, su geçirmez plastik depolamak Konteynırlar, buzun içinde sular altında veya kullanım kadar buzdolabında).
- İşlem doku toplama önemli RNA yıkımı önlemek için zaman 18-26 saat içinde.
Not: bağırsak segment ve depolama temizlik bağlı olarak bizim önerilen süre uzatmak mümkün olabilir.
- Bu protokol için belirtildiği gibi insan dokusu toplamalarında peşin, gerekli tüm malzemeleri hazırlamak (daha ayrıntılı ürün bilgileri için Malzemeler tablo bakın). Gerekli tüm kişisel koruyucu ekipman her zaman giyilen emin olun.
- Kuru buz kovaları ile birlikte bir kuru buz Bulamaç Şekil 1' de gösterildiği gibi hazırlayın.
- 4 standart dairesel buz kovaları ve bir dikdörtgen buz kovası doldurmak için yeterli Kuru buz ezmek. Bir standart kova küçük (11 x 21 cm) laboratuvar olması gereken dokulara yerleştirilen Kuru buz yüzeyde. Mümkünse, yeni, açılmamış kutular laboratuvar dokuların kullanın.
- Kuru buz Bulamaç Kuru buzun içinde temiz dikdörtgen bir buz kovası 2 L powderizing tarafından olun.
- Önceden soğutulmuş 2 MB kadar kuru buz yüzeye ekleyin. Biraz karıştırın ve bir pipet ucu kutusu kapak Bulamaç şekil yüzeye daha büyük dikdörtgen kova kenarlarında Kuru buz parçalarını çevrili bir kanal içine kullanarak Bulamaç düzleştirin.
- Daha hızlı donma teşvik etmek için bir yer kuru buz buz kovası kenarları boyunca birkaç ince bloğunu. Oda gevşek Kuru buz Bulamaç kova içinde belirli bir zamanda sığacak şekilde ≥4 temel kalıpları için olmalıdır.
- İsteğe bağlı olarak, yığın başka bir dikdörtgen buz kovası içinde buz kovası ¼ Kuru buz ile dolu. Bu konumlandırma daha iyi Kuru buz Bulamaç izole etmek yardımcı olur ve işlem sırasında sık sık ayarlamalar Kuru buz ve 2 MB gereksinimini engeller.
- Şu sırada bir montaj hattı içinde kuru buz kovaları getirin: 1) Kuru buz Bulamaç kova, 2) laboratuvar doku-Kuru buz Kovası, 3 & 4) normal Kuru buz kovaları, 5) dikdörtgen Kuru buz kovası (Şekil 1A).
2. Flash donmuş insan bağırsak dokusu hazırlanması
Not: Bu sürecin bağırsak doku kalitesi bağlı olarak bağırsak kesimi başına 45-80 dk arasında sürebilir. Ayrıca RNA kalite ve histoloji LCM işlemine devam etmeden önce değerlendirmek için kalite kontrol örnekleri toplama öneririz.
- Büyük bir tepsi ıslak buz ile doldurun ve cerrahi kesme tahtaları Kuru buz üstüne yerleştirin.
- Bu kurulum, doku ve kesilmiş parça soğuk depolama çözümünde depolamak için bir 500 mL ve 100 mL kadehler chill. Böylece doku almaya hazır ön sakin Bankası kesme tahtası üzerinde kalıpları.
- Taze bağırsak dokusu aldığında, hangi doku taşınır medya dökün ve önceden soğutulmuş şişeler içinde saklayın. Bu kadehler bağırsak dokusu ve sonraki adımlar hazırlanmış olabilir kesilmiş parçalar, geçici depolama için biraz yer bırakın.
- Bağırsak kesimi yaklaşık 20 RNA için aşağı akım uygulamaları oluşturmak için yeterli doku (40-60 cm2) ve kalite kontrol örnekler sağlayan cm uzunluğunda, için kesti. Doku bütünlüğü bağlı olarak RNA izolasyon çok daha küçük bir uzunluk (Yani, bağırsak 5 cm) ile aşağı akım işleme gerçekleştirmek için uygun olabilir.
- Dış görev yağ ve bağ dokusu cerrahi makas kullanarak bağırsak üzerinden kırpın. Artık bağırsak serosa adipose doku sonraki adımda tamamen dümdüz yeteneği ödün vermez. Dikkatlice böylece yağ ve bağ dokusu, yapısal olarak myenteric pleksus zarar verebilir veya düzensiz kesit için Düzleştir'i dış doku yapmak kaldırma sırasında serosa nicking önlemek için doku, kırpın.
- Bağırsak örnek, tercihen mezenterik eki sitenin tüm uzunluğu boyunca uzunlamasına bir kesi yapmak.
- Uzak incelemek ve böylece daha kolay, gerginliği serbest bırakılması üzerine düzleştirir tenia coli kolon, üzerinden atmak.
- Bağırsak mukoza tarafı aşağı soğuk kesme tahtası edebilir ve doku tam uzunlukta 1,25 cm çapında şeritler kesti.
Not: Bu boyut buna göre ayarlanması gereken bu yüzden bağırsak dokusu kez kırparak sonra genişletir. - Geçici olarak şeritler soğutulmuş doku-depolama çözümünde saklamak.
Not: uzun bir raf ömrü vardır, nispeten düşük maliyetli olduğundan ve oda gerekinceye kadar sıcaklıkta depolanan biz Belzer UW soğuk depolama çözümü kullanın. - Bir doku şerit soğuk hava deposu çözümden kaldırmak ve segmentleri ~1.5-2 cm uzunluğunda kesti.
- Hızlı bir şekilde aşırı sıvı kaldırmak ve flash-donma sırasında buz kristalleri boyunca bağırsak serosa oluşumunu engellemek için laboratuvar mendil, bir yığın bağırsak kesimlerinde leke. Eğer doku yeterince kuru değil, yüksek kaliteli bölümler myenteric pleksus elde etmek zor olacak.
- Fotoğraflarda bağırsak adet mukoza tarafında bir önceden soğutulmuş, büyük, tek kullanımlık plastik temel kalıp (37 x 24 x 5 mm) üzerine yığmak.
- Dikkatle her kesimi hafifçe doku temel kalıp yüzey üzerinde uzanan ve hafifçe bastırın ve serosa altında sıkışmış herhangi bir hava kabarcıkları kovmak için eğri forseps kullanarak düzleştirin. Not doku düzleştirme sırasında genişletir. Gerekirse, segmentleri döşeme ve kalan örnekleri daha küçük bir boyutta kesilmiş.
Not: Doku aşırı gergin ise, bu myenteric pleksus bozar. Tüm hava kabarcıkları kaldırıldıktan sonra donma önce örnek kalınlığı değerlendirmek. Bağırsak örnek özgün kalınlığı yaklaşımlar kadar gerekirse, numune içe kenarlarına itin. - Yüklü temel kalıp Kuru buz, 2 MB Bulamaç yüzeyine yerleştirin. Doku boyutu ve kalınlığı bağırsak segmentin bağlı olarak 30-60 s içinde tamamen dondurun.
- Kalan 2 MB temel kalıp Kuru buz ikinci kovaya önceden soğutulmuş laboratuvar dokular üzerinde sürtünme hızlı bir şekilde kaldırmak için temel kalıp alt kuru.
- Kurutulmuş örnek Kuru buz üçüncü küvete aktarmak ve kaplanabilir hazır olması ne kadar kuru buz yüzeyinin altında göm.
- Hızlı kaydırma, numune hazırlama kalitesini incelemek için önce temel kalıp alt gözlemlemek. Bunlar-meli var olmak kaçmak için cryosectioning ve LCM gibi değil düz görünür veya büyük hava kabarcıkları, herhangi bir örnek not alın.
- Örnek bir demet Kuru buz üstüne koydu, böylece tamamen donmuş muhafaza süre kaydırma doku oluşur önceden etiketli alüminyum folyo şal.
- Örnek bir tabaka ile doku dehidratasyon-80 ° C'de depolama sırasında en aza indirmek için plastik wrap, wrap
- Kadar derin dondurucu için taşınacak hazır örnekleri dikdörtgen kova içinde saklayın.
- Önceden etiket ve anında depolama için-80 ° C'de derin dondurucu kutularca örnekleri toplandıktan sonra önceden chill.
- Doku LCM iletken önce RNA bütünlük değerlendirilmesi için bağırsak her kesiminden küçük bir bölümünü al.
- Ön etiket RNase free bir 2mL tüp her kesimine lizis arabellek ≥500 µL ile dolu. RNA ekstraksiyon kiti "D" Malzemeleri tablodalistelenen, kullanmanızı öneririz.
- Bir çift doku mikro-homogenizer (20-40 sn, hiçbir doku parçaları kalıncaya kadar) bağırsaklarda bir küçük (2 x 2 mm) parça lunaparkçı. O zaman, hemen RNA lysate Kuru buz ve mağaza-80 ° C'de RNA ayıklama işlemine devam etmeden kadar dondur.
- İsteğe bağlı olarak, bazı bölümlerin doku dondurma Orta (TFM) bir yedekleme gömün. Bu bölümde açıklanan aynı şekilde doku bölümleri hazırlamak ama TFM örnekleri flaş donma önce temel kalıp içinde daldırın.
3. Cryosectioning
- Daha önce cryosectioning, boyama ve dehidratasyon tüm gerekli malzemeleri hazırlamak ve istenilen doku örnekleri-80 ° C dondurucudan Kuru buz bir kova içine aktarın.
- Cryostat kullanmak için en uygun kesme sıcaklığa (-18-22 ° c) ayarlama ve yüzeyler % 100 etanol ile aşağı silme ve bıçak tedavi hazırlamak ve tepsi RNase Dekontaminasyon solüsyonu ile fırça.
- En iyi örnek Chuck uymaları, aşağıdaki yöntemi kullanın.
- Kuru buz için en az 30 koyun forseps bağırsak örnek unwrapping ve kuru buz serosa-yan-up yüzeyde yerleştirerek önce s.
- 3-5 mm Höyük doku dondurma Orta (TFM) bir büyük cryostat numune tutucu dökün ve hemen bağırsak örnek serosa-yan-up TFM üzerine aktarın.
- Hızlı bir şekilde örnek sahibi Kuru buz ve kapak powderized Kuru buz ile Oda sıcaklığında 2-5 s için örnek uyacak TFM sonra transferi sağlayan. TFM myenteric pleksus uçak altında kalmasını sağlamak.
Not: örnek çözdürme olmadan dondurmak TFM başlamadan önce ideal olarak, bağırsak mukoza dış yüzeyine tam TFM için uygun olacaktır.
- Numune sahibi cryostat'ın numune aklına takmak ve myenteric pleksus uçak için kesici bıçağın paralel olacak şekilde örnek cryostat bıçakla hizalayın.
- Parça kalınlığı 8 µm için cryostat olarak ayarlayın. Mükemmel örnek hizalama amacı en büyük olası yüzölçümü myenteric pleksus her bir slayt üzerinde elde etmektir. Bu kalınlık genelde insan ve kemirgen doku için önerilir, ancak gerektiği gibi ayarlanabilir.
- Bölüm serosa ve myenteric pleksus ulaşan kadar boyuna kas.
- Myenteric pleksus bulmak için bir örnek bölüm bir slayt üzerine monte ve Bölüm %1 kresil menekşe veya toluidin blue, vbgibi bir sulu boya lekesi.
- Boyuna ve dairesel kas tabakaları arasında bağlantı tanımlamak için 40-2000 X büyütme, hafif bir mikroskop altında bölümüne bakın. Mikroskop parametreleri Tablo malzemeleritemin edilmektedir. Kesit başında serosa bağ dokusu varlığı ile işaretlenir. Kalan bazı mezenterik yağlı de serosa gözlenebilir. Bir sayfa dış boyuna kas tabakasının sonra başlar. Boyuna ve dairesel kas tabakaları arasındaki sınır aşıldığında, enterik gangliyon bir kısmını tespit edilecektir.
Not: sonraki birkaç bölümlerde myenteric pleksus çok belirgin, tek bir bölüm (Şekil 2C) içinde mevcut olan gangliyon büyük tarama alanı haline gelecek. Doku kesit başında tamamen düz değilse, gangliyon yalnızca bir bölümünü herhangi bir anda her bölümünde mevcut olacaktır. Bazı durumlarda, bağırsak örnek mükemmel düz görünen doku rağmen bir doğal olarak dengesiz myenteric pleksus gerekebilir. Bu oniki parmak bağırsağı örnekleri için özellikle doğrudur. Deneyim, bu örnekler LCM ile işlemek için uzun zaman alabilir ancak yeterli RNA tek bir günlük oturum içinde toplanır. Myenteric pleksus tam konumunu örnek, doku ve onun hazırlık donma önce dayalı arasında önemli ölçüde değişebilir.
- Seri bölümler neurons ve glia slayt başına en yüksek sayıda sağlayan en iyi koleksiyonları ile LCM için toplama başlar. Örnek yüzey alanı bağlı olarak, birden çok bölüm tek bir kalem-membran slayt kombine edilebilir.
- Kısa bir süre içinde cryostat 5-10 s soğutulmuş kalem membran slayda bölümleri bağlayın. Ne zaman montaj, doku sadece biraz sonuna kadar RNA bütünlüğünü koruyarak eritin.
4. boyama
Not: boyama işlemine genel bakış için Tablo 1' e bakın. Tüm çözümler kullanılan standart 50 mL konik şişeleri hazırlanır. Tüpler RNase Dekontaminasyon solüsyonu ile dış tedavi sonuçlarını (veriler gösterilmez) geliştirmek için görünmez.
- En az bir gün önceden %4 kresil mor % 95 etanol içinde doymuş çözeltisi hazırlamak ve tam belgili tanımlık tenkıye yükleme öncesinde kresil violet yeniden askıya alma.
Not: Etanol konsantrasyonu etkili boyama için indirdi tartışma bölümünde açıklandığı gibi gerekebilir. Boyama sırasında önemli ölçüde % 50 veya % 75 etanol kullanarak RNA bütünlük azaltıp biz test etmedim. Kresil mor ışığa duyarlı ve böylece ışıktan korunmalıdır. - Myenteric pleksus bir slayda bölümlerini takma sonra hemen daldırın % 95 etanol (-20 ° C'de önceden soğutulmuş) konik bir şişe içinde slayt için 30 s.
- Eğer bölümleri tam olarak önceki adımda slayt için uygun değil, biraz slayt (Laboratuvar mendil yerleştirilmiş ikisinin arasında slayt olmalı ve eldiven) eldivenli elle % 95 etanol batış önce tam bağlılık için alt sıcak. Bu çözüm RNA bütünlük azaltmadan en az 3-6 slayt için yeniden kullanılabilir.
- Slayt yüz-up önceden tedavi, RNase free konteyner8yerleştirilen bir laboratuvar silin yatıyordu.
- 3-mL şırınga %4 kresil mor ile ön doldurma ve 0.2 µm şırınga filtre ekleyebilirsiniz.
Not: Selüloz asetat filtreleri öneririz. - Leke doğrudan üzerine doku bölümleri8 6-10 damla uygulamak ve yeterli boya kadar veya 10-30 s için kuluçkaya ne zaman korunur de-lekeli. Boyama sırasında el ile doku bölümler eşit leke ile kaplı olan sağlamak için slayt konteyner yavaşça döndürün.
- Pour leke ve hemen de-% 75 etanol bir şişe olarak slaydı leke. Aşırı boya çoğunlukla kapalı örnek seeped kadar art arda slayt daldırın. Bu 10-20 s arasında sürebilir.
- Tüm fazla leke kaldırılıncaya kadar art arda bir şişe % 95 etanol örnekte 10 s. Submerge örnek için art arda daldırma de-boyama son haline getir.
- Destaining süresi, gangliyon boyama en iyi duruma getirmek için gerekli değişiklikleri yapın. Çok fazla leke kaldırılırsa, örnek de saydam olur ve görselleştirmek zor olabilir
Not: Bu boyama Protokolü tatmin edici sonuçlar elde edilmiştir önce hangi değişiklik gerekli çeşitli yayınlar5,8,10,11 göre optimize edilmiştir. Bu nedenle, boya ve destaining işlemi sırasında kullanılan etanol konsantrasyonu, gerektiğinde en iyi bir sonuç elde etmek değiştirilmesi gerekir.
- Destaining süresi, gangliyon boyama en iyi duruma getirmek için gerekli değişiklikleri yapın. Çok fazla leke kaldırılırsa, örnek de saydam olur ve görselleştirmek zor olabilir
5. su kaybı
- Hemen % 100 etanol içinde slayt 2 - 3 kez, toplamda 10-20 s daldırma.
- Susuz % 100 etanol için en az 30 slayt daldırın s. Susuz etanol çok higroskopik olduğu için moleküler elekler (8-12 mesh) % 100 etanol emilen su kaldırmak ve böylece daha tamamen örnek5kurutmak için yordamı başlangıcı önce şişe ekleyin.
- Art arda ksilen 15-20 s için slayt daldırma. Bu adım tam slayt üzerindeki etanol tabakası kaldırır. Moleküler elekler vaktinden tam olarak aşırı etanol ve su molekülleri5absorbe ksilen, tüpler için ekleyin.
Dikkat: Xylenes gözleri ve üst solunum yolu için tahriş edici olarak sınıflandırılmış ve bir kimyasal duman mahallede kullanılmalıdır. - En az 10 dk (ile moleküler elekler, 8-12 mesh) ksilen içinde slayt daldırın.
Not: Kısa bir mola bu adımdan sonra gerekirse alınabilir. Örnekleri ksilen içinde 4-5 saat zararlı etkileri olmadan boyama için LCM veya RNA verim/bütünlük bırakılabilir. - Isteğe bağlı olarak, tek tek bu noktada birkaç ek slayt hazırlamak. Hazırlanan tüm slaytlarda LCM tamamladıktan sonra ikinci turunda slaytlar hazırlanıyor, cryostat doku doku yüzey su kaybı refaced gerekebilir. 1-4 bölümleri kullanılabilir bölümler toplanan önce iptal gerekir.
6. lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM)
- Slayt ksilen kaldır ve LCM mikroskop sahne içine bir kimyasal duman başlıklı en az 1 dk. Ekle bir kartuş LCM kapaklar kuruması. Sahne Alanı'na slayt yük ve slayt genel bakış görüntüsünü elde etmek.
- LCM için istediğiniz yere belirlemek ve bir kap bir slayda yüklemek.
- Kızılötesi (IR) lazer hizalama ve onun güç ve süresi yakalamak bir 20-30 µm çapı spot yapmak için ayarlayın.
- Ultraviyole (UV) lazer bulun ve bir uygun kesme hızını ve yoğunluğunu ayarlayın.
- (Slayt genel yazılım programının yeşil bir daire olarak tasvir) kap collectable alan sınırı içinde kalmak emin LCM yazılımını kullanarak toplanan için istenen gangliyon anahat.
- Orada öyle ki en az bir IR spot her 100-500 µm her izini sürmek, IR noktalar ayarlayın.
- IR/UV kesme düğmesi tüm işaretli gangliyon koleksiyonu ile devam etmek için tuşuna basın.
- Koleksiyonları tamamlandığında, kap yeni bir konuma taşımak ve toplama işlemi yineleyin veya kapağı yeterince Gangliyon (veya önerilen zaman sınırı 60-80 dakika ulaşılana kadar) dolu bir kez LCM kap QC istasyonunda inceleyin.
- Enkaz kapakta varsa uzak RNase dekontaminasyon çözüm ile önceden tedavi, nükleaz ücretsiz su ile durulanmalıdır, ve tamamen kurumuş ince uçlu bir fırça kullanarak silin.
- Dikkatle göz kapağı incelemek veya tüm enkaz sağlamak için parlak alan mikroskop altında büyütme ile kaldırıldı. Enkaz önceden tedavi boya fırçası kullanımı yoluyla kaldırılamaz, bir iyi pipet ucu (RNase free) uzak enkaz kazımak için kullanın.
- 230 µL RNA lizis arabelleği (RNA ekstraksiyon kiti "10 µL/mL konsantrasyonu eklendi B", β-mercaptoethanol ile arabellek RLT) ile dolu bir 0.5 mL microfuge tüp üzerine kapağı güvenli.
- Ters çevir kapağı, kısaca girdap ve 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- 5 min ve o zaman transfer microfuge için Kuru buz tüp için ≥ 5000 x g santrifüj kapasitesi.
Not: Protokol burada duraklatılmış. RNA lysates RNA bozulması en az 1 hafta üzerinde önemli bir etkisi olmadan-80 ° C'de muhafaza edilebilir. RNA izolasyon aynı gün gerçekleştirilirse, buz üzerinde örnekleri çıkarma için hazır olana kadar sakin ol. - 80-90 dk önerilen maksimal süre içinde tüm ek koleksiyon slayt ksilen çıkardıktan sonra gerçekleştirin. RNases yavaş yavaş susuz bölümler için ortam nemi maruz kalır gibi yeniden olmak. Koleksiyon dönem sınırlama etkileri en aza indirmek ve sonuna kadar RNA bütünlüğünün korunması.
7. RNA izolasyon
- Bir RNase free iş istasyonu RNA çekimi için hazırlayın.
- Tüm tüpler ve Kimyasalları kılavuzuna göre RNA ayıklama çantası için hazırla.
Not: olmakla birlikte birçok kitleri LCM takip RNA izolasyon için kullanılabilir, biz "B" malzeme listesinde listelenen, RNA ekstraksiyon kiti kullanarak en iyi başarı oldu. Şekil 5 RNA ayıklama reaktifler yan yana karşılaştırma için bkz. - Örnekleri-80 ° C dondurucudan kaldırmak ve hızla bir 37 ° C su banyosunda çözülme.
- Hemen çözdürülen girdap örnekleri eşit guanidinium thiocyanate tuzları dağıtmak 2-3 s.
- Her örnek % 70 etanol eşit bir hacmi ile birleştirin. 2 veya daha fazla lysates birlikte, gerekirse, yeterli bir RNA konsantrasyon ulaşmak havuz.
- RNA ayıklama işlemi için kılavuzda microdissected örnekleri için en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralını kullanarak üretici yönergelerine göre devam edin.
- RNA nükleaz ücretsiz su (14 µL) önerilen en küçük birim içine son adım, elute.
- RNA izolasyon, aliquot 1-2 µL dönüştürmek bir yeni gelen RNA'ın RNase free tube kalite değerlendirme/kalite kontrol için RNA, bir Bioanalyzer gibi küçük miktarlarda görselleştirebilirsiniz Havacilik aygıtı ile önceden etiketli. Aliquot bir miktar ile yüksek-duyarlı RNA miktar teçhizat için ayrı bir tüp içine ek 1 µL.
- Bu adımları, RNA aşağı akım analiz için yeterli miktarda elde etmek için gereken şekilde ayarlayın (i.e., LCM kapaklar RNA ayıklama önce daha çok sayıda havuz).
- Aşağı akım analiz için yeterli örnekleri toplamaya kadar-80 ° C'de mağaza RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LCM, RNA-devamı için standartlara toplantı kullanarak insan bağırsak örneklerinden enterik gangliyon nispeten hızlı toplamayı etkinleştirmek varolan iletişim kuralları için çeşitli iyileştirmeler yaptık İlk olarak, biz en iyi duruma getirilmiş Kuru buzun içinde 2 MB (Şekil 1B) bir bulamaç yüzeyinde yer büyük temel kalıpları bağırsak dokusu segmentlerinde hızlı donma. En iyi başarı cryosectioning ve sonraki LCM sırasında mukoza-tarafı (1B-1 C rakamlar) yukarı bakacak şekilde düz bir temel kalıp içinde bağırsak segmentleri döşeme elde edildi. Herhangi bir eğrilik çok daha zor myenteric pleksus büyük bir kesit almak için yapacak gibi temel kalıpları Tur, mümkün olduğunca düz olduğundan emin olun. Bu yaklaşım kolayca 8-µm kalınlık (Şekil 1E) kesitli ve boyama işleminden TFM tam ortadan kaldırılması için izin veren bir doku oluşur. TFM boyama işlemine uğratır ve böylece enterik gangliyon kimliği belirsiz bulduk. Doku bu yönde konumlandırma da RNases12yüksek bir içeriğe sahiptir mukoza kesit önler, her ne kadar bizim deneyim, öyle görünüyor ethanolic lekeleri kullanımını büyük ölçüde bu RNases engeller. Durumlarda nerede TFM veya en uygun kesme sıcaklık (OCT) orta gereklidir, ilk örnek temel kalıp alt dümdüz ve bu adımı (Şekil 1D) takip kalıp TFM eklemek için en güvenilir bulduk. Bu "hangi bağırsak kolayca görselleştirildiği, yapım o basit-e doğru örnek hizalayın ve myenteric pleksus (Şekil 1E) tamamen paralel bölümler üretmek bir pencere" bırakır.
Cryosections boyuna myenteric pleksus (Şekil 2A), paralel bir yönde bağırsak uzunluğu aşağı hazırlanması enterik gangliyon slayt başına en büyük alan boyama üzerine () görünür bölümleri oluşturur Resim 2 C). myenteric pleksus (Şekil 2C), (resim 2B) boyuna ve dairesel kas tabakaları appozisyon adlı yaklaşırken, 6-12 seri bölümler olabilir (Şekil 2A, toplanan boyuna) enterik Gangliyon (Şekil 2C) büyük tarama alanı içerir. LCM kapaklar kapasitesi tek bölümü (Şekil 4D) kullanılarak yüklenebilir. Buna ek olarak, taze donmuş bağırsak (Şekil 2A-2B) enine bölümler hazırlanırken, myenteric pleksus her slaytta (Şekil 2B) mevcut sadece küçük bir alanda işte. Çok az enterik gangliyon büyük zaman yatırım ve genel örnek başına daha yüksek maliyet sonuçlanan enine doku bölümlerden toplanabilir. Paralel kesit yaklaşım enine bölümleri ile karşılaştırıldığında daha az beşte biri LCM kapaklar ve slayt sayısını kullanır ve toplama işlemi büyük ölçüde hızlandırır.
LCM daha önce örnekleri lekeli ve LCM toplama sırasında RNase etkinliği önlemek için tamamen susuz. Biz doğrudan ethanolic lekeleri vs sulu lekeler RNA bütünlüğü üzerinde diş ağrısı için bir deney tasarlanmıştır. Bu deneyde iki bağırsak bölümü birlikte tek bir slaytta monte edildi ve dört yollardan biriyle işlenmiş olan = n ile grup başına 2-3 biyolojik çoğaltır. İlk grubunda, taze bağırsak bölümleri bir slayt monte edildi değil ve her doğrudan RNA lizis arabelleği kuru buza (Şekil 3A) önceden soğutulmuş RNase free forseps kullanarak içine transfer oldu. Tüm kalan grupları, bölümler slayda yapıştırılır, işlenen, kapalı bir RNase dekontaminasyon çözüm tedavi tıraş bıçağı kullanarak slayttan alıntı ve RNA lizis arabelleğe RNase free forseps ile transfer. Standart bir mikro-homogenizer tam olarak tüm grupları örneklerinde koşullar için kullanıldı. İkinci gruptaki slaytları tüm adımlarda işlendi ama hiçbir boya boyama işlemi sırasında (Şekil 3B) kullanıldı. Grup üç %4 kresil mor boya (Şekil 3C) yukarıda açıklanan iletişim kuralı'nı ile işlem. Dördüncü grubunda, sulu bir leke, toluidin mavisi, iletişim kuralı için bir sulu tabanlı boyama seti toluidin blue ve Hematoksilen (Şekil 3D) karışımı kullanarak aşağıdaki sırada kullanıldı. RNA ayıkladıktan sonra açıklandığı gibi RNA kalite bir Bioanalyzer ile değerlendirildi. Sulu ve ethanolic iletişim kuralları boyama arasındaki tek fark iki su incubations ilavesi yapıldı (30 s her), hemen önce ve sonra boyama hangi alımı ve boya tutma için gerekli. Slayt doku bölümlerine bağlı kalarak ve RNA kalite (3A-3B rakamlar) hafif, kaçınılmaz azaltma için liderliğindeki dehidratasyon adımlarla işleme işlemi bulduk ama ethanolic boya ile boyama, kresil mor, değil daha fazla RNA kalite (Şekil 3C) azaltın. Buna ek olarak, sulu boya toluidin blue, önemli RNA bozulması, endojen RNase etkinlik (Şekil 3D) izin veren genişletilmiş sulu maruz kalma nedeniyle büyük olasılıkla yol açtı.
Enterik gangliyon benzersiz şekiller zorluklar standart IR-LCM geleneksel cam slayt6 (Şekil 4A) için poz. KALEM-membran slaytlar (Şekil 4B) kullanırken, örnekleri cam slayt çoğunluğu müstakil ince bir levha yapıştırılır vardır. UV Lazer hem örnek hem de tam müfreze gangliyon slayt (Şekil 4C) ve LCM kap (Şekil 4D) tam bağlılık ile sonuçlanan kalem membran aracılığıyla keser. Yapıları, herhangi bir istenen boyutu ve şekli (> 10-15 µm)-ebilmek var olmak tamamen ve kesin (Düşündü 4E-4 H) toplanan. Bölüm başına daha az gangliyon ile bazı örnekler için kap dört kez toplama önce taşınan ≥ olabilir. Bu durumda, iki ya da üç bölümleri slayt başına montaj kalem-membran slaytlar kullanımını en aza indirir.
RNA, RNA-seq için LCM örnekleri izole zaman amaç yüksek RNA kalite ve miktar, tüm genomik DNA (gDNA) ayrıcılıklarına elde etmektir. İdeal bir RNA izolasyon yordamı tanımlamak için biz bir kafa kafaya karşılaştırma bir RNA ekstraksiyon kiti "A" ile (Şekil 5A), RNA ekstraksiyon kiti "B" (Şekil 5B) veya RNA ayıklama yöntemi yapılacak "C" ile temizlik RNA örnekleri RNA ekstraksiyon kiti "B" (Şekil 5C) tarafından. En iyi duruma getirilmiş kresil mor ile protokol boyama örnekleri işledikten sonra LCM bağırsak dokusu, boyuna kas katmanından alınan standart dairesel örnekleri (çapı 500 µm) almak için kullanılan. Her kap her kit ilgili lizis arabelleğinden önceden dolu bir 0,5 mL microfuge tüp üstüne yerleştirilen üç RNA izolasyon gruplarının her biri için rastgele. İzlemek belgili tanımlık öğretim tam olarak RNA ekstraksiyon kiti ile her kit için "A" lizis arabellek için 30 dk 42 ° C'de kuluçka gerektiren tarif. Diğer takımları için oda sıcaklığında kuluçka için 30 dk kullanıldı. Tüm örneklerinin kısaca vortexed lizis arabellek için ek üzerine olduğu. Örnekleri-sonra soğutulmuş buz kadar çekimi aynı gün yapılmıştır (n = 4). Bulduk RNA ekstraksiyon kiti "B" bir sütun üzerinde DNA sindirim adım ile en yüksek RNA kalite ve miktar gDNA (5A-5 C rakamlar) ayrıcılıklarına olan etkili bir şekilde sonuçlandı. Önemlisi, RNA ayıklama Kit "B" tarafından tam olarak sağlanan RNA lizis arabellek enterik Gangliyon (Şekil 5D) toplarken yakalanan gangliyon lyses.
Ortalama olarak, bizim örnekleri bir RIN 7,49 ± 0,53 (Tablo 2) var. RIN puanları 6-7 den büyük RNA-seq (bağlı olarak belirli RNA profil)13bize veren, yeterli kalite güven örneklerimizi RNA-devamı bu dikkate alınarak için yeterli kalitede olduğunu RIN aldıktan sonra bu örnekler için sayılır, değişmekteydi 7.4 9.5, bizim en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı RNA bütünlüğünü mükemmel koruma sağlar Bu sonuçlar gösterir. Temsilcisi RNA kaliteli sonuçlar RNA-seq için gönderilmiş örneklerinden Rakamlar 6A-6 Ctasvir edilir. RNA-seq sonuçlarından örneklerimizi başarıyla sıralı göstermek ve mütevazı 3' uç önyargı (Şekil 6D) var. Genel olarak, bir daha büyük 3'-önyargı örnekleri alt RIN14ile tercih edilir; Bu etkiyi orta bizim örneklerinde yansıtılır. Buna rağmen gözlemlenen gen biotypes verilerin güvenilirliği ile gösteren tüm örnekleri arasında (Şekil 6E), büyük ölçüde tutarlı edildi.
Resim 1 . En iyi bağırsak dokusu dondurma. (A)Kuru buz kovaları tasvir; sırayla hazırlanıyor Ben) Kuru buz Bulamaç, II) laboratuvar dokulara yerleştirilen Kuru buz, III) geçici depolama kova, IV) kaydırma kova, v) öncesi dondurucu depolama kova, VI) öncesi dondurucu depolama taşma kova. (B) büyük temel kalıpları bir bulamaç Kuru buz ve 2-methylbutane yüzeyde yerleştirilen doku segmentlerinde hızlı dondurulması optimize. (C) A daha yakın-up panel B. bağırsak kesimleri düz mukoza tarafı yukarı bakacak şekilde bir temel kalıp koyulur gösterilen kurulumunda gözlenen bir tamamen donmuş numune görüntüsü. (D) donma bu yöntem doku aynı şekilde hazırlanıyor ama donma önce temel kalıp TFM ekleme tarafından TFM kullanılmak üzere kolayca adapte edilebilir. Sonuç örnek kolayca görselleştirildiği serosa ile tamamen düz myenteric pleksus olacaktır. (E) her iki doku hazırlık yaklaşımlar önerilen 8-µm kalınlık mükemmel doku bölümleri üretmek. TFM kullanarak yordamı burada tasvir edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Bağırsak dokusu uygun yönlendirmeyi bölümleri enterik gangliyon zengin sağlar. Taze donmuş bağırsak (A, B) standart enine kesit hazırlanırken, sadece küçük bir alanda myenteric pleksus (B) her bir slayt üzerinde mevcut vardır. Çok az enterik gangliyon zaman alıcı ve pahalı olan slayt toplanabilir. Buna ek olarak, boyuna bölümlerini myenteric pleksus (C), düzlemde hazırlanıyor Gangliyon (C) bir çok daha büyük yüzey alanı sunmaktadır. Myenteric pleksus bölümlerini serosa başlayan ve içe doğru boyuna kas (B) kesit elde edilir. Myenteric pleksus, (B), boyuna ve dairesel kas tabakasının kavşakta yaklaşırken 6-12 seri bölümler toplanabilir. Myenteric pleksus boyuna her bölümünün enterik Gangliyon (tercihen gangliyon leke olmadan ksilen, değiştirilmiş bir boyama yordamı kullanarak C temsil edilen) büyük tarama alanı içerir. LCM kapaklar kapasitesi tek doku bölümü kullanılarak doldurulabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Bir etanol uyumlu boya boyama RNA kalitesi geliştirir. RNA kalite Bioanalyzer tarafından ölçüldü ve her gruptan iki örnek temsilcisi sonuçları görüntülenir. İlk RNA kaliteli taze, monte edilmemiş bölümleri (A, hiçbir tedavi) ölçülen, bir RNA bütünlük dizi (RIN) 8.65 ± 0,07 vardı. İçin monte edilmiş ve tüm adımları boyunca ama leke (B) olmadan işlenen bölümleri, RIN 7.95 ± 0,35 yapıldı. %4 kresil mor ile boyama dehidratasyon adımları eklendiğinde, RIN, ortalama bir RIN 7.87 ± 0,35 (C) ile ihmal edilebilir bir etkisi vardı. Buna karşılık, 6.45 ± 0.21 RIN ile önemli ölçüde azaltılmış RNA kalite sulu leke, toluidin blue (T-mavi) ve (D) yordamı için gerekli su durular ilavesi kullanımı sonuçlandı. Her grup n oluşuyordu "Hayır muamele" ve "T-Blue"(n=2). dışında 3 biyolojik çoğaltır = RINs bildirilen ortalama ± standart sapma olarak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . KALEM membran LCM slaytlar enterik gangliyon kesin koleksiyonları etkinleştirin. Enterik gangliyon LCM toplamak için normal cam mikroskop slaytlar kullanarak istenmeyen doku pickup(a)neden eğilimindedir. Kırmızı daireler (çapı 30 µm) toplama işlemi sırasında kullanılan IR okek noktalar boyutunu gösterir. Beyaz ok bitişik muscularis doku parçasına çektiği bir sinir düğümü gösterir. KALEM-membran slaytlar ile (B), örnekleri cam slayt çoğunluğu müstakil ince bir levha yapıştırılır vardır. Ne zaman UV-LCM lazer ile kesim, hem örnek hem de kalem membran, gangliyon ganglion şekli (C), ne olursa olsun slayttan tam müfreze sonuçlanan dilimlenmiş ve örnek (D kaldırılır LCM kap bağlılığı tamamlamak ). Yapıları, herhangi bir istenen boyutu ve şekli ≥10-15 µm olabilir tamamen ve [(doku işaretleme; ilk tam olarak toplananE), (F) IR ve UV Lazer kesim tamamlandı; (G) LCM kap bölümünden kaldırıldı], gibi LCM kap (H) görüntülenir. Benekli arka panelinde H kap doğasında vardır ve istenmeyen enkaz değil. Yeşil daire mavi crosshairs panelleri E-H LCM programının bir parçasıdır ve sırasıyla UV ve IR lazer için yer tutuculardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . En uygun bir RNA izolasyon kiti seçme. RNA bütünlük sonuçları üç farklı RNA izolasyon yordamlar eşzamanlı bir karşılaştırma sonra gösterilir. Her gruptan iki temsilcisi araziler paralel olarak işlenmiş örnekler arasındaki oluşabilir değişkenlik göstermek için görüntülenir. RNA ekstraksiyon kiti "A" (A) örnekleri 6,83 ± 0.65 RIN ile üretilen ve ılımlı RNA verimleri sağlanan ve bir sütun üzerinde DNaz sindirim gerçekleştirme rağmen DNA, var olarak gördüler. RNA ekstraksiyon kiti "B" (B) en yüksek ölçülen RIN 8.3 ± 0,1, sonuçlandı. Süre fenol tabanlı RNA ayıklama yöntemi "C (RNA ekstraksiyon kiti"B"ile RNA örneklerinin temizlik ve ardından)" (C) gDNA ortadan kaldırmak için ortaya çıktı ve bir RIN 7.5 ± 0,26 vardı, erime gelen neden olmuş bantları kirletici büyük Yapıştırıcı polimer RNA lizis adım sırasında LCM kap dan. Ayrıca, RNA verimleri RNA ekstraksiyon kiti "A" ve ayıklama yöntemi "C" sürekli olarak bu RNA ekstraksiyon kiti "B" tarafından elde edilen daha düşüktü. RNA ayıklama Kit "B" tarafından sağlanan önemlisi, RNA lizis arabellek. (eklenen β-mercaptoethanol ile) tam olarak yakalanan Gangliyon (D) lyses. Her grup n vardı 3 biyolojik çoğaltır = ve burada olarak ortalama ± standart sapma sunulur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 . Temsilcisi sonuçları. Enterik gangliyon örnek başına iki kapsül havuzu, biz RNA-seq için RNA yeterli miktarda elde (> 1 ng) mükemmel RNA kalitesi ile birlikte. Temsilcisi RNA araziler için bir örnek bir RIN 8,3(a), (B) 7.5 ve 6,9 (C) ile gösterilir. RNA-seq veri örnekleri başarıyla sıralı ve mütevazı 3' uç önyargı var sonu-önyargı Arsa gösterir R. (D) çalıştırmak bir kalite değerlendirmesi programlarıyla işletilmiştir. (E) gen biotype Arsa da sıralama sonuçları örnekleri arasında büyük ölçüde tutarlı olduğunu temsil eder. Toplamda, biz oldu bir > örnekleri kullanılabilir RNA-Seq için üreten % 95 başarı oranı Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Adım | Süresi | Amaç |
| % 95 etanol (-20 oC) | 30 s | Fiksasyon |
| %4 kresil Violet % 95 etanol içinde | 10-30 s | Leke |
| % 75 (ile tekrarlanan daldırma) etanol | 15-25 s | De-leke |
| %95 (ile tekrarlanan daldırma) etanol | 5-15 s | De-leke |
| % 100 etanol | 15 s | Su kaybı |
| % 100 etanol (susuz) | 30 s | Su kaybı |
| Ksilen (ile tekrarlanan daldırma) | 15-20 s | Su kaybı |
| Ksilen | > 10 dk | Su kaybı |
| Kuruması | 1-3 dk | Ksilen buharlaşma |
Tablo 1. Boyama ve dehidrasyon protokol genel bakış. Bizim en iyi duruma getirilmiş boyama protokolü bu tabloda özetlenmektedir. Eğer daha iyi sonuçlar sunmaktadır herhangi bir etanol uyumlu leke Not kresil mor, değiştirmek için kullanılabilir. Bazı durumlarda, boyama ve destaining süreleri kısaltılmış ve genişletilmiş gerekecektir. Genel olarak, uzun süre fiksasyon zaman daha hızlı doku tamamen lekeli. Şişeleri ilâ 3 kere aynı doku kesimi slaytlardan hazırlarken yeniden kullandıktan sonra RNA bütünlük herhangi bir azalma farkında değil.
| Donör | Doku | RIN |
| F | İki nokta üst üste | 7.1, 7.4, 7,2 |
| M | İleum | 7.2, 6,9, 7,8 |
| M | Oniki parmak bağırsağı | 8.2, 7.4, 7.7 |
| İleum | 7.4, 7,6, 7.3 | |
| İki nokta üst üste | 7,7, 7,8, 7.3 | |
| F | Oniki parmak bağırsağı | 7.1, 7.3, 6,9 |
| İleum | 7,8, 7,9, 7.6 | |
| İki nokta üst üste | 7.3, 8.0, 7.5 | |
| M | İleum | 6,9, 6,7, 6,9 |
| İki nokta üst üste | 6,8, 6.4, 6,6 | |
| M | İleum | 7.2, 7.3, 7.6 |
| İki nokta üst üste | 6,7, 7,6, 7.7 | |
| M | İleum | 8.3, 7,8, 7.4 |
| İki nokta üst üste | 7.0, 7.4, 7.0 | |
| F | Oniki parmak bağırsağı | 8.3, 8.8, 8.0 |
| İleum | 8.1, 8.0, 7,8 | |
| İki nokta üst üste | 8.4, 8.6, 7.1 |
Tablo 2. Temsilcisi RNA bütünlük sonuçları. Bu tabloda gösterilen örnek tüm insan enterik gangliyon elde edilmiştir. Tüm seçili örnekleri yeterli RNA kalite ve miktar RNA-seq analiz için sahip. Bu tabloda listelenen tüm örneklerinin ortalama RIN 7,49 ± 0,53 var. RNA konsantrasyonu da RiboGreen Quant-BT tahlil kullanarak ölçülen ve bu tabloda gösterilen tüm örnek bizim RNA seq için gereken en az miktar getirilmiştir (> 1 ng) deneyler. Küçük miktarlarda, ön amplifikasyon yordama bağlı olarak kullanılabilir. Ancak, ne zaman biri orada örnekleri arasında büyük farklılıklar Gen ifadesinin olması veya karşılaştırılan grupların beklemek-e doğru tür yordamlar daha güvenilir; Aksi takdirde bu sonuçların doğru bazı RNA-seq uygulamalar farklılıkları maske yapabilirsiniz. Bu nedenle genellikle mümkün olduğunda daha fazla malzeme ile başlatmak için önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çok sayıda enterik gangliyon verimli toplama RNA-devamı için RNA türetmek için bir kaynak olarak bu yordamla Burada, sonuna kadar RNA bütünlüğünü koruyarak varolan iletişim kuralları'nda belirtilen işlemler hız. Bu yordamdaki adımların tümünü birbirine bağlı olduğundan, tüm sorunları çalışma başlangıcından bertaraf edilmesi ve tüm örnekleri olarak benzer şekilde bir başkasına mümkün olduğunca güvenilir RNA-seq. elde etmek için hazır olduğundan önemlidir
Arasındaki zaman aralığını (soğuk iskemik zaman) koleksiyonu doku organ bağışı zamanda ve doku alınması işleme laboratuvarı için çok uzun ise işlem başlangıcından RNA bütünlüğünü olumsuz etkilenen. Bu endişe göz önüne alındığında, biz yüksek kaliteli RNA soğuk iskemik zaman bile 24 saat sonra hala bağırsak örnekleri ayıklanabildiği şaşırdık. Bağırsak örnekleri soğutulmuş ve düzgün soğuk depolama çözümünde depolanan zaman doku bütünlüğü ve RNA kalitesi mükemmel koruma yoktur. Biz bağırsak dokusu toplama bağırsak sindirim enzimleri, RNases ve bu dönemde RNA kalite etkileyebilir diğer moleküller için maruz kalma sınırı için organ toplama ekibi tarafından aktarılmadan gerektirir. Biz bağırsak numune tamamen değil temizlendiğinde, bu önemli ölçüde örnek'ın RIN azaltabilir bulduk.
Bağırsak doku örnekleri hazırlamak için en iyi duruma getirilmiş bizim işlemi uygulayarak, biz örnekleri TFM içinde katıştırma önlemek edebiliyoruz. TFM etanol ve Ksilen enterik gangliyon görselleştirme ile engelleyen bir koyu kahverengi küçülmesinihızlandırmalı oluşturmak için etkileşim çünkü bizim örnekleri hariç tercih ederim. Ancak, fare veya diğer türler bağırsak dokusu ile çalışırken, TFM dışlanması mümkün olmayabilir. Bu durumda, biz bir slayt üzerinde yapıştırılan bir bölümünden TFM kaldırma ile tecrübe var. Doku yeterli yüzey alanı varsa, etanol (-20 ° C'de soğutulmuş) hızlı bir şekilde forseps ile silinmesine izin TFM düzeltmek için bir transfer pipet ile slayt üzerine damladı. Etanol slaytlar üzerine damlama TFM birikimi birden çok slayt işlendiğinde hangi esmerleşme etkisi azdırmak etanol, şişe içinde önler.
2 MB kolayca doku yüzeyine iniş zaman buharlaşır çünkü flaş-donma sırasında biz % 100 etanol, yerine 2 MB ile Kuru buz Bulamaç kullanarak lehine. Etanol daha yavaş, özellikle TFM, kimyasal bir çamur kolayca kaldırılamaz doku blokta şekillendirme ile birleştirildiğinde buharlaşır eğilimindedir. Etanol ve 2 MB var ve ne zaman küçük dondurma kaplarında dondurma kuru buz Bulamaç küçük hacimli bir düşük özgül ısı kapasitesi vardır çünkü şiddetle sıçramak eğilimindedir. Bunun yerine, powderized Kuru buz dolu büyük bir dikdörtgen kova kullanılması büyük bir soğutma kitle sağlar ve doku dondurulmuş iken sıcaklık derecesi fluctuations engeller.
Belirtildiği gibi bazen diğerlerine göre biraz doku örneği enterik gangliyon sürekli yaprak elde etmek kolaydır. Anlaşılır, LCM genel hızı değişkenliği bağlı olarak kaynak doku veya örnek bağırsak bölgesi özelliklerini tabidir. Bu nedenle, pek çok taze donmuş örnekleri başlangıçlı, hazırlamak iyisi. Biz genellikle 20 örnek segment bağırsak (~ 2 cm x 1,5 cm, her) / toplam aşağı akım uygulamaları için geniş RNA sağlamak çok daha--dan yeterli olduğunu bulduk. Ancak, sadece küçük bir bağırsak dokusu uzunluğu varsa, en az 5 cm uzunluğunda öneririz. Yaklaşımımız ile elde edilen en düşük verim, 18-30 ng olarak daha fazla aşağıda açıklanan RNA'ın arasında değişir. Özellikle cDNA preamplification daha yüksek miktarda kullanıldığında en az 5 cm uzunluk potansiyel olarak, uygulamaya bağlı olarak azaltılabilir. Bu parametreler geçerli çalışmada test değil. Örneğin, enterik gangliyon tam-kalınlık bağırsak biyopsisi örnekleri (2 cm x 2 cm) qPCR4ile kullanmak için toplanmıştır.
Biz bu çalışmada göstermek gibi etanol uyumlu boya, kresil mor, kullanımı daha sulu leke, toluidin blue RNA bütünlüğünü daha iyi koruma sağlar. Etanol batık, RNases etkin olmayan5,15olur. Ancak, RNases hala bir kez7,15su maruz işlevi yeniden elde eder. Sulu boya ile boyama zaman doku, nükleaz ücretsiz su önemli RNA düşmesine yol yaklaşık 1 dk9, maruz gerekir. Çünkü bu değişiklikler aynı zamanda Alım ve muhafaza edilmesine toluidin mavisi, sırasıyla azaltılmış toluidin mavi doku boyama kullanırken, biz önce ve boyama sonra su maruz azaltmak koyamadık. Benzer bir sorun ayrıca hematoksilen-esaslı boya9ile karşılaşıldı. Burada açıklanan değiştirilmiş iletişim kuralı kresil mor ile boyama su için bağırsak örneklerinin doğrudan maruz böylece maksimum RNA bütünlüğünü koruyarak önler. Bu sonuçlar ek RNase inhibitörleri boyama çözümde ihtiyacını ortadan kaldırmak. Biz böyle inhibitörleri hem alım hem de boya tutma ile müdahale gibi sulu boya toluidin mavisi, kullanımının etkinleştirilmesi etkisiz bulundu.
Başlangıçta bizim boyama Protokolü en iyileştirirken, biz were yapamaz-e doğru diğer iletişim kuralları'nda elde edilen sonuçları çoğaltmak ve5,7,8,11rapor eder. Bunun nedeni belirsiz olmakla birlikte, tutarsız boya alımı ve saklama için yol açan faktörlerden bulduk. Her ne kadar bazı protokoller başarıyla % 100 etanol8 veya % 75 etanol5kresil mor kullanarak doku lekeli, sadece hafifçe gangliyon etiketli veya yüksek arka plan vardı örneğin, boya kresil % 95 etanol menekşe kullanarak göre. Son, kresil mor boyama çözümde kullanılan yüzdesi da çok önemlidir. Çoğu iletişim kuralları %1 kresil menekşe çözüm7,8öneririz, ancak bu konsantrasyon güvenilir bizim ellerimizde bile bölümleri için 2 dakikaya kadar boyama sonra boyama sağlamadı. En iyi başarı bir açıklık doymuş boyama çözüm % 4 ile kresil menekşe11 ile steril enjektör filtre8örnek uygulanan boyama yaptık. Çok daha hızlı boyama örneği bu doymuş çözüm sağlar, içinde olduğu kadar az 10-15 s. soğutulmuş % 95 etanol (-20 ° C'de) örnekte öncesi fiksasyonu leke daha hızlı alımını sağlar.
Başka bir rapor enterik gangliyon en belirgin taze donmuş insan bağırsak bölümlerde kresil mor eozin % 75 etanol çözüm5ile birleştirirken lekeli olduğunu buldum. Ancak, eozin daha zor gangliyon tanımlamak için yapılmış ve o kresil mor, yalnız, üstün algılama sunmaktadır bulundu. Farklı bir çalışmada, tamponlu bir kresil menekşe çözüm sağlanan tutarlı boyama sonuçlar için rahim kanseri doku10bulundu. Ancak, bu herhangi bir iyileşme için insan bağırsak dokusu teklif vermedi ve ayrıca % 95 etanol için boyama çözüm kullanırken uygulamaya olabilir değil bulundu.
Hangi iletişim kuralını duraklatılabilir ve daha sonra devam koşulları bir dizi test ettik. Birçok iletişim kuralları vaktinden slaytlar kesit ve onları yeniden hemen sonra montaj üzerine slayt5,9-80 ° C'de dondurmak öneririz. Bu yaklaşım, boyama ve LCM olabilir o zaman ile gelecek hafta içinde büyük bir esneklik sunan devam. Ancak, sadece bu büyük ölçüde boyama ile engel; Ayrıca RNA bütünlük (veriler gösterilmez) bizim ellerde azaltılmış. Bu sorunu aşmak için Grover vd. boyama ve dondurucu11depoda önce bölümleri dehydrating öneririz. Bu yaklaşım, slaytlar lekeli ve % 100 susuz etanol hızlandırmaya (Bölüm 5.2 iletişim kuralı) ( Tablo 1de olduğu gibi) susuz. O zaman, örnekleri % 100 susuz etanol 10 min için ikinci bir şişe içinde inkübe ve hemen bir konik tüp sonra kuru buzda soğutulmuş ve-80 ° C dondurucu transfer Kurutucu Jel ile aktarılır. Örnekleri dondurucudan kaldırırken, slaytlar hemen %100 30 s ve air-dried önceden için susuz etanol içinde LCM11gerçekleştirmek için sular altında. Ne yazık ki, bizim elimizde, bu yaklaşım RIN 0,6-0,8 (veri gösterilmez) azaltılmış. Bu nedenle tüm kesit, boyama ve LCM aynı gün içinde maksimal RNA bütünlük içinde bizim koşulları elde etmek için gerçekleştirmek için başvurdu. Bu zaman alan bir işlem olmaktadır, ama 10-14 LCM kapaklar bir tam gün çalışmaları sırasında dolu olabilir.
Ksilen kuluçka adımda, hangi bizim protokol duraklatılmış en güvenilir noktasıdır. Slaytlar ksilen içinde (moleküler elekler ile) için en fazla 4-5 saat RNA bütünlüğü üzerinde belirgin bir etkisi olmadan bırakılmış. Bir saat mola gerekli olsa bile biz ne zaman bir kerede üç slayt hazır mısın, tüm LCM ile bu süre içinde işlenebilir olduğunu bulduk. Bir Kasa'da exicator16içinde boyama ve dehidrasyon adımları sonra slaytlar yazılıolduğu için alternatif bir seçenektir ama biz henüz bu yaklaşım çalıştı değil.
RNA izolasyon olduğunu henüz başka bir önemli adım prosedürü ile en önemli faktörler olmak: RNA, RNA (olmadan daha küçük RNA türler kaybı)17,18, tam spektrum istinat maksimal olası verimi elde etmek ve tamamen ortadan kaldırarak genomik DNA örneği17. Daha fazla verim sunulan ve genomik DNA ortadan kaldırılması daha verimli gibi bizim ellerimizde, RNA ekstraksiyon kiti "B" Bizim örnekleri ile en iyi sonucu sağladı. Gözlemlerimiz verimleri RNA ayıklama reaktifler arasındaki farkları ile ilgili önceki raporlar17,18ile tutarlıdır. Ancak, aynı zamanda diğer RNA ayıklama reaktifler19,20ile başarı bildirdin birçok LCM çalışma vardır. Önceki raporlar da sütunlara göre RNA çıkarma işlemleri küçük RNA molekülleri süpernatant RNA yağış sırasında kayıp olabilir küçük RNA molekülleri daha iyi saklama fenol tabanlı RNA çıkarma yöntemleri18 daha sunuyoruz gösterir adımları.
Biz guanidinium thiocyanate eklenen β-mercaptoethanol ile kullanın RNA lizis arabellekleri tüm yakalanan gangliyon LCM kap (Şekil 5D) son derece etkin gözlenen. Çoğu LCM protokolleri vortexing lysate tavsiye etmem, biz bu mükemmel sonuçlar üretiyor ve RNA düşmesine neden değil bulduk. Ayrıca tüm gangliyon yakalanan bile daha büyük bir olasılık RNA çıkarılması için kap dan çıkacak sağlar. Bu yöntemleri kullanarak, biz genellikle RNA verimleri ile 1,8-18 ng/cm2 kaç gangliyon belirli bir slaytta bulunan bağlı olarak bağırsak dokusunun aralığında enterik gangliyon LCM alın. Bizim RNA-seq yordamı 10 ng RNA'ın en az bir giriş gerektirir, ancak diğer yordamlar sıralama işlem öncesi amplifikasyon döngüleri daha fazla sayıda içeriyorsa giriş çok daha düşük RNA olabilir. Doku hazırlık ve flaş dondurma işlemi depolanan toplam yüzölçümü cDNA Kütüphanesi hazırlık ve düşük-girdili RNA-Seq uygulamaları için geniş RNA sağlayan 40-60 cm2' dir.
Bizim yordamı tüm enterik gangliyon koleksiyonu için tasarlandığından, yaklaşım kolayca tek nöronlar veya glia, topluluğu için5istenirse değiştirilebilir. Yoğun gliyal işlediğinden ancak, ensheath nöronlar ENS, gliyal RNA, daha düşük sayar da olsa, yakalanan nöronlar, RNA ile birlikte eklenir. Bu nöronal tutanaklar bir düşük kopya sayısı ifade tanımlamak çalışırken sorunlara yol açtı. Tek hücreli RNA-seq en iyi hassasiyet ve algılama bu konuda sunuyor, ancak bağırsak dokusundan ayrışmış, pan-nöronal işaretleri ile lekeli ve akış sitometresi21 ile izole veya bütün-bağırsak üzerinden tespit için nöronlar gerektirir Biyoinformatik ile yaklaşımlar sıralama sonra dissociations. Çoğu ayrılma çalışmaların çoğu iletişim kuralları örnek oda sıcaklığında veya transcriptome3değiştirmek için bilinen 37 ° C uzun bir süre için inkübe gerektirir downside. Son zamanlarda, Bacillus licheniformis gelen soğuk-aktif proteaz fare dokular için tek hücre süspansiyonlar oluşturmada kullanılan ve bu enzim ayrılma 4 ° C22insan dokusunun için uygulamak mümkün olabilir. Böyle optimizasyonu gerçekleştirilir kadar LCM taze donmuş insan dokusunun enterik gangliyon gibi periferik sinir sistemi elemanlarının ifade profil oluşturma için RNA yakalamak için güçlü bir araçtır.
Özetle, biz insan enterik gangliyon RNA topluluktan için güvenilir ve tutarlı bir protokol geliştirdik. Biz insan bağırsak dokusu, boyama, LCM süreci ve RNA ekstraksiyon dayalı çok sayıda yayınlar ve protokolleri hazırlanması optimize. Biz de bu yaklaşım RNA-devamı için yeterli RNA kalite RNA örnekleri toplamak güvenilirliğini göstermiştir Bu iletişim kuralı geniş hastalarda gastrointestinal hastalıkların bir dizi ile toplanan dokulara uygulanabilir ve kemirgen modelleri, böylece roman therapeutics gelişimi için güvenilir bir strateji sunuyor kullanılmak üzere kolayca adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Biz bağış ve bu iş mümkün kılan onların aileleri için minnettarız. Ayrıca Uluslararası Tıp Enstitüsü ve Tennessee donör Bu çalışmada kullanılan doku koordinat koleksiyonu yardım hizmetleri personeli yardım ederiz. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri, NIH OT2-OD023850 EMS2 ve nakit çekmek için gelen NIH T32-DK007673 AMZ için gelen hibe tarafından desteklenmiştir. Vanderbilt translasyonel patoloji paylaşılan kaynak personel için erişim okek enstrüman ve doku hazırlık tavsiyeler için minnettarız. Vanderbilt doku patoloji paylaşılan kaynak NIH hibe P30-CA068485-14 ve U24-DK059637-13 tarafından kısmen desteklenir. Genom teknoloji erişim merkezi Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi, genetik bölümü Genom Analizi ile yardım için teşekkür. GTAC ncı Kanser Merkezi Destek Grant #P30 CA91842 Siteman Kanser Merkezi için ve bit/CTSA Grant #UL1TR002345 Milli Merkezi tarafından kısmen desteklenen araştırma kaynakları (NCRR), ulusal kurumları sağlık (NIH) ve NIH bir bileşeni için Tıbbi araştırmalar için yol haritası. Bu yayın sadece yazarlar sorumludur ve mutlaka NCRR veya NIH resmi görünümünü temsil etmiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
- Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
- Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
- PALM Protocols - RNA handling. , ZEISS. Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011).
- Schlaudraff, F. L. M. Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015).
- Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
- Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
- Potter, S. S., Brunskill, E. W.
- Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
- Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
- Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
