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Bioengineering

光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57763
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

4 次元 (4-d) ゼブラフィッシュで心の開発を視覚化するためのプロトコルを紹介します。4 D イメージング、光シート蛍光顕微鏡 (LSFM) は、開発の心を再構築する時間を 3 次元 (3 D) 画像を引き継ぎます。質的にも量的そのせん断応力が心臓の肉を推進室開発時に心内膜 Notch シグナルをアクティブに示します。

Abstract

血行動態の軍によって心臓の影響心臓開発、特に肉は、分岐増生心筋からのネットワークを形成する経験します。ノッチ シグナル伝達カスケードは心室欠損症左室非圧縮の心筋症や左心低形成症候群などに関与しているの欠陥の遺伝的プログラム.このプロトコルを使用して、それを決定できます駆動せん断応力肉と Notch シグナルは互いに関連しています。光シート蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ心臓の開発の可視化は可能だった。本稿では、それは血行力 Notch シグナルによる肉の開始を調節してしたがって、収縮機能に影響を与えるかどうかが評価されたに発生します。質的・量的にせん断応力解析、4 D (3-D + 時間) ゼブラフィッシュ心臓の形態形成時に得られた画像と 4 D 同期統合光シート蛍光顕微鏡は心室拍動を捕獲しました。血液粘度ではそれにより、せん断応力を減少する - morpholino gata1a(MO) のオリゴヌクレオチド マイクロ射出成形を介してダウン調整ノッチ シグナル伝達と減衰の肉が減った。Gata1a MO のNrg1 mRNA の共射出は、肉を復元するノッチ関連遺伝子を救出しました。Notch シグナルを駆動せん断応力影響肉を確認する心筋細胞の収縮はさらにtnnt2a経由で逮捕された -MO、それにより血行力を減らすために非 trabeculated を開発するノッチ標的遺伝子をダウン調整心筋。最後に、せん断応力応答ノッチ遺伝子の発現パターンの確証は、内皮細胞を拍動流に服従させることによって行なわれました。したがって、4 D ライト シート顕微鏡は非圧縮の心筋症に臨床的意義と Notch シグナルと肉を基になる血行力を発見しました。

Introduction

血行動態のせん断応力などの生体力学的力は心臓の形態形成に密接に関与しています。血行動態のせん断力に対し、心筋の隆起部分および溝は房室 (AV) 弁1にわたってせん断応力の方向と配置で波のような骨梁ネットワークで開発します。心臓肉収縮機能と心筋質量2を増加する必要があります。Notch シグナルの突然変異の結果人間および他の脊椎動物3先天性心疾患。たとえば、 gata1a4 、 tnnt2a5 morpholino オリゴヌクレオチド (MO) は、エリスロポエチン (EPO) mRNA6とイソプロテレノール (ISO)7増加赤血球、赤血球を減らすために示されています。セルと心拍数, その壁せん断応力 (WSS)。さらに、ErbB2 下流シグナリング、ノッチ、促進する心筋細胞の増殖と分化、Notch シグナル8,9を起動収縮力を生成します。そのせん断応力が Notch シグナル心室開発の駆動肉を支配するをお勧めします。現在、さらに先天性心臓欠陥 (CHD)10、11,12につながる遺伝的プログラミング イベントを理解しようと多くの研究がありますが、ほとんどの調査はどのように機械力形成の心に影響を与えます。

機械の力を調査するために発達期間中に観察、心内膜に作用を実装する必要があります。しかし生体内で伝統的な顕微鏡13の内属のためサンプルを破っての質の良い画像を取得するために挑戦です。物理的な区分および染色はサンプル内で時間をかけて開発を観察するために、したがって、13,14,15を発生する必要。共焦点顕微鏡画像サンプル14,16の 3次元構造に用い、これらのイメージング システムの取得まだ遅いスキャン速度によって制限されます。

光シート蛍光顕微鏡 (LSFM) は、動的イベント長い作業距離13で生体内での可視化を可能にするユニークなイメージング手法です。この技法は、サンプル17を光学セクションのライト シート蛍光顕微鏡を使用します。サンプルに光の薄いシートのみの照明、写真漂白、写真毒性13,18削減あります。ビューと長作動距離の大きい分野は、大きなサンプル画像13,14,17ありのままそのままをことができます。低倍率で、永い間、イメージを作成する大きい区域は、作動距離厚いサンプル信号対雑音比を損なうことがなくイメージを作成することができます。多くのグループ、画像全体胚17に LSFM を使用して脳14,18筋肉と心19他の組織の中で多様なイメージを作成することができますのサンプルを示します。

前の研究は、ゼブラフィッシュ心臓の流入または流出のトラックを遮蔽して減らされた血行力学的せん断力を実証、情報はもっぱら定性的です。それによって異常な第 3 室、減少心臓ループと障害弁形成20。4 D の LSFM 画像は、心臓組織の開発血行動態のせん断力に影響を与える方法に新しい視点を与えます。これらの機械力が敏感なシグナリング分子をアクティブにし、骨の隆起部分の形成を誘導します。4 D イメージングの追加時間の側面、ためこれまで見過ごされていた新しい啓示につながる可能性がリアルタイムでの変化を追跡することであります。ゼブラフィッシュ イメージング科学者は、細胞間の相互作用だけ対全体の脊椎動物を観察できるための理想的なモデルであります。酸素もなしに行われる血管システムに応じてとは異なり哺乳類の開発の開発を可能にする全体の胚を介して拡散します。ゼブラフィッシュ心臓 4 chambered 中心、肺の器官を欠いているにもかかわらず、ゼブラフィッシュと人間21の間保存されている心臓の遺伝子の数が多いがあります。

本稿では、ゼブラフィッシュの心のさまざまな状況で発展途上の梁をイメージさせるライト シート蛍光顕微鏡を使用する方法をについて説明します。まず、 gata1a4 tnnt2a5の注射 MOs は低血液粘度と WSS に使用されました。心臓の形態を記録しただった。魚の別のグループ、 EPO mRNA6またはイソプロテレノール7を管理することにより、WSS を増やし、結果を観察しました。異なる脈動や振動流量と細胞の調査を実施しました。各グループをイメージング、わかった WSS をノッチによる心内膜で感じたこと開始肉をシグナリングします。

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Protocol

次の方法は、うたと UCLA IACUC プロトコルに準拠して行った。これらの実験グループ トランスジェニックTg(cmlc2:gfp)、使用されたwea (弱いアトリウム) 、 clo (cloche)変異体: (a) 野生型 (WT) 制御、(b) gata1aミズーリ、および (c) tnnt2a MO 注射 (表 1)。

モデル 名 変更された遺伝子 表現型 参照
コントロール 野生型 どれも N/A
Tg(cmlc2:gfp) 心筋ミオシン軽鎖 緑色の蛍光が心筋に特異的に発現 34
減少の壁面せん断応力 弱いアトリウム (wea) 変異体 アトリウム固有ミオシン heacy チェーン アトリウム」契約はできません、心室心筋壁の厚さ、狭い内腔、dialated アトリウムをコンパクト 37
クロッシュ (clo) 変異体 N/A 小さい心室存在しない心臓 cushins unaturally 大アトリウム心内膜を完全に除去 41
gata1aMO gata1a  赤血球の不足から貧血 4
tnnt2aMO tnnt2a 39
増加の壁面せん断応力 EPO mRNA どれも 深刻な多血症、循環血液細胞の数の増加は粘度を増加 6
Isoprotenerol どれも 心拍数の増加 7

表 1: ゼブラフィッシュの説明。定義およびゼブラフィッシュ実験で使用される説明。

1. セットアップを研究します。

  1. 肉の救出のためNrg1とEPO mRNA を準備します。
    1. 人間Nrg1 cDNA を取得し、ドナー プラスミッドから増幅します。
      注:人間Nrg1 cDNA は、スタンフォード大学のウィリアム ・ タルボットから寄贈されました。
      1. 必要な試薬および材料、PCR マスター ミックス (-20 ° C に格納)、プライマー (表 2参照) (-20 ° C に格納)、(常温保存) PCR プレート、および (常温保存) 20 μ L ピペットすなわちを取る。例製品の材料の表を参照してください。
        Table 2
        表 2: Nrg1クローン人間用プライマー。
      2. 各プライマー 20 μ L ピペットを使用して帳票をマスター ミックスを準備します。トリプリケートの 1 セットのため、マスター ミックスの 37.5 μ L、3 μ L の DNA 無料水、プライマーの 4.5 μ L を使用します。詳細トリプリケートのためには、サンプルの数を掛けます。
      3. 10 μ L のサンプルごとの井戸あたり合計ので DNA 無料水プライマー ストリップで働く解決策人間Nrg1 cDNA (20 ng/μ g 濃度) を希釈します。
        注:[ステップ 1.1.1 各ソリューションが均等に分散を確認します。上下にピペッティングによる各ソリューションを混合することによってこれを行います。クロスコンタミネーションを防ぐためには、1 つだけサンプルの 1 つのピペット チップを使用します。
      4. PCR プレートに希望の井戸に 10 μ L マルチ チャンネル ピペットのNrg1 cDNA の約数。
      5. 井戸の cDNA に、マスター ミックスの 14.5 μ L を追加します。粘着性のカバーを井戸を封印し PCR マシンに PCR プレートに適用します。
      6. PCR マシンを起動し、酵素およびプライマーの使用によると適切な温度をサイクルに達することを確認します。
    2. Nrg1 cDNA をクローン プラスミド pCS2 に+すべてのプラスミッドの cDNA を結紮ように病原と EcoRI 過剰の酵素を使用して病原と EcoRI サイトで。
      1. プラスミド pCS2 ドナーとNrg1 cDNA をミックス+、市販のマスター ミックス ソリューションおよびプライマー (表 2)。
        注:全反応ボリュームは、マスター ミックス、プライマーの 3 μ L とNrg1 cDNA を用いた 20 ng/μ L ドナー プラスミッドの 1 μ L の 25 μ L の 50 μ L をする必要があります。
      2. PCR マシンでステップ 1.1.2.1 からミックスを置き、次の仕様を満たすようにパラメーターを設定: 98 ° C 10 s、55 ° C、5 または 15 s 72 ° C、5 s/kb に。
      3. 製造元の指示に従って精製キットを使用して PCR の製品を浄化します。50 μ L の溶出バッファーに製品を溶出します。
      4. ダイジェスト精製 PCR の製品と pCS2 の 5 μ g+病原と 200 μ L 反応量の 2 h の 37 ° C で個別に EcoRI。市販キットの結果消化を浄化し、それぞれ 20 μ L、100 μ L トリス-HCl (pH 8.5) の溶出します。
      5. Nrg1 cDNA の 4 μ L と消化の pCS2 の 2 μ L を縛る+ 25 μ L を 1 μ l の反応、16 ° C のリガーゼ触媒一晩でプラスミド。
        注:手順をここで一晩インキュベートを停止できます。
      6. (材料の表を参照) をクローニングのため適当なエシェリヒア属大腸菌細菌細胞の 50 μ L に 2 μ L ステップ 1.1.2.5 から結紮ソリューションおよび変換を使用します。
    3. Nrg1 cDNA クローンの PCR を用いた検診では変換が起こったことを確認します。クローンをランダムに選択し、特異的プライマー、ポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩 (dNTPs) のソリューションに追加します。
      注:コントロールされたベクトル (pCS2+) と (ヒト cDNA) を挿入せず。選択しない過剰な細菌の PCR を抑えることができますので、コロニーの大きすぎます。
      1. 変換と画面の pCS2 から 8 コロニーを拾う+-Nrg1 の表 2から、PCR のプライマーを使用してクローンを作成します。
      2. 文化、pCS2 を分離するNrg1 cdna クローン+-Nrg1 プラスミド DNA。PCS2エシェリヒア属大腸菌細菌の 100 μ l 接種+-37 ° C で (160 225 RPM) を揺することによって LB メディア文化の 100 mL に Nrg1 プラスミド
    4. Transfect 精製 pCS2+-Nrg1 プラスミドに HEK 293 細胞の製造元の指示に従って商業トランスフェクション試薬を用いた 6 ウェル プレート。
    5. トランスフェクション後、24 h 換散バッファーを使用して細胞を溶解し SDS ページのゲル、ゲル膜に転送、反Nrg1抗体22で染色します。西部のしみを使用してNrg1タンパク質発現を確認します。
      注:コントロールが空の pCS2+プラスミド。一晩ゲル膜の転送が発生した場合ここに休止できます。
    6. Nrg1 mRNAテーブルの材料に類似する商品を合成し、製造元の指示に従ってください。
      1. PCS2 の 5 μ L を取る+-東北大学からのプラスミッドをリニア化する 37 ° C で 2 時間 200 μ L 反応で分離された細菌文化ダイジェストから Nrg1 DNA。
      2. 市販キットが付いている線形プラスミッドの浄化、トリス-HCl (pH 8.5) の 20 μ L の溶出です。
      3. 製造元の指示に従って線形プラスミッドの 5 μ L を使用して 20 μ L 反応の商業 RNA 分離キットとの in vitro転写を行います。
      4. RNA 換散バッファーの 350 μ L にNrg1の転写体外を追加し、RNA 分離キットで浄化します。トリス-HCl (pH 8.5) の 60 μ L に RNA を溶出します。
      5. RNA 濃度を測定し、将来使用するため-80 ° C で保存します。
    7. 手順 1.1.6.1 - EPOの cDNA と mRNA 準備がクローン EcoRI で XhoI pCS2 + プラスミドに cDNA の代わりにサイトの上記 1.1.6.5。
  2. ゼブラフィッシュの Morpholino を注入します。
    1. 23 gata1a4 (3 '5'-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-)、 tnnt2a5 (3 '5'-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-) の ATG シーケンスに対してオンライン ツール (資材表) を利用した MO 注射をデザインします。
    2. 8 ng/nL の 4 ng/nL、最終濃度をそれぞれするヌクレアーゼ フリー水にgata1aとtnnt2a MO を個別に追加します。20 pg/nL の最終的な集中にEPO mRNA を繰り返します。最終巻は 1 mL であることを確認します。
    3. 注入 1 nL gata1a MO の 8 ng/nL の 1 減らす心室壁せん断応力 (WSS)24 tnnt2a 1 4 細胞期に独立したゼブラフィッシュ胚に MO の 4 ng/nL の nL。WSS を上げるには、注入 1 のEPO mRNA6 1-4 細胞期でゼブラフィッシュ胚への 20 pg/nL nL。
  3. 肉を抑制するゼブラフィッシュを化学的に扱う
    1. 20 mL のピペットを使用して希釈 E3 中 30 で 5 μ M の最終濃度 1 %dmso で 10 mg/mL AG1478 15 mL チューブに hpf。コントロールとして 1 %dmso だけにそれぞれの魚を扱います。
    2. 1 %dmso で N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t - ブチル (部) を追加 (100 μ M) 40 ノッチ シグナル伝達を阻害するために 15 mL チューブの E3 媒体に同様の方法で hpf。コントロールとしてのみ 1 %dmso を扱います。

2. イメージング技術

  1. 同期アルゴリズムを用いた 4 D 心臓 LSFM イメージング
    1. 全体の魚の胚の 2 D 画像を破ってサイクル (図 1) 以下の手順を使用して複数の心臓に引き継ぐ。光板厚が約 5 μ m であることを確認します。ナイキスト サンプリング原則25によるとロスレスのデジタル サンプリングの 1 μ m に 500 x y フレーム 10 さん z スキャン セットの露出時間を取る。
      1. 寒天 1 g を 100 mL に追加し、すべてアガロースを溶解するまで加熱することによって 1% (w/v) agarose のゲルを作成します。20 μ L ピペットを使用して agarose の胚と小さなプラスチック製のチューブを読み込み、ステージ上に固定します。
      2. 画像閲覧用ソフトを開き、ライブサンプルのライブ ビューを表示する] をクリックします。サンプルは、フォーカスのつまみを使用して目的を調整します。同様に、サンプルのライブビューが胚の上部を示すようにステージを移動します。
      3. 5 の 500 倍の画像を取る顕微鏡のソフトウェア26を使用して 10 倍の倍率で s。
      4. 新しいレイヤー (z 軸方向 1 μ m) にモーターを使用して、ステージを移動し、画像処理の手順を繰り返します。
      5. 心臓全体が完全にイメージ化されるまで上記の 2 手順を繰り返します。
    2. 最初と最後の心臓サイクルのイメージを無視してデータ整合性を確認します。心周期ですが異なる期間で同じ時点で撮影した画像を照合することによって心臓のサイクルの周期を見つけます。期間を見つけるために開発された次の式を使用します。
      Equation 1(1)
      Dは期仮説を嵌合するためのコスト関数私mキャプチャ画像τ' 、イメージのキャプチャ、時刻zkイメージの z 方向インデックス、 xmは、ピクセル インデックスのベクトルとT'周期の仮説であります。
    3. 次の方程式を使用すると、同様の段階で 2 つの画像間の相対シフトを確認します。
      Equation 2(2)
      場所 Qk'、k相対シフト、 Rのコスト関数が可能な空間近隣、 Lはイメージのキャプチャの合計時間、 xは、ピクセルのインデックス、 zkとの z を示しますk'最初と 2 番目の z 軸方向のスライスは、 tは時間、およびsは相対シフト仮説。
    4. 相対シフトを最初の画像に関して絶対シフトに変換し、前述27として画像の次のセクションを配置する絶対の関係を検索する擬似逆のアプローチを使用して線形方程式を解きます。
    5. 最終的な 4 D の画像は、画像処理ソフトウェア (資材表) を使用して処理されました。
      1. 3 D に 2 D の画像をスタック
        1. 市販の画像処理ソフトウェアを開きます。
        2. データを開くをクリックします。
        3. 3-D にまとめられ、すべての画像を選択 > をクリックしてロード。
        4. 0.65 × 0.65 × 1 ボクセル サイズ追加 > [ok]をクリックします。
        5. 3次元画像を視覚化する卒論セッション ビュー ] ボックスをクリックします。
        6. 青slice_1.tiffボックスを右クリックして >表示を選択 > Volrenを選択します。
        7. 編集をクリックして >オプションを選択 >カラーマップを編集を選択します。
        8. 赤の輪郭のボックスを使用してカラーを調整する > OK をクリックします。
      2. 4 D から 3 D への変換
        1. クリックして"ファイル>時系列データを開きます。
        2. 単に行われました 3次元 tiff を選択 > をクリックしてロード。
        3. 前と同じボクセル サイズを入力します。
        4. 青slice_1.tiffボックスを右クリックして >「ディスプレイ」を選択 > Volrenを選択します。
        5. 編集をクリックして >オプションを選択 >カラーマップを編集を選択します。ボックスを使用して色を調整する > [ok]をクリックします。
        6. 時間シリーズのコントロールを右クリックして > [ムービー メーカー ] をクリックして > 映画を見るために [再生] ボタンを押します。
        7. 単眼を入力ファイル名、フレーム サイズ、フレーム レート、1 に等しい品質を追加 >] をクリック適用
        8. ビデオをエクスポートします。適切なソフトウェアでビデオを開きます。

3. qRT PCR 解析

  1. ゼブラフィッシュ心臓ノッチ リガンド、受容体を定量化する RNA の隔離とターゲット遺伝子の表現
    1. Tricaine ・ メチラート28,29の過剰摂取にそれらを服従させることによって、ゼブラフィッシュを犠牲に。30上記プロトコルを使用すると、ゼブラフィッシュ心は摘出し、RNA の隔離のために準備されました。
    2. 総 RNA を分離し、製造元の指示に従って cDNA 合成キットを使用して cDNA を合成します。
    3. PCR プライマーを設計ノッチ ligands Jag1、 Jag2、 Dll4、 Notch1b、受容体、シグナル伝達関連遺伝子Nrg1 ErbB2。我々 が使用されるプライマーの表 3 を参照してください。
    4. PCR プレートにステップ 3.1.3 からプライマー、3.1.2 のステップから分離された mRNA および商業マスター ミックスを追加します。適切な温度、使用される酵素によると時間で qRT PCR を実行します。ゼブラフィッシュ α アクチンに結果を正規化します。
      注:これは、各リガンド、受容体と遺伝子の発現レベルを計算します。

4.培養ひと大動脈内皮細胞 (HAEC) 実験

  1. 動的せん断応力モデル
    1. HAEC 培地と培養 HAEC 細胞。一度完全に合流、層流と 23 × 10-5 N 24 h の 1 Hz のレートでの拍動流に細胞を公開します。
      1. ウォーム アップ EC メディア/DMEM 10% 水で FBS バス 20 分。
      2. 液体窒素タンクから HAEC セルを取得し、風呂の水溶けるまでにバイアルを配置します。
      3. 1,000 μ L ピペットを使用して、解凍のセルを削除して、メディアの 3-5 mL と 15 mL チューブに入れてください。3 分間 53 x g で細胞液を遠心します。
      4. ソリューションを離れて吸い出しなさい、10 mL の容量の十分なメディアを追加します。滅菌 T75 フラスコに携帯ソリューションを追加、フラスコのキャップ、プレートの底に均等に細胞を配布します。
      5. イニシャル、日付、セル型通路番号とフラスコをマークします。細胞が 80% 合流までは、37 ° c、5% CO2フラスコを孵化させなさい。2-3 日毎に、メディアを変更してください。
      6. 商業ポンプを使用して、フラスコ、チューブを付けるし、ステップ 4.1.131,32,33上記のパラメーターを設定します。
    2. HAEC 培地で 30 分の 5 μ M の最終濃度 50 mL に GI254023X を追加します。
    3. 予混合 GI254023X Notch シグナルを抑制する ADAM10 阻害剤同じ流または 4.1.1 のように拍動流の実験を行います。
    4. ノッチ (Jag1、 Jag2、 Dll4) とノッチ標的遺伝子の定量化 (毛深いと分割 [Hes] のエンハンサー) qRT PCR を用いた HAEC サンプル (層流、流 + GI254023X、拍動流の 4 つのグループ拍動流 + GI254023X)32をは前述。

5. 救助と Notch シグナルの過剰発現

  1. 1 を注入gata1aノザン ノッチ ターゲット遺伝子24するために MO で 1-4 細胞期で (ステップ 1.1.6) から 5 pg/nL の濃度で準備Nrg1 mRNA の nL。
  2. 1 を注入と同様方法24 wea変異にNrg1 mRNA の nL。
  3. ダブル Nrg1 mRNA の濃度 (10 pg/nL)24 1 を注入と心室の形態を観察するゼブラフィッシュに nL。
  4. 注入 1 以前に24を示す心室 WSS を増やす造血を強化するために 1-4 細胞期でゼブラフィッシュ胚にEPO mRNA6 20 pg/nL の nL。
  5. 1 を注入中ゼブラフィッシュ 24 h E3 媒体に収縮の率が増加、50 μ M イソプロテレノール7の nL を示した24として培養しています。
  6. 各グループの 4 D LSFM イメージングを実行します。手順 2.1.1-2.1.5.2.8 の指示に従ってください。

6 時間の分数を短縮し、ボリューム変更の定量化

  1. 50、75、100、各グループの 4 D LSFM イメージングを実行 hpf。2.1.1-2.1.5.2.8 の手順に従ってください。それぞれがある心臓の壁運動のレプリケーションの 600 のノードは、各イメージを分割します。
  2. 拡張期と収縮する次の数式を使用しての間に心室の直径の変化を測定します。
    Equation 3(3)
    間隔で心室画像を読み込み可視化ソフトウェアと測定ボリューム s。
  3. 75 で実験グループごとに時間をかけて体積変化をプロット hpf と 100 hpf。

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Representative Results

LSFM は、高解像度の 2 D と 3 D の画像を取得するためにこの原稿で使用されました。図 1 aおよび1 bに見られるように照明レンズはサンプルで光シートを指示します。光シートの薄さ、ため 1 つの平面だけが点灯します。検出レンズ照明レンズに垂直に配置されたは、照らされた面 (図 1 b) に焦点を当てた。照明レンズから光のシートは、左から右 (図 1) のサンプルを検索します。スキャン写真漂白、写真-毒性となっており低い信号対雑音比。

LSFM は急速なスキャン (> 30 s) ボクセル解像度を持つ × 0.65 0.65 の x 1 μ m 単一平面照明のためによりTg(cmlc2a:gfp)胚全体の心臓構造34を視覚化するために適用された、バック グラウンド ノイズが大幅に減少(図 1)。海綿の尾根が 75 で心室内腔へ突出 hpf と骨梁ネットワーク明確に 100 で示された hpf (図 2 aB)。Gata1aMO マイクロ射出成形は、造血、粘度を 904,35減。この減少の粘性減衰せん断応力、血行力学的遅延の開始および 75 の骨梁ネットワークの密度で hpf と 100 hpf (図 2 Cは、D) の制御グループと比較されたとき。さらに、ワンランク上の配位子 (Dll4、 Jag1、およびJag2) の受容体 (Notch1b)、下流のシグナル伝達コンポーネント (Nrg1とErbB2) gata1a MO に対して調整されます。インジェクション (p < 0.05、n = 5) (図 2 K)2,8,36。Gata1a MO Nrg1 mRNA をノッチ シグナル伝達関連遺伝子発現と救出の骨梁形成の 5 μ M と 75 の共射出 hpf と 100 hpf (図 2 e F K)。したがって、 gata1a MO はNrg1 mRNA 救助ノッチ関連遺伝子に対し、シグナル、ダウン規制につながる血行力を低下し、肉を再開始。

私たちの血行動態変化を強制する仮説そしてこうして Notch シグナル、 wea変異導入による肉をさらに証明するためにそれは非収縮アトリウム37を開発しています。心室流入と心房収縮期に血行力学的力のない場合は、 wea変異表現 Notch シグナル コンポーネント遺伝子の低い心臓 mrna と標的遺伝子のコントロールを比較し、ハーバーの非 trabeculated、小さく、弱く(図 2、 L) の心室を収縮します。ただし、 wea変異体にNrg1 mRNA マイクロインジェクション調整にもかかわらず、非収縮アトリウム (より顕著な収縮心室につながるノッチ シグナル伝達経路、海綿の尾根の部分的な救助を伴う図 2 H, L)2。このコンテキストでは、 wea変異体は Notch シグナルによる肉の血行力学的変調を強調する非収縮のアトリウムと非 trabeculated 心室の関係を確証しました。

Tnnt2aMO は、心筋トロポニン T38,39を阻害することによって心筋収縮を停止に配信されました。Tnnt2a MO 注入魚が完全に循環と大幅ダウン規制のノッチ シグナル伝達、コントロール グループ(図 2 i, M) と比較されたとき心室表面壁滑らかにつながるため心室 WSS を欠いています。.心内膜に WSS が肉のための要件かどうか調べるために、また、心内膜と心臓の内皮細胞膜を開発しない40,41クロッシュ(clo) 変異体があります。Clo変異心臓梁の開発に失敗しより小さい大きさで分類された心室を示し, 不完全な心(図 2 j)をループします。したがって、心内膜のライニングは意味血行力学的せん断応力 Notch シグナル(図 2 M)をアクティブにする必要は。しかし、造血やイソプロテレノール収縮力を高めるための治療を増やすことによって血行動態の剪断応力の増加、ノッチ関連遺伝子の発現量が増加していないと骨梁ネットワーク形態が変化しなかった(図 3)。

せん断応力と Notch シグナルの関係をさらに示すためには、HAECsの in vitroテストのために使用されました。拍動流で合流細胞内皮細胞による血行動態のせん断応力をシミュレートするために行使されました。それは静的と比較して拍動培養(図 4)ノッチ関連遺伝子の発現が増加することが表示されます。さらに、ADAM10 阻害剤による治療は、Notch シグナル(図 4)を大幅削減。

次に、心室の小数ショートニングと心室野生型gata1aミズーリ、AG1478、時間をかけてボリュームの増減を計算した、それらは 50 Nrg1注入グループによって救出 hpf、75 hpf と 100 hpf (図 5 aC).ErbBシグナル伝達阻害剤、AG1478、治療は大幅に遅延し、100 で心室の拡張期に短縮率を削減 hpf (図 5 a)。Gata1a MO と AG1478 の治療は、4 D LSFM (図 5 e, F)の変化により評価した収縮では、心室のサイズを削減しました。両方のグループは、野生型と比較して増加終わりシストリックおよび diastolic ボリュームを開発しました。Gata1a MO のNrg1 mRNA の共射出は、野生型の方、短縮率、駆出分画を復元しました。

Figure 1
図 1: 蛍光シートの概要を光します。(A)代表者 LSFM システム照明レンズ (IL) から光シートの交差点と検出レンズ (DL) の検出パスのサンプルを配置する場所。(B) IL の背後にある円筒のレンズは、ミクロン サイズ光内のシート (紫) サンプルでは、サンプルの薄いシートを刺激を作成します。受光レンズは、放出される蛍光信号を記録します。(C)左に右に移動するゼブラフィッシュ胚を光学セクショニング薄いレーザー シート (紫) の模式図。この図は、李ら17から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 心室の形態の遺伝的操作Tg(cmlc:gfp)ゼブラフィッシュ ノッチ リガンド、受容体、ターゲット遺伝子の発現と。(A) 75 に海綿のネットワークが表示されますコントロール ゼブラフィッシュの hpf。(B) 100 で骨梁ネットワーク コントロール ゼブラフィッシュの hpf。(C) 1-4 細胞期でgata1a MO の注入を 75 でない肉に少し示した hpf。(D) gata1aゼブラフィッシュに MO の注入は、海綿のネットワーク形成を遅れていた。(E) gata1a MO および人間のNrg1 mRNA の共射出が 75 で肉を部分的に復元 hpf。(F) gata1a MO および人間のNrg1 mRNA の共射出ほぼ完全に復元 100 で骨梁ネットワーク hpf。100 (G) wea変異ない肉と滑らかな心室壁に hpf が示しています。(H)注入wea変異ゼブラフィッシュ人間Nrg1部分的に復元 100 で肉 hpf。(I)注入tnnt2a 75 で肉を示さなかった MO の hpf (図示せず) と 100 hpf。(J)100 で肉を示さなかったclo変異 hpf。(K) gata1a MO の注射削減notch1 遺伝子、Nrg1、およびJag2の mRNA 発現 (t 検定、* P < 0.05、n = 制御対 5)。Gata1a MO および人間のNrg1 mRNA の共射出Jag1、ErbB、Nrg1 Notch1bコントロールと比較して発現が増大。(L) wea変異株が大幅に低いノッチ関連遺伝子発現 (t 検定、* P < 0.05、n = 制御対 5)。人間Nrg1の注入ノッチ関連遺伝子の発現の増強Jag1とJag2されたコントロールに比べて有意に高かった。(M) tnnt2a MO 注入とclo変異を示したノッチ関連遺伝子発現が有意に低かった (t 検定、* P < 0.05、n = 制御対 5)。スケール バー: 50 μ m。データは、平均の標準偏差として表示されます。この図は、李ら17から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 操作で WSS の増加Tg(cmlc:gfp)ノッチのリガンド、受容体、ターゲット遺伝子の発現とゼブラフィッシュ生体内で. EPO(A)の注射または心拍数の増加を介して ISO (B)の追加と造血の過剰発現を介して WSS を増加して肉を増加しなかった、コントロールに似た海綿ネットワークを持っていた。(C) EPO mRNA またはイソプロテレノール注入にはノッチ リガンド、受容体、ターゲット遺伝子の発現を変わりませんでした (t 検定、* P < 0.05、n = 制御対 5)。この図は、李ら17から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 振動や脈動のせん断応力を受ける内皮細胞体外.拍動せん断応力 τ平均の対象 HAECs = 30 x 10-5 1 Hz で N/s ADAM10 阻害剤が適用されたとき誘導ノッチ関連遺伝子の発現とノッチ関連遺伝子の発現のダウンレギュ レートがあった (t 検定、* P < 0.05、n = 5対コントロール)。この図は、李ら17から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: 小数短縮と駆出分画の肉の効果。(A ~ C)AG1478 とgata1a MO 添加減少 100 で小数の短縮 hpf が人間のNrg1 ・ gata1a MO 共射出はそれを改善しました。100 で、短縮率が減少(D) gata1a注入と AG1478 hpf (t 検定、* P < 0.05、n = 制御対 5)。Gata1aとNrg1 mRNA 共射出は、小数の短縮を改善しました。(E ・ F)AG1478 とgata1a MO が 75 で終わりシストリックおよび diastolic ボリュームを増加したことを示した LSFM と 4 D 同期アルゴリズムを統合する hpf (E)と 100 hpf (F)。データは、平均の標準偏差として表示されます。この図は、李ら17から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ゼブラフィッシュ Jag1 フォワード CCGCGTATGTTTGAAGGAGTATCAGTCG
下位 CAGCACGATCCGGGTTTTGTCG
ゼブラフィッシュ Jag2 フォワード AGCCCTAGCAAAACGAGCGACG
下位 GCGTGAATGTGCCGTTCGATCAA
ゼブラフィッシュ Dll4 フォワード CAAAGTGGGAAGCAGACAGAGCTAAGG
下位 CGGTCATCCCTGGGTGTGCATT
ゼブラフィッシュ BMP10 フォワード GCATCAAGGGGCCACTCGTGTAGA
下位 TCGTCTCACTCCACTAGGTCCCATACTG
ゼブラフィッシュ ErBb2 フォワード GATCAGGACTGCCAAACATTGACGTCT
下位 AGCAGCACACTGAACATGGCAGCA
ゼブラフィッシュ エナジー 1 フォワード GTGTGTTTGTCCCTGTGGACGCGT
下位 CCTCCTGGAGCTTCCCCTCAAACA
ゼブラフィッシュ Notch1b フォワード CAGAGAGTGGAGGCACAGTGCAATCC
下位 GCCGTCCCATTCACACTCTGCATT

表 3: プライマー ゼブラフィッシュ スクリーニングに使用します。

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Discussion

このプロトコルでは、我々 は 4 D イメージングを生体力学的力の変化に対応した骨梁ネットワークの発展を追跡する使用ことができることを示しています。特に、血管内皮細胞による経験豊富な剪断応力は、ノッチ シグナル伝達カスケードは、順番に肉を促進するを開始します。本稿では、我々 は、(1) gata1a MO 注入減少造血、したがってそれは壁面せん断応力を減少、抑制 (2) tnnt2a MO (3) wea と壁面せん断応力を減らすため心室の収縮機能を示されています。変異体を欠いて心房、心室、血行力減少がみられる。心臓壁のせん断応力を減らしては qRT PCR によって Notch シグナルを定量化し、減らされた WSS であることがわかった Notch シグナルを減少します。心内膜に欠けていたclo変異体は梁、さらに我々 の仮説を証明するために形作らないし、そのせん断応力は、Notch シグナル活性化を示した ADAM10 存在と拍動のせん断応力を血管内皮細胞にかけること。

共焦点顕微鏡など他のイメージング技術は、3次元14のイメージ サンプルを使用できます。しかし、この手法など多くの欠点があります。たとえば、共焦点レーザー顕微鏡のサンプルに深く突き通すことができない、軸の低解像度、低速スキャン速度19,42。共焦点レーザー顕微鏡の浸透深さの制限によりゼブラフィッシュ胚などの小さいサンプルだけ完全に視覚化されます。二光子励起共焦点顕微鏡浸透深さを向上しますが、解像度、走査速度が遅いと高コストを作るこの手法の望ましくない13。正常に 2 光子励起顕微鏡と LSFM を組み合わせた研究がされている18、しかし、欠点は、まだ顕著な42。

LSFM、一方では、少なくとも写真漂白と被害13,18,42、高速集録速度、同様の浸透深さ13。さらに、デュアル レンズ、1 つの平面(図 1)の励起のためのバック グラウンド ノイズは大幅に減らされた43です。ただし、サンプルは、体内モデル ゼブラフィッシュ14,17,19以外に適用することは困難になるサンプルの固定化ゲルに埋め込まれる必要があります。また、蛍光灯の光の利用は数ミリに深さの浸透を制限します。にもかかわらず、LSFM は、可視化のための素晴らしい方法です、それは量的データで補われることが重要です。LSFM、質的に限られるために、様々 な解釈の対象となることです。QRT PCR を使用して、LFSM 4 D の画像がライブのサンプルで発生するイベントの正確な表現であることを確認できた。時折より大きいサンプルでストライプと影を画像で形成できます。ただし、両面イルミネーションや mSPIM は、これらの成果物の42を減らすために利用できます。LSFM は汎用性が高く、高解像度と全体的に良い品質の画像をキャプチャの能力は LSFM 約束の未来を作る。以前述べたように、成功したイメージング18,42の他のイメージング システムと LSFM を結合できます。

以前 23 × 10-5 N 1 Hz で 24 h の拍動せん断応力を大幅に適用する upregulates ノッチ シグナル伝達の in vitro(図 4)17デモンストレーションを行った。我々 はさらにせん断力が造血 (gata1a MO)4, 心筋収縮 (tnnt1a MO)5、心房収縮 (wea変異)、心内膜の遺伝的操作による Notch シグナルを活性化することを実証削除 (clo変異体)、および Notch シグナル (Tg [flk:mCherry; tp1:gfp]) のローカリゼーション。ここで述べたいことノッチ関連遺伝子が調整される(図 2 K, L, M)、心室壁のせん断応力を下げることによって。さらに、 Nrg1 mRNA Notch シグナル、復元、肉を救出することができることを証明し、心室短縮率や駆出率を向上させることができました (図 2 e, F, H, K M、図 5).心臓の機能の回復は、Notch シグナル(図 2 KM)を活性化関数を介するの血行力学的力は収縮の増加によって示されました。

せん断応力アクティブ Notch シグナルが心内膜依存性であることも決定。Gata1aミズーリ、 tnnt2a MO、 wea変異体または AG1478 治療を使用して肉が抑制され、Notch シグナルは調整される(図 2 KM)。Nrg1救出肉と Notch シグナルwea変異体でただしとミズーリ州(図 2 D, H, K, L)共同gata1aを注入します。壁せん断応力 (EPO注射) や Notch シグナル (10 pg/nL Nrg1注入) の増加、形態面でEPOグループの変更はなかったが、心室形態異常がNrg1 の存在増量(図 3)。

結論として、私たちは剪断応力のメカノトランスダクションがノッチ シグナル伝達経路を活性化するを示しています。4 D LSFM と遺伝子組換えゼブラフィッシュを用いて開発したモデル システムの重要性の血流を示す形態、収縮性、全体的な機能と心臓の開発中であります。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者は人間を提供するためスタンフォード大学からウィリアム ・ タルボットに感謝の意を表したいと思いますNrg1cDNA とを提供するための UCSD からデボラ ・ Yelon、wea変異体。著者も感謝したいシンシア陳画像の取得で助けるため。この研究は (t. k. Hsiai) に NIH の HL118650 の補助金によって支えられました (t. k. Hsiai) に HL083015、HD069305 (ノースカロライナ州チーと t. k. Hsiai.) に、(t. k. Hsiai、ノースカロライナ州 Chi) に HL111437 (t. k. Hsiai) に HL129727、(r. r. Sevag パッカード) に T32HL007895 (V. メッサーシュ ミット) に HL 134613 と(J. リー) へ星をテキサス州の資金の大学.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clontech Hifi PCR pre-mix  Takara  639298 PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N/A Used for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855201 PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+ GE Health Plasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit   Clontech 740609.25 DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase  Clontech 2011A PCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cells Clontech 636763 E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent Life Technologies 11668027 Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kit Invitrogen AM1340 Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820 Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8 GeneTools N/A Software for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA Creative Biogene CDFH006026 Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478 Sigma-Aldrich  T4182 ErbB inhibitor
1.3.1
E3 medium To grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT Sigma-Aldrich  D5942 γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose  Sigma-Aldrich  A9539 Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software FEI Software N/A Visualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  Sigma-Aldrich  886-86-2 Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge Eppendorf 05-400-005 Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023X Sigma-Aldrich  260264-93-5 ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich  I5627 Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLAB Mathworks N/A Cardiac mechanics analysis

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References

  1. Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924 (2013).
  2. Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish. Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).
  3. High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).
  4. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos. Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).
  5. Chi, N. C., et al. Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662 (2010).
  6. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110 (7), 2718 (2007).
  7. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898 (2014).
  8. Liu, J., et al. A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation. Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).
  9. Samsa, L. A., et al. Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish. Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).
  10. Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521, 520 (2015).
  11. Sifrim, A., et al. Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing. Nature Genetics. 48, 1060 (2016).
  12. Hu, Z., et al. A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations. Nature Genetics. 45, 818 (2013).
  13. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).
  14. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).
  15. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
  16. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12, 2081 (2016).
  17. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
  18. Lavagnino, Z., et al. 4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM). Scientific Reports. 6, 23923 (2016).
  19. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007 (2004).
  20. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
  21. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  22. BioRad. General Protocol for Western Blotting. 6376, http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2018).
  23. GeneTools. Gene Tools Oligo Design Website. , https://oligodesign.gene-tools.com/request/ (2018).
  24. Mullins, M. Zebrafish Course. , ed University of Chicago (2013).
  25. Grenander, U. Probability and Statistics: The Harald Cramér Volume. , Alqvist & Wiksell. (1959).
  26. Fei, P., et al. Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function. Scientific Reports. 6, 22489 (2016).
  27. Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences. Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).
  28. Adeoye, A. A., et al. Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome. Aquaculture. 463, 61-70 (2016).
  29. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165 (2011).
  31. Li, R., et al. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxidants & Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).
  32. Li, R., et al. Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).
  33. Baek, K. I., et al. Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).
  34. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).
  35. Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), (2009).
  36. Grego-Bessa, J., et al. Notch signaling is essential for ventricular chamber development. Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).
  37. Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish. Development. 130 (24), 6121 (2003).
  38. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).
  39. Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biol. 6 (5), e109 (2008).
  40. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124 (2), 381-389 (1997).
  41. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).
  42. Santi, P. A. Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  43. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).

Tags

バイオ エンジニア リング、問題 138、選択的平面照明顕微鏡を用いて、Notch シグナル、肉、血行動態、ゼブラフィッシュ、心臓開発、剪断応力、4次元心臓イメージング、メカノバイオロジー、心臓、光シート蛍光顕微鏡

Erratum

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 09/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには
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Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, … More

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, K. I., Ding, Y., Hsu, J. J., Bryant, R., Li, R., Hsiai, T. K., Lee, J. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (138), e57763, doi:10.3791/57763 (2018).

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