Summary
Le but du présent protocole est d’obtenir des échantillons d’ARN haute intégrité de ganglia entérique isolée du tissu intestinal humain non fixée, fraîchement réséquée à l’aide de microdissection de saisie de laser (LCM). Ce protocole consiste à préparer les échantillons congelés flash de tissu intestinal humain, de cryosectioning, de coloration dans l’éthanol et de déshydratation, LCM et extraction de l’ARN.
Abstract
Le but de cette méthode est d’obtenir des échantillons d’ARN haute intégrité d’entériques ganglions prélevées de tissu intestinal humain non fixée, fraîchement réséquée à l’aide de microdissection de saisie de laser (LCM). Nous avons identifié cinq étapes dans le flux de travail qui sont cruciaux pour l’obtention de RNA isolats de ganglia entérique avec suffisamment de haute qualité et la quantité de RNA-Seq. Tout d’abord, lors de la préparation de tissu intestinal, chaque échantillon doit avoir tous les excès de liquide retiré par éponger avant d’aplatir la séreuse autant que possible dans le bas du gros moules base. Les échantillons sont ensuite rapidement gelés au sommet d’une bouillie de glace sèche et 2-Méthylbutane. En second lieu, lorsque le tissu de sectionnement, il est important de positionner cryomolds afin que les sections intestinales en parallèle le plan complet du plexus myentérique, réduisant ainsi à la plus grande surface de ganglia entérique par diapositive. Troisièmement, au cours de LCM, polyéthylène napthalate (stylo)-diapositives de membrane offrent la plus grande vitesse et la flexibilité en décrivant les formes non uniforme des ganglions entériques lors de la collecte de ganglia entérique. Quatrièmement, pour visualisation distincte des ganglions entériques au sein des sections, compatibles avec l’éthanol colorants, comme le Violet de crésyle, offrent excellente conservation de l’intégrité de la RNA par rapport aux colorants aqueux. Enfin, pour l’extraction de l’ARN des ganglions capturées, nous avons observé des différences entre les kits commerciaux RNA extraction qui a donné quantité de RNA supérieure et de la qualité, tout en éliminant l’ADN contaminant. Optimisation de ces facteurs dans le protocole actuel grandement accélère le flux de travail et donne des échantillons de ganglia entérique avec une qualité exceptionnelle RNA et quantité.
Introduction
Cette méthode est conçue pour obtenir des échantillons d’ARN de haute qualité de ganglia entérique de tissu intestinal humain à l’aide de microdissection de saisie de laser (LCM). Le protocole décrit ici a été optimisé pour fournir suffisamment de qualité RNA et de rendements pour l’ARN (RNA-seq) de séquençage et est destiné à être utilisé avec tissu intestinal humain fraîchement réséqué, interprétation, éclair gelé.
Troubles de la motilité gastro-intestinale et intestin fonctionnel affectent une des quatre personnes aux Etats-Unis. Le système nerveux entérique (ENS), également dénommé le deuxième cerveau1, est souvent au centre de ces troubles, car elle joue un rôle crucial dans l’homéostasie intestinale et la motilité. Manipulation de motilité intestinale a été généralement limitée à une résection chirurgicale du tissu aganglionnaire/non contractiles, modification de l’alimentation chronique et/ou médicaments. Étonnamment, le transcriptome complet de l’ENS adulte reste à être séquencé, limitant grandement notre capacité à identifier des molécules au sein de l’ENS peut être ciblé pharmaceutiquement ou utilisés dans les thérapies de cellules souches.
Il y a relativement peu de méthodes pour isoler l’ARN de ganglions entériques humaines. La première approche, de dissociation cellulaire2, nécessite de hautes températures et temps d’incubation longue ; les deux qui sont connus pour favoriser la dégradation de l’ARN et altérer le transcriptome2,3. Une approche alternative, LCM, plus fiable préserve le transcriptome et protège l’intégrité de la RNA. Bien que plusieurs études ont utilisé des LCM pour recueillir les ganglions du tissu intestinal humain frais congelé4,5,6, ces approches ont été soit contrariées par la mauvaise qualité de RNA et la quantité, étaient tout à fait beaucoup de travail, ou besoin de modification de coloration ou de techniques d’extraction de RNA pour travailler dans nos mains. Autres protocoles de LCM conçus pour préserver la RNA qui ont été trouvés dans des produits LCM manuels fournis des améliorations supplémentaires7,8, mais l’adaptation était nécessaire lorsqu’il est appliqué à l’isolement de ganglia entérique8, 9. pour ces raisons, nous avons développé un protocole optimisé basé sur ces ressources qui donne des quantités substantielles de l’ARN haute intégrité de ganglions entériques humaines, possède un flux de travail relativement rapide et produit des résultats cohérents dans l’ensemble une grande nombre d’échantillons.
Dans cette étude, nous présentons un résumé des procédures optimisées qui facilitent l’isolement de l’ARN haute intégrité de ganglia entérique provenant de tissu intestinal humain réséqué. Notre méthode intègre cinq aspects importants. Tout d’abord, fraîchement réséqué, interprétations échantillons intestinaux humains doivent être coupés à la taille, avoir tous les excès d’humidité enlevées avec un laboratoire et aplati dans un grand moule avant flash-gel au sommet d’une bouillie de glace sèche et 2-Méthylbutane (2 Mo). Deuxième coupes histologiques de l’intestin doivent être prêts à obtenir le plan complet du plexus myentérique sur une lame, qui offre une grande charge de ganglia entérique. Succès avec cette étape dépend en grande partie le processus de préparation des tissus. Troisièmement, la structure non uniforme des ganglions dans l’ENS nécessite l’utilisation du polyéthylène napthalate (PEN) membrane diapositives6, qui offrent la plus grande vitesse et la précision lors du processus de LCM. Quatrièmement, compatibles avec l’éthanol colorants, comme le Violet de crésyle, devraient servir à préserver l’intégrité de RNA tout coloration ganglia entérique. Enfin, le processus d’extraction de RNA est essentiel pour un résultat positif avec RNA-Seq. Nous avons tenté une approche d’extraction d’ARN qui produit haute intégrité de RNA, optimise les rendements de RNA lors du démarrage avec petites collections de ganglia entérique, élimine la contamination de l’ADN et conserve des espèces d’ARN autant que possible.
Pris ensemble, optimisation de ces facteurs dans la présente étude grandement accélère le flux de travail et donne des échantillons des ganglions entériques avec exceptionnel RNA quantitatif et qualitatif. Résultats ont été largement compatibles parmi un groupe important d’échantillons, ce qui indique la cohérence de cette approche. En outre, nous avons utilisé ces approches pour séquencer avec succès des dizaines d’échantillons d’ARN de ganglia entérique. Les stratégies mis en évidence ici aussi largement adaptable pour LCM des ganglions désirées ou noyaux de périphérique et du système nerveux central et autres cas nécessitant l’isolement de l’ARN de haute qualité.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tous les protocoles décrits ici ont été approuvés par la Vanderbilt University Institutional Review Board (IRB).
1. préparation avant l’arrivée de tissus
- Obtenir l’approbation de la CISR appropriée et coordonner avec les organismes de Don organe humain pour obtenir fraîchement réséqué, interprétation de tissu intestinal provenant de donneurs qui répondent à tous les critères de recherche nécessaires à l’étude.
Remarque : Ce protocole peut être adapté pour être utilisé sur des souris et autres modèles de rongeurs.- Immédiatement après la résection de chaque segment intestinal, rincer abondamment la lumière avec PBS réfrigérés ou sur un support-tissu pour enlever luminale de matières résiduelles et les matières fécales.
- Après rinçage et jeter les déchets dans un récipient approprié biohazard, plonger le tissu dans un volume suffisant de tissu-support (par exemple de 3 à 5 fois le volume de tissu intestinal) et stocker en plastique marquées individuellement, étanche à l’eau conteneurs, immergé dans la glace ou au réfrigérateur jusqu'à l’utilisation).
- Traiter le tissu dans les 18-26 heures depuis le moment de la collecte pour empêcher la dégradation substantielle de l’ARN.
Remarque : Selon la propreté du segment intestinal et de stockage, il peut être possible d’étendre notre délai suggéré.
- Préparer tout le matériel nécessaire pour la collection de tissus humains à l’avance, comme indiqué dans le présent protocole (voir la Table des matières pour des informations produit plus détaillés). Garantir que tous les équipements de protection individuelle est porté en tout temps.
- Préparer des seaux de glace sèche avec une bouillie de glace carbonique comme illustré à la Figure 1.
- Écraser assez carboglace pour remplir des seaux à glace circulaire standard 4 et un seau à glace rectangulaire. L’un des seaux standards devrait avoir laboratoire de petite taille (11 x 21 cm) tissus placés à la surface de la glace sèche. Si possible, utilisez des boîtes neuf, non ouverts, des tissus de laboratoire.
- Faire une bouillie de glace sèche par powderizing 2 L de glace carbonique dans un seau à glace propre rectangulaire.
- Ajouter préalablement réfrigérée 2 Mo jusqu'à la surface de la glace sèche. Mélanger et aplatir la pâte à l’aide d’un couvercle de boîte de pointe de pipette à surface de forme de la boue dans un canal entouré de gros morceaux de glace sèche le long des côtés du seau rectangulaire légèrement.
- Placer plusieurs blocs minces de glace sèche sur les bords de la seau à glace pour encourager la congélation plus rapide. Il devrait y avoir place pour ≥ 4 moules base adapter souplement dans le seau de boue de neige carbonique à un moment donné.
- Éventuellement, pile le seau à glace dans un autre seau à glace rectangulaire remplie ¼ avec neige carbonique. Ce positionnement permet de mieux isoler la boue de neige carbonique et évite la nécessité d’ajustements fréquents de glace sèche et 2 Mo au cours de la procédure.
- Positionner les seaux de glace sèche dans une chaîne de montage dans l’ordre suivant : 1) glace seau de lisier, seau à glace 2) laboratoire tissu sec, 3 & 4) normal sec seaux à glace, seau de glace 5) rectangulaire (Figure 1A).
2. préparation du tissu Intestinal humain congelé Flash
Remarque : Tout ce processus peut prendre entre 45-80 min par segment intestinal, en fonction de la qualité de tissu intestinal. Nous vous recommandons également le prélèvement d’échantillons de contrôle de la qualité afin d’évaluer la qualité de RNA et histologie avant de procéder à la LCM.
- Remplir un grand plateau de glace humide et placez les planches à découper chirurgicale au sommet de la glace sèche.
- Dans cette configuration, faites refroidir un béchers de 500 mL et 100 mL pour stocker les tissus et les segments taillées dans une solution d’entreposage au froid. Base de pré refroidissement éolien moules sur les planches à découper afin qu’ils soient prêts à recevoir des tissus.
- Après avoir reçu les tissus intestinaux frais, décanter les médias dont le tissu est transporté et conservez-le dans les béchers préalablement réfrigérées. Laisser une certaine marge dans ces gobelets pour le stockage temporaire des tissus intestinaux et segments ajustées, qui seront préparés dans les étapes suivantes.
- Couper le segment intestinal sur une longueur d’environ 20 cm, ce qui fournit un grand tissu (40 à 60 cm2) pour générer des RNA pour applications en aval et des échantillons de contrôle de la qualité. Selon l’intégrité des tissus, il peut être possible de réaliser des ARN pour le traitement en aval d’une beaucoup plus petite longueur (c.-à-d., 5 cm de l’intestin).
- Tailler loin tissus adipeux et le tissu conjonctif de l’intestin à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Adipeuse le long de la séreuse intestinale résiduelle compromet la capacité d’aplatir complètement le tissu dans les étapes suivantes. Couper avec précaution le tissu, afin d’éviter les entailles de la séreuse au moment du retrait de la graisse et du tissu conjonctif, qui peut structurellement endommager le plexus myentérique ou qui rendent à l’extérieur du tissu aplatir inégalement pour le sectionnement.
- Faire une incision longitudinale sur toute la longueur de l’échantillon intestinal, préférablement sur le site d’attachement mésentérique.
- Disséquer de loin et jeter le coli ténia du colon, afin qu’il s’aplatit plus facilement, dès sa sortie de tension.
- S’écrasent la muqueuse intestinale du côté vers le bas sur une planche à découper réfrigérés et couper des bandes de 1,25 cm de large de toute la longueur du tissu.
Remarque : Tissu Intestinal développe souvent après massicotage, alors cette taille doit être ajustée en conséquence. - Stocker temporairement les bandes dans la solution de stockage réfrigéré sur le tissu.
Remarque : Nous utilisons Belzer UW cold storage solution car il a une longue durée de vie, peut être relativement intéressant et peut être conservé à température ambiante jusqu'à ce que nécessaire. - Supprimer une bande de tissu de la solution de stockage de froid et le découper en segments ~1.5-2 cm de long.
- Rapidement, épongez les segments intestinaux sur une pile de lingettes de laboratoire, pour enlever l’excès de liquide et éviter la formation de cristaux de glace le long de la séreuse intestinale au cours du flash-gel. Si le tissu n’est pas suffisamment séché, il sera difficile d’obtenir des Articles de haute qualité du plexus myentérique.
- Déposer la buvardages pièces intestinale muqueuse-face vers le haut sur un pré réfrigéré, grand, jetable en plastique moule (37 x 24 x 5 mm).
- Aplatissez soigneusement chaque segment par légèrement étirer le tissu sur la surface de la moule et avec une pincette courbée à doucement enfoncer et expulser les bulles d’air qui peuvent être pris au piège sous la séreuse. Notez que le tissu se développe tout en aplatissant. Si nécessaire, découper les segments et couper les échantillons restants à une taille plus petite.
Remarque : Si le tissu est trop tendu, cela faussera le plexus myentérique. Après que toutes les bulles d’air sont enlevés, évaluer l’épaisseur de l’échantillon avant la congélation. Si nécessaire, appuyez sur les bords du entrant spécimen jusqu'à ce que l’échantillon intestinal aborde son épaisseur d’origine. - Placer le moule chargé sur la surface de la glace sèche, boue de 2 Mo. Le tissu doit complètement figer dans 30 à 60 s, selon la taille et l’épaisseur du segment intestinal.
- Essuyez le fond de la moule pour enlever 2 Mo résiduel en frottant rapidement le moule sur les tissus de laboratoire préalablement refroidis dans le deuxième seau de glace sèche.
- Transférer l’échantillon séché à la troisième cuve de glace sèche et l’enterrer sous la surface de la glace sèche jusqu'à ce qu’il est prêt à être emballé.
- Rapidement observer le fond de la moule avant emballage, afin d’examiner la qualité de la préparation de l’échantillon. Prenez note de tous les échantillons qui ne pas apparaître plat ou avoir des bulles d’air important, que ceux-ci devraient être évités pour cryosectioning et LCM.
- Envelopper l’exemple dans une feuille d’aluminium préalablement étiquetées qui est présentée au sommet de la glace carbonique dans un seau, pour que l’enveloppe de tissus se produit tout en étant complètement congelés.
- Envelopper l’échantillon avec une couche de film plastique, pour minimiser la déshydratation des tissus au cours du stockage à-80 ° C.
- Conserver les échantillons dans le seau rectangulaire jusqu'à ce qu’elles sont prêtes à être déplacés vers le congélateur.
- Étiqueter pré et pré chill boîtes de congélateur à-80 ° C pour assurer immédiatement le stockage des échantillons après le prélèvement.
- Prendre une petite partie du tissu de chaque segment intestinal pour évaluation de l’intégrité de la RNA avant la tenue de LCM.
- Étiquette avant un tube de RNase-libre de 2mL pour chaque segment, rempli de ≥500 µL de tampon de lyse. Nous vous recommandons d’utiliser le Kit d’Extraction d’ARN « D », énuméré dans la Table des matières.
- Homogénéiser un morceau de grêle (2 x 2 mm) de l’intestin dans un tissu standard micro-homogénéisateur (20-40 s, jusqu'à ce qu’aucun morceaux de tissu). Puis, immédiatement geler l’ARN lysat sur glace sèche et de conserver à-80 ° C jusqu'à ce que de procéder à l’extraction de l’ARN.
- Éventuellement, incorporer certaines des sections dans le milieu de congélation des tissus (TFM) sous forme d’un back-up. Préparer des coupes de tissus dans exactement la même manière décrite dans cette section, mais submerger les échantillons à TFM dans le moule avant le flash du point de congélation.
3. Cryosectioning
- Avant cryosectioning, préparer tout matériel requis pour la coloration et la déshydratation et transférer les échantillons de tissu souhaité du congélateur à-80 ° C dans un seau de glace sèche.
- Préparer le cryostat pour utilisation en affectant la température de coupe optimale (-18 à-22 ° C) et essuyer les surfaces avec 100 % d’éthanol et traitement de la lame et la brosse plateau avec la solution de décontamination de RNase.
- Pour mieux respecter l’échantillon au mandrin, utiliser l’approche suivante.
- Placer la pince à glace sèche pendant au moins 30 s avant de déballer l’échantillon intestinal et en le plaçant à la surface de la glace carbonique séreuse-côté-vers le haut.
- Verser un monticule de 3 à 5 mm de tissu gel milieu (TFM) sur un porte-échantillon cryostat grand et transférer immédiatement l’échantillon intestinal séreuse-côté-vers le haut sur la TFM.
- Transférer rapidement le porte-échantillon à la glace sèche et recouvrir de carbonique réduit après avoir laissé la TFM à adhérer à l’échantillon pour 2-5 s à température ambiante. Assurez-vous que la TFM reste au-dessous du plan du plexus myentérique.
NOTE : Idéalement, la surface extérieure de la muqueuse intestinale entièrement adhérera à la TFM avant la TFM commence à geler sans dégel de l’échantillon.
- Monter le porte-échantillon dans la tête de l’objet du cryostat et aligner l’échantillon avec la lame du cryostat, tels que le plan du plexus myentérique sera parallèle à la lame de coupe.
- Définir l’épaisseur de coupe sur le cryostat à 8 µm. Le but d’aligner parfaitement le spécimen est d’obtenir la plus grande surface possible du plexus myentérique sur chaque diapositive. Cette épaisseur est généralement recommandée pour les tissus humains et rongeurs, mais peut être ajustée, au besoin.
- Article par le biais de la séreuse et le muscle longitudinal jusqu'à atteindre le plexus myentérique.
- Pour localiser le plexus myentérique, monter une section de l’échantillon sur une lame et tacher la section avec un colorant aqueux, par exemple 1 % Cresyl violet ou bleu de toluidine, etc.
- Consulter la section sous un microscope optique à grossissement 40-2000 X pour identifier la jonction entre les couches de muscles longitudinaux et circulaires. Paramètres de microscope sont fournis dans la Table des matières. Au début de la section, la séreuse sera marquée par la présence de tissu conjonctif. Certains gras mésentérique restant peuvent être également présents le long de la séreuse. Une feuille de la couche musculaire longitudinale externe commence alors. Après avoir atteint la frontière entre les couches de muscles longitudinaux et circulaires, on observera une partie des ganglions entériques.
Remarque : Dans les prochaines sections de plusieurs, le plexus myentérique deviendra très évident, avec grandes étendues de ganglions étant présent dans une seule section (Figure 2C). Si le tissu n’est pas complètement à plat au début de la section, alors qu’une partie des ganglions sera présente dans chaque section à un moment donné. Parfois, l’échantillon intestinale peut avoir un plexus myentérique intrinsèquement inégaux, malgré le tissu apparaissant parfaitement plane. Cela est particulièrement vrai pour les échantillons du duodénum. Dans notre expérience, ces échantillons peuvent prendre beaucoup plus de temps pour traiter avec LCM, mais RNA suffisante peut être rassemblée au sein de la session d’un seul jour. L’emplacement exact du plexus myentérique peut varier considérablement entre les échantillons, basés sur le tissu et sa préparation avant la congélation.
- Commencer à percevoir des coupes sériées pour LCM, avec des collections optimales offrant le plus grand nombre de neurones et cellules gliales par diapositive. Selon la surface de l’échantillon, plusieurs sections peuvent être combinées sur une seule diapositive PEN-membrane.
- Monter les sections sur glissières de membrane PEN, réfrigérées brièvement dans le cryostat pour 5-10 s. Lors du montage, le tissu devrait fondre légèrement, en préservant au maximum l’intégrité RNA.
4. coloration
Remarque : Pour une vue d’ensemble du processus de coloration, reportez-vous au tableau 1. Toutes les solutions utilisées sont préparées en standards 50 mL fioles coniques. Traitement à l’extérieur des tubes avec la solution de décontamination de RNase ne semble pas améliorer les résultats (données non présentées).
- Préparer une solution saturée de violet de crésyle 4 % dans l’éthanol à 95 % au moins une journée à l’avance et bien remettre en suspension le violet de crésyle avant le chargement de la seringue.
Remarque : La concentration d’éthanol peut doivent être réduites pour la coloration efficace, tel que décrit dans la section « discussion ». Nous n’avons pas testé si utilisant l’éthanol 50 % ou 75 % au cours de coloration nettement réduit l’intégrité RNA. Violet de crésyle est sensible à la lumière et doit donc être protégé de la lumière. - Après avoir monté les sections du plexus myentérique sur le toboggan, immédiatement plonger la lame dans une fiole conique d’éthanol à 95 % (préalablement refroidi à-20 ° C) pendant 30 s.
- Si les sections n’adhèrent pas en totalité à la diapositive à l’étape précédente, le réchauffer légèrement le bas de la lame avec une main gantée (une lingette de laboratoire doit être placé entre les deux la diapositive et gant), l’adhérence complète avant de plonger dans l’éthanol à 95 %. Cette solution peut être réutilisée pour au moins 3-6 diapositives sans réduire l’intégrité RNA.
- Posez la lame face vers le haut sur une lingette de laboratoire placée au sommet d’un conteneur pré-traité, exempte de RNase8.
- Remplir à l’avance une seringue de 3mL avec 4 % violet de crésyle et fixer un filtre de seringue 0,2 µm.
Remarque : Nous vous recommandons les filtres acétate de cellulose. - Appliquer 6 à 10 gouttes de colorant directement sur le tissu les sections8 et incuber pendant 10-30 s, ou jusqu’au colorant suffit est conservée quand le teint. Tout en coloration, tourner doucement le récipient de la diapositive à la main pour s’assurer que les sections de tissu sont uniformément recouvert de taches.
- Décanter la tache et immédiatement la tache la lame dans un flacon d’éthanol 75 %. À plusieurs reprises de submerger la diapositive jusqu'à ce que le colorant excédentaire pour la plupart s’est infiltrée hors de l’échantillon. Cela peut prendre entre 10-20 s.
- Finaliser la coloration par maintes fois immersion l’échantillon dans un flacon d’éthanol à 95 % pendant 10 s. Submerge l’échantillon à plusieurs reprises jusqu'à ce que tous les excès tache a été supprimé.
- Modifier la durée de décoloration, au besoin, afin d’optimiser la coloration des ganglions. Si trop tache est enlevée, l’échantillon devient trop transparent et il peut être difficile à visualiser
Remarque : Ce protocole de coloration a été optimisé basé sur plusieurs publications5,8,10,,11 qui prévoit être modifiés avant que des résultats satisfaisants ont été obtenus. Par conséquent, la concentration d’éthanol utilisé dans la teinture et Pendant le processus de décoloration devrait être modifiée, si nécessaire, pour obtenir un résultat optimal.
- Modifier la durée de décoloration, au besoin, afin d’optimiser la coloration des ganglions. Si trop tache est enlevée, l’échantillon devient trop transparent et il peut être difficile à visualiser
5. la déshydratation
- Tremper immédiatement la lame dans de l’éthanol 100 % 2 - 3 fois, pour un total de 10-20 s.
- Plonger la lame dans l’éthanol anhydre 100 % pendant au moins 30 s. Comme l’éthanol anhydre est très hygroscopique, ajouter tamis moléculaires (maille de 8-12) dans le flacon d’éthanol à 100 % avant le début de la procédure pour enlever toute l’eau absorbée et donc plus complètement déshydrater l' échantillon5.
- À plusieurs reprises tremper la lame dans le xylène pour 15-20 s. Cette étape supprime complètement la couche de l’éthanol sur la diapositive. Ajouter des tamis moléculaires avance aux tubes du xylène, d’adsorber entièrement les excès d’éthanol et d’eau molécules5.
ATTENTION : Les xylènes sont classés comme un irritant pour les yeux et les voies respiratoires et doivent être utilisés dans une hotte chimique. - Plonger la lame dans le xylène (avec des tamis moléculaires, maille de 8-12) pendant au moins 10 min.
Remarque : Une brève pause peut être prise après cette étape, si nécessaire. Des échantillons peuvent être laissés dans le xylène pendant 4-5 heures sans effets néfastes aux taches, LCM ou ARN rendement/intégrité. - Facultativement, individuellement préparer plusieurs diapositives supplémentaires à ce stade. Si vous préparez une deuxième série de diapositives après avoir terminé de LCM sur toutes les lames préparées, le tissu dans le cryostat devrez peut-être être rectifiés, due à une déshydratation de la surface du tissu. Un à quatre sections peuvent doivent être jetés avant les sections utilisables peuvent être collectées.
6. laser Microdissection de saisie (LCM)
- Retirez la lame de xylène et sécher à l’air elle sous une hotte chimique pendant au moins 1 min. Insérer une cartouche de bouchons de LCM sur la platine du microscope LCM. Chargez la lame sur la scène et acquérir une image d’aperçu de la diapositive.
- Identifier l’emplacement désiré pour LCM et charger un capuchon sur la diapositive.
- Aligner le laser infrarouge (IR) et d’ajuster sa puissance et sa durée pour faire 20 à 30 µm de diamètre capturer spot.
- Localiser le laser ultraviolet (UV) et définir une vitesse de coupe approprié et l’intensité.
- Décrire les ganglions désirées à percevoir à l’aide du logiciel de LCM, en veillant à rester dans les limites de la zone percevable sur la PAC (représentée dans l’aperçu de la diapositive du logiciel comme un cercle vert).
- Dans chacune des traces, ajuster les taches IR telles qu’il y a au moins un IR repérer chaque 100 à 500 µm.
- Appuyez sur le bouton coupe de IR/UV pour procéder à la collecte de tous les ganglions marquées.
- Une fois que les collections sont complétées, soit passer le cap vers un nouvel emplacement et répéter le processus de collecte ou examiner la PAC LCM à la station QC lorsque le bouchon est suffisamment rempli avec les ganglions (ou jusqu'à ce que soit atteinte la limite recommandée de temps de 60 à 80 minutes).
- Si les débris sont présents sur la PAC, l’essuyer loin à l’aide d’un pinceau à pointe fine qui a été préalablement traité avec la solution de décontamination de RNase, rincé avec de l’eau exempte de nucléase et complètement sec.
- Examiner soigneusement le bouchon par œil ou grossissement sous un champ lumineux de microscope pour s’assurer que tous les débris a été supprimé. Si les débris ne peuvent être enlevés en utilisant le pinceau pré-traité, utilisez une fine de pipette (RNase-libre) pour gratter les débris.
- Fixer le couvercle sur un tube à centrifuger 0,5 mL rempli de 230 µL de tampon de lyse RNA (tampon RLT de Kit d’Extraction d’ARN « B », avec la β-mercaptoéthanol ajouté à une concentration de 10 µL/mL).
- Inverser le cap, brièvement vortex et incuber à température ambiante pendant 30 min.
- Centrifuger à ≥ 5 000 x g pour 5 min et puis transfert les microtubes tube de glace sèche.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. RNA lysats peuvent être stockées à-80 ° C sans un effet substantiel sur la dégradation de l’ARN pendant au moins 1 semaine. Si l’ARN est effectuée le jour même, puis faites refroidir les échantillons sur la glace jusqu'à ce qu’ils sont prêts pour l’extraction. - Effectuer toutes les collections supplémentaires dans la limite de temps maximale recommandée de 80 à 90 min après avoir retiré la diapositive du xylène. Comme les sections déshydratées sont exposées à l’humidité ambiante, ribonucléases peuvent progressivement devenir réactivées. Restreindre la période de collecte peut réduire au minimum ces effets et préserver au maximum l’intégrité RNA.
7. les ARN
- Préparer un poste de travail libre de RNase pour les extractions de RNA.
- Préparer tous les tubes et les réactifs selon le manuel pour le Kit d’Extraction d’ARN.
Remarque : Bien qu’il existe de nombreux kits disponibles pour ARN suite LCM, nous avons eu les meilleurs succès en utilisant le Kit d’Extraction d’ARN « B », figurant dans la liste du matériel. Voir la Figure 5 pour une comparaison côte-à-côte des réactifs d’extraction RNA. - Prélèvement d’échantillons du congélateur à-80 ° C et décongeler rapidement dans un bain-marie à 37 ° C.
- Immédiatement le vortex décongelés échantillons pour 2-3 s pour répartir les sels de sulfocyanure de guanidinium.
- Mélanger chaque échantillon avec un volume égal d’éthanol à 70 %. Regrouper des lysats de 2 ou plus, si nécessaire, pour atteindre une concentration suffisante d’ARN.
- Procéder selon les instructions du fabricant dans le manuel pour le procédé d’extraction de RNA, utilisant le protocole optimisé pour échantillons microdissected.
- Éluer l’ARN à l’étape finale dans le volume minimum conseillé d’eau exempte de nucléase (14 µL).
- Après isolement d’ARN, aliquote 1-2 µL d’ARN de chaque échantillon dans un nouveau pré étiquetés tube exempt de RNase qualité évaluation/contrôle de qualité avec un dispositif microfluidique qui peut visualiser de petites quantités d’ARN, comme un Bioanalyzer. Aliquoter une supplémentaire 1 µL dans une éprouvette distincte pour la quantification avec un kit de quantification ARN haute sensibilité.
- Réglez ces étapes, si nécessaire, pour obtenir une quantité suffisante de l’ARN pour analyse en aval (i.e., mettre en commun un grand nombre de sélections de LCM avant l’extraction de l’ARN).
- Magasin RNA à-80 ° C jusqu'à recueillir suffisamment d’échantillons pour analyse en aval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nous avons apporté plusieurs améliorations aux protocoles existants qui permettent la collecte relativement rapide des ganglions entériques à partir des échantillons intestinaux humains utilisant LCM, répondant aux normes pour RNA-Seq. Tout d’abord, nous avons optimisé la congélation rapide des segments de tissu intestinal dans les grands moules base placées à la surface d’une bouillie de glace sèche dans 2 Mo (Figure 1B). Le meilleur succès pendant cryosectioning et LCM subséquente a été obtenu par la pose des segments intestinaux plat dans un moule, face à la muqueuse-vers le haut (figure 1 b-1c). Veiller à ce que les moules de base sont aussi plates que possible à la base, comme toute courbure rendra beaucoup plus difficile d’obtenir une frange importante de plexus myentérique. Cette approche se traduit dans le tissu qui est facilement sectionné à l’épaisseur de 8 µm (Figure 1-E) et permet l’élimination complète des TFM du processus de coloration. Nous avons trouvé que TFM interfère avec le processus de coloration et obscurcit ainsi l’identification des ganglions entériques. Positionnement du tissu dans cette orientation permet également d’éviter de sectionnement à travers la muqueuse, qui a une teneur élevée de ribonucléases12, bien que selon notre expérience, il apparaît que l’utilisation des taches dans l’éthanol inhibe en grande partie ces RNases. Dans les cas où TFM ou la température optimale de coupe moyenne (OCT) est nécessaire, nous l’avons trouvé plus fiable pour aplatir tout d’abord l’échantillon au fond de la moule, puis ajouter la TFM au moule suite à cette étape (Figure 1D). Cela laisse une « fenêtre » dans lequel l’intestin peut être facilement visualisée, rendant facile à aligner le spécimen et produire des sections qui sont complètement parallèles au plexus myentérique (Figure 1E).
Préparation des cryosections longitudinalement vers le bas de la longueur de l’intestin dans une orientation parallèle au plexus myentérique (Figure 2A), génère des sections où la plus grande superficie de ganglia entérique par diapositive sont visibles lors d’une coloration) Figure 2 C). en approchant le plexus myentérique (Figure 2C), à l’apposition des couches de muscles longitudinaux et circulaires (Figure 2B), 6-12 coupes sériées peuvent être collectées (Figure 2A, longitudinale) qui contiennent de grandes étendues de ganglia entérique (Figure 2C). Casquettes de LCM peuvent être chargées à la capacité à l’aide d’une seule section (Figure 4D). En revanche, lors de la préparation des coupes transversales de frais-congelé intestin (Figures 2 a-2 b), il y a seulement une petite zone du plexus myentérique présent sur chaque diapositive (Figure 2B). Ganglia entérique très peu peut être prélevés sur des sections de tissu transversale, résultant en plus temps investi et le coût plus élevé par exemple global. L’approche parallèle-sectionnement utilise moins d’un cinquième du nombre de caps de LCM et glisse en comparaison avec des sections transversales et accélère grandement le processus de collecte.
Avant LCM, échantillons doivent être colorées et complètement déshydratés pour éviter l’activité RNase pendant la collecte de LCM. Nous avons conçu une expérience visant à comparer directement l’effet des taches aqueuses vs éthanoliques taches sur l’intégrité de la RNA. Dans cette expérience, deux sections intestinale étaient montées ensemble sur une seule diapositive et ont été traitées dans l’une des quatre façons, avec n = 2-3 répétitions biologiques par groupe. Dans le premier groupe, sections intestinales fraîches n’étaient pas montées sur une lame, et chacun a été transféré directement dans le tampon de lyse RNA avec une pincette exempte de RNase préalablement refroidie sur la glace sèche (Figure 3A). Pour tous les autres groupes, sections ont adhéré à une diapositive, traitées, grattées la diapositive à l’aide d’une lame de rasoir imprégnées de solution RNase décontamination et transféré au tampon de lyse RNA avec une pince de RNase-libre. Une norme micro-homogénéisateur servait à entièrement lyser les échantillons dans tous les groupes. Dans le second groupe, les diapositives ont été traitées à travers toutes les étapes, mais aucun colorant a été utilisé au cours de la procédure de marquage (Figure 3B). Trois groupes ont été traitées avec le protocole décrit ci-dessus, à l’aide de colorant violet de crésyle de 4 % (Figure 3C). Dans le quatrième groupe, une tache aqueuse, toluidine bleu, a été utilisée en suivant le protocole pour un kit de coloration à base aqueuse à l’aide d’un mélange de bleu de toluidine et l’hématoxyline (Figure 3D). Après l’extraction de RNA, tel que décrit, RNA qualité a été évaluée avec un Bioanalyzer. La seule différence entre l’aqueux et éthanoliques souillant des protocoles a été l’ajout de deux incubations d’eau (30 s de chaque), immédiatement avant et après la coloration, qui est nécessaire pour l’absorption et la rétention du colorant. Nous avons constaté que le processus d’adhérentes des sections de tissu à la diapositive et de traiter avec les étapes de la déshydratation conduits à une réduction légère, inévitable de qualité RNA (Figures 3 a-3 b), mais que la coloration avec le colorant dans l’éthanol, violet de crésyle, n’est pas plus loin réduire la qualité de RNA (Figure 3C). En revanche, le colorant aqueux, le bleu de toluidine, conduit à importante dégradation de l’ARN, probablement due à une exposition prolongée aqueuse qui permet une activité RNase endogène (Figure 3D).
Les formes uniques de ganglia entérique soulèvent des difficultés pour IR-LCM standard avec verre classique diapositives6 (Figure 4A). Lorsque vous utilisez des diapositives PEN-membrane (Figure 4B), les échantillons sont respectées une feuille mince qui se détache de la majorité de la lame de verre. Le laser UV traverse l’échantillon et membrane de stylo, entraînant le détachement complet des ganglions de la lame (Figure 4-C) et l’adhérant pleinement à la PAC de LCM (Figure 4D). Structures de tout désiré la taille et la forme (> 10 à 15 µm) peut être complètement et précisément recueillies (Chiffrée 4E-4 H). Pour certains échantillons avec des ganglions de moins par section, le bouchon peut être ≥ déplacé quatre fois avant de recueillir. Dans ce cas, deux ou trois sections par lame de montage minimise l’utilisation de diapositives PEN-membrane.
Lorsque isoler l’ARN provenant d’échantillons de LCM pour RNA-seq, le but est d’obtenir la meilleure qualité possible de RNA et de la quantité, tout en éliminant tout génomiques (ADNg). Pour identifier une méthode d’isolement de RNA idéale, nous avons effectué une comparaison entre avec un Kit d’Extraction d’ARN « A » (Figure 5A), Kit d’Extraction d’ARN « B » (Figure 5B), ou la méthode d’Extraction d’ARN « C » avec clean-up de l’échantillons d’ARN par Kit d’Extraction d’ARN « B » (Figure 5C). Après le traitement des échantillons avec le violet de crésyle optimisé souillant le protocole, LCM a servi à recueillir des échantillons standardisés circulaires (diamètre de 500 µm) de tissu intestinal, tiré de la couche musculaire longitudinale. Chaque bouchon a été assigné au hasard à chacun des trois groupes d’isolement RNA, étant placés au sommet d’un tube à centrifuger de 0,5 mL rempli au préalable avec le tampon de lyse respectifs de chaque kit. Les instructions ont été suivies à la lettre comme décrit pour chaque kit, avec le Kit d’Extraction d’ARN « Un » tampon de lyse nécessitant une incubation à 42 ° C pendant 30 min. Pour les autres kits, température ambiante incubation a été utilisée pendant 30 min. Tous les échantillons ont été brièvement mixés par addition de tampon de lyse. Les échantillons avaient ensuite froid sur la glace jusqu'à ce que les extractions ont été réalisées le même jour (n = 4). Nous avons trouvé que le Kit d’Extraction d’ARN « B » avec une étape de digestion de l’ADN sur colonne a entraîné dans la plus haute qualité de RNA et de la quantité tout en éliminant efficacement ADNg (Figures 5 a-5C). Ce qui est important, le tampon de lyse RNA fourni par le Kit d’Extraction d’ARN « B » entièrement lyse les ganglions capturées lors de la collecte de ganglia entérique (Figure 5D).
En moyenne, nos échantillons ont un RIN de 7,49 ± 0,53 (tableau 2). Scores RIN de plus de 6-7 sont réputées de qualité suffisante pour RNA-seq (en fonction du profil spécifique de RNA)13, ce qui nous donne confiance que nos échantillons sont d’une qualité suffisante pour RNA-Seq. considérant que le RIN pour ces échantillons, dès réception, a varié de 7,4 à 9.5, ces résultats indiquent que notre protocole optimisé fournit excellente conservation de l’intégrité de la RNA. Des résultats de qualité de RNA représentatifs d’échantillons présentés à RNA-seq sont représentés dans les Figures 6 a-6c. Résultats de RNA-seq démontrent que nos échantillons ont été séquencées avec succès et ont un biais modeste extrémité 3'-(Figure 6D). Généralement, un plus grand 3'-biais est favorisé dans les échantillons avec bas RIN14; cet effet est modérément reflété dans nos échantillons. Malgré cela, les biotypes de gène observées étaient largement compatibles parmi tous les échantillons (Figure 6E), ce qui indique la fiabilité des données.
Figure 1 . Congélation de tissu intestinal optimal. Seaux à glace sèche (A) sont préparés dans l’ordre représenté ; J’ai) coulis de glace sèche, tissus laboratoire ii) placées au sommet de la glace sèche, seau de stockage iii) temporaire, iv) conditionnement seau, seau de stockage du congélateur avant v), seau de dépassement de capacité de stockage de vi) congélateur avant. (B) nous avons optimisé la congélation rapide des segments de tissus en gros moules base placées à la surface d’une bouillie de glace sèche et 2-Méthylbutane. (C) une image de plus près en place d’un spécimen complètement gelé, observé dans la configuration indiquée dans panneau B. Intestinal segments sont mis à plat dans un moule muqueuse-face vers le haut. (D), cette méthode de congélation peut être facilement adapté pour être utilisé avec TFM en préparant le tissu de la même manière, mais en y ajoutant des TFM pour le moule avant de la congeler. L’échantillon qui en résulte aura un plexus myentérique complètement à plat, avec une séreuse qui peut être facilement visualisé. (E), les deux préparation tissulaire approches produisent des sections de tissu excellente à l’épaisseur recommandée 8 µm. La procédure à l’aide de TFM est représentée ici. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . L’orientation correcte de tissu intestinal fournit des sections riches en ganglions entériques. Lors de la préparation des coupes transversales standards de frais-congelé intestin (A, B), il y a seulement une petite zone du plexus myentérique (B) présent sur chaque diapositive. Très peu de ganglia entérique peut être collectées par lame, qui est lente et coûteuse. En revanche, préparation des coupes longitudinales dans le plan du plexus myentérique (C), offre une beaucoup plus grande surface de ganglions (C). Sections du plexus myentérique sont obtenues en partant de la séreuse et sectionnant vers l’intérieur à travers le muscle longitudinal (B). Lorsque vous approchez le plexus myentérique, à la jonction de la couche de muscles longitudinaux et circulaires (B), 6-12 coupes sériées peuvent être collectées. Chaque section longitudinale de plexus myentérique contient de grandes étendues de ganglia entérique (représenté en C, en utilisant une méthode de coloration modifiée, sans xylène, teinter préférentiellement les ganglions). Casquettes de LCM peuvent être remplis à capacité, à l’aide d’une section de tissu unique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Coloration avec un colorant compatibles avec l’éthanol améliore la qualité de la RNA. Qualité de RNA a été mesurée par le Bioanalyzer et des résultats représentatifs de deux échantillons provenant de chaque groupe sont affichés. Qualité de RNA initiale mesurée à partir de sections de frais, non montées (A, aucun traitement), avaient un nombre de l’intégrité du RNA (RIN) de 8,65 ± 0,07. Pour les sections montées et traitées à travers toutes les étapes, mais sans tache (B), RIN était 7.95 ± 0,35. Lorsque la coloration au violet de crésyle 4 % a été ajoutée aux étapes de la déshydratation, il y avait un effet négligeable sur le RIN, avec une moyenne RIN de 7,87 ± 0,35 (C). En comparaison, l’utilisation de la tache aqueuse, le bleu de toluidine (T-bleu) et l’ajout de rinçages d’eau nécessaire à la procédure (D) a entraîné une qualité RNA considérablement réduite, avec un RIN de 6,45 ± 0,21. Chaque groupe était composé de n = 3 répétitions biologiques à l’exception de « Aucun traitement » et « T-Blue"(n=2). RINs sont rapportés ici comme moyenne ± écart-type. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Diapositives de LCM PEN membrane permettent des collections précises de ganglia entérique. à l’aide de lames de microscope de verre régulier pour recueillir les ganglions entériques par LCM tend à provoquer Pick-up tissus indésirables (A). Les cercles rouges (30 µm de diamètre) indiquent la taille des taches IR LCM utilisés pendant le processus de collecte. La flèche blanche indique une collection de ganglion qui a arraché un morceau de tissu musculaire adjacent. Avec toboggans PEN-membrane (B), les échantillons sont respectées une feuille mince qui se détache de la majorité de la lame de verre. Lors de la coupe au laser UV-LCM, l’échantillon et membrane PEN sont découpés en tranches, ce qui entraîne le détachement complet des ganglions de la lame, quelle que soit la forme de ganglion (C) et terminer l’adhérence à la PAC de LCM lorsque retiré de l’échantillon (D ). Structures de tout désiré taille et la forme ≥ 10-15 µm peut complètement et précisément recueillies [(E), premier supplément de tissu ; Découpage au laser (F) IR et UV terminé ; Cap de LCM (G) supprimée de l’article], tel qu’il est visualisé sur le capuchon de LCM (H). Le fond moucheté dans panneau H est inhérent à la PAC et n’est pas des débris indésirables. Le réticule de cercles verts bleu en panneaux E-H font partie du programme LCM et est des espaces réservés pour les lasers UV et IR, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Sélection d’un kit d’isolation optimal d’ARN. RNA intégrité résultats apparaissent après une comparaison simultanée des trois procédures différentes d’isolement des RNA. Deux parcelles représentant de chaque groupe sont affichés pour illustrer la variabilité qui peut se produire entre les échantillons traités en parallèle. Kit d’Extraction d’ARN « A » (A) produit des échantillons avec un RIN de 6,83 ± 0,65 et fourni des rendements modérés de RNA et avaient tendance à avoir l’ADN contaminant, malgré l’exécution d’une digestion de DNase sur colonne. Kit d’Extraction d’ARN « B » (B) a donné lieu à la plus haut RIN mesuré, à 8,3 ± 0,1. Alors que la méthode d’Extraction ARN « C » (suivi de dépollution de l’échantillons d’ARN avec Kit d’Extraction d’ARN « B ») Phénol-basé (C) semble éliminer ADNg avait un RIN de 7,5 ± 0,26, on a grand contamine les bandes qui ont peuvent résulter de la fusion de la polymère adhésif du bouchon lors de l’étape de lyse RNA LCM. Plus loin, les rendements de RNA de Kit d’Extraction d’ARN « A » et « C » méthode d’Extraction ont été systématiquement inférieurs à ceux obtenus par le Kit d’Extraction d’ARN « B ». Ce qui est important, le RNA tampon de lyse fourni par le Kit d’Extraction d’ARN « B ». (avec ajout de β-mercaptoéthanol) entièrement lyse les ganglions capturées (D). Chaque groupe avait n = 3 réplicats biologiques et est présentée ici comme moyenne ± écart-type. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 . Résultats représentatifs. Lorsque la mise en commun de deux bouchons de ganglia entérique par échantillon, on obtient une quantité suffisante de l’ARN de RNA-seq (> 1 ng) ainsi que l’excellente qualité de RNA. Représentant RNA emplacements sont indiqués pour un échantillon avec un RIN de 8,3 (A) 7,5 (B) et 6,9 (C). RNA-seq données étaient dirigées par un-l’évaluation de la qualité des programmes, exécutez dans r (D) l’intrigue de la fin-partialité indique que les échantillons ont été séquencées avec succès et ont un préjugé modeste extrémité 3'. (E), l’intrigue de biotype gène représente également que les résultats du séquençage correspondent en grande partie entre les échantillons. Au total, nous avons eu un > taux de réussite de 95 % dans la production d’échantillons utilisables pour RNA-Seq s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Étape | Durée | Objectif |
| Éthanol à 95 % (-20 oC) | 30 s | Fixation |
| Violet de crésyle 4 % dans l’éthanol à 95 % | 10-30 s | Tache |
| 75 % éthanol (avec immersion répétée) | 15-25 s | La tache |
| 95 % éthanol (avec immersion répétée) | 5-15 s | La tache |
| 100 % éthanol | 15 s | Déshydratation |
| 100 % éthanol (anhydre) | 30 s | Déshydratation |
| Xylène (avec immersion répétée) | 15-20 s | Déshydratation |
| Xylène | > 10 min | Déshydratation |
| Sécher à l’air | 1-3 min | Évaporation du xylène |
Tableau 1. Coloration et vue d’ensemble du protocole de déshydratation. Ce tableau donne un aperçu notre protocole de coloration optimisé. Remarque qui colorent tout l’éthanol-compatible peut être utilisé pour remplacer violet de crésyle, s’il offre de meilleurs résultats. Dans certains cas, les durées de coloration et de décoloration devra être prolongée ou réduite. Généralement, plus le temps de fixation, plus vite le tissu va être entièrement coloré. Nous n’avons pas remarqué toute réduction de l’intégrité de RNA après ré-utilisation de flacons jusqu'à 3 fois lors de la préparation des diapositives à partir du même segment de tissu.
| Bailleurs de fonds | Tissu | RIN |
| F | Colon | 7.4, 7.1, 7.2 |
| M | Iléon | 7.2, 6.9, 7,8 |
| M | Duodénum | 8.2, 7.4, 7.7 |
| Iléon | 7.4, 7.6, 7.3 | |
| Colon | 7.7, 7.8, 7.3 | |
| F | Duodénum | 7.1, 7.3, 6,9 |
| Iléon | 7.8, 7.9, 7,6 | |
| Colon | 7.3, 8.0, 7.5 | |
| M | Iléon | 6.9, 6,7, 6,9 |
| Colon | 6.8, 6.4, 6.6 | |
| M | Iléon | 7.2, 7.3, 7,6 |
| Colon | 6.7, 7.6, 7.7 | |
| M | Iléon | 8.3, 7,8, 7.4 |
| Colon | 7.0, 7.4, 7.0 | |
| F | Duodénum | 8.3, 8.8, 8.0 |
| Iléon | 8.1, 8.0, 7,8 | |
| Colon | 8.4, 8.6, 7.1 |
Le tableau 2. Résultats représentatifs de l’intégrité des RNA. Les échantillons affichés dans ce tableau ont été obtenus auprès d’humains ganglia entérique. Tous les échantillons sélectionnés ont suffisamment RNA qualitativement et quantitativement pour analyse de RNA-seq. Le RIN moyens de tous les exemples répertoriés dans ce tableau est de 7,49 ± 0,53. Concentration d’ARN a également été mesurée à l’aide de l’essai RiboGreen Quant-iT et tous les échantillons affichés dans ce tableau ont rencontré la quantité minimale requise pour notre RNA-seq (> 1 ng) expériences. Petites quantités peuvent être utilisées, selon la procédure de pré amplification. Toutefois, ces procédures sont plus fiables quand on s’attend il à être de grandes différences dans l’expression génétique entre les échantillons ou les groupes comparés ; dans le cas contraire ces résultats peuvent masquer les véritables différences dans certaines applications de RNA-seq. Il est donc généralement recommandé de commencer avec plus de matériel lorsque cela est possible.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cette procédure permet la collecte efficace de nombreux ganglions entériques comme source pour calculer les RNA pour RNA-Seq. Ici, nous avons accéléré les processus décrits dans les protocoles existants tout en préservant au maximum l’intégrité RNA. Comme toutes les étapes de cette procédure sont interdépendants, il est important que toutes les questions soit éliminée dès le début de l’étude et que tous les échantillons sont préparés sous le nom de la même façon les uns que possible, afin d’obtenir une fiabilité RNA-Seq.
Depuis le début de la procédure, l’intégrité RNA peut être négativement affectée si l’intervalle de temps (temps froid ischémique) entre la collection de tissus au moment du don d’organes et de la réception du tissu pour le traitement en laboratoire est trop long. Compte tenu de cette préoccupation, nous avons été surpris que RNA de haute qualité peut toujours être extraite des échantillons intestinaux même après 24 heures de froid ischémique. Lorsque les échantillons intestinaux sont réfrigérés et stockés correctement dans la solution de stockage de froid, il est superbe protection de l’intégrité des tissus et de la qualité de la RNA. Nous exigeons que le tissu intestinal est vidé à la collection de l’équipe de collecte d’orgue, pour limiter l’exposition de l’intestin d’enzymes digestives, les RNases et autres molécules qui pourraient avoir une incidence qualité RNA pendant cette période. Nous avons trouvé que lorsque le spécimen intestinal n’est pas complètement vidé, cela peut réduire considérablement les RIN de l’échantillon.
Préparation d’échantillons de tissu intestinal avec notre procédure optimisée, nous sommes en mesure d’éviter l’incorporation des échantillons à TFM. Parce que TFM interagit avec l’éthanol et le xylène pour former un précipité brun foncé qui interfère avec la visualisation des ganglions entériques, nous préférons l’exclure de nos échantillons. Toutefois, lorsque vous travaillez avec des tissus intestinaux de souris ou d’autres espèces, l’exclusion de TFM ne serait pas possible. Dans ce cas, nous avons expérimenté avec la suppression de TFM d’une section collée sur une diapositive. Si le tissu a une superficie suffisante, l’éthanol (réfrigérée à-20 ° C) peut être égoutté sur la lame avec une pipette de transfert pour corriger rapidement la TFM, lui permettant d’être enlevée avec une pince. Gouttes d’éthanol sur les lames évite l’accumulation de TFM dans le flacon d’éthanol, qui peut aggraver l’effet de brunissement lors du traitement de plusieurs diapositives.
Au cours du flash-gel, nous sommes favorables à l’aide d’une bouillie de glace sèche avec 2 Mo, plutôt que de l’éthanol à 100 %, parce que 2 Mo évapore lors d’un atterrissage sur la surface du tissu. L’éthanol tend à s’évaporer plus lentement, en particulier lorsqu’il est combiné avec la TFM, formant une boue chimique sur le bloc de tissu qui ne peut être facilement enlevé. L’éthanol et 2 Mo ont tendance à pétiller et éclaboussures vigoureusement en gelant dans de petits contenants de gel, car le faible volume de la boue de la glace carbonique a une capacité de faible chaleur spécifique. Au lieu de cela, à l’aide d’un grand seau rectangulaire rempli de glace réduite fournit une grande masse de refroidissement et évite les fluctuations de température lorsque le tissu est actuellement gelé.
Comme mentionné, il est parfois plus facile d’obtenir des feuilles continues de ganglia entérique de quelques échantillons de tissus par rapport à d’autres. Naturellement, la vitesse globale de LCM est sous réserve de la variabilité selon les caractéristiques de la muqueuse de la source ou la région intestinale à échantillonner. Pour cette raison, il est souvent préférable de préparer les nombreux échantillons frais congelé au début. Généralement, nous avons constaté qu’un total de 20 échantillons par segment de l’intestin (~ 2 cm x 1,5 cm, chaque) est beaucoup plus que suffisant pour fournir amplement RNA pour applications en aval. Toutefois, si seulement une petite longueur de tissu intestinal est disponible, nous recommandons une longueur minimale de 5 cm. Grâce à notre approche, le rendement le plus bas qui serait obtenus varieraient entre 18-30 ng d’ARN, tel que discuté ci-dessous. La longueur minimale de 5 cm peut potentiellement être réduite, selon l’application, surtout si des quantités plus élevées de préamplification ADNc sont utilisées. Ces paramètres n’ont pas été testés dans l’étude actuelle. Par exemple, ganglia entérique a recueilli des échantillons de biopsie intestinale pleine épaisseur (2 cm x 2 cm) pour qPCR4.
Comme nous le montrer dans cette étude, l’utilisation du colorant compatibles avec l’éthanol, Cresyl violet, offre beaucoup meilleure protection de l’intégrité de la RNA que la tache aqueuse, le bleu de toluidine. Lorsque vous trempez dans de l’éthanol, ribonucléases deviennent inactifs5,15. Cependant, ribonucléases peuvent encore retrouver la fonction une fois exposée à l’eau7,15. En souillant avec colorants aqueux, le tissu doit être exposé à l’eau sans nucléase pour presque 1 min9, ce qui conduit à une dégradation substantielle de l’ARN. Lors de l’utilisation de coloration des tissus bleu de toluidine, nous étions incapables de réduire l’exposition à l’eau avant et après la coloration, car ces modifications réduit aussi l’absorption et la rétention de toluidine bleu, respectivement. Un problème similaire a été également détecté par un colorant axée sur l’hématoxyline9. Dans le protocole modifié décrit ici, coloration au violet de crésyle évite l’exposition directe des échantillons intestinaux à l’eau, préservant ainsi au maximum l’intégrité RNA. Ces résultats d’éliminer la nécessité d’autres inhibiteurs de la RNase dans la solution colorante. Nous avons constaté que ces inhibiteurs sont inefficaces à permettre l’utilisation du colorant aqueux, toluidine bleu, comme il a interféré avec l’absorption et la rétention du colorant.
Quand au départ optimisant notre protocole de coloration, nous étaient incapables de reproduire les résultats obtenus dans les autres protocoles et rapports5,7,8,11. Alors que la raison n’est pas claire, nous avons trouvé plusieurs facteurs qui ont conduit à incompatible colorant-absorption et de rétention. Par exemple, bien que certains protocoles ont teinté avec succès de tissu à l’aide de violet de crésyle 100 % éthanol8 ou à l’éthanol 75 %5, le colorant seulement faiblement marqués des ganglions ou eu ambiants, alors à l’aide de Cresyl violet dans l’éthanol à 95 %. Enfin, le pourcentage de violet de crésyle utilisé dans la solution colorante est également très important. La plupart des protocoles recommandent un 1 % Cresyl violet solution7,8, mais cette concentration n’a pas fourni de coloration fiable dans nos mains, même après coloration des sections jusqu'à 2 min. Nous avons eu le meilleur succès avec une solution de coloration clarifiée saturée de 4 % de coloration violet de crésyle11 appliquée à l’échantillon à travers un filtre de seringue stérile8. Cette solution saturée permet une coloration beaucoup plus rapide de l’échantillon, en aussi peu que 10 à 15 s. fixation préalable de l’échantillon dans l’éthanol à 95 % réfrigéré (à-20 ° C) permet une absorption plus rapide de la tache.
Un autre rapport a constaté que ganglia entérique était plus distinctement teint frais-congelé des sections intestinales humaine en violet de crésyle avec éosine dans une de solution d’éthanol 75 %5. Cependant, nous avons constaté qu’éosine a rendu plus difficile d’identifier les ganglions et que violet de crésyle, seul, offre une détection supérieure. Dans une autre étude, on a trouvé qu’une solution de violet de crésyle tampon fourni coloration des résultats cohérents pour le cancer de l’endomètre tissu10. Cependant, nous avons trouvé cela n’offrait pas une amélioration pour les tissus intestinaux humains et aussi ne pourrait pas être exécuté lors de l’utilisation de l’éthanol à 95 % pour la solution colorante.
Nous avons testé un certain nombre de conditions dans lesquelles le protocole peut être suspendu et a repris à une date ultérieure. Nombreux protocoles suggèrent diapositives avance de sectionnement et de recongélation eux à-80 ° C immédiatement après le montage sur la diapositive5,9. Avec cette approche, la coloration et la LCM peut ensuite être reprise la semaine prochaine, offrant une grande flexibilité. Cependant, non seulement n’a cela grandement entravé coloration ; Il réduit également l’intégrité des RNA dans nos mains (données non présentées). Pour contourner ce problème, Grover et coll. recommander la coloration et la déshydratation les sections avant entreposage dans le congélateur11. Dans cette approche, les diapositives sont colorées et déshydratés (comme dans le tableau 1) jusqu'à l’étape d’éthanol anhydre 100 % (protocole section 5.2). Ensuite, les échantillons sont incubés dans un deuxième flacon d’éthanol anhydre à 100 % pendant 10 min et sont transférés immédiatement dans un tube à fond conique avec gel déshydratant de couleur, qui est ensuite refroidi sur la glace sèche et transféré au congélateur à-80 ° C. Pour retirer des échantillons dans le congélateur, les diapositives sont immédiatement immergés dans un 100 % éthanol anhydre pendant 30 s et séchés à l’air avant LCM11lorsque vous exécutez. Malheureusement, dans nos mains, cette approche réduit RIN de 0,6 à 0,8 (données non présentées). Par conséquent, nous avons eu recours à l’exécution de toutes les coupes, coloration et LCM dans la même journée afin d’obtenir l’intégrité RNA maximale dans nos conditions. Ceci s’avère pour être un processus fastidieux, mais casquettes LCM 10-14 peuvent être remplis pendant travail une journée complète de.
Le point plus fiable au cours de laquelle notre protocole peut être suspendue est à l’étape d’incubation de xylène. Diapositives ont été laissés dans le xylène (avec des tamis moléculaires) jusqu'à 4-5 h sans aucun effet apparent sur l’intégrité de la RNA. Nous avons trouvé que lorsque trois lames sont préparées à la fois, tout peut être traité avec LCM dans ce délai, même si une pause d’une heure est nécessaire. Une autre solution consiste à dessécher les diapositives après les étapes de coloration et de déshydratation dans un sous vide exicator16, mais nous n’avons pas encore tenté cette approche.
Isolement d’ARN est encore une autre étape cruciale de la procédure, par le plus important étant les facteurs : obtenir le rendement maximal possible de l’ARN, conservant toute la gamme des RNA (sans perte des plus petites espèces d’ARN)17,18, et éliminer complètement l’ADN génomique de l' exemple17. Dans nos mains, Kit d’Extraction d’ARN « B » a fourni les meilleurs résultats avec nos échantillons, car il offrait des rendements accrus et était plus efficace pour l’élimination de l’ADN génomique. Nos observations concernant les différences de rendements entre les réactifs d’extraction RNA sont conformes aux précédents rapports17,18. Cependant, il y a aussi de nombreuses études de LCM qui ont rapporté le succès avec les autres RNA extraction réactifs19,20. Les rapports indiquent également que les procédés d’extraction basée sur les colonnes RNA offrent meilleure rétention de petites molécules d’ARN que le phénol-basé de méthodes de l’Extraction d’ARN18 petites molécules d’ARN peuvent être perdu dans le surnageant au cours de la précipitation d’ARN étapes.
Nous avons observé que les mémoires tampons de lysis RNA qui utilisent le thiocyanate de guanidinium avec ajout de β-mercaptoéthanol est très efficace pour éliminer tous les ganglions capturées de la PAC de LCM (Figure 5D). Alors que la plupart des protocoles de LCM expression n’implique pas le lysat de Vortex, nous avons constaté que ce produit d’excellents résultats et n’entraîne pas de dégradation de l’ARN. Il fournit également une probabilité encore plus grande que tous capturés les ganglions qui sortira de la PAC pour l’extraction de l’ARN. En utilisant ces méthodes, nous obtenons généralement des rendements de RNA de LCM des ganglions entériques de l’ordre de 1,8 à 18 ng/cm2 de tissu intestinal, selon le nombre de ganglions sont présentes sur une diapositive donnée. Notre procédure de RNA-seq requiert une contribution minimale de 10 ng ARN, mais les autres procédures peuvent avoir beaucoup inférieur RNA d’entrée si un traitement de séquençage comprend un plus grand nombre de cycles de pré-amplification. La surface totale du tissu stocké de la préparation et le processus de congélation flash est de 40 à 60 cm2, qui prévoit une ample RNA cDNA library prep et applications de faibles intrants RNA-Seq.
Alors que notre procédure est conçue pour le prélèvement des ganglions tout entériques, l’approche peut être facilement modifiée pour la collecte des neurones ou cellules gliales, si vous le souhaitez5. Cependant, car traite gliales densément forte des neurones de l’ENS, RNA glial seront inclus ainsi que de l’ARN de neurones capturés, quoiqu’à des dénombrements plus faibles. Cela soulève des questions en essayant d’identifier les transcriptions neuronales a exprimé un certain nombre de faibles copies. Unicellulaire RNA-seq offre la meilleure précision et détection à cet égard, mais nécessite des neurones être dissociée du tissu intestinal, colorées avec des marqueurs pan-neuronale et isolé par cytométrie en flux-21 ou identifié à partir ensemble-intestinale dissociations après triage des approches avec la bio-informatique. L’inconvénient de la plupart des études de dissociation est que la plupart des protocoles exigent que l’échantillon être incubé à température ambiante ou à 37 ° C pendant une période prolongée, qui est appelé à modifier le transcriptome3. Récemment, la protéase de froid-active du Bacillus licheniformis a été utilisée pour la production de suspensions cellulaires unique pour les tissus de souris et il peut être possible d’appliquer cette enzyme pour la dissociation du tissu humain à 4 ° C22. Avant que cette optimisation est accomplie, LCM de tissus humains congelés frais est un moyen robuste pour capturer RNA pour le profilage de l’expression des éléments du système nerveux périphérique comme ganglia entérique.
En résumé, nous avons développé un protocole fiable et cohérent pour la collection de l’ARN à partir des ganglions entériques humaines. Nous avons optimisé la préparation de tissu intestinal humain, coloration, processus de LCM et extraction de l’ARN issu de nombreuses publications et protocoles. Nous avons aussi démontré la fiabilité de cette approche dans la collecte d’échantillons d’ARN de qualité suffisante de RNA pour RNA-Seq. Ce protocole peut être appliqué largement dans les tissus prélevés chez des patients avec un certain nombre de maladies gastro-intestinales et peut être facilement adapté pour être utilisé avec les modèles de rongeurs, offrant ainsi une stratégie fiable pour le développement de nouvelles thérapeutiques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants envers les bailleurs de fonds et de leurs familles qui ont rendu ce travail possible. Nous apprécions également l’aide du personnel à l’International Institute of Medicine et le Tennessee Services aux donateurs pour aider collection coordonnée du tissu utilisé dans cette étude. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 à l’appui de2 et allocation de EMS de NIH T32-DK007673 à AMZ. Nous sommes reconnaissants au personnel de la ressource partagée de la pathologie translationnelle de Vanderbilt pour accéder à l’Instrument de LCM et conseils sur la préparation du tissu. La ressource partagée Vanderbilt tissu pathologie est soutenue en partie par des subventions de NIH P30-CA068485-14 et U24-DK059637-13. Nous remercions le centre du génome d’accès à la technologie dans le département de génétique à la Washington University School of Medicine de l’aide avec l’analyse génomique. La GTAC est partiellement pris en charge par NCI Cancer Center Support Grant #P30 CA91842 vers le centre de Cancer Siteman et TIC/CSTC Grant #UL1TR002345 du Centre National pour la recherche des ressources (RRRNC), un composant du NIH National Institutes of Health (NIH) et Feuille de route pour la recherche médicale. Cette publication est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement la position officielle des RRRNC ou des NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
- Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
- Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
- PALM Protocols - RNA handling. , ZEISS. Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011).
- Schlaudraff, F. L. M. Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015).
- Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
- Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
- Potter, S. S., Brunskill, E. W.
- Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
- Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
- Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
