Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Lys-ark Fluorescens mikroskopi til fange 4-dimensionelle billeder af virkningerne af modulerende Shear Stress på udvikle zebrafisk hjertet

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57763
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at visualisere udvikle hjerter i zebrafisk i 4 dimensioner (4-D). 4-D imaging, via lys-ark Fluorescens mikroskopi (LSFM), tager 3-Dimensional (3-D) billeder over tid, at rekonstruere udvikle hjerter. Vi vise kvalitativt og kvantitativt at shear stress aktiveres endokardial Notch signalering under kammer udvikling, der fremmer hjerte trabeculation.

Abstract

De hæmodynamiske kræfter opleves af hjertet indflydelse hjerte udvikling, især trabeculation, som udgør et netværk af forgrenede udvækster fra myokardiet. Genetisk program defekter i hak signalering cascade er involveret i ventrikulær defekter som venstre ventrikel ikke-komprimering kardiomyopati eller hypoplastiske venstre hjerte syndrom. Ved hjælp af denne protokol, kan det bestemmes, at shear stress drevet trabeculation og hak signalering er relateret til hinanden. Ved hjælp af lys-ark Fluorescens mikroskopi, var visualisering af udvikle zebrafisk hjertet muligt. I dette manuskript, blev det vurderet, om hæmodynamiske styrker modulere indledningen af trabeculation via Notch signalering og således påvirke kontraktile funktion opstår. For kvalitativ og kvantitativ shear stress analyse, 4-D (3-D + tid) billeder blev erhvervet under zebrafisk hjerte morfogenese, og integreret lys-ark Fluorescens mikroskopi med 4-D synkronisering erobrede den ventrikulære bevægelse. Blod viskositet blev reduceret via gata1a- morpholino oligonukleotider (MO) mikro-injektion til at formindske shear stress, dermed ned-regulering Notch signalering og formildende trabeculation. Co injektion af Nrg1 mRNA med gata1a MO reddet Notch-relaterede gener for at gendanne trabeculation. For at bekræfte shear stress drevet Notch signalering påvirker trabeculation, cardiomyocyte sammentrækning arresteret yderligere via tnnt2a-MO at reducere hæmodynamiske styrker dermed ned-regulering Notch target gener til at udvikle en ikke-trabeculated myokardiet. Endelig blev bestyrkelse af udtryk mønstre af shear stress-responderende Notch gener gennemført ved at underkaste endotelceller pulsatile flow. Således afdækket 4-D lys-ark mikroskopi hæmodynamiske styrker underliggende Notch signalering og trabeculation med klinisk relevans for ikke-komprimering kardiomyopati.

Introduction

Biomekaniske kræfter, som hæmodynamiske shear stress, er dybt involveret i hjertets morfogenese. Svar på hæmodynamiske shear styrker udvikle myokardial højderygge og grooves i en bølge-lignende trabekulær netværk i tilpasningen til retning af shear stress på tværs af atrioventrikulær (AV) ventil1. Hjertets trabeculation er nødvendigt at øge kontraktile funktion og Myokardie masse2. Mutationer i hak signalering veje resultere i medfødt hjertefejl hos mennesker og andre hvirveldyr3. For eksempel, har gata1a4 og tnnt2a5 morpholino oligonukleotider (MO) vist sig at reducere erythropoiesen, mens erythropoietin mRNA (EPO)6 og Isoproterenol (ISO)7 øge røde blod celler og puls væg henholdsvis, og derfor shear stress (WSS). Derudover ErbB2 signalering nedstrøms af Notch, fremmer cardiomyocyte spredning og differentiering til at generere kontraktile kraft, som igen aktiverer Notch signalering8,9. Det foreslås, at shear stress styrer Notch signalering drevet trabeculation for ventrikulær udvikling. I øjeblikket, der er mange undersøgelser, der forsøger at yderligere at forstå de genetisk programmering begivenheder, der førte til medfødte hjerte-defekter (CHD)10,11,12, men meget lidt er at undersøge hvordan mekaniske kræfter indflydelse danner hjertet.

Handler på endokardiet, tæt observation under den udviklingsmæssige periode skal gennemføres for at undersøge de mekaniske kræfter. Men det er udfordrende at få god kvalitetsbilleder af i vivo slå prøver på grund af inherence af traditionelle mikroskopi13. For at observere udviklingen over tid i en stikprøve, skal fysiske skæring og farvning, derfor ske13,14,15. Selvom Konfokal mikroskopi er almindeligt anvendt til at afbilde den 3D-struktur af prøver14,16, er disse imaging systems' erhvervelse stadig begrænset af langsom scanning hastigheder.

Lys-ark Fluorescens mikroskopi (LSFM) er en unik billedbehandling teknik, der giver mulighed for visualisering af in vivo dynamiske begivenheder med lange arbejde afstand13. Denne teknik bruger en lys-ark fluorescerende mikroskopi til optisk sektion en prøve17. På grund af belysningen af kun en tynd plade af lys på prøve er der en reduktion i foto-blegning og foto toksicitet13,18. Feltet store og lange arbejde afstand giver mulighed for store prøver at holde intakt, som de er afbildet13,14,17. Lav forstørrelse giver mulighed for et større område til afbildning, mens langt arbejde afstand giver tykkere prøver at blive afbildet uden at kompromittere signal til støjforhold. Mange grupper har brugt LSFM til billedet hele embryoner17, brains14,18, muskler og hjerter19 blandt andre væv, viser de forskellige typer af prøver, der kan være afbildet.

Selvom tidligere forskning vist reduceret hæmodynamiske shear kraft af tilstoppe indstrømning eller udstrømning sporene af zebrafisk hjerte, er oplysninger udelukkende kvalitative. Det resulterer i en unormal tredje afdeling, formindsket hjerte springer og nedsat ventil dannelse20. 4-D LSFM billeder giver et nyt perspektiv i den måde de hæmodynamiske shear kræfter påvirker udviklingen af hjertets væv. Disse mekaniske kræfter kan aktivere kraft-følsom signaling molekyler og fremkalde dannelse af trabekulær kamme. På grund af ekstra tid aspekt af 4-D imaging er man i stand til at spore ændringer i udvikling i realtid, hvilket kunne føre til nye afsløringer, der havde gået ubemærket tidligere. For zebrafisk er en ideel model for imaging fordi videnskabsfolk kan observere en hele hvirveldyr dyret versus kun celle-celle interaktioner. Ilt kan også diffuse gennem hele fosteret, som giver mulighed for udvikling sted uden afhængigt af det vaskulære system, i modsætning til i pattedyr udvikling. Selvom zebrafisk hjertet mangler pulmonal organer, som kræver en fire-chambered hjerte, er der et stort antal hjerte gener, der er bevaret mellem zebrafisk og mennesker21.

I dette manuskript beskrive vi hvordan du bruger light-ark Fluorescens mikroskopi til billede udvikle bjælkerne i zebrafisk hjerter under forskellige omstændigheder. For det første injektion af gata1a4 eller tnnt2a5 MOs blev brugt til at lavere blod viskositet og dermed WSS. Morfologi af hjertet blev indspillet. I en særskilt gruppe af fisk, vi øget WSS ved at administrere EPO mRNA6 eller isoproterenol7 og observerede resultaterne. Vi har også foretaget en celle undersøgelse med forskellige pulsatile eller oscillerende strømningshastigheder. Efter imaging hver gruppe, har vi fundet at WSS sanses af endokardiet via Notch signalering indleder trabeculation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Følgende metoder blev udført i overensstemmelse med UTA og UCLA IACUC protokoller. Disse eksperimentelle grupper blev brugt med transgene Tg(cmlc2:gfp), wea (svage atrium) eller clo (cloche) mutanter: a wild-type (WT) kontrol, (b) gata1a MO og (c) tnnt2a MO injektioner (tabel 1).

Model Navn Modificerede gener Fænotype Reference
Kontrol Vildtype Ingen NIELSEN
TG(cmlc2:gfp) Hjerte myosin lys kæde Grøn flourescence specifikt udtrykt i myokardiet 34
Nedsat væg Shear Stress Svage atrium (wea) mutant Atrium-specifikke myosin heacy kæde Atrium ikke kontrakt, kompakt ventrikel, myokardial tykvæggede, smalle lumen, dialated atrium, 37
Cloche (clo) mutant NIELSEN Fuldstændig fjernelse af endokardiet, unaturally store atrium med små ventrikel, ikke-eksisterende hjerte puder 41
gata1a MO gata1a  Anæmi mangel på røde blodlegemer 4
tnnt2a MO tnnt2a 39
Øget væg Shear Stress EPO -mRNA Ingen Svær polycythemia, stigning i antallet af cirkulerende blod celler, øgede viskositet 6
Isoprotenerol Ingen Øget hjertets sats 7

Tabel 1: Zebrafisk beskrivelser. Definitioner og beskrivelser af zebrafisk forsøgsdyr.

1. undersøgelsen Setup

  1. Forberede Nrg1 og EPO mRNA for trabeculation redning.
    1. Få Human Nrg1 cDNA og forstærke fra en donor plasmid.
      Bemærk: Den menneskelige Nrg1 cDNA var begavet fra William Talbot fra Stanford University.
      1. Tage ud nødvendige reagenser og materialer, nemlig PCR-mastermix (gemt i-20 ° C), primere (Se tabel 2) (gemt i-20 ° C), en PCR plade (opbevares ved stuetemperatur) og 20 μL pipette (opbevares ved stuetemperatur). Se tabel over materialer for eksempel produkter.
        Table 2
        Tabel 2: Primere for Nrg1 kloning.
      2. Forberede mastermix for hver primer i tredobbelt ved hjælp af 20 μL pipette. 1 sæt af tre, bruge 37,5 μl af mastermix, 3 μl DNA-gratis vand, 4,5 μL af primer. For yderligere tre, blot ganges med antallet af prøver.
      3. Fortyndes brugsopløsning menneskelige Nrg1 cDNA (20 ng/μg koncentration) i primer-striben med DNA-gratis vand, således at der er 10 μL samlede pr. brønd pr. prøve.
        Bemærk: Sikre, at hver løsning under trin 1.1.1 er jævnt fordelt. Gøre dette ved at blande hver løsning af pipettering op og ned. For at undgå krydskontaminering, skal du bruge en pipette tip til kun én prøve.
      4. Alikvot Nrg1 cDNA med 10 μL multi-kanal pipette ønskede brønde i PCR-plade.
      5. Tilføje 14,5 μl af mastermix til cDNA i brøndene. Anvende en klæbrig cover til PCR-plade til at forsegle brøndene, og placere i PCR-maskine.
      6. Start PCR-maskine og sikre at cyklussen når passende temperaturer enzymer og primere anvendes.
    2. Klon Nrg1 cDNA ind i plasmid pCS2+ i BamHI og EcoRI steder ved hjælp af overskydende enzymer BamHI og EcoRI for at sikre cDNA er forbundet i alle plasmider.
      1. Bland Nrg1 cDNA med donor plasmidet pCS2+, kommercielt tilgængelige master mix løsning og primere (tabel 2).
        Bemærk: Den samlede reaktion volumen skal være 50 μL med 25 μL af master mix, 3 μL af primere og 1 μL af 20 ng/μl donor plasmid med Nrg1 cDNA.
      2. Placere mix fra trin 1.1.2.1 i PCR-maskine og angive parametrene, der opfylder følgende specifikationer: 98 ° C til 10 s, 55 ° C til 5 eller 15 s og 72 ° C i 5 s/kb.
      3. Rense PCR produkt ved hjælp af en rensning kit efter fabrikantens anvisninger. Elueres produktet i 50 μL eluering buffer.
      4. Fordøje renset PCR produktet og 5 μg af pCS2+ med BamHI og EcoRI separat ved 37 ° C i 2 timer i en 200 μl reaktion volumen. Rense den resulterende fordøjelse med en kommerciel kit og elueres i 20 μL og 100 μL af Tris-HCl (pH 8,5), henholdsvis.
      5. Ligate 4 μL Nrg1 cDNA og 2 μl af den nedbrudte pCS2+ plasmid i en 25 μL reaktion med 1 μL af ligase katalysator på 16 ° C natten over.
        Bemærk: Proceduren kan blive stoppet her i natten inkubation.
      6. Bruge 2 μl af ligatur løsning fra trin 1.1.2.5 og omdanne til 50 μL af E. coli bakterieceller egnet til kloning (Se Tabel af materialer).
    3. Bekræfte, at omdannelsen fandt sted ved screening Nrg1 cDNA kloner ved hjælp af PCR. Vælg kloner tilfældigt og tilføje til en løsning af specifikke primere, polymerase og deoxyribonucleotide triphosphates (dNTP'er).
      Bemærk: Kontrollen var vektoren (pCS2+) med og uden indsætte (menneskelige cDNA). Ikke vælge for stor af en koloni, fordi overdreven bakterier kan hæmme PCR.
      1. Vælge 8 kolonier fra transformation og skærm pCS2+-Nrg1-kloner ved hjælp af PCR-primere fra tabel 2.
      2. Kultur en klon med Nrg1 cDNA at isolere pCS2+-Nrg1 plasmid DNA. Podes med 100 μL af E. coli bakterier med pCS2+-Nrg1 plasmid i 100 mL LB medier og kultur ved omrystning (160-225 RPM) ved 37 ° C.
    4. Transfect renset pCS2+-Nrg1 plasmid i HEK-293 celler i en 6-godt plade ved hjælp af en kommerciel Transfektion reagens efter fabrikantens anvisninger.
    5. 24 timer efter Transfektion, lyse celler ved hjælp af en lysisbuffer og køre gennem en SDS-PAGE gel, overførsel til en gel membran og derefter pletten med anti-Nrg1 antistof22. Kontroller Nrg1 protein udtryk ved hjælp af en Western Blot.
      Bemærk: Kontrollen er en tom pCS2+ plasmid. Kan være midlertidigt her hvis gel membran overførsel sker natten over.
    6. Syntetisere Nrg1 mRNA ved hjælp af et kommercielt produkt lig den i Tabel af materialer og Følg fabrikantens anvisninger.
      1. Tage 5 μl af pCS2+-Nrg1 DNA fra bakterier isoleret kultur og fordøje med NotI i en 200 μl reaktion i 2 timer ved 37 ° C til linearize plasmidet.
      2. Rense den lineariseret plasmid med en kommerciel kit og elueres i 20 μL af Tris-HCl (pH 8,5).
      3. Adfærd i vitro transskription med en kommerciel RNA isolering kit i en 20 μL reaktion ved hjælp af 5 μl af den lineariseret plasmid efter fabrikantens anvisninger.
      4. Tilføj in vitro- transskriberet Nrg1 til 350 μl af RNA lysisbuffer og derefter rense med en RNA isolering kit. Elueres RNA i 60 μl af Tris-HCl (pH 8,5).
      5. Måle RNA-koncentrationen og opbevares ved-80 ° C til fremtidig brug.
    7. Følg trin 1.1.6.1 - 1.1.6.5 over for EPO cDNA og mRNA forberedelse men klon cDNA ind i pCS2 + plasmidet på EcoRI og XhoI sites i stedet.
  2. Tilføre zebrafisk Morpholino
    1. Design23 MO injektioner ved hjælp af et onlineværktøj (Table of Materials) mod ATG sekvensen af gata1a4 (5 '-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3′) og tnnt2a5 (5 '-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3′).
    2. Tilsæt gata1a og tnnt2a MO separat til nukleasen-gratis vand til at foretage de endelige koncentrationer af 8 ng/nL og 4 ng/nL, henholdsvis. Gentag med EPO mRNA med en endelig koncentration på 20 pg/nL. Sikre, at det endelige rumfang 1 mL.
    3. Injicér 1 nL af de 8 ng/nL af gata1a MO og 1 nL af de 4 ng/nL af tnnt2a MO i separate zebrafisk embryoner på 1 til 4-celle stadium at reducere ventrikel væg shear stress (WSS)24. For at øge WSS, indsprøjte 1 nL af 20 pg/nL EPO mRNA6 i zebrafisk embryoner på 1 - til 4-celle stadium.
  3. Kemisk behandling af zebrafisk for at hæmme trabeculation
    1. Ved hjælp af en 20 mL pipette, fortyndet 10 mg/mL AG1478 i 1% DMSO i E3 medium til en endelig koncentration på 5 μM på 30 hpf ind i en 15 mL rør. Som kontrol, behandle hver fisk med 1% DMSO kun.
    2. Tilføj N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine Thomsen-butyl ester (DAPT) i 1% DMSO (100 μM) til E3 medium i en 15 mL tube til at hæmme Notch signalering på 40 hpf i en lignende måde. Som kontrol, behandling med kun 1% DMSO.

2. billedbehandling teknikker

  1. 4-D hjerte LSFM Imaging med synkronisering algoritme
    1. Tage 2D-billeder af hele fisk embryo over flere hjerte slå cyklusser ved hjælp af trinene nedenfor (figur 1). Sikre, at lys-arks tykkelse ca 5 μm. Tage 500 x-y rammer med en eksponeringstid for 10 ms. sæt z-scanning til 1 μm lossless digital stikprøver ifølge Nyquist prøveudtagning princippet25.
      1. Oprette en 1% (w/v) agarosegel ved at tilføje 1 g af Agarosen til 100 mL og varme den, indtil alle Agarosen er opløst. Indlæse en lille plastikrør med Foster og Agarosen ved hjælp af 20 μL pipette og sikkert det på scenen.
      2. Åbn billedvisning software og klik på Live for at se de levende opfattelse af prøven. Justere mål ved hjælp af knop, således at prøven er i fokus. På samme måde flytte scenen, så de levende opfattelse af prøven viser toppen af embryoet.
      3. Tage billeder 500 gange for 5 s ved 10 X forstørrelse ved hjælp af mikroskops software26.
      4. Flytte scene ved hjælp af motor til et nyt lag (1 μm i z-aksen) og Gentag proceduren billeddannelse.
      5. Genganger ovenfor 2 foranstaltninger, indtil hele hjerte er fuldt afbildet.
    2. Sikre dataintegritet ved at se bort fra den første og sidste hjertets cyklus billeder. Find perioden af hjertets cyklus af matchende billeder, der blev truffet på det samme tidspunkt i hjertets cyklus, men i forskellige perioder. Bruge følgende ligning, der blev udviklet for at finde perioden:
      Equation 1(1)
      hvor D er funktionen omkostninger bruges til montering af en periode hypotese, jegm billedet, τ' det tidspunkt, billedet blev taget til fange, zk i z-retning indeks af billedet, xm er den Vektor af pixel-indekset, og T' er den periodiske hypotese.
    3. Bruge følgende ligning til at finde den relative Skift mellem to billeder i lignende stadier:
      Equation 2(2)
      hvor Qk', k betegner en omkostninger funktion for den relative forskydning, R er den mulige rumlige kvarter, L er den samlede tid af fanger billedet, x er pixel indeks, zk og zk» er de første og anden z-retning skiver, t er tid og s er relative Skift hypotesen.
    4. Konvertere den relative Skift til absolut Skift med hensyn til det første billede og løse den lineære ligning ved hjælp af metoden pseudo inverse for at finde absolutte relationen til at justere den næste del af billeder som tidligere beskrevet27.
    5. De endelige 4-D billeder blev behandlet ved hjælp af billedbehandlingsprogram (Tabel af materialer).
      1. Stabling 2D-billeder i 3D
        1. Åbne en kommerciel billedbehandling software.
        2. Klik på Open Data.
        3. Vælg alle billeder at blive stablet i 3-D > Klik belastning.
        4. Tilføje voxel størrelse 0,65 x 0,65 x 1 > Klik OK.
        5. Klik på boksen Multi-Planar View for at visualisere 3D-billedet.
        6. Højreklik på feltet blå slice_1.tiff > Vælg skærm > Vælg Volren.
        7. Klik på Rediger > Vælg Indstillinger > Vælg Rediger Colormap.
        8. Justere farven ved hjælp af boksene skitseret i rød > Klik på OK.
      2. Konvertere 3D-4-D
        1. Klik på "File > Åbn tid seriedata.
        2. Vælg 3D-TIFF, der blev kun foretaget > Klik belastning.
        3. Angiv den samme voxel størrelse som før.
        4. Højreklik på feltet blå slice_1.tiff > Vælg "Display" > Vælg Volren.
        5. Klik på Rediger > Vælg Indstillinger > Vælg Rediger Colormap. Justere farven ved hjælp af boksene > Klik OK.
        6. Højreklik på Gang serie kontrol > Klik på Movie maker > Tryk på knappen Afspil for at se filmen.
        7. Tilføje et filnavn, rammestørrelse, framerate, kvalitet lig 1, Skriv Monoscopic > Klik Anvend
        8. Eksportere videoen. Åbne videoen i et passende software.

3. qRT-PCR analyse

  1. Zebrafisk hjerte RNA isolering for at kvantificere Notch ligander, receptorer, og målrette gener udtryk
    1. Ofre for zebrafisk ved at underkaste dem en overdosis af tricaine methylate28,29. Ved hjælp af en tidligere beskrevne protokol30blev zebrafisk hjerter skåret ud og forberedt til RNA isolering.
    2. Isolere den samlede RNA, og syntetisere cDNA ved hjælp af cDNA syntese kit efter fabrikantens anvisninger.
    3. Designe PCR-primere for Notch ligander Jag1, Jag2, Dll4, Notch1b-receptoren og signalering relaterede gener Nrg1 og ErbB2. Se tabel 3 for primere vi brugte.
    4. Tilføje primere fra trin 3.1.3, på isoleret mRNA fra trin 3.1.2 og en kommerciel mastermix til PCR-plade. Køre qRT-PCR ved passende temperaturer og gange efter de enzymer, der anvendes. Normalisere resultaterne til zebrafisk α-actin.
      Bemærk: Dette vil beregne udtryk niveauer for hver af ligander, receptorer og gener.

4. in vitro menneskelige aorta endotel celle (hvis) eksperimenter

  1. Dynamisk Shear Stress Model
    1. Kultur hvis celler med hvis kultur medier. Når fuldt sammenflydende, udsætte celler til laminar flow og pulsatile flow af 23 x 10-5 N med en sats på 1 Hz i 24 timer.
      1. Varm op EF media/DMEM 10% FBS i et vand bad i 20 min.
      2. Hente hvis celler fra flydende kvælstof tank og placere hætteglasset i vandbad indtil smeltet.
      3. Ved hjælp af en 1000 μL pipette, fjerne de optøede celler og læg dem i en 15 mL tube med 3-5 mL af medier. Der centrifugeres celle løsning på 53 x g i 3 min.
      4. Opsug løsningen ud og tilføje nok medier for en samlet maengde paa 10 mL. Tilføje celle løsning til en steril T75 kolbe, cap kolben og distribuere celler jævnt på bunden af pladen.
      5. Markere kolben med initialer, dato, celletype og passage nummer. Inkuber i kolben ved 37 ° C, 5% CO2, indtil celler er 80% sammenflydende. Husk at ændre medierne hver 2-3 dage.
      6. Ved hjælp af en kommerciel pumpe, fastgør slangen til kolben, og angive de parametre, der er nævnt ovenfor i trin 4.1.131,32,33.
    2. Tilføj GI254023X til 50 mL medium, hvis der i en endelig koncentration på 5 μM i 30 min.
    3. Med den færdigblandede GI254023X, en ADAM10-hæmmer, som undertrykker Notch signalering, foretage den samme laminar flow eller pulsatile flow eksperimenter som 4.1.1.
    4. Kvantificere Notch ligander (Jag1, Jag2, og Dll4) og hak target gener (behårede og forstærker af split [Hes]) ved hjælp af qRT-PCR for fire grupper af hvis prøver (laminar flow, laminar flow + GI254023X, pulsatile flow, pulsatile strøm + GI254023X) beskrevet tidligere32.

5. redning og overdrevne udtryk for Notch signalering

  1. Injicér 1 nL af de forberedte Nrg1 mRNA i en koncentration på 5 pg/nL (fra trin 1.1.6) på 1 - til 4-celle stadium med gata1a MO for at overexpress Notch target gener24.
  2. Injicér 1 nL af Nrg1 mRNA i wea mutant i en lignende måde24.
  3. Dobbelt koncentration af Nrg1 mRNA (10 pg/nL) og indsprøjtes24 1 nL i zebrafisk at observere den ventrikulære morfologi.
  4. Injicér 1 nL af de 20 pg/nL EPO mRNA6 i zebrafisk embryoner på 1 - til 4-celle stadium at forøge bloddannelsen for at øge ventrikulær WSS som tidligere vist24.
  5. Injicér 1 nL af 50 μM Isoproterenol7, hvilket øger hastigheden af kontraktilitet, til E3 medium for 24 h mens zebrafisk er kulturperler som tidligere vist24.
  6. Udføre 4-D LSFM imaging for hver gruppe. Følg instruktionerne i trin 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. kvantificering af fraktioneret afkortning og lydstyrke ændring over tid

  1. Udføre 4-D LSFM imaging for hver gruppe på 50, 75 og 100 hpf. Følg instruktionerne i trin 2.1.1-2.1.5.2.8. Opdele hvert billede, så hver har 600 noder til replikering af hjerte væg bevægelse.
  2. Måle ændringen i diameter af ventrikel under diastolen og systole ved hjælp af følgende formel:
    Equation 3(3)
    Indlæse 3-D ventrikulær billeder på hver 0,1 s med visualisering software og måle lydstyrken.
  3. Plot lydstyrke ændring over tid for hver eksperimentelle gruppe på 75 hpf og 100 hpf.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LSFM blev brugt i dette håndskrift for at erhverve 2D- og 3D-billeder. Som det ses i figur 1A og 1B, dirigerer belysning linse arket lys på prøven. På grund af thinness i arket lys lyser kun et enkelt fly. Registrering af linsen er placeret vinkelret på belysning linse og er fokuseret på den belyste flade (figur 1B). Arket lys fra linsen, belysning scanner derefter prøve fra venstre mod højre (figur 1 c). Scanningen giver mulighed for mindre foto-blegning, foto-toksicitet, og har et lavere signal / støj-forhold.

LSFM blev anvendt til Tg(cmlc2a:gfp) embryoner til at visualisere hele hjertets struktur34 af hurtig scanning (> 30 s) med en voxel opløsning af 0,65 x 0,65 x 1 µm. på grund af et enkelt fly belysning, baggrundsstøj blev væsentligt reduceret (Figur 1). Trabekulær kamme stak i den ventrikulære lumen på 75 hpf og en trabekulær netværk klart blev vist på 100 hpf (figur 2A, B). Gata1a MO mikroinjektion reduceret bloddannelsen og viskositet af 90%4,35. Dette faldt viskositet svækket hæmodynamiske shear stress, hvilket resulterer i en forsinket indledning og tæthed af trabekulær netværk på 75 hpf og 100 hpf sammenlignet med kontrolgruppen (figur 2 C, D). Derudover hak ligander (Dll4, Jag1og Jag2) receptor (Notch1b), og downstream signaling komponenter (Nrg1 og ErbB2) var nedreguleret svar på gata1a MO injektion (p < 0,05, n = 5) (figur 2 K)2,8,36. Co injektion af gata1a MO med 5 μM af Nrg1 mRNA op-regulerede Notch signalering-relaterede gen expression og reddede trabekulær dannelse på 75 hpf og 100 hpf (figur 2E, F, K). Således gata1a MO reduceret hæmodynamiske kræfter fører til ned-regulering af Notch signalering, hvorimod Nrg1 mRNA redde op-regulerede Notch-relaterede gener og igen indledte trabeculation.

Yderligere bevis vores hypotese, at ændre hæmodynamiske styrker og dermed trabeculation via Notch signalering, vi indført wea mutant, der udvikler sig en ikke-kontraktile atrium37. I mangel af ventrikulær tilstrømning og hæmodynamiske styrker under atriale systole, wea mutanter express lavere hjerte mRNA niveauer af Notch signalering komponent gener og target gener i forhold til kontrol, og havnen ikke-trabeculated, lille og svagt kontraherende hjertekamrene (figur 2 g, L). Dog regulerede Nrg1 mRNA mikro-indsprøjtning wea mutanter op-Notch signalering pathway, ledsaget af den delvise redning af trabekulær højderygge, fører til en mere udtalt kontraktile ventrikel trods en ikke-kontraktile atrium ( Figur 2 H, L)2. I forbindelse støttes wea mutanter relationen mellem de ikke-kontraktile atrium og en ikke-trabeculated hjertekammer, understreger de hæmodynamiske graduering af trabeculation via Notch signalering.

Tnnt2a MO blev leveret for at stoppe hjerte sammentrækning ved at hæmme hjerte troponin T38,39. Tnnt2a MO-indsprøjtning fisk var helt blottet for omsætning og ventrikulær WSS på grund af betydelig nedreguleret Notch signalering, fører til en glat ventrikulær overflade og tynde væg i forhold til kontrolgruppen (figur 2I, M) . For at undersøge, om WSS på endokardiet var en forudsætning for trabeculation, har vi også cloche (clo) mutanter som endokardiet og endotel foring af hjertet ikke udvikle40,41. ULT mutanten kunnet udvikle hjerte bjælkerne og viste mindre størrelse ventrikel og ufuldstændige hjerte springer (figur 2J). Endokardial foring er således nødvendigt at forstand hæmodynamiske shear stress at aktivere Notch signalering (figur 2 M). Men når de hæmodynamiske shear stress blev øget ved at øge bloddannelsen eller behandling af isoprenalin at øge kontraktilitet, udtryk niveauer af hak-relaterede gener steg ikke, og trabekulær netværk morfologi ændre ikke (Figur 3).

Yderligere viser forholdet mellem shear stress og hak signalering, blev HAECs brugt til in vitro- test. En pulsatile flow blev udøvet på sammenflydende celler til at simulere de hæmodynamiske shear stress observeret af endothelceller. Det er vist, at i forhold til statisk kultur, pulsatile kultur øger udtryk af hak-relaterede gener (figur 4). Desuden, behandling med ADAM10-hæmmer væsentligt reduceret Notch signalering (figur 4).

Næste, vi beregnet ventrikulær fraktioneret afkortning og ventrikulær hulrum ændring i volumen over tid for vildtype, gata1a MO, AG1478, og dem, der reddet af Nrg1 injektion grupper på 50 hpf, 75 hpf og 100 hpf (figur 5A- C) . Behandling med ErbB signalering inhibitor, AG1478, betydeligt forsinket og reduceret fraktioneret afkortning under ventrikulær diastolen på 100 hpf (figur 5A). Både gata1a MO og AG1478 behandling reduceret ventrikulær kammer størrelse under sammentrækning, som vurderet af ændringer i 4-D LSFM (figur 5E, F). Begge grupper udviklet en øget ende-systolisk og -diastoliske volumen i forhold til wild-type. Co injektion af Nrg1 mRNA med gata1a MO restaureret fraktioneret afkortning såvel uddrivningsfraktion mod dem, af typen vilde.

Figure 1
Figur 1 : Fluorescerende lys arket oversigt. (A) repræsentant LSFM system hvor prøven placeres i skæringspunktet mellem lys arket fra belysning linse (IL) og stien påvisning af påvisning linse (DL). (B) den cylindrisk linse bag IL skaber micron mellemstore lys arket (lilla) inden for stikprøven, som ophidser en tynd plade af prøven. Registrering af linsen registrerer den udsendte fluorescerende signal. (C) en skematisk af arket tynde laser (lilla) optisk skæring zebrafisk embryoet, der flytter højre til venstre. Dette tal er blevet ændret fra Lee al.17. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Ventrikulær morfologier af genetisk manipuleret TG(cmlc:gfp) zebrafisk med Notch Ligand og receptor target genekspression. (A) den trabekulær netværk er vist på 75 hpf af kontrol zebrafisk. (B) den trabekulær netværk på 100 hpf af kontrol zebrafisk. (C) injektion af gata1a MO på 1 - til 4-celle stadium viste lidt at ingen trabeculation på 75 hpf. (D) injektion af gata1a MO i zebrafisk havde forsinket trabekulær netværk dannelse. (E) co injektion af gata1a MO og menneskelige Nrg1 mRNA delvist restaureret trabeculation på 75 hpf. (F) co injektion af gata1a MO og menneskelige Nrg1 mRNA næsten helt restaureret den trabekulær netværk på 100 hpf. (G) wea mutant ved 100 hpf viser ikke trabeculation og et glat ventrikel væg. (H) injektion af menneskelige Nrg1 i wea mutant zebrafisk delvist restaureret trabeculation på 100 hpf. (I) injektion af tnnt2a MO viste ingen trabeculation på 75 hpf (ikke vist) og 100 hpf. (J) CLO mutant viste ingen trabeculation på 100 hpf. (K) injektion af gata1a MO betydeligt reduceret mRNA udtryk for Notch1, Nrg1, og Jag2 (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs kontrol). Co injektion af gata1a MO og menneskelige Nrg1 mRNA steget betydeligt udtryk for Notch1b, Nrg1, ErbB, og Jag1 i forhold til kontrol. (L) wea mutant havde et betydeligt lavere udtryk for Notch-relaterede gener (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs kontrol). Injektion af menneskelige Nrg1 forøget udtryk af hak-relaterede gener; Jag1 og Jag2 var betydeligt højere end kontrol. (M) tnnt2a MO injektion og clo mutant viste en markant lavere udtryk af hak-relaterede gener (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs kontrol). Skalere barer: 50 μm. Tallene vises som den gennemsnitlige standardafvigelse. Dette tal er blevet ændret fra Lee al.17. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Øge WSS i manipuleret TG(cmlc:gfp) zebrafisk med Notch ligand og receptor target genekspression i vivo . Stigende WSS via overdrevne udtryk for bloddannelsen med injektion af EPO(A) eller tilsætning af ISO (B) via øget puls steg ikke trabeculation og havde en trabekulær netværk svarer til kontrol. (C) injektion af EPO mRNA eller Isoproterenol ændrede ikke udtryk for Notch ligand, receptor eller target gener (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs kontrol). Dette tal er blevet ændret fra Lee al.17. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Endotelceller underlagt vakler eller pulsatile shear stress in vitro- . HAECs omfattet af pulsatile shear stress af τgennemsnitlige = 30 x 10-5 N/s ved 1 Hz havde upregulated Notch-relaterede gen udtryk og downregulated af hak-relaterede gen udtryk, når ADAM10-hæmmer blev anvendt (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs kontrol). Dette tal er blevet ændret fra Lee al.17. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Effekt af trabeculation af fraktioneret afkortning og udslyngning brøkdel. (A-C) Tilsætning af AG1478 og gata1a MO faldt betydeligt fraktioneret afkortning på 100 hpf, men co injektion af menneskelige Nrg1 og gata1a MO forbedret det. (D) gata1a injektion og AG1478 faldt betydeligt fraktioneret afkortning på 100 hpf (t-test, * P < 0,05, n = 5 vs kontrol). Co injektion af gata1a og Nrg1 mRNA forbedret fraktioneret afkortning. (E-F) Integrere 4-D synkronisering algoritme med LSFM viste at AG1478 og gata1a MO var steget ende systolisk og diastolisk diskenheder på 75 hpf (E) og 100 hpf (F). Tallene vises som den gennemsnitlige standardafvigelse. Dette tal er blevet ændret fra Lee al.17. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Zebrafisk Jag1 Fremad CCGCGTATGTTTGAAGGAGTATCAGTCG
Bagud CAGCACGATCCGGGTTTTGTCG
Zebrafisk Jag2 Fremad AGCCCTAGCAAAACGAGCGACG
Bagud GCGTGAATGTGCCGTTCGATCAA
Zebrafisk Dll4 Fremad CAAAGTGGGAAGCAGACAGAGCTAAGG
Bagud CGGTCATCCCTGGGTGTGCATT
Zebrafisk BMP10 Fremad GCATCAAGGGGCCACTCGTGTAGA
Bagud TCGTCTCACTCCACTAGGTCCCATACTG
Zebrafisk ErBb2 Fremad GATCAGGACTGCCAAACATTGACGTCT
Bagud AGCAGCACACTGAACATGGCAGCA
Zebrafisk Nrg-1 Fremad GTGTGTTTGTCCCTGTGGACGCGT
Bagud CCTCCTGGAGCTTCCCCTCAAACA
Zebrafisk Notch1b Fremad CAGAGAGTGGAGGCACAGTGCAATCC
Bagud GCCGTCCCATTCACACTCTGCATT

Tabel 3: Primere bruges til zebrafisk screening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol, har vi vist, at 4-D billedbehandling kan bruges til at spore udviklingen af et trabekulær netværk som svar på ændringer i biomekaniske kræfter. Især indleder shear stress erfarne af endothelceller Notch signalering kaskade, der igen fremmer trabeculation. I dette manuskript, har vi vist, at (1) gata1a MO injektion faldt bloddannelsen og derfor det reduceret væg shear stress, (2) tnnt2a MO injektion hæmmede ventrikulær kontraktile funktion for at reducere væg shear stress, og (3) wea mutanter manglede atriale kontraktion, som derefter faldt den hæmodynamiske kraft ventriklen. Ved at reducere shear stress på hjertets vægge, vi kvantificeret Notch signalering via qRT-PCR og fundet, at med reduceret WSS, der var reduceret Notch signalering. For at yderligere bevise vores hypotese, clo mutanter, der manglede endokardiet danne ikke bjælkerne, og underkaste endotelceller pulsatile shear stress med ADAM10 nuværende viste at shear stress aktiveres Notch signalering.

De andre billeddiagnostiske teknikker såsom Konfokal mikroskopi kan bruges til billede prøver i 3D-14. Dog, denne teknik og andre har mange ulemper. For eksempel, den Konfokal imaging kan ikke trænge dybt ind i prøver, har lav aksial opløsning, og langsomt scanning hastigheder19,42. På grund af penetration dybdegrænse i Konfokal imaging, kan små prøver, såsom zebrafisk embryoner, kun være afbildet i sin helhed. To-foton Konfokal mikroskopi forbedrer indtrængningsdybde, men opløsning, langsom scanningshastighed og høje omkostninger gør denne teknik uønskede13. Der har været undersøgelser, der kombinerer to-foton mikroskopi og LSFM med held18, men ulemperne er stadig fremtrædende42.

LSFM, på den anden side har den mindst foto-blegning og skader13,18,42, hurtig erhvervelse hastighed og lignende penetration dybde13. Desuden, på grund af den dobbelte linser og excitation af et enkelt fly (figur 1)er baggrundsstøj betydeligt reduceret43. Prøverne skal imidlertid integreres i gels til at immobilisere den prøve, der gør det vanskeligt at anvende i vivo modeller end zebrafisk14,17,19. Udnyttelse af det fluorescerende lys begrænser også, dybde penetration til et par millimeter. Selv om LSFM er en fremragende metode for visualisering, er det afgørende, at det er suppleret med kvantitative data. Da LSFM kun er kvalitative, kan det være genstand for forskellige fortolkninger. Bruger qRT-PCR, kan vi bekræfte, at LFSM 4-D billeder var en korrekt repræsentation af hændelser i de levende prøver. Lejlighedsvis i større prøver, kan striber og skygger danne i billederne. Men dobbelt-sidet belysning eller mSPIM kan udnyttes til at reducere disse artefakter42. Fordi LSFM er så alsidige, gør sin kapacitet med at fange høj opløsning og generelt bedre billeder for LSFM lovende fremtid. Tidligere nævnte kan LSFM kombineres med andre billeddiagnostiske systemer for vellykket imaging18,42.

Vi viste tidligere, der anvender en pulsatile shear stress af 23 x 10-5 N ved 1 Hz til 24 h væsentligt upregulates hak signalering i vitro(figur 4)17. Vi viste yderligere, at snitte styrker aktivere Notch signalering af genmanipulation af bloddannelsen (gata1a MO)4, hjertets sammentrækning (tnnt1a MO)5, atriale kontraktion (wea mutant), endokardial sletning (clo mutant), og lokaliseringen af Notch signalering (Tg [flk:mCherry; tp1:gfp]). Vi beskriver her som ved at sænke væg shear stress i ventriklen, at Notch-relaterede gener var nedreguleret (figur 2 K, L, M). Desuden, vi var i stand til at demonstrere, at Nrg1 mRNA var i stand til at redde trabeculation, gendanne Notch signalering, og forbedre ventrikulære fraktioneret afkortning og uddrivningsfraktion (figur 2E, F, H, K-M, figur 5) . Restaurering af hjertefunktion var vist af stigningen i kontraktile funktion-medieret hæmodynamiske kræfter, der aktiveret Notch signalering (Figur 2 K- M).

Vi har også besluttet at shear stress-aktiveret Notch signalering er endokardial afhængige. Ved hjælp af gata1a MO, tnnt2a MO, wea mutant eller AG1478 behandling, trabeculation var hæmmet og hak signalering var nedreguleret (Figur 2 K- M). Men Nrg1 reddede trabeculation og hak signalering i wea mutanter og Hvornår Co injiceres med gata1a MO (figur 2D, H, K, L). Når væggen shear stress (EPO injektion) eller hak signalering (10 pg/nL Nrg1 injektion) blev øget, var der ingen ændring i gruppen EPO i morfologi, men unormal ventrikulær morfogenese var til stede i Nrg1 øget dosis (figur 3).

Afslutningsvis har vi vist, at mechanotransduction af shear stress aktiveres Notch signalering pathway. Ved at anvende 4-D LSFM og gensplejsede zebrafisk, vi udviklet en ny model, der viser hvordan kritisk blodgennemstrømningen er under hjerte udvikling til dets morfologi, kontraktilitet og samlede funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne udtrykke taknemmelighed over for William Talbot fra Stanford Universitet for at give menneskelige Nrg1 cDNA og Deborah Yelon fra UCSD for at give den WEA mutanter. Forfatterne vil også gerne takke Cynthia Chen til at hjælpe med billede erhvervelse. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud NIH HL118650 (til T.K. Hsiai), HL083015 (til T.K. Hsiai), HD069305 (til NC Chi og T.K. Hsiai.), HL111437 (til T.K. Hsiai og NC Chi), HL129727 (til T.K. Hsiai), T32HL007895 (til R.R. Sevag Packard), HL 134613 (til V. Messerschmidt) og Universitet Texas System stjerner finansiering (til J. Lee).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clontech Hifi PCR pre-mix  Takara  639298 PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N/A Used for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855201 PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+ GE Health Plasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit   Clontech 740609.25 DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase  Clontech 2011A PCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cells Clontech 636763 E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent Life Technologies 11668027 Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kit Invitrogen AM1340 Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820 Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8 GeneTools N/A Software for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA Creative Biogene CDFH006026 Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478 Sigma-Aldrich  T4182 ErbB inhibitor
1.3.1
E3 medium To grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT Sigma-Aldrich  D5942 γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose  Sigma-Aldrich  A9539 Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software FEI Software N/A Visualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  Sigma-Aldrich  886-86-2 Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge Eppendorf 05-400-005 Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023X Sigma-Aldrich  260264-93-5 ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich  I5627 Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLAB Mathworks N/A Cardiac mechanics analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924 (2013).
  2. Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish. Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).
  3. High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).
  4. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos. Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).
  5. Chi, N. C., et al. Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662 (2010).
  6. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110 (7), 2718 (2007).
  7. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898 (2014).
  8. Liu, J., et al. A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation. Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).
  9. Samsa, L. A., et al. Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish. Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).
  10. Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521, 520 (2015).
  11. Sifrim, A., et al. Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing. Nature Genetics. 48, 1060 (2016).
  12. Hu, Z., et al. A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations. Nature Genetics. 45, 818 (2013).
  13. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).
  14. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).
  15. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
  16. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12, 2081 (2016).
  17. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
  18. Lavagnino, Z., et al. 4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM). Scientific Reports. 6, 23923 (2016).
  19. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007 (2004).
  20. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
  21. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  22. BioRad. General Protocol for Western Blotting. 6376, http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2018).
  23. GeneTools. Gene Tools Oligo Design Website. , https://oligodesign.gene-tools.com/request/ (2018).
  24. Mullins, M. Zebrafish Course. , ed University of Chicago (2013).
  25. Grenander, U. Probability and Statistics: The Harald Cramér Volume. , Alqvist & Wiksell. (1959).
  26. Fei, P., et al. Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function. Scientific Reports. 6, 22489 (2016).
  27. Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences. Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).
  28. Adeoye, A. A., et al. Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome. Aquaculture. 463, 61-70 (2016).
  29. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165 (2011).
  31. Li, R., et al. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxidants & Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).
  32. Li, R., et al. Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).
  33. Baek, K. I., et al. Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).
  34. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).
  35. Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), (2009).
  36. Grego-Bessa, J., et al. Notch signaling is essential for ventricular chamber development. Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).
  37. Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish. Development. 130 (24), 6121 (2003).
  38. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).
  39. Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biol. 6 (5), e109 (2008).
  40. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124 (2), 381-389 (1997).
  41. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).
  42. Santi, P. A. Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  43. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 138 selektiv flyet belysning mikroskopi Notch signalering trabeculation Hæmodynamik zebrafisk cardiac udvikling shear stress 4-dimensionelle heart imaging mechanobiology hjerte lys ark Fluorescens mikroskopi

Erratum

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 09/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

Lys-ark Fluorescens mikroskopi til fange 4-dimensionelle billeder af virkningerne af modulerende Shear Stress på udvikle zebrafisk hjertet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, … More

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, K. I., Ding, Y., Hsu, J. J., Bryant, R., Li, R., Hsiai, T. K., Lee, J. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (138), e57763, doi:10.3791/57763 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter