Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Licht vel fluorescentie microscopie 4-dimensionale beelden van de gevolgen van het moduleren van Shear Stress op de ontwikkelingslanden Zebrafish hart

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57763
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren ontwikkeling van harten in zebrafish in 4 dimensies (4-D). 4-D imaging, via licht-blad fluorescentie microscopie (LSFM), neemt de 3-dimensionale (3-D) beelden na verloop van tijd te reconstrueren ontwikkelende harten. Laten we kwalitatief en kwantitatief dat schuifspanning activeert endocardial Notch signalering tijdens de ontwikkeling van de zaal, die cardiale trabeculation bevordert.

Abstract

De hemodynamische krachten, ervaren door de hart invloed cardiale ontwikkeling, vooral trabeculation, die een netwerk van vertakkende uitwassen van het myocardium vormt. Genetische programma gebreken in de inkeping signalering trapsgewijs zijn betrokken bij ventriculaire gebreken zoals links ventriculaire Non-compactie cardiomyopathie of Hypoplastic links hart syndroom. Met behulp van dit protocol, kan het worden bepaald dat de schuifspanning gedreven trabeculation en Notch signalering zijn gerelateerd aan elkaar. Met behulp van licht vel fluorescentie microscopie, was visualisatie van het ontwikkelende zebrafish hart mogelijk. In dit manuscript, het was beoordeeld of hemodynamische krachten moduleren van de opening van trabeculation via Notch signalering en dus, invloed contractiele functie optreedt. Voor kwalitatieve en kwantitatieve schuintrekken spanningsanalyse, 4-D (3-D + tijd) beelden werden verworven tijdens de zebravis cardiale genuitdrukking en geïntegreerde licht-blad fluorescentie microscopie met 4-D synchronisatie veroverde de ventriculaire motie. Bloed viscositeit werd verminderd via gata1a- morfolino oligonucleotides (MO) micro-injectie te verminderen schuifspanning, daarmee Notch signalering en verzachtende trabeculation down-regulering. Co injectie van Nrg1 mRNA met gata1a MO gered Notch-gerelateerde genen om te herstellen van trabeculation. Om te bevestigen schuifspanning gedreven Notch signalering invloeden trabeculation, gearresteerd cardiomyocyte contractie verder via tnnt2a-MO om hemodynamische krachten, daarmee Notch doelgenen down-regelen om een niet-trabeculated myocard. Ten slotte werd datanauwkeurigheid van de expressiepatronen van shear stress-responsieve Notch genen uitgevoerd door endotheliale cellen te onderwerpen aan gepulseerde stroom. Dus, de microscopie van de licht-blad 4-D ontdekt hemodynamische krachten onderliggende Notch signalering en trabeculation met klinische relevantie voor non-compactie cardiomyopathie.

Introduction

Biomechanische krachten, zoals hemodynamische schuifspanning, zijn nauw betrokken bij cardiale morfogenese. In reactie op de hemodynamische schuintrekken krachten ontwikkelen myocardiale richels en groeven in een golf-achtige trabecular netwerk in afstemming met de richting van de schuifspanning over de atrioventriculaire (AV) ventiel1. Cardiale trabeculation is noodzakelijk om contractiele functie en myocard massa2te verhogen. Mutaties in Notch signalering trajecten leiden tot congenitale hartafwijkingen bij mensen en andere gewervelde dieren3. Bijvoorbeeld, is gata1a4 en tnnt2a5 morfolino oligonucleotides (MO) aangetoond dat het verminderen van Erytropoëse, terwijl Erytropoëtine (EPO) mRNA6 en Isoproterenol (ISO)7 rood bloed verhogen cellen en hartslag muur respectievelijk, en daarom schuifspanning (WSS). Bovendien, ErbB2 signalering, stroomafwaarts van de inkeping, bevordert cardiomyocyte proliferatie en differentiatie voor het genereren van contractiele force, die op zijn beurt activeert Notch signalering van8,9. Er wordt voorgesteld dat schuifspanning regelt Notch signalering gedreven trabeculation voor ventriculaire ontwikkeling. Op dit moment, er zijn vele studies die poging om verder te begrijpen de genetische programmering gebeurtenissen die leiden tot aangeboren hart gebreken (CHD)10,11,12, maar heel weinig zijn onderzoekt hoe mechanische krachten beïnvloeden de vorming hart.

Om te onderzoeken de mechanische krachten die op het endocard, nauwe waarneming tijdens de periode ontwikkelingsbehoeften worden uitgevoerd. Het is echter wel uitdagend om het verkrijgen van goede kwaliteitsbeelden van het in vivo verslaan monsters als gevolg van de verbondenheid van traditionele microscopie13. Om het observeren van de ontwikkeling na verloop van tijd in een steekproef, moeten fysieke segmenteren en kleuring, daarom optreden van13,14,15. Hoewel confocale microscopie veel gebruikt wordt om het imago van de 3D-structuur van monsters14,16, is deze beeldvormingssystemen overname nog beperkt door langzame digitaliseringsnelheden aan.

Licht vel fluorescentie microscopie (LSFM) is een unieke beeldvormende techniek die de visualisatie van in vivo dynamische evenementen met lang werkende afstand13 toelaat. Deze techniek maakt gebruik van een licht vel fluorescent microscopie optisch deel een monster17. Als gevolg van verlichting van alleen een dun blad van licht op de steekproef is er een vermindering in de foto-bleken en foto toxiciteit13,18. Het grote gebied van weergave en lange afstand zorgt voor grote monsters intact blijven zoals ze verbeelde13,14,17 zijn. De lage vergroting zorgt voor een groter gebied aan het image worden gemaakt, terwijl de lange afstand zorgt voor dikker monsters te worden zonder afbreuk te doen aan de signal-to-noise verhouding beeld. Veel groepen LSFM zijn gewend geraakt afbeelding hele embryo's17, hersenen14,18, spieren en hart19 onder andere weefsels, tonen van de verschillende soorten monsters die image kunnen worden gemaakt.

Hoewel eerder onderzoek aangetoond verminderde hemodynamische schuintrekken kracht door de instroom of uitstroom tracks van de zebravis hart occluding, is de informatie uitsluitend kwalitatieve. Dit resulteert in een abnormale derde kamer, verminderde cardiale looping en verminderde ventiel vorming20. De 4-D LSFM beelden geven een nieuw perspectief in de manier waarop die de hemodynamische schuintrekken dwingt invloed op de ontwikkeling van de cardiale weefsel. Deze mechanische krachten kunnen activeren kracht-gevoelige signalering moleculen en de vorming van de trabecular rimpels veroorzaken. Vanwege de toegevoegde tijd aspect voor 4-D imaging is het kundig voor bijhouden van wijzigingen in ontwikkeling in realtime, die kunnen leiden tot nieuwe onthullingen dat eerder onopgemerkt was gegaan. De zebravis is een ideaal model voor imaging omdat wetenschappers een hele gewervelde dier versus alleen cel-cel interacties kunnen observeren. Zuurstof kan ook diffuus door het gehele embryo, waarmee de ontwikkeling optreden zonder afhankelijk van het vaatstelsel, in tegenstelling tot bij zoogdieren ontwikkeling. Hoewel de zebravis hart de pulmonaire organen, waarvoor een vier-chambered hart ontbreekt, is er een groot aantal cardiale genen die tussen zebravis en mensen21zijn bewaard.

In dit manuscript beschrijven we het gebruik van licht-blad fluorescentie microscopie om het imago van de ontwikkelingslanden trabeculae in zebrafish hart onder verschillende omstandigheden. Ten eerste injectie van gata1a4 of tnnt2a5 Mnd werden gebruikt om lager de viscositeit van het bloed, en dus WSS. De morfologie van het hart werd vervolgens opgenomen. In een afzonderlijke groep van vissen, we de WSS verhoogd door het toedienen van de EOB mRNA6 of isoproterenol7 en de resultaten waargenomen. We voerde ook een onderzoek van de cel met een verschillende gepulseerde of oscillerende spuitsnelheid. Na elke groep imaging, vonden we dat WSS gevoeld door het endocard via Notch signalering ingewijden trabeculation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De volgende methoden werden uitgevoerd met inachtneming van UTA en UCLA IACUC protocollen. Deze experimentele groepen werden gebruikt met transgene Tg(cmlc2:gfp), de mutanten wea (zwakke atrium) of clo (cloche) : (a) wild-type (WT) controle, (b) gata1a MO en (c) tnnt2a MO injecties (tabel 1).

Model Naam Gemodificeerde genen Fenotype Referentie
Controle Wild type Geen N/B
TG(cmlc2:GFP) Cardiale myosin lichtketting Groene flourescence specifiek uitgedrukt in het myocardium 34
Verminderde muur Shear Stress Zwakke atrium (wea) mutant Atrium-specifieke myosin heacy ketting Atrium niet vatbaar, compacte ventrikel, dikke myocardiale muur, smalle lumen, dialated atrium, 37
Cloche (clo) mutant N/B Volledige verwijdering van endocard, unaturally grote atrium met kleine ventrikel, onbestaande cardiale cushins 41
gata1a MO gata1a  Bloedarmoede door gebrek aan rode bloedcellen 4
tnnt2a MO tnnt2a 39
Verhoogde muur Shear Stress EOB mRNA Geen Ernstige polycythemie, toename aantal circulerende bloedcellen, verhoogde viscositeit 6
Isoprotenerol Geen Cardiale tarief verhoogd 7

Tabel 1: Zebravis beschrijvingen. Definities en omschrijvingen van de zebravis gebruikt in experimenten.

1. studie Setup

  1. Nrg1 en EOB mRNA voorbereiden door trabeculation redding.
    1. Menselijke Nrg1 cDNA verkrijgen en versterken van een donor-plasmide.
      Opmerking: De menselijke Nrg1 cDNA was begaafd van William Talbot van Stanford University.
      1. Nemen van nodige reagentia en materialen, namelijk PCR mastermix (opgeslagen in de-20 ° C), inleidingen (Zie tabel 2) (opgeslagen in de-20 ° C), een plaat van de PCR (bewaard bij kamertemperatuur) en een 20 μL Pipet (bewaard bij kamertemperatuur). Zie tabel met materialen voor voorbeeld producten.
        Table 2
        Tabel 2: Inleidingen voor Nrg1 klonen van mensen.
      2. Bereiden de mastermix voor elke primer instellenin drievoudige met behulp van de 20 μL pipet. Gebruik voor 1 set triplicates, 37.5 μL van de mastermix, 3 μL van DNA-gratis water, 4.5 μL van de primer. Voor meer triplicates, gewoon vermenigvuldigen met het aantal monsters.
      3. Verdun de werkoplossing menselijke Nrg1 cDNA (20 ng/μg concentratie) in de strook van de primer met DNA-gratis water zodat er 10 μL totaal per putje per monster.
        Opmerking: Ervoor zorgen dat elke oplossing onder stap 1.1.1 gelijkmatig wordt verdeeld. Doe dit door het mengen van elke oplossing door pipetteren omhoog en omlaag. Voorkom kruisbesmetting en gebruik een pipet tip voor slechts één voorbeeld.
      4. Aliquot Nrg1 cDNA met de 10 μL meerkanaals pipet aan gewenste putjes in de plaat PCR.
      5. 14,5 μL van de mastermix toevoegen aan de cDNA in de putjes. Een kleverige cover toepassen op de plaat van de PCR te verzegelen van de putten in de PCR-machine plaatsen.
      6. De PCR-machine start en zorgen dat de cyclus terechtkomt bij passende temperaturen volgens de enzymen en de inleidingen gebruikt.
    2. Nrg1 cDNA klonen in de plasmide pCS2+ op de BamHI en EcoRI sites met behulp van overtollige enzymen BamHI en EcoRI om cDNA is afgebonden in alle plasmiden.
      1. Meng de Nrg1 cDNA met de donor plasmide pCS2+, verkrijgbare master mix oplossing- en grondlagen (tabel 2).
        Opmerking: Het volume van de totale reactie moet 50 μl met 25 μL van master mix, 3 μL van inleidingen en 1 μL van 20 ng/μL donor plasmide met Nrg1 cDNA.
      2. Plaats de mix uit stap 1.1.2.1 in de PCR-machine en stel de parameters om te voldoen aan de volgende specificaties: 98 ° C voor 10 s 55 ° C voor 5 of 15 s en 72 ° C gedurende 5 s/kb.
      3. Het zuiveren van het PCR-product met behulp van een zuivering kit na instructies van de fabrikant. Elueer het product in 50 μl van elutie buffer.
      4. Verteren het gezuiverde PCR product en 5 μg pCS2+ met BamHI en EcoRI afzonderlijk bij 37 ° C gedurende 2 uur in een volume van 200 μl reactie. Zuiveren van de resulterende spijsvertering met een commerciële kit en elueer in 20 μL en 100 μl van Tris-HCl (pH 8,5), respectievelijk.
      5. Afbinden 4 μL van Nrg1 cDNA en 2 μL van de verteerd pCS2+ plasmide in 25 μL reactie met 1 μL van katalysator ligase bij 16 ° C's nachts.
        Opmerking: De procedure kan hier worden gestopt voor overnachting incubatie.
      6. Gebruik 2 μL van de afbinding oplossing uit stap 1.1.2.5 en de transformatie tot 50 μl van E. coli bacteriën cellen geschikt voor klonen (Zie Tabel van materialen).
    3. Bevestigen dat de transformatie plaatsvond door screening die nrg1 cDNA klonen met behulp van PCR. Klonen willekeurig kiezen en toevoegen aan een oplossing van specifieke primers, polymerase en deoxyribonucleotide trifosfaat (dNTPs).
      Opmerking: De controles waren de vector (pCS2+) met en zonder de insert (menselijke cDNA). Kies niet te groot van een kolonie omdat buitensporige bacteriën PCR remmen kunnen.
      1. Kies 8 kolonies van de transformatie en scherm pCS2+-Nrg1 klonen met behulp van de PCR inleidingen van tabel 2.
      2. Een kloon met Nrg1 cDNA te isoleren van de pCS2 cultuur+-Nrg1 plasmide DNA. Enten met 100 μl van E. coli bacteriën met pCS2+-Nrg1 plasmide in 100 mL van LB-media en cultuur door schudden (160-225 RPM) bij 37 ° C.
    4. Gezuiverde pCS2 transfect+-Nrg1 plasmide in HEK-293 cellen in een 6-well-plate met behulp van een commerciële transfectiereagens na instructies van de fabrikant.
    5. 24 uur na de transfectie, lyse de cellen met behulp van een lysis-buffermengsel doorlopen van een SDS-pagina gel, overbrengen in een gel-membraan en vervolgens vlek met anti-Nrg1 antistof22. Controleer of de Nrg1 eiwit expressie met behulp van een Western Blot.
      Opmerking: Het besturingselement is een lege pCS2+ plasmide. Kan hier worden gepauzeerd als gel membraan overdracht 's nachts gebeurt.
    6. Synthetiseren Nrg1 mRNA met behulp van een commercieel product vergelijkbaar met die in de Tabel van materialen en volg de instructies van de fabrikant.
      1. Neem 5 μL van de pCS2+-Nrg1 DNA uit de bacteriën geïsoleerd cultuur en verteren met kennisgevingen in de reactie van een 200 μl gedurende 2 uur bij 37 ° C aan het plasmide linearize.
      2. Zuiveren van de gelineariseerde plasmide met een commerciële kit en elueer in 20 μL van Tris-HCl (pH 8,5).
      3. In vitro transcriptie met een commerciële RNA isolatie kit in een reactie van de 20 μL 5 μL van de gelineariseerde plasmide na instructies van de fabrikant met het gedrag.
      4. Voeg dat de in vitro herschreven Nrg1 als 350 μL van RNA lysis-buffermengsel en vervolgens zuiveren met een RNA isolatie kit. Elueer de RNA in 60 μL van Tris-HCl (pH 8,5).
      5. Meten van de concentratie van RNA en opslaan bij-80 ° C voor toekomstig gebruik.
    7. Volg de stappen 1.1.6.1 - 1.1.6.5 boven voor het EOB cDNA en mRNA voorbereiding maar kloon de cDNA in het plasmide pCS2 + EcoRI en XhoI sites in plaats daarvan.
  2. Morfolino injecteren zebravis
    1. Ontwerp23 de MO-injecties met behulp van een online tool (Tabel of Materials) tegen de volgorde van de ATG van gata1a4 (5 '-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3) en tnnt2a5 (5 '-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3).
    2. Gata1a en tnnt2a MO afzonderlijk toevoegen aan de nuclease-gratis water om de eindconcentraties van 8 ng/nL en 4 ng/nL, respectievelijk. Herhaal met EOB mRNA met een eindconcentratie van 20 pg/nL. Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume 1 mL.
    3. Injecteren van 1 van de 8 ng/nL van gata1a MO en 1 nL nL voor de 4 ng/nL van tnnt2a MO in aparte zebrafish embryo's bij de 1 naar de 4-cel fase om ventriculaire muur schuifspanning (WSS)24. Het vergroten van WSS, injecteren 1 nL voor 20 pg/nL EOB mRNA6 in de zebravis embryo's in de fase 1 - 4-cel in.
  3. Chemisch behandelen zebrafish om trabeculation te remmen
    1. Met behulp van een precisiepipet van 20 mL, Verdun de 10 mg/mL AG1478 in 1% DMSO in E3 middellange tot een uiteindelijke concentratie van 5 μM op 30 hpf in een tube van 15 mL. Als een besturingselement, elke vis met 1% DMSO alleen te behandelen.
    2. Toevoegen van N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t-butyl ester (DAPT) in 1% DMSO (100 μM) naar E3 medium in een tube van 15 mL voor de remming van de inkeping signalering bij 40 hpf op een soortgelijke manier. Als een besturingselement, behandelen met slechts 1% DMSO.

2. imaging technieken

  1. 4-D cardiale LSFM Imaging met synchronisatie algoritme
    1. 2D-beelden van het hele vis embryo overnemen door meerdere cardiale verslaan cycli met gebruik van de volgende stappen (Figuur 1). Zorg ervoor dat de licht-blad dikte ongeveer 5 μm is. 500 x-y-frames met een belichtingstijd van 10 ms. Set de z-virussoftware aan 1 μm voor lossless digitale bemonstering volgens de Nyquist bemonstering principe25nemen.
      1. Maak een agarose gel van 1% (m/v) door toevoeging van 1 g agarose tot 100 mL en verwarming het totdat alle agarose is opgelost. Een kleine plastic buis met het embryo en de agarose met behulp van een precisiepipet 20 μL laden en veilig op het podium.
      2. Open de afbeelding software weergeven en klik op Live om te zien de live view van het monster. Pas de doelstelling met behulp van de knop, zodat het monster in focus is. Op dezelfde manier verplaatsen de fase, zodat de live view van het monster de top van het embryo toont.
      3. Opnamen 500 keer voor 5 s bij 10 X vergroting met behulp van de Microscoop software26.
      4. Verplaats het werkgebied met de motor naar een nieuwe laag (1 micrometer in de z-as) en herhaal de imaging procedure.
      5. Herhaal bovenstaande 2 stappen totdat de gehele hart is volledig beeld.
    2. De gegevensintegriteit van de garanderen door rekening te houden met de beelden van de eerste en laatste cardiale cyclus. Vind de periode van de cardiale cyclus congruente beelden die zijn genomen op het zelfde tijdstip in de cardiale cyclus, maar in verschillende perioden. Gebruik de volgende vergelijking die is ontwikkeld om te zoeken naar de periode:
      Equation 1(1)
      waar D de kosten-functie gebruikt is voor het aanbrengen van een periode hypothese, ikm het gevangen beeld, τ' de tijd het beeld gevangen werd genomen, zk de index z-richting van het beeld, xm is de vector van de pixel-index, en T' is de periodieke hypothese.
    3. De volgende vergelijking gebruiken om te vinden van de relatieve verschuiving tussen twee foto's in vergelijkbare stadia:
      Equation 2(2)
      waar Qk', k duidt op een functie van de kosten voor de relatieve verschuiving, R is de mogelijke ruimtelijke wijk, L is de totale tijd van de opname, x is de pixel-index zk en zk' zijn de eerste en tweede z-richting plakjes, t is tijd en s is de relatieve verschuiving-hypothese.
    4. De relatieve verschuiving omzetten in absolute verschuiving ten opzichte van de eerste afbeelding en de lineaire vergelijking met behulp van de pseudo-omgekeerde benadering te vinden van de absolute relatie met de volgende sectie van beelden als eerder beschreven27uitlijnen oplossen.
    5. De laatste 4 D beelden werden verwerkt met behulp van beeld processing software (Tabel van materialen).
      1. 2D-afbeeldingen stapelen in 3-D
        1. Open een commerciële beeld processing software.
        2. Klik op Open Data.
        3. Selecteer alle beelden om te worden gestapeld in 3-D > Klik op laden.
        4. Voeg in de voxel grootte van 0,65 x 0.65 x 1 > Klik op OK.
        5. Schakel de Multi-Planar weergave in de 3D-beeld visualiseren.
        6. Met de rechtermuisknop op het vak van de blauwe slice_1.tiff > Kies weergave > Selecteer Volren.
        7. Klik op bewerken > Selecteer Opties > Selecteer bewerken kleurenkaart.
        8. De kleur met behulp van de vakken in een rood kader aanpassen > Klik op OK.
      2. 3-D omzetten in 4-D
        1. Klik op "bestand > openen van tijdreeksen.
        2. Selecteer de 3D-TIFF's die werden zojuist > Klik op laden.
        3. Voer dezelfde voxel grootte als vóór.
        4. Klik met de rechtermuisknop het blauwe slice_1.tiff vak > Selecteer "weergave" > Selecteer Volren.
        5. Klik op bewerken > Selecteer Opties > Selecteer bewerken kleurenkaart. De kleur met behulp van de vakken aanpassen > Klik op OK.
        6. Klik met de rechtermuisknop Serie tijdcontrole > Klik op Movie maker > druk op de knop afspelen om te kijken naar de film.
        7. Voeg een bestandsnaam, framegrootte, beeldfrequentie, kwaliteit gelijk is aan 1, typt u Monoscopic > Klik op toepassen
        8. Exporteren van de video. Open de video in een juiste software.

3. qRT-PCR analyse

  1. Zebravis hart van RNA isolatie om te kwantificeren Notch liganden, receptoren, en target genen expressies
    1. De zebravis offeren door hen te onderwerpen aan een overdosis tricaïne methylate28,29. Met behulp van een protocol van de eerder beschreven30, waren de zebravis harten weggesneden en voorbereid voor RNA isolatie.
    2. Isoleren van de totale RNA en synthetiseren cDNA met behulp van de cDNA synthese kit na instructies van de fabrikant.
    3. De PCR inleidingen ontwerpen voor de inkeping liganden Jag1, Jag2, Dll4, receptor Notch1ben signalering gerelateerde genen Nrg1 en ErbB2. Zie tabel 3 voor de inleidingen die we gebruikten.
    4. De inleidingen van stap 3.1.3, de geïsoleerde mRNA uit stap 3.1.2 en een commerciële mastermix toevoegen aan de PCR-plaat. Voer de qRT-PCR op de vereiste temperatuur en de tijden volgens de enzymen gebruikt. Normaliseren de resultaten zebrafish α-actine.
      Opmerking: Dit zal het berekenen van de niveaus van de expressie voor elk van de liganden, receptoren en genen.

4. in vitro menselijke aorta Endothelial cel (HAEC) experimenten

  1. Dynamische schuifspanning Model
    1. Cultuur HAEC cellen met HAEC voedingsbodems. Eenmaal volledig confluente, bloot de cellen laminaire flow en Pulsatiele stroom van 23 x 10-5 N debiet van 1 Hz gedurende 24 uur.
      1. Opwarmen van EG media/DMEM 10% FBS in een water bad voor 20 min.
      2. HAEC cellen ophalen met vloeibare stikstof tank en plaats de ampul in het waterbad tot gesmolten.
      3. Met behulp van een 1.000 μL Pipet, de ontdooide cellen verwijderen en leg ze in een tube van 15 mL met 3-5 mL van de media. Centrifugeer het cell-oplossing bij 53 x g gedurende 3 minuten.
      4. Gecombineerd de oplossing af en voeg voldoende media voor een totaal volume van 10 mL. De oplossing van de cel toevoegen aan een steriele kolf T75, de kolf van het GLB en distribueren van de cellen gelijkmatig over de bodem van de plaat.
      5. Mark de kolf met initialen, datum, celtype, en het nummer van de passage. Incubeer de kolf bij 37 ° C, 5% CO2, totdat de cellen zijn 80% heuvels. Vergeet niet om de media elke 2-3 dagen wijzigen.
      6. Het gebruik van een commerciële pomp, sluit de slang aan de kolf, en stel de parameters hierboven in stap 4.1.131,32,33.
    2. GI254023X toevoegen aan 50 mL HAEC medium bij een eindconcentratie van 5 μM gedurende 30 minuten.
    3. Met de vooraf gemengde GI254023X, een ADAM10-remmer die onderdrukt Notch signalering, voeren de dezelfde laminaire flow of Pulsatiele stroom experimenten zoals in 4.1.1.
    4. Kwantificeren van de inkeping liganden (Jag1, Jag2, en Dll4) en Notch doelgenen (harige en versterker van split [Hes]) met behulp van qRT-PCR voor vier groepen van HAEC monsters (laminaire flow, laminaire flow + GI254023X, Pulsatiele stroom, eerder beschreven Pulsatiele stroom + GI254023X)32.

5. rescue en overmatige uitdrukking van Inkeping signalering

  1. Injecteren van 1 nL van de voorbereide Nrg1 mRNA in een concentratie tussen 5 pg/nL (uit stap 1.1.6) in het stadium van de 1 - tot 4-cel met de gata1a MO om Notch doel genen24overexpress.
  2. Injecteren van 1 nL van de Nrg1 mRNA in wea mutant in een soortgelijke manier24.
  3. Dubbele de concentratie van Nrg1 mRNA (10 pg/nL) en injecteren24 1 nL in zebrafish te observeren de ventriculaire morfologie.
  4. Injecteren van 1 nL voor de 20 pg/nL EOB mRNA6 in de zebravis embryo's in de fase 1 - tot 4-cel uitbreiden van de Haematopoiese te verhogen van ventriculaire WSS24zo eerder te zien.
  5. Injecteren van 1 nL van de 50 μM Isoproterenol7, dat het tarief van contractility, aan het medium van de E3 gedurende 24 uur terwijl de zebravis verhoogt als eerder is laten zien24worden gekweekt.
  6. 4-D LSFM imaging voor elke groep uitvoeren. Volg de instructies in de stappen 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. kwantificering van fractionele verkorten en volume verandering in de tijd

  1. 4-D LSFM imaging uitvoeren voor elke groep bij 50, 75 en 100 hpf. Instructies in stappen 2.1.1-2.1.5.2.8. Verdeel elke afbeelding zodat elk 600 knooppunten te repliceren de beweging van de cardiale muur heeft.
  2. Het meten van de verandering in de diameter van het ventrikel tijdens de diastole en systole met de volgende formule:
    Equation 3(3)
    Laden van 3D-ventriculaire beelden bij elke 0,1 s met visualisatie software en meet het volume.
  3. Uitzetten van de volumeverandering na verloop van tijd voor elke experimentele groep op 75 hpf en 100 hpf.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LSFM werd gebruikt in dit manuscript om verwerven van hoge resolutie 2D en 3D-afbeeldingen. Zoals te zien in figuur 1A en 1B, regisseert de verlichting lens het lichte blad op het monster. Vanwege de dunheid van het lichte blad, slechts een enkel vliegtuig brandt. De detectie-lens is gepositioneerd loodrecht op de lens van de verlichting en is gericht op het verlichte vlak (figuur 1B). Het lichte blad van de verlichting-lens scant dan de steekproef van links naar rechts (Figuur 1 c). Het scannen kan minder foto-bleken, foto-toxiciteit, en heeft een lagere signal-to-noise verhouding.

LSFM werd door snelle scannen (> 30 s) met een resolutie van voxel van 0,65 x 0.65 x 1 µm. als gevolg van een enkel vliegtuig verlichting toegepast op Tg(cmlc2a:gfp) embryo's te visualiseren van de gehele structuur van de cardiale34 , achtergrondgeluiden was aanzienlijk verlaagde (Figuur 1). Trabecular ruggen staken in de ventriculaire lumen bij 75 hpf, en een trabecular netwerk duidelijk was aangetoond bij 100 hpf (figuur 2A, B). Gata1a MO micro-injectie verlaagd Haematopoiese en viscositeit met 90%4,35. Deze verminderde viscositeit verzwakt hemodynamische schuifspanning, wat resulteert in een vertraagde opening en de dichtheid van trabecular netwerk op 75 hpf en 100 hpf in vergelijking met de controlegroep (Figuur 2 C, D). Bovendien, Notch liganden (Dll4, Jag1en Jag2), receptor (Notch1b), en stroomafwaarts signalering onderdelen (Nrg1 en ErbB2) waren naar beneden-geregeld in reactie op gata1a MO injectie (p < 0,05, n = 5) (Figuur 2 K)2,8,36. Co injectie van gata1a MO met 5 μM van Nrg1 mRNA omhoog-geregeld Notch signalering-gerelateerde genexpressie en geredde trabecular vorming op 75 hpf en 100 hpf (figuur 2E, F, K). Gata1a MO verminderd hemodynamische krachten leidt tot down-regulatie van Inkeping signalering, overwegende dat Nrg1 mRNA redden Notch-gerelateerde genen omhoog-geregeld en dus opnieuw gestart trabeculation.

Om verdere bewijzen onze hypothese dat het veranderen van hemodynamische krachten en dus trabeculation via Notch signalering, introduceerden we de wea mutant ontwikkelt die een niet-contractiele atrium37. Bij gebrek aan ventriculaire instroom en hemodynamische strijdkrachten tijdens atriale systole, wea mutanten express lagere cardiale mRNA niveaus van Inkeping signalering component genen en doelgenen vergeleken met besturingselementen en haven van niet-trabeculated, klein en zwak aanbestedende ventrikels (Figuur 2 g, L). Echter Nrg1 mRNA micro-injectie in de wea mutanten omhoog-geregeld de inkeping signalering traject, vergezeld van de gedeeltelijke redding van trabecular ruggen, wat leidt tot een meer uitgesproken contractiele ventrikel ondanks een (niet-contractiele atrium Figuur 2 H, L)2. In dit verband bevestigd de wea mutanten de relatie tussen de niet-contractiele atrium en een niet-trabeculated ventrikel, onderstrepen de hemodynamische modulatie van trabeculation via Notch signalering.

Tnnt2a MO werd geleverd om te stoppen met cardiale contractie door remming van de cardiale troponine T38,39. De tnnt2a MO-geïnjecteerd vissen waren volledig verstoken van verkeer en ventriculaire WSS als gevolg van aanzienlijke down-gereglementeerde Notch signalering, wat leidt tot een soepele ventriculaire oppervlak en dunne muur in vergelijking met de controlegroep (figuur 2I, M) . Om te onderzoeken of WSS op het endocard een eis voor trabeculation was, hebben we ook cloche (clo) mutanten waarvoor endocard en de endothelial bekleding van het hart niet40,41 ontwikkelen. De clo mutant verzuimd te ontwikkelen van cardiale trabeculae en toonde kleiner formaat ventrikel en onvolledige cardiale (figuur 2J)in een lus. Dus, is de endocardial bekleding nodig zin hemodynamische schuifspanning te activeren Notch signalering (Figuur 2 M). Echter wanneer de hemodynamische schuifspanning werd verhoogd door het verhogen van de Haematopoiese of de behandeling van isoproterenol om contractility, de niveaus van de expressie van genen Notch-gerelateerde niet te verhogen, en de morfologie trabecular netwerk veranderde niet (Figuur 3).

Als u wilt verder tonen de relatie tussen schuifspanning en Notch signalering, werden HAECs gebruikt voor in vitro testen. Een gepulseerde stroom werd uitgeoefend op confluente cellen te simuleren de hemodynamische schuifspanning waargenomen door endotheliale cellen. Het is aangetoond dat in vergelijking met statische cultuur, Pulsatiele expressie van Inkeping-gerelateerde genen (Figuur 4 verhoogt). Bovendien, behandeling met de ADAM10-remmer aanzienlijk verminderd Notch signalering (Figuur 4).

Vervolgens wij berekend ventriculaire fractionele verkorting en ventriculaire holte verandering in volume in de tijd voor de wild-type, gata1a MO, AG1478, en die gered door Nrg1 injectie risicogroepen-50 hpf, 75 hpf en 100 hpf (figuur 5A- C) . Behandeling met ErbB signalering remmer, AG1478, aanzienlijk vertraagd en verminderd fractionele verkorting tijdens ventriculaire diastole bij 100 hpf (figuur 5A). Gata1a MO zowel AG1478 behandeling minimumgrootte van ventriculaire kamer tijdens contractie, zoals beoordeeld door de veranderingen in de 4-D LSFM (figuur 5E, F). Beide groepen ontwikkeld een verhoogde einde-systolische en -diastolische volume in vergelijking met de wild-type. Co injectie van Nrg1 mRNA met gata1a MO hersteld fractionele verkorting zowel ejectie fractie naar die van het wild-type.

Figure 1
Figuur 1 : Fluorescerend licht blad overzicht. (A) vertegenwoordiger LSFM systeem waar het monster wordt geplaatst in het snijpunt van het lichte blad van de verlichting lens (IL) en het pad van de detectie van de detectie-lens (DL). (B) de cilindrische lens achter de IL maakt de micron middelgrote licht blad (paars) in het monster, die een dunne plaat van het monster boeit. De detectie-lens registreert het uitgestoten fluorescent signaal. (C) een schematische voorstelling van de dunne laser blad (paars) optisch segmenteren de zebravis embryo's die van rechts naar links verplaatst. Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Ventriculaire morphologies van genetisch gemanipuleerde TG(cmlc:GFP) zebrafish met inkeping Ligand, receptor en doel genexpressie. (A) het trabecular netwerk wordt weergegeven bij 75 hpf van controle zebrafish. (B) het trabecular netwerk op 100 hpf van controle zebrafish. (C) injectie van gata1a MO stadium 1 - tot 4-cel toonde weinig tot geen trabeculation op 75 hpf. (D) injectie van gata1a MO in zebrafish had uitgesteld trabecular netwerk vorming. (E) mede injectie van gata1a MO en menselijke Nrg1 mRNA gedeeltelijk hersteld trabeculation 75 hpf. (F) mede injectie van gata1a MO en menselijke Nrg1 mRNA bijna volledig gerestaureerd het trabecular netwerk op 100 hpf. (G) wea mutant bij 100 hpf toont geen trabeculation en een soepele ventriculaire muur. (H) injectie van menselijke Nrg1 in wea mutant zebrafish gedeeltelijk hersteld trabeculation bij 100 hpf. (I) injectie van tnnt2a MO toonde geen trabeculation op 75 hpf (niet afgebeeld) en 100 hpf. (J) CLO mutant toonde geen trabeculation op 100 hpf. (K) injectie van de gata1a MO aanzienlijk verminderd mRNA uitdrukking van Notch1, Nrg1, en Jag2 (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs. controle). Co injectie van gata1a MO en menselijke Nrg1 mRNA aanzienlijk verhoogd de uitdrukking van Notch1b, Nrg1, ErbB, en Jag1 t.o.v. controle. (L) de wea mutant had de aanzienlijk lagere expressie van genen Notch-gerelateerde (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs. controle). Injectie van menselijke Nrg1 verhoogd de expressie van Inkeping-gerelateerde genen; Jag1 en Jag2 waren aanzienlijk hoger is dan het besturingselement. (M) de tnnt2a MO injectie en clo mutant bleek een aanzienlijk lagere expressie van genen die Notch-gerelateerde (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs. controle). Schaal bars: 50 μm. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde standaardafwijking. Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Verhogen van WSS in gemanipuleerd TG(cmlc:GFP) zebravis met inkeping ligand, receptor en doel genexpressie in vivo . Verhoging van de WSS via overmatige uitdrukking van Haematopoiese met de injectie van EPO(A) of toevoeging van ISO (B) via de verhoging van de hartslag niet verhogen trabeculation en had een trabecular netwerk vergelijkbaar met die van het besturingselement. (C) de injectie van het EOB mRNA of Isoproterenol veranderde niet de expressie van genen die Inkeping ligand, receptor of doel (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs. controle). Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Endotheliale cellen onder oscillerende of Pulsatiele schuifspanning in vitro . HAECs onder voorbehoud van de gepulseerde schuifspanning van τgemiddelde = 30 x 10-5 z 1 Hz had upregulated gen Notch-gerelateerde expressies en werden van Inkeping-gerelateerde gen expressies wanneer de ADAM10-remmer werd toegepast (t-test, * P < 0,05, n = 5 VS. control). Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Effect van trabeculation van fractionele verkorting en ejectie Fractie. (A-C) Toevoeging van AG1478 en gata1a MO aanzienlijk daalde het fractionele verkorten bij 100 verbeterde it-hpf, maar mede injectie van menselijke Nrg1 en gata1a MO. (D) gata1a injectie en AG1478 aanzienlijk daalde het fractionele verkorten bij 100 hpf (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs. controle). Co injectie van gata1a en Nrg1 mRNA verbeterd het fractionele verkorten. (E-F) Integratie van het algoritme van de 4-D synchronisatie met LSFM toonde dat AG1478 en gata1a MO einde systolische en diastolische volumes op 75 toegenomen hpf (E) en 100 hpf (F). Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde standaardafwijking. Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Zebrafish Jag1 Voorwaarts CCGCGTATGTTTGAAGGAGTATCAGTCG
Achteruit CAGCACGATCCGGGTTTTGTCG
Zebrafish Jag2 Voorwaarts AGCCCTAGCAAAACGAGCGACG
Achteruit GCGTGAATGTGCCGTTCGATCAA
Zebrafish Dll4 Voorwaarts CAAAGTGGGAAGCAGACAGAGCTAAGG
Achteruit CGGTCATCCCTGGGTGTGCATT
Zebrafish BMP10 Voorwaarts GCATCAAGGGGCCACTCGTGTAGA
Achteruit TCGTCTCACTCCACTAGGTCCCATACTG
Zebrafish ErBb2 Voorwaarts GATCAGGACTGCCAAACATTGACGTCT
Achteruit AGCAGCACACTGAACATGGCAGCA
Zebrafish Nrg-1 Voorwaarts GTGTGTTTGTCCCTGTGGACGCGT
Achteruit CCTCCTGGAGCTTCCCCTCAAACA
Zebrafish Notch1b Voorwaarts CAGAGAGTGGAGGCACAGTGCAATCC
Achteruit GCCGTCCCATTCACACTCTGCATT

Tabel 3: Inleidingen gebruikt voor Zebrafish screening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit protocol hebben we aangetoond dat 4-D imaging kan worden gebruikt voor het bijhouden van de ontwikkeling van een trabecular netwerk in reactie op veranderingen in de biomechanische krachten. In het bijzonder initieert de shear stress ervaren door endotheliale cellen de inkeping signalering cascade, die op zijn beurt trabeculation bevordert. In dit manuscript, hebben wij aangetoond dat (1) gata1a MO injectie daalde Haematopoiese en daarom het minder muur shear stress, (2) tnnt2a MO injectie geremd ventriculaire contractiele functie muur shear stress, en (3) wea te verminderen mutanten atriale contractie, die vervolgens de hemodynamische op het ventrikel uitgeoefende kracht daalde ontbrak. Door het verminderen van de afschuifweerstand op de cardiale muren, we gekwantificeerd de inkeping signalering via qRT-PCR en vond dat met verminderde WSS, er was minder Notch signalering. Om te verder bewijzen onze hypothese, clo mutanten die endocard ontbraken vormden geen trabeculae en onderwerpen van endotheliale cellen aan gepulseerde shear stress met ADAM10 aanwezig bleek dat schuifspanning activeert Notch signalering.

De andere beeldvormingstechnieken zoals confocale microscopie kunnen worden gebruikt om foto's in 3D-14. Echter, deze techniek en anderen hebben veel nadelen. Bijvoorbeeld, de confocal beeldvorming kan niet diep doordringen in monsters, heeft de lage axiale resolutie, en traag scannen snelheden19,42. Vanwege deze beperking tot diepte penetratie in confocale beeldbewerking, kunnen kleine steekproeven, zoals zebrafish de embryo's daarvan, alleen worden beeld in zijn geheel. Twee-foton confocale microscopie verbetert de indringingsdiepte, maar de resolutie, zacht scanner vaart en hoge kosten maken deze techniek ongewenste13. Zijn er studies die een combinatie van twee-foton microscopie en LSFM met succes18, de nadelen zijn echter nog steeds prominent42.

LSFM, aan de andere kant, heeft de minste foto-bleken en schade13,18,42, snelle overname snelheid en soortgelijke penetratie diepte13. Daarnaast vanwege de dual lenzen en de excitatie van een enkel vliegtuig (Figuur 1)is de achtergrondgeluiden aanzienlijk verlaagde43. Nochtans, moeten de monsters worden ingebed in gels te immobiliseren van het monster, waardoor het moeilijk toe te passen op de in vivo modellen dan zebrafish14,17,19. Gebruik van de tl-licht beperkt ook de penetratie van de diepte op een paar millimeter. Hoewel LSFM een geweldige methode voor visualisatie is, is het essentieel dat het wordt aangevuld met kwantitatieve gegevens. Want LSFM alleen kwalitatieve is, kunnen het voorwerp van verschillende interpretaties. QRT-PCR gebruikt, kunnen wij bevestigen dat de LFSM 4-D beelden waren een correcte vertegenwoordiging van de gebeurtenissen die zich in de levende voorbeelden. Af en toe in grotere monsters, kunnen strepen en schaduwen vormen in de beelden. Echter, tweezijdig verlichting of mSPIM kan worden gebruikt om deze artefacten42. Omdat LSFM zo veelzijdig is, maakt haar bekwaamheid voor het vastleggen van hoge resolutie en over het algemeen betere kwaliteit beelden de toekomst van LSFM veelbelovende. Eerder vermeld, kan LSFM worden gecombineerd met andere imaging systemen voor succesvolle imaging18,42.

We toonden eerder dat toepassing van een gepulseerde schuifspanning van 23 x 10-5 N 1 Hz gedurende 24 uur aanzienlijk upregulates Notch signalering in vitro(Figuur 4)17. We verder aangetoond dat schuintrekken krachten activeren Notch signalering door genetische manipulatie van Haematopoiese (gata1a MO)4, cardiale contractie (tnnt1a MO)5, atriale contractie (wea mutant), endocardial verwijderen (clo mutant) en lokalisatie van Inkeping signalering (GS [flk:mCherry; tp1:gfp]). We beschrijven hier dat door het verlagen van de muur shear stress in de ventrikel, dat Notch-gerelateerde genen down-gereglementeerde (Figuur 2 K, L, M waren). Bovendien konden we aantonen dat Nrg1 mRNA kon redden trabeculation, Notch signalering te herstellen en verbeteren van ventriculaire fractionele verkorting en ejectie fractie (figuur 2E, F, H, K-M, Figuur 5) . Het herstel van de hartfunctie bleek door de toename van de contractiele functie-gemedieerde hemodynamische krachten die geactiveerd Notch signalering (Figuur 2 K- M).

Wij ook vastbesloten dat de schuifspanning-geactiveerde Notch signalering afhankelijk van de endocardial is. Met behulp van gata1a MO, tnnt2a MO, wea mutant of AG1478 behandeling, trabeculation was geremd en Notch signalering was down-gereglementeerde (Figuur 2 K- M). Echter Nrg1 trabeculation en Notch signalering in wea mutanten gered en wanneer mede ingespoten met gata1a MO (figuur 2D, H, K, L). Wanneer de muur schuifspanning (EOB injectie) of Notch signalering (10 pg/nL Nrg1 injectie) werd verhoogd, was er geen verandering in de groep van het EOB in termen van morfologie, maar abnormale ventriculaire morfogenese was aanwezig in de Nrg1 verhoogde dosis (Figuur 3).

Kortom, hebben we aangetoond dat de mechanotransduction van shear stress activeert de inkeping signalering traject. Door toepassing van 4-D LSFM en genetisch gemanipuleerde zebrafish, ontwikkelden we een nieuw modelsysteem dat hoe kritisch doorbloeding toont is tijdens de ontwikkeling van de cardiale morfologie, contractility, en algemene functie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs zou dank willen uitspreken aan William Talbot van Stanford University voor het verstrekken van de mens Nrg1 cDNA en Deborah Yelon van UCSD voor het verstrekken van de wea de mutanten. De auteurs ook bedank Cynthia Chen voor het helpen met Beeldacquisitie. Deze studie werd ondersteund door subsidies NIH HL118650 (T.K. Hsiai), HL083015 (naar T.K. Hsiai), HD069305 (naar NC Chi en T.K. Hsiai.), HL111437 (aan T.K. Hsiai en NC Chi), HL129727 (naar T.K. Hsiai), T32HL007895 (naar R.R. Sevag Packard), HL 134613 (naar V. Messerschmidt) en Universiteit van Texas systeem sterren financiering (J. Lee).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clontech Hifi PCR pre-mix  Takara  639298 PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N/A Used for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855201 PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+ GE Health Plasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit   Clontech 740609.25 DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase  Clontech 2011A PCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cells Clontech 636763 E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent Life Technologies 11668027 Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kit Invitrogen AM1340 Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820 Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8 GeneTools N/A Software for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA Creative Biogene CDFH006026 Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478 Sigma-Aldrich  T4182 ErbB inhibitor
1.3.1
E3 medium To grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT Sigma-Aldrich  D5942 γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose  Sigma-Aldrich  A9539 Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software FEI Software N/A Visualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  Sigma-Aldrich  886-86-2 Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge Eppendorf 05-400-005 Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023X Sigma-Aldrich  260264-93-5 ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich  I5627 Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLAB Mathworks N/A Cardiac mechanics analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924 (2013).
  2. Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish. Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).
  3. High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).
  4. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos. Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).
  5. Chi, N. C., et al. Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662 (2010).
  6. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110 (7), 2718 (2007).
  7. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898 (2014).
  8. Liu, J., et al. A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation. Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).
  9. Samsa, L. A., et al. Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish. Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).
  10. Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521, 520 (2015).
  11. Sifrim, A., et al. Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing. Nature Genetics. 48, 1060 (2016).
  12. Hu, Z., et al. A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations. Nature Genetics. 45, 818 (2013).
  13. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).
  14. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).
  15. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
  16. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12, 2081 (2016).
  17. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
  18. Lavagnino, Z., et al. 4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM). Scientific Reports. 6, 23923 (2016).
  19. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007 (2004).
  20. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
  21. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  22. BioRad. General Protocol for Western Blotting. 6376, http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2018).
  23. GeneTools. Gene Tools Oligo Design Website. , https://oligodesign.gene-tools.com/request/ (2018).
  24. Mullins, M. Zebrafish Course. , ed University of Chicago (2013).
  25. Grenander, U. Probability and Statistics: The Harald Cramér Volume. , Alqvist & Wiksell. (1959).
  26. Fei, P., et al. Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function. Scientific Reports. 6, 22489 (2016).
  27. Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences. Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).
  28. Adeoye, A. A., et al. Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome. Aquaculture. 463, 61-70 (2016).
  29. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165 (2011).
  31. Li, R., et al. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxidants & Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).
  32. Li, R., et al. Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).
  33. Baek, K. I., et al. Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).
  34. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).
  35. Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), (2009).
  36. Grego-Bessa, J., et al. Notch signaling is essential for ventricular chamber development. Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).
  37. Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish. Development. 130 (24), 6121 (2003).
  38. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).
  39. Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biol. 6 (5), e109 (2008).
  40. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124 (2), 381-389 (1997).
  41. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).
  42. Santi, P. A. Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  43. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).

Tags

Bioengineering kwestie 138 selectieve vliegtuig verlichting microscopie Notch signalering trabeculation hemodynamica zebravis cardiale ontwikkeling schuifspanning 4-dimensionale hart imaging mechanobiology hart licht blad fluorescentie microscopie

Erratum

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 09/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

Licht vel fluorescentie microscopie 4-dimensionale beelden van de gevolgen van het moduleren van Shear Stress op de ontwikkelingslanden Zebrafish hart
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, … More

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, K. I., Ding, Y., Hsu, J. J., Bryant, R., Li, R., Hsiai, T. K., Lee, J. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (138), e57763, doi:10.3791/57763 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter