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Bioengineering

Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, 4-dimensionale Bilder über die Auswirkungen der modulierende Schubspannung auf entwickelnden Zebrafisches Herzen erfassen

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57763
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Entwicklung von Herzen im Zebrafisch in 4 Dimensionen (4D) zu visualisieren. 4-D-Bildgebung, über Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) dauert 3-dimensionale (3D) Bilder im Laufe der Zeit entwickelnde Herzen zu rekonstruieren. Wir zeigen qualitativ und quantitativ die Scherspannung aktiviert endokardialen Kerbe Signalisierung während der Entwicklung der Kammer, die kardiale Trabeculation fördert.

Abstract

Die hämodynamischen Kräfte durch die Herzen Einfluss kardiale Entwicklung, vor allem Trabeculation, bildet ein Netz von verzweigten Auswüchse von Myokard erlebt. Genetisches Programm Mängel in der Kerbe Signalisierung Kaskade ventrikuläre Defekte wie linken Ventricular Non-Compaction-Kardiomyopathie oder hypoplastischen Links-Heart-Syndrom beteiligt sind. Unter Verwendung dieses Protokolls, kann festgestellt werden, dass Schubspannung angetrieben Trabeculation und Notch signaling miteinander verbunden sind. Mit Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie war Visualisierung der entwickelnden Zebrafisches Herzen möglich. In diesem Manuskript wurde geprüft, ob hämodynamischen Kräfte die Einleitung der Trabeculation über die Kerbe Signalisierung modulieren und somit KONTRAKTILE Funktion beeinflussen auftritt. Für qualitative und quantitative Scheren Spannungsanalyse, 4-D (3-D + Zeit) Bilder wurden während der Zebrafisch kardiale Morphogenese erworben und integrierten Licht-Blatt-Fluoreszenz-Mikroskopie mit 4D Synchronisation erfasst die ventrikuläre Bewegung. Viskosität des Blutes verringerte Down-Regulierung Kerbe Signal- und mildernde Trabeculation über gata1a- Morpholino Oligonucleotides (MO) Mikro-Injektion, Schubspannung, dadurch zu verringern. Co-Injektion von Nrg1 mRNA mit gata1a MO gerettet Kerbe-Genen um die Trabeculation wiederherzustellen. Bestätigen Schubspannung getrieben Notch signaling beeinflusst Trabeculation Cardiomyocyte Kontraktion verhaftet weiter über tnnt2a-MO hämodynamischen Kräfte dabei reduzieren Down-Regulierung Kerbe Zielgene, non-trabekulierte zu entwickeln Myokard. Zu guter Letzt wurde Bestätigung der Expressionsmuster von Scherbeanspruchung reagierende Kerbe Gene von Endothelzellen pulsierender Strömung unterwerfen durchgeführt. So deckte die 4-D-Licht-Blatt-Mikroskopie hämodynamischen Kräfte zugrunde liegenden Kerbe Signal- und Trabeculation mit klinischer Relevanz, nicht-Verdichtung Cardiomyopathy.

Introduction

Biomechanische Kräfte, wie hämodynamische Schubspannung sind kardiale Morphogenese eng beteiligt. In Reaktion auf die hämodynamische Scherkräfte entwickeln myokardialen Rillen und Nuten in einem wellenartigen trabekuläre Netzwerk in Übereinstimmung mit der Richtung der Schubspannung in der ventrikulären (AV) Ventil1. Kardiale Trabeculation ist notwendig, KONTRAKTILE Funktion und myokardialen Masse2zu erhöhen. Mutationen im Notch Signalwege führen angeborene Herzfehler bei Menschen und anderen Wirbeltieren3. Beispielsweise wurden gata1a4 und tnnt2a5 Morpholino Oligonucleotides (MO) gezeigt, Erythropoese, reduzieren, während Erythropoetin (EPO) mRNA6 und Isoproterenol (ISO)7 roten Blutkörperchen zu erhöhen Zellen und Herzfrequenz Wand bzw. daher Scherspannung (WSS). Darüber hinaus ErbB2-Signalisierung, flussabwärts von Notch, fördert die Cardiomyocyte Proliferation und Differenzierung Kontraktionskraft, generieren die Einkerbung8,9Signalisierung wiederum aktiviert. Es wird vorgeschlagen, dass die Schubspannung Notch signaling gesteuerte Trabeculation für ventrikuläre Entwicklung regelt. Derzeit gibt es viele Studien, die versuchen, weiter zu verstehen, die genetische Programmierung Ereignisse auf angeborene Defekte (KHK)10,11,12, aber sehr wenig untersuchen, wie mechanische Kräfte beeinflussen das Umformen Herz.

Um die mechanischen Kräfte untersuchen muss auf Endokards, genaue Beobachtung während der Entwicklungszeit umgesetzt werden. Allerdings ist es schwierig, gute Bildqualität von in Vivo Proben durch die Inhärenz des traditionellen Mikroskopie13schlagen zu erhalten. Um die Entwicklung im Laufe der Zeit innerhalb einer Probe zu beobachten, müssen daher körperliche schneiden und färben,13,14,15auftreten. Obwohl der konfokalen Mikroskopie weit verbreitet ist, die 3-d-Struktur der Proben14,16Bild, ist diese bildgebenden Systemen Erwerb noch durch langsame Scan-Geschwindigkeit begrenzt.

Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) ist eine einzigartige bildgebendes Verfahren, die die Visualisierung von in Vivo dynamischen Events mit lange arbeiten Abstand13ermöglicht. Diese Technik verwendet eine Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, optisch eine Probe17Abschnitt. Durch Beleuchtung nur eine dünne Folie aus Licht auf die Probe ist ein Rückgang der Foto-Bleichen und Foto Toxizität13,18. Das große Sichtfeld und langem Arbeitsabstand erlaubt für große Proben intakt bleiben, wie sie abgebildeten13,14,17sind. Die geringe Vergrößerung ermöglicht einen größeren Bereich abgebildet werden, während der langen Arbeitsabstand ermöglicht dickere Proben abgebildet werden, ohne das Signal-Rausch-Verhältnis. Viele Gruppen haben LSFM verwendet, um Bild gesamte Embryonen17,14,18, Muskeln und Herz19 unter anderen Geweben, Gehirne, zeigen die vielfältigen Arten von Proben, die abgebildet werden können.

Obwohl die bisherige Forschung reduzierte hämodynamische Querkraft nachgewiesen durch den Zufluss oder Abfluss Spuren der Zebrafisch Herzen verschließen, sind die Informationen ausschließlich qualitative. Es ergibt sich eine abnorme Dritte Kammer, verminderte kardiale looping und beeinträchtigt Ventil Bildung20. Die 4-D LSFM Bilder geben eine neue Perspektive in die Lebensweise, die der hämodynamischen beeinflussen Scherkräfte, die Entwicklung der das Herzgewebe. Diese mechanische Kräfte können Kraft-Sensitive Signalmoleküle aktivieren und induzieren die Bildung von den trabekulären Kämmen. Wegen der Nachspielzeit Aspekt der 4-D-Bildgebung kann man zum Nachverfolgen von Änderungen in der Entwicklung in Echtzeit, die zu neuen Enthüllungen führen könnten, die bisher unbemerkt hatte. Der Zebrabärbling ist ein ideales Modell für imaging, weil Wissenschaftler eine ganze vertebrate Tier im Vergleich zu nur Zell-Zell-Interaktionen beobachten können. Sauerstoff kann auch durch den gesamten Embryo diffundieren die Entwicklung ohne je nach Kreislauf-Systems, im Gegensatz zu Säugetieren Entwicklung auftreten können. Obwohl der Zebrafisch-Herz der pulmonalen Organe, die erfordern ein vier-Kammer-Herz fehlen, gibt es eine große Anzahl von kardialen Gene, die zwischen Menschen und Zebrafisch21konserviert sind.

In diesem Manuskript beschreiben wir, wie Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie verwenden, um die Entwicklung Trabekel im Zebrafisch Herzen unter verschiedenen Umständen Bild. Zunächst wurden Injektion von gata1a4 oder tnnt2a5 MOs niedriger die Viskosität des Blutes und damit WSS verwendet. Die Morphologie des Herzens wurde dann aufgezeichnet. In einer separaten Gruppe von Fischen wir erhöht die WSS durch Verabreichung von EPO mRNA6 oder Isoproterenol7 und die Ergebnisse zu beobachten. Wir haben auch eine Zelle-Studie mit verschiedenen pulsierender oder oszillierende Durchflussraten. Nach jeder Gruppe imaging, fanden wir, dass WSS durch Endokards über Kerbe spürte Signalisierung Eingeweihten Trabeculation.

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Protocol

Die folgenden Methoden wurden in Übereinstimmung mit UTA und UCLA IACUC Protokolle durchgeführt. Diese experimentellen Gruppen dienten mit transgenen Tg(cmlc2:gfp), Wea (schwache Atrium) oder Clo (Cloche) Mutanten: (a) Wildtyp (WT) Kontrolle, (b) gata1a MO und (C) tnnt2a MO-Injektionen (Tabelle 1).

Modell Name Veränderten Genen Phänotyp Referenz
Kontrolle Wildtyp Keine N/A
TG(cmlc2:GFP) Kardialen Myosin-Leichtketten Grüne Flourescence speziell im Myokard ausgedrückt 34
Verminderte Wand Schubspannung Schwache Atrium (Wea) mutant Atrium-spezifische Myosin Heacy Kette Atrium kann nicht Vertrag, kompakte Ventrikel, myokardiale dickwandigen, engen Lumen, Dialated Atrium 37
Cloche (Clo) mutant N/A Vollständige Entfernung des Endokards, Unaturally große Atrium mit kleinen Ventrikel, nicht vorhandene kardiale cushins 41
gata1a MO gata1a  Anämie aus Mangel an roten Blutkörperchen 4
tnnt2a MO tnnt2a 39
Erhöhte Wand Schubspannung EPA -mRNA Keine Schwere Polyzythämie, Erhöhung der Anzahl der zirkulierenden Blutzellen, erhöhte Viskosität 6
Isoprotenerol Keine Erhöhte kardiale rate 7

Tabelle 1: Zebrafisch Beschreibungen. Definitionen und Beschreibungen der Zebrafisch in Experimenten verwendet.

1. studieren Sie Setup

  1. Trabeculation Rettung Nrg1 und EPA mRNA vorbereiten.
    1. Menschliche Nrg1 cDNA erhalten und von einem Spender-Plasmid zu verstärken.
      Hinweis: Die menschlichen Nrg1 cDNA wurde von William Talbot von der Stanford University begabt.
      1. Nehmen Sie notwendigen Reagenzien und Materialien, nämlich PCR Mastermix (gespeichert in-20 ° C), Primer (siehe Tabelle 2) (gespeichert in-20 ° C), eine PCR-Platte (bei Raumtemperatur gelagert) und einer 20 μl Pipette (bei Raumtemperatur gelagert). Siehe Tabelle der Materialien für Beispielprodukte.
        Table 2
        Tabelle 2: Primer zum Nrg1 Klonen.
      2. Bereiten Sie den Mastermix für jede Grundierung in dreifacher Ausfertigung mit der 20 μl Pipette festgelegt. Verwenden Sie für 1 Satz Triplicates 37,5 μl der Mastermix, 3 μl DNA-freie Wasser, 4,5 μl Grundierung. Multiplizieren Sie für mehr Triplicates einfach mit der Anzahl der Stichproben.
      3. Verdünnen Sie die Arbeitslösung menschlichen Nrg1 cDNA (20 ng/μg Konzentration) im Primer-Streifen mit DNA-freies Wasser, so dass es 10 μL pro Well pro Probe insgesamt.
        Hinweis: Stellen Sie sicher, dass jede Lösung unter Schritt 1.1.1 gleichmäßig verteilt ist. Zu diesem Zweck mischen jede Lösung durch pipettieren rauf und runter. Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, verwenden Sie eine PIPETTENSPITZE für nur eine Probe.
      4. Aliquoten Nrg1 cDNA mit der 10 μL Mehrkanal-Pipette zum gewünschten Brunnen in der PCR-Platte.
      5. Die cDNA in den Vertiefungen 14,5 μL der Mastermix hinzufügen. Die PCR-Platte zur Abdichtung der Brunnen, und legen Sie in der PCR-Maschine zuweisen Sie ein klebrigem Cover.
      6. Starten Sie die PCR-Maschine und sicherzustellen Sie, dass der Zyklus entsprechende Temperaturen entsprechend der Enzyme und Primer verwendet.
    2. Klonen Sie die Nrg1 cDNA in das Plasmid pCS2+ an den Standorten BamHI und EcoRI mit überschüssigen Enzymen BamHI und EcoRI cDNA ist in alle Plasmide ligiert.
      1. Mischen die Nrg1 cDNA mit dem Spender Plasmid pCS2+, handelsübliche Master mix, Lösung und Primer (Tabelle 2).
        Hinweis: Das gesamte Reaktionsvolumen sollte 50 μL mit 25 μL des master-Mix, 3 μL der Zündkapseln und 1 μl 20 ng/μl Spender Plasmids mit Nrg1 cDNA.
      2. Legen Sie die Mischung aus Schritt 1.1.2.1 in der PCR-Maschine und stellen Sie die Parameter für den folgenden Spezifikationen entsprechen: 98 ° C für 10 s, 55 ° C für 5 oder 15 s und 72 ° C für 5 s/kb.
      3. Das PCR-Produkt mit einer Reinigung Kit nach den Anweisungen des Herstellers zu reinigen. Eluieren Sie das Produkt in 50 μL der Elution Buffer.
      4. Verdauen die gereinigten PCR-Produkt und 5 μg pCS2+ mit BamHI und EcoRI separat bei 37 ° C für 2 h in einem Reaktionsvolumen von 200 μL. Die daraus resultierende Verdauung mit einem kommerziellen Kit reinigen und eluieren in 20 μl und 100 μl Tris-HCl (pH 8,5), beziehungsweise.
      5. Verbinden von 4 μL Nrg1 cDNA und 2 μL der verdauten pCS2+ Plasmid in einer 25 μL Reaktion mit 1 μl der Ligase Katalysator bei 16 ° C über Nacht.
        Hinweis: Das Verfahren kann hier für die Inkubation über Nacht gestoppt werden.
      6. Verwenden Sie 2 μL der Ligatur Lösung aus Schritt 1.1.2.5. und Transformation in 50 μL der E. Coli Bakterienzellen geeignet für das Klonen (siehe Tabelle der Materialien).
    3. Bestätigen Sie, dass die Transformation erfolgte durch Screening die Nrg1 cDNA Klone mittels PCR. Klone nach dem Zufallsprinzip auswählen und hinzufügen zu einer Lösung von spezifischen Primern, Polymerase und Deoxyribonucleotide Triphosphate (dNTPs).
      Hinweis: Die Kontrollen waren der Vektor (pCS2+) mit und ohne Einlage (menschliche cDNA). Nehmen nicht zu groß für eine Kolonie, weil übermäßige Bakterien PCR hemmen können.
      1. Wählen Sie aus der Transformation und Bildschirm pCS2 8 Kolonien+-Nrg1-Klone unter Verwendung der PCR Zündkapseln aus Tabelle 2.
      2. Kultur einen Klon mit Nrg1 cDNA zu isolieren, die pCS2+-Nrg1 Plasmid DNA. Impfen mit 100 μL der E. Coli -Bakterien mit pCS2+-Nrg1 Plasmid in 100 mL LB Medien und Kultur durch Schütteln (160-225 u/min) bei 37 ° C.
    4. Transfizieren gereinigten pCS2+-Nrg1 Plasmid in HEK-293-Zellen in einem 6-Well-Platte mit einem kommerziellen Transfektion Reagenz nach den Anweisungen des Herstellers.
    5. 24 h nach Transfektion, lösen Sie die Zellen mit einer Lyse-Puffer und durchlaufen eine SDS-PAGE-Gel, auf einer Gel-Membran übertragen und dann färben mit Anti-Nrg1 Antikörper22. Überprüfen Sie die Nrg1 -Protein-Expression mit einem Western-Blot.
      Hinweis: Die Steuerung ist eine leere pCS2+ Plasmid. Kann hier angehalten werden, wenn Gel Membran über Nacht erfolgt.
    6. Synthetisieren Sie Nrg1 mRNA mit einem kommerziellen Produkt ähnlich dem in der Tabelle der Materialien zu und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
      1. Nehmen Sie 5 μL der pCS2+-Nrg1 DNA aus den isoliert Bakterienkultur und verdauen mit NotI in einer 200 μL Reaktion für 2 h bei 37 ° C auf das Plasmid zu linearisieren.
      2. Reinigen Sie die linearisierte Plasmid mit einem kommerziellen Kit und eluieren in 20 μl Tris-HCl (pH 8,5).
      3. Durchführung von in-vitro- Transkription mit einem kommerziellen RNA isolierungskit in einem 20 μl-Reaktion unter Verwendung der 5 μL des linearisierten Plasmids nach den Anweisungen des Herstellers.
      4. Fügen Sie die in-vitro- Nrg1 auf 350 μL der RNA Lyse Puffer übertragen und dann mit einem RNA-Isolierung-Kit zu reinigen. Die RNA in 60 μl Tris-HCl (pH 8,5) eluieren.
      5. Die RNA-Konzentration zu messen und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.
    7. Folgen Sie den Schritten 1.1.6.1 - 1.1.6.5 oben für die EPA cDNA und mRNA Vorbereitung aber Klon die cDNA in der pCS2 + Plasmid EcoRI und XhoI statt Standorten.
  2. Morpholino in Zebrafish Einspritzen
    1. Design-23 MO-Injektionen, die über ein online-Tool (Table of Materials) gegen die ATG Abfolge der gata1a4 (5′-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3 ') und tnnt2a5 (5′-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3 ').
    2. Fügen Sie hinzu, gata1a und tnnt2a MO separat Nuklease-freies Wasser die Endkonzentrationen von 8 ng/nL und 4 ng/nL, bzw. zu machen. Wiederholen Sie mit EPO mRNA mit einer Endkonzentration von 20 Pg/nL. Stellen Sie sicher, dass das endgültige Volumen 1 mL.
    3. Spritzen 1 nL 8 ng/nL der gata1a MO und 1 nL 4 ng/NB der tnnt2a MO in separaten Zebrafisch-Embryonen im 1 bis 4-Zell-Stadium, Ventrikelwand Scherspannung (WSS)24zu reduzieren. Steigerung der WSS injizieren 1 nL 20 Pg/nL EPA mRNA6 in der Zebrafisch-Embryonen im 1 - 4-Zell-Stadium.
  3. Behandeln Sie chemisch Zebrafisch um Trabeculation zu hemmen
    1. Mit einer Pipette 20 mL verdünnen die 10 mg/mL AG1478 in 1 % DMSO in E3 Medium, eine Endkonzentration von 5 μM bei 30 hpf in einem 15 mL-Tube. Als Kontrolle jeder Fisch mit nur 1 % DMSO zu behandeln.
    2. N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t-Butyl-Ester (DAPT) in 1 % DMSO hinzufügen (100 μM), E3 Medium in einer 15 mL Tube zu hemmen, Kerbe Signalisierung bei 40 hpf in ähnlicher Weise. Als Kontrolle mit nur 1 % DMSO behandeln.

2. die bildgebenden Verfahren

  1. 4-D kardiale LSFM Imaging mit Synchronisation Algorithmus
    1. Übernehmen Sie 2-D-Bilder von der gesamten Fisch-Embryo mehrere Herz schlagen Zyklen mit den Schritten unten (Abbildung 1). Sicherstellen Sie, dass die Licht-Blechstärke ca. 5 μm. Nehmen Sie 1 μm für verlustfreie digitale Probenahme gemäß Nyquist Sampling-Prinzip25500 X-y-Rahmen mit einer Belichtungszeit von 10 Ms. Set Z-Scan.
      1. Erstellen Sie eine 1 % (w/V) Agarose-Gel 100 mL 1 g Agarose hinzufügen und erhitzen, bis alle Agarose aufgelöst ist. Laden Sie einen kleinen Plastikschlauch mit dem Embryo und Agarose mit einer 20 μl Pipette zu und sichern Sie ihn auf der Bühne.
      2. Öffnen Sie das Bild-Viewer-Software, und klicken Sie auf Live um zu sehen, die live-Ansicht der Probe. Passen Sie das Ziel mit dem Regler, so dass die Probe im Fokus befindet. In ähnlicher Weise verschieben Sie die Phase, so dass die live-Ansicht der Probe der obere Teil des Embryos zeigt.
      3. Nehmen Sie Bilder 500 Mal für 5 s bei 10facher Vergrößerung mit dem Mikroskop Software26.
      4. Verschieben Sie die Phase mit den Motor auf eine neue Ebene (1 μm in der z-Achse) und wiederholen Sie bildgebende Verfahren.
      5. Wiederholen Sie über 2 Schritte bis ganzes Herz voll abgebildet wird.
    2. Datenintegrität durch Nichtbeachtung der ersten und letzten Herzzyklus Bilder zu gewährleisten. Finden Sie den Zeitraum von dem Herzzyklus durch passende Bilder, die zum gleichen Zeitpunkt in der Diastole, sondern in verschiedenen Zeiten aufgenommen wurden. Verwenden Sie die folgende Formel, die entwickelt wurde, um den Zeitraum zu finden:
      Equation 1(1)
      wo D die Kostenfunktion verwendet ist für den Einbau einer Periode Hypothese, ichm das aufgenommene Bild τ' die Zeit der Aufnahme war Zk Z-Richtung Index des Bildes, Xm ist die Vektor des Indexes Pixel und T' ist die periodische Hypothese.
    3. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die relative Verschiebung zwischen zwei Bildern in ähnliche Stadien zu finden:
      Equation 2(2)
      wo Qk', k kennzeichnet eine Kostenfunktion für die relative Verschiebung, R ist die mögliche räumliche Nachbarschaft, L ist die gesamte Zeit von der Aufnahme, X ist das Pixel-Index, Zk und -Zk' sind die ersten und zweiten Z-Richtung Scheiben, t ist an der Zeit, und s ist die relative Verschiebung-Hypothese.
    4. Konvertieren Sie die relative Verschiebung in absolute Veränderung in Bezug auf das erste Bild und lösen Sie die lineare Gleichung mit dem Pseudo-inverse-Ansatz, um der absolute Bezug zum richten Sie des nächsten Abschnitts der Bilder als zuvor beschriebenen27zu finden.
    5. Die letzten 4-D-Bilder wurden mit Bildbearbeitungssoftware (Table of Materials) verarbeitet.
      1. Stapeln von 2-D-Bilder in 3D
        1. Öffnen Sie eine kommerzielle Bildverarbeitungs-Software.
        2. Klicken Sie auf Open Data.
        3. Wählen Sie die Bilder in 3-d gestapelt werden > Klick Laden.
        4. Fügen Sie in die Voxel-Größe von 0,65 x 0,65 x 1 > Klicken Sie auf "OK".
        5. Klicken Sie auf Feld Multi-Planar Ansicht um das 3D-Bild zu visualisieren.
        6. Mit der rechten Maustaste der blaue slice_1.tiff -Box > Wählen Sie Anzeige > Wählen Sie Volren.
        7. Klicken Sie auf Bearbeiten > Optionen > Bearbeiten Farbtabelleauswählen.
        8. Passen Sie die Farbe über die Felder in rot beschriebenen > Klicken Sie auf OK.
      2. Umwandlung von 3-d 4-d
        1. Klicken Sie auf "Datei > Öffnen Zeitreihendaten.
        2. Wählen Sie die 3-d-TIFF-Dateien, die gerade gemacht wurden > Klick Laden.
        3. Geben Sie die gleiche Voxel-Größe wie vor.
        4. Die blaue slice_1.tiff -Box einen Rechtsklick > Wählen Sie "Anzeige" > Wählen Sie Volren.
        5. Klicken Sie auf Bearbeiten > Optionen > Bearbeiten Farbtabelleauswählen. Passen Sie die Farbe über die Felder > Klicken Sie auf "OK".
        6. Zeitsteuerung-Serie einen Rechtsklick > Klicken Sie auf Movie Maker > drücken Sie den Play -Button um den Film zu sehen.
        7. Fügen Sie einen Dateinamen, Frame-Größe, Frame-Rate, Qualität gleich 1, geben Sie monoskopisches > Klicken Sie auf Apply
        8. Exportieren Sie das Video. Öffnen Sie das Video in einer geeigneten Software.

(3) qRT-PCR-Analyse

  1. Zebrafisch Herz RNA Isolation Notch-Liganden, Rezeptoren, zu quantifizieren und gezielt Gene Ausdrücke
    1. Der Zebrabärbling zu Opfern, indem sie auf eine Überdosierung von Tricaine метоксид28,29. Mit einem zuvor beschriebenen Protokoll30, wurden der Zebrafisch Herzen herausgeschnitten und für RNA Isolierung vorbereitet.
    2. Isolieren Sie die gesamte-RNS zu, und synthetisieren Sie die cDNA mit dem cDNA Synthese Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
    3. Die PCR-Primer-Design für den Notch-Liganden Jag1, Jag2, Dll4, Notch1b-Rezeptor und Signalisierung im Zusammenhang mit Genen Nrg1 und ErbB2. Siehe Tabelle 3 für die Primer, die wir verwendet.
    4. Die PCR-Platte die Primer aus Schritt 3.1.3, die isolierte mRNA aus Schritt 3.1.2 und eine kommerzielle Mastermix hinzufügen. Führen Sie die qRT-PCR bei geeigneten Temperaturen und Zeiten nach der Enzyme verwendet. Die Ergebnisse zum Zebrafisch α-Actin zu normalisieren.
      Hinweis: Hierfür wird der Ausdruck Niveaus für jedes der Gene, Liganden und Rezeptoren berechnet.

4. in-vitro- Experimente der menschlichen Aortenklappe Endothelial Zelle (HAEC)

  1. Dynamische Schubspannung Modell
    1. HAEC Zellkulturen mit HAEC Nährmedien. Einmal voll konfluierende, setzen Sie die Zellen Laminar-Flow und pulsierender Durchfluss von 23 x 10-5 N mit einer Rate von 1 Hz für 24 h.
      1. Wärmen Sie sich EG Medien/DMEM 10 % FBS in einem Wasser Bad für 20 Minuten.
      2. Rufen Sie HAEC Zellen aus flüssigem Stickstoff-Tank ab und setzen Sie das Fläschchen in das Wasserbad bis Sie geschmolzen.
      3. Mit einer 1.000 μl Pipette, die aufgetauten Zellen zu entfernen und steckte sie in eine 15 mL-Tube mit 3 bis 5 mL der Medien. Zentrifugieren Sie die Zelle-Lösung bei 53 X g für 3 min.
      4. Aspirieren Sie die Lösung aus, und fügen Sie genügend Medien für ein Gesamtvolumen von 10 mL. Ergänzen die Zelle Projektmappe um einem sterilen T75 Kolben, den Kolben Mütze und die Zellen gleichmäßig auf der Unterseite der Platte verteilen.
      5. Markieren Sie den Kolben mit Initialen, Datum, Zelltyp und durchgangsnummer. Inkubieren Sie die Flasche bei 37 ° C, 5 % CO2, bis 80 % Zusammenfluss Zellen. Vergessen Sie nicht, die Medien alle 2-3 Tage gewechselt.
      6. Verwenden eine kommerzielle Pumpe, befestigen Sie den Schlauch in den Kolben, und legen Sie die Parameter, die oben genannten Schritt 4.1.131,32,33.
    2. 50 mL HAEC Medium auf eine Endkonzentration von 5 μM für 30 min GI254023X hinzufügen.
    3. Mit dem vorgemischten GI254023X Inhibitor ADAM10, der Kerbe Signaltechnik, unterdrückt führen die gleichen Laminar-Flow oder pulsierender Fluss Experimente wie in 4.1.1.
    4. Quantifizierung von Notch-Liganden (Jag1, Jag2, und Dll4) und Notch Zielgene (behaarte und Enhancer von Split [Hes]) mit qRT-PCR für vier Gruppen von HAEC Proben (laminare Strömung, laminare Strömung + GI254023X, pulsierender Durchfluss pulsierender Fluss + GI254023X) beschriebenen32.

5. Rettungs- und Überexpression von Notch-Signalisierung

  1. Spritzen 1 nL der vorbereiteten Nrg1 mRNA in einer Konzentration von 5 Pg/nL (aus Schritt 1.1.6) im 1-4-Zell-Stadium mit gata1a MO um Kerbe Ziel Gene24overexpress.
  2. Spritzen 1 nL Nrg1 mRNA in Wea -Mutante in einer ähnlichen Art und Weise24.
  3. Verdoppeln die Konzentration von Nrg1 mRNA (10 Pg/nL) und Spritzen24 1 nL in Zebrafisch, die Linksventrikuläre Morphologie zu beobachten.
  4. Spritzen 1 nL 20 Pg/NB von EPA mRNA6 in der Zebrafisch-Embryonen im 1-4-Zell-Stadium Hämatopoese ventrikuläre WSS wie zuvor gezeigt24erhöhen zu erweitern.
  5. Spritzen 1 nL 50 μM Isoproterenol7, wodurch die Rate der Kontraktilität, dem E3-Medium für 24 h beim Zebrafisch erhöht werden wie bisher gezeigte24kultiviert.
  6. Durchführen Sie 4-D LSFM Bildgebung für jede Gruppe. Folgen Sie den Anweisungen in den Schritten 2.1.1-2.1.5.2.8.

(6) Quantifizierung der gebrochene Verkürzung und Lautstärke ändern im Laufe der Zeit

  1. 4-D LSFM Bildgebung führen Sie für jede Gruppe in 50, 75 und 100 hpf. Befolgen Sie die Anweisungen im Schritte 2.1.1-2.1.5.2.8. Unterteilen Sie jedes Bild, damit jede 600 Knoten für die Replikation der Herzwand Bewegung hat.
  2. Messen Sie die Änderung im Durchmesser des Ventrikels während der Diastole und Systole mithilfe der folgenden Formel:
    Equation 3(3)
    Laden ventrikuläre 3D-Bilder auf jeden 0,1 s mit Visualisierungs-Software und Messen Sie das Volumen.
  3. Zeichnen die Volumenänderung im Laufe der Zeit für jede Versuchsgruppe bei 75 hpf und 100 hpf.

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Representative Results

LSFM wurde in diesem Manuskript verwendet, um hochauflösende 2-D und 3-d-Bilder zu erwerben. Wie in Abbildung 1A und 1 b, leitet die Beleuchtung Linse leichte Blatt an der Probe. Wegen der Schlankheit des leichten Blatts leuchtet nur ein einziges Flugzeug. Die Erkennung Linse ist senkrecht auf die Beleuchtung Linse positioniert und konzentriert sich auf die beleuchtete Fläche (Abbildung 1 b). Das leichte Blatt von der Beleuchtung Linse scannt dann die Probe von links nach rechts (Abbildung 1). Das Scannen ermöglicht weniger Foto-Bleichen, Phototoxizität, und hat ein geringeres Signal-Rausch-Verhältnis.

LSFM applizierte rapid Scan (> 30 s) mit einer Voxel-Auflösung von 0,65 x 0,65 x 1 µm. durch ein einziges Flugzeug Beleuchtung Tg(cmlc2a:gfp) Embryonen, die gesamte kardialen Struktur34 zu visualisieren, Hintergrundgeräusche war deutlich reduzierte (Abbildung 1). Trabekuläre Grate ragte in das ventrikuläre Lumen bei 75 hpf und trabekuläre Netzwerk deutlich zeigte sich bei 100 hpf (Abb. 2A, B). Gata1a MO Mikro-Injektion reduziert Hämatopoese und Viskosität von 90 %4,35. Dieses verringerte Viskosität abgeschwächt hämodynamische Schubspannung, was eine verzögerte Einleitung und Dichte der trabekuläre Netzwerk bei 75 hpf und 100 hpf im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 2 C, D). Darüber hinaus erstklassige Liganden (Dll4, Jag1und Jag2) Rezeptor (Notch1b) und nachgeschaltete Signalisierung Komponenten (Nrg1 und ErbB2) wurden nach unten reguliert, als Reaktion auf gata1a MO Injektion (p < 0,05, n = 5) (Abbildung 2 K)2,8,36. Co-Injektion von gata1a MO mit 5 μM Nrg1 mRNA bis geregelt Notch signaling-bezogene Genexpression und geretteten trabekuläre Bildung bei 75 hpf und 100 hpf (Abbildung 2E, F, K). So gata1a MO hämodynamischen Kräfte Down-Regulierung von Notch signaling, reduziert, während Nrg1 mRNA retten bis geregelt Kerbe-Genen und neu initiierte Trabeculation.

Um weiter beweisen unsere Hypothese, dass die Änderung hämodynamischen Kräfte und damit Trabeculation über Notch signaling, wir die Wea -Mutante eingeführt entwickelt, die eine nicht-kontraktilen Atrium-37. In Ermangelung von ventrikulären zu- und hämodynamischen Kräfte während atriale Systole Wea Mutanten express kardiale mRNA geringerer Notch signaling Komponente Gene und Zielgene im Vergleich zu Kontrollen und Hafen nicht trabekulierte, klein und schwach Ventrikel (Abbildung 2, L) zur Verfügung gestellt. Jedoch regulierten bis Nrg1 mRNA Mikro-Injektion in die Wea -Mutanten der Notch Signalweg, begleitet durch die teilweise Rettung der trabekuläre Bergrücken, führt zu einer ausgeprägteren kontraktilen Ventrikel trotz einer nicht-kontraktilen Atrium ( Abbildung 2 H, L)2. In diesem Zusammenhang bestätigt der Wea -Mutanten das Verhältnis zwischen der nicht-kontraktilen Atrium und ein nicht trabekulierte Ventrikel, unterstreicht die hämodynamische Modulation des Trabeculation über die Kerbe zu signalisieren.

Tnnt2a MO wurde geliefert, um kardiale Kontraktion zu stoppen, durch Hemmung der kardiale Troponin T38,39. Die tnnt2a MO injiziert Fische waren völlig frei von Verkehr und ventrikuläre WSS wegen erheblichen Down-reguliert Kerbe signalisieren, was zu einer glatten Oberfläche und dünne Ventrikelwand im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 2I, M) . Um zu untersuchen, ob WSS auf der Endokards eine Anforderung für Trabeculation war, haben wir auch Cloche (Clo) durch Mutation entstehende Variationen für die Endokards und der endothelialen Auskleidung des Herzens nicht40,41entwickeln. Die Clo -Mutante nicht kardialen Trabekel entwickeln und zeigte kleiner dimensionierte Ventrikel und unvollständige Herz-looping (Abbildung 2J). So ist das endokardialen Futter notwendig, Sinn hämodynamische Schubspannung, Notch signaling (Abbildung 2 M)zu aktivieren. Jedoch wenn die hämodynamische Scherspannung durch Erhöhung der Blutbildung oder Behandlung von Isoproterenol Erhöhung der Kontraktilität erhöht wurde, nicht zu einer Erhöhung der Ausdruck Niveaus von Notch-Genen und die trabekuläre Netzwerk Morphologie änderte sich nicht (Abbildung 3).

Um die Beziehung zwischen Schubspannung und Notch signaling weiter zu demonstrieren, wurden HAECs für in-vitro- Tests verwendet. Ein pulsierender Strom wurde auf konfluierende Zellen simulieren die hämodynamische Scherspannung von Endothelzellen beobachtet ausgeübt. Es wird gezeigt, dass im Vergleich zu statischen Kultur, pulsierende Kultur erhöht die Expression von Genen im Zusammenhang mit der Kerbe (Abbildung 4). Des weiteren reduziert Behandlung mit dem ADAM10 Inhibitor deutlich Notch signaling (Abbildung 4).

Als nächstes wir ventrikuläre gebrochene Verkürzung und ventrikuläre Hohlraum-Änderung der Lautstärke im Laufe der Zeit für das Wildtyp- gata1a MO, AG1478, berechnet und diejenigen gerettet von Nrg1 Injektion Gruppen um 50 hpf, 75 hpf und 100 hpf (Abbildung 5A- C) . Behandlung mit ErbB Signalisierung Inhibitor, AG1478, erheblich verzögert und reduziert gebrochene Verkürzung während ventricular Diastole bei 100 hpf (Abb. 5A). Gata1a MO und AG1478 Behandlung reduziert ventrikuläre kammergröße während der Kontraktion, wie die Veränderungen in 4-D LSFM (Abb. 5E, F)bewertet. Beide Gruppen entwickelten ein erhöhtes Ende systolischen und diastolischen - Volumen im Vergleich zu dem Wildtyp. Co-Injektion von Nrg1 mRNA mit gata1a MO restauriert gebrochene Verkürzung sowohl Auswurffraktion gegenüber denen der Wildtyp.

Figure 1
Abbildung 1 : Fluoreszierendes Licht Blatt Übersicht. (A) Vertreter LSFM System wo sich die Probe in der Kreuzung der hellen Blatt von der Beleuchtung-Linse (IL) und die Erkennung Pfad der Erkennung Linse (DL befindet). (B) Zylinderlinse hinter der IL schafft das Mikrometer Größe leichte Blatt (lila) innerhalb der Probe, das eine dünne Folie aus der Probe anregt. Die Erkennung Objektiv zeichnet das emittierte Fluoreszenzsignal. (C) eine schematische Darstellung der dünnen Laser-Blatt (lila) optisch schneiden die Zebrafish Embryos, rechts nach links bewegt. Diese Zahl wurde von Lee Et al.17geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Ventrikuläre Morphologien von genmanipulierten TG(cmlc:GFP) Zebrafisch mit Kerbe Ligand und Rezeptor Ziel Genexpression. (A) die trabekuläre Netzwerk zeigt sich bei 75 hpf Kontrolle Zebrafisch. (B) die trabekuläre Netzwerk bei 100 hpf Kontrolle Zebrafisch. (C) Injektion von gata1a MO im 1 - 4-Zell-Stadium zeigte wenig bis keine Trabeculation bei 75 hpf. (D) Injektion von gata1a MO in Zebrafisch hatte trabekuläre Netzwerkbildung verzögert. (E) Co-Injektion von gata1a MO und menschlichen Nrg1 mRNA teilweise restauriert Trabeculation bei 75 hpf. (F) Co-Injektion von gata1a MO und menschlichen Nrg1 mRNA fast komplett restauriert die trabekuläre Netzwerk bei 100 hpf. (G) Wea Mutante bei 100 zeigt hpf, keine Trabeculation und eine glatte Ventrikelwand. (H) Injektion von menschlichen Nrg1 in Wea mutierten Zebrafisch teilweise restauriert Trabeculation bei 100 hpf. (I) Injektion von tnnt2a MO zeigte keine Trabeculation bei 75 hpf (nicht dargestellt) und 100 hpf. (J) CLO -Mutant zeigte keine Trabeculation bei 100 hpf. (K) Injektion von gata1a MO deutlich reduziert mRNA Expression von Notch1, Nrg1, und Jag2 (t-Test, * P < 0,05, n = 5 vs. Kontrolle). Co-Injektion von gata1a MO und menschlichen Nrg1 mRNA deutlich erhöht den Ausdruck von Notch1b, Nrg1, ErbB, und Jag1 im Vergleich zur Kontrolle. (L) die Wea -Mutante hatte die deutlich niedrigeren Ausdruck von Notch-Genen (t-Test, * P < 0,05, n = 5 vs. Kontrolle). Injektion von menschlichen Nrg1 erhöht die Expression von Genen im Zusammenhang mit der Kerbe; Jag1 und Jag2 waren deutlich höher als Kontrolle. (M) tnnt2a MO-Injektion und Clo -Mutant zeigten einen deutlich geringeren Ausdruck von Notch-Genen (t-Test, * P < 0,05, n = 5 vs. Kontrolle). Skalieren Sie Bars: 50 μm. Daten sind als Mittelwert Standardabweichung dargestellt. Diese Zahl wurde von Lee Et al.17geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Erhöhung der WSS in manipuliert TG(cmlc:GFP) Zebrafisch mit Notch-Liganden, Rezeptor und Target Genexpression in vivo . Erhöhung der WSS über Überexpression der Hämatopoese mit der Injektion von EPA(A) oder Zugabe von ISO (B) über die Erhöhung der Herzfrequenz nicht zu einer Erhöhung Trabeculation und hatte eine trabekuläre Netzwerk ähnlich dem des Steuerelements. (C) die Injektion von EPA mRNA oder Isoproterenol änderte nicht die Expression von Notch Liganden, Rezeptor oder Ziel-Genen (t-Test, * P < 0,05, n = 5 vs. Kontrolle). Diese Zahl wurde von Lee Et al.17geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Endothelzellen unterliegen oszillierende oder pulsierender Schubspannung in-vitro- . HAECs unterliegen die pulsatile Scherspannung von τdurchschnittliche = 30 x 10-5 n/s bei 1 Hz hatte hochreguliert Kerbe-bezogene gen Ausdrücke und herunterreguliert Kerbe-bezogene gen Ausdrücke als ADAM10 Inhibitor angewendet wurde (t-Test, * P < 0,05, n = 5 vs. Kontrolle). Diese Zahl wurde von Lee Et al.17geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Wirkung von Trabeculation der gebrochene Verkürzung und Auswurf Bruchteil. (A-C) Zusatz von AG1478 und gata1a MO signifikant verringert die gebrochene Verkürzung bei 100 hpf, aber Co-Injektion von menschlichen Nrg1 und gata1a MO verbessert es. (D) gata1a Einspritzung und AG1478 deutlich verringert die gebrochene Verkürzung bei 100 hpf (t-Test, * P < 0,05, n = 5 vs. Kontrolle). Co-Injektion von gata1a und Nrg1 mRNA verbessert die gebrochene Verkürzung. (E-F) Integration des 4D Synchronisation-Algorithmus mit LSFM zeigte, dass AG1478 und gata1a MO Ende systolischen und diastolischen Volumina auf 75 erhöht hatte hpf (E) und 100 hpf (F). Daten sind als Mittelwert Standardabweichung dargestellt. Diese Zahl wurde von Lee Et al.17geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Zebrafisch Jag1 Nach vorne CCGCGTATGTTTGAAGGAGTATCAGTCG
Rückwärts CAGCACGATCCGGGTTTTGTCG
Zebrafish Jag2 Nach vorne AGCCCTAGCAAAACGAGCGACG
Rückwärts GCGTGAATGTGCCGTTCGATCAA
Zebrafish Dll4 Nach vorne CAAAGTGGGAAGCAGACAGAGCTAAGG
Rückwärts CGGTCATCCCTGGGTGTGCATT
Zebrafish BMP10 Nach vorne GCATCAAGGGGCCACTCGTGTAGA
Rückwärts TCGTCTCACTCCACTAGGTCCCATACTG
Zebrafisch ErBb2 Nach vorne GATCAGGACTGCCAAACATTGACGTCT
Rückwärts AGCAGCACACTGAACATGGCAGCA
Zebrafisch Nrg-1 Nach vorne GTGTGTTTGTCCCTGTGGACGCGT
Rückwärts CCTCCTGGAGCTTCCCCTCAAACA
Zebrafish Notch1b Nach vorne CAGAGAGTGGAGGCACAGTGCAATCC
Rückwärts GCCGTCCCATTCACACTCTGCATT

Tabelle 3: Primer für Zebrafisch-Screening verwendet.

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Discussion

In diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass 4-D-Bildgebung verwendet werden kann, um die Entwicklung der trabekuläre Netzwerk als Reaktion auf Veränderungen der biomechanischen Kräfte zu verfolgen. Insbesondere initiiert die Scherspannung erfahrenen von Endothelzellen die Kerbe Signalkaskade, die wiederum Trabeculation fördert. In dieser Handschrift haben wir gezeigt, dass (1) gata1a MO-Injektion verminderte Blutbildung und daher es reduziert Wand Schubspannung, (2) tnnt2a MO-Injektion gehemmt ventrikuläre KONTRAKTILE Funktion zur Verringerung der Wand Schubspannung und (3) wea Mutanten fehlte atrial Kontraktion, die dann die hämodynamische Krafteinwirkung auf die Herzkammer verringert. Durch die Reduzierung der Schubspannung auf die kardiale Wände, wir quantifiziert die Kerbe Signalisierung über qRT-PCR und festgestellt, dass mit reduzierten WSS gab Notch signaling reduziert. Um unsere Hypothese zu beweisen, Clo -Mutanten, die Endokards fehlte bildeten keine Trabekel und unterwerfen Endothelzellen pulsatile Schubspannung mit ADAM10 präsent zeigte die Scherspannung Kerbe Signalisierung aktiviert.

Die anderen bildgebenden Verfahren wie der konfokalen Mikroskopie können zu Bildbeispiele in 3-d-14verwendet werden. Diese Technik und andere haben jedoch viele Nachteile. Zum Beispiel die konfokale Bildgebung kann nicht dringen tief in Proben, hat die niedrige axiale Auflösung und langsamen Scan Geschwindigkeit19,42. Aufgrund der Durchdringung Tiefenbegrenzung in der konfokalen Bildgebung können kleine Proben, wie Zebrafisch-Embryonen nur in seiner Gesamtheit dargestellt werden. Zwei-Photonen-konfokalen Mikroskopie verbessert die Eindringtiefe, aber die Auflösung, langsame Scan-Geschwindigkeit und hohen Kosten machen diese Technik unerwünschte13. Es wurden Studien, die zwei-Photonen-Mikroskopie und LSFM erfolgreich kombinieren18, Nachteile sind jedoch noch prominenter42.

LSFM, auf der anderen Seite hat die wenigsten Foto Bleichen und Schaden13,18,42, schnelle Geschwindigkeit und ähnliche Eindringen Tiefe13. Darüber hinaus ist aufgrund der dual-Objektive und Anregung von einer Ebene (Abbildung 1), die Hintergrundgeräusche deutlich reduzierten43. Die Proben müssen jedoch in Gelen, die Probe zu immobilisieren, wodurch es schwierig anzuwenden zur in-Vivo -Modelle als Zebrafisch14,17,19eingebettet werden. Einsatz von fluoreszierendem Licht begrenzt auch, das Tiefe eindringen um wenige Millimeter. Obwohl LSFM eine großartige Methode für Visualisierung ist, ist es wichtig, dass sie mit quantitativen Daten ergänzt wird. Da LSFM nur qualitative ist, kann es verschiedene Interpretationen unterliegen. Mittels qRT-PCR, konnten wir bestätigen, dass die LFSM 4-D-Bilder eine korrekte Darstellung der Ereignisse in den live Proben waren. Gelegentlich können in größere Muster, Streifen und Schatten in den Bildern bilden. Jedoch kann beidseitige Beleuchtung oder mSPIM genutzt werden, um diese Artefakte42zu reduzieren. Da LSFM so vielseitig ist, ist seine Fähigkeit für den Fang von hoher Auflösung und insgesamt bessere Bildqualität die Zukunft der LSFM verspricht. Bereits erwähnt, kann mit anderen bildgebenden Systemen für erfolgreiche Bildbearbeitung18,42LSFM kombiniert werden.

Beweisen wir vorher, dass ein pulsierender Schubspannung von 23 x 10-5 N bei 1 Hz für 24 h wesentlich reguliert Signalisierung in Vitro(Abbildung 4)17 Notch. Wir zeigen weiter, dass Scherkräfte aktivieren Kerbe Signalisierung durch genetische Manipulation der Hämatopoese (gata1a MO)4, kardiale Kontraktion (tnnt1a MO)5, atrial Kontraktion (Wea -Mutante), endokardialen Löschung (Clo -Mutante) und Lokalisierung von Notch signaling (Tg [Flk:mCherry; Tp1:gfp]). Wir beschreiben hier, durch eine Senkung der Wand Schubspannung in der Herzkammer, dass Notch-Genen nach unten geregelt (Abbildung 2 K, L, M)waren. Darüber hinaus konnten wir nachweisen, dass Nrg1 mRNA in der Lage war, Trabeculation zu retten, wiederherstellen, Kerbe Signalisierung und ventrikuläre gebrochene Verkürzung und Auswurffraktion verbessern (Abb. 2E, F, H, K-M, Abbildung 5) . Die Wiederherstellung der Herzfunktion zeigte sich durch die Zunahme der kontraktilen Funktion-vermittelten hämodynamischen Kräfte, die Kerbe Signalisierung (Abbildung 2 K- M)aktiviert.

Wir bestimmt auch, dass die Schubspannung aktiviert Notch signaling endokardialen abhängig ist. Gata1a MO, tnnt2a MO, Wea Mutant oder AG1478 Behandlung mit Trabeculation war gehemmt und Signalisierung Kerbe wurde nach unten geregelt (Abbildung 2-K- M). Jedoch Nrg1 gerettet, Trabeculation und Notch signaling in Wea Mutanten und wann Co injiziert mit gata1a MO (Abb. 2D, H, K, L). Als Wand Schubspannung (EPA -Injektion) oder Notch signaling (10 Pg/nL Nrg1 Injektion) erhöht wurde, gab es keine Änderung in der Gruppe " EPO " in Bezug auf die Morphologie, aber abnorme Linksventrikuläre Morphogenese war in der Nrg1 vorhanden erhöhte Dosis (Abbildung 3).

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass der mechanotransduktion Schubspannung der Notch-Signalweg aktiviert. Mittels 4-D LSFM und gentechnisch Zebrafisch, entwickelten wir ein neues Modellsystem, das zeigt, wie wichtig Blutfluss ist während der kardialen Entwicklung seiner Morphologie, Kontraktilität und Gesamtfunktion.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren möchten mit William Talbot von der Stanford University für die Bereitstellung des menschliches Dankbarkeit Nrg1 cDNA und Deborah Yelon von UCSD für die Bereitstellung der WEA Mutanten. Die Autoren möchten auch Cynthia Chen Danke für die Hilfe bei der Bildaufnahme. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse NIH HL118650 (zu t. k. Hsiai), HL083015 (zu t. k. Hsiai), HD069305 (zu N.C. Chi und t. k. Hsiai.), HL111437 (zu t. k. Hsiai und NC-Chi), HL129727 (zu t. k. Hsiai), T32HL007895 (zu R.R Sevåg Packard), HL-134613 (zu V. Messerschmidt) und Universität von Texas System STARS Finanzierung (J. Lee).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clontech Hifi PCR pre-mix  Takara  639298 PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N/A Used for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855201 PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+ GE Health Plasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit   Clontech 740609.25 DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase  Clontech 2011A PCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cells Clontech 636763 E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent Life Technologies 11668027 Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kit Invitrogen AM1340 Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820 Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8 GeneTools N/A Software for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA Creative Biogene CDFH006026 Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478 Sigma-Aldrich  T4182 ErbB inhibitor
1.3.1
E3 medium To grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT Sigma-Aldrich  D5942 γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose  Sigma-Aldrich  A9539 Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software FEI Software N/A Visualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  Sigma-Aldrich  886-86-2 Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge Eppendorf 05-400-005 Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023X Sigma-Aldrich  260264-93-5 ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich  I5627 Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLAB Mathworks N/A Cardiac mechanics analysis

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Bioengineering Ausgabe 138 selektive Flugzeug Beleuchtung Mikroskopie Notch signaling Trabeculation Hämodynamik Zebrafisch kardiale Entwicklung Schubspannung 4-dimensionalen Herz-Bildgebung Mechanobiology Herz leichte Blech-Fluoreszenz-Mikroskopie

Erratum

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 09/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, 4-dimensionale Bilder über die Auswirkungen der modulierende Schubspannung auf entwickelnden Zebrafisches Herzen erfassen
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Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, … More

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, K. I., Ding, Y., Hsu, J. J., Bryant, R., Li, R., Hsiai, T. K., Lee, J. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (138), e57763, doi:10.3791/57763 (2018).

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