Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Свет лист флуоресцентной микроскопии для захвата 4-мерного изображения эффектов модуляции напряжения сдвига на развивающихся сердце данио рерио

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57763
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Здесь мы представляем протокол для визуализации разработки сердца в zebrafish в 4-измерениях (4-D). 4-D изображений, через свет лист флуоресцентной микроскопии (LSFM), занимает 3-мерных изображений (3-D) со временем, чтобы реконструировать развивающихся сердца. Мы покажем, и количественно и качественно, касательное напряжение активирует эндокарда Notch сигнализации во время разработки камеры, которая способствует сердечной trabeculation.

Abstract

Гемодинамические силы сталкиваются сердце влияние сердца развития, особенно trabeculation, который образует сеть ветвления наросты от миокарда. Генетическая программа дефекты в паз, сигнальный Каскад занимаются такие левого желудочка Non-уплотнение кардиомиопатия или синдром сердца гипоплазии левого желудочков дефекты. Используя этот протокол, можно определить, что касательное напряжение инициативе trabeculation и Notch сигнализации связаны друг с другом. С помощью микроскопии флуоресцирования свет лист, Визуализация развивающихся данио рерио сердца было возможно. В этой рукописи, она оценивалась ли гемодинамики силы модулировать начало trabeculation через выемку сигнализации и таким образом, влияние сократительной функции происходит. Для качественного и количественного сдвига стресс анализ, 4-D (3-D + время) изображения были приобретены во время данио рерио сердца морфогенеза и комплексной света лист флуоресцентной микроскопии с 4-D синхронизации захватили желудочков движения. Вязкость крови был сокращен через gata1a- Морфолино олигонуклеотиды (MO) микро инъекции для уменьшения напряжения сдвига, тем самым, вниз регулирующие выемку сигнализации и смягчающих trabeculation. Совместное инъекций Nrg1 мРНК с gata1a MO спасли Notch связанных генов для восстановления trabeculation. Для подтверждения инициативе Notch сигнализации при сдвиге влияния trabeculation, сокращение cardiomyocyte далее был арестован через tnnt2a-MO для уменьшения гемодинамики силы, тем самым, вниз регулирующие выемку целевых генов для разработки не trabeculated миокард. Наконец подтверждения, выражений шаблонов касательное напряжение отзывчивым Notch генов было проведено подвергать пульсирующего потока эндотелиальных клеток. Таким образом микроскопия свет лист 4-D непокрытый гемодинамики силы лежащие в основе Notch сигнализации и trabeculation с клинической значимости для не уплотнение кардиомиопатии.

Introduction

Биомеханические сил, например гемодинамики при сдвиге, тесно вовлечены в сердечной морфогенеза. В ответ на гемодинамические сдвига миокарда гребней и пазов развиваются в волнообразных трабекулярной сети в соответствие с направлением касательное напряжение через предсердно (AV) клапан1. Сердца trabeculation необходимо увеличить сократительной функции и миокарда массовые2. Мутации в паз, сигнальные пути привести врожденных пороков сердца в организме человека и других позвоночных3. Например было показано, уменьшить эритропоэза, эритропоэтин (ЭПО) мРНК6 и7 Isoproterenol (ISO) увеличение красных кровяных gata1a4 и tnnt2a5 Морфолино олигонуклеотиды (MO) клетки и сердечного ритма соответственно и поэтому стены касательное напряжение (WSS). Кроме того ErbB2 сигнализации, вниз по течению выемки, способствует cardiomyocyte пролиферации и дифференцировки сформировать сократительной силы, которая в свою очередь активирует Notch сигнализации8,9. Он предложил что касательное напряжение регулирует Notch сигнализации приводом trabeculation желудочков развития. В настоящее время, существует множество исследований, которые пытаются понять генетического программирования событий, приведших к сердца врожденные дефекты (CHD)10,11,12, но очень мало изучают как формируя сердце влияние механических сил.

Для того чтобы расследовать механических сил, действующих на эндокарда, тщательное наблюдение в период развития должна осуществляться. Однако это является сложной задачей для получения хорошего качества изображения в vivo избиение образцы из-за наследования традиционных микроскопии13. Для того, чтобы наблюдать за развитием со временем в рамках выборки, физические секционирование и окрашивание, поэтому, должны произойти13,14,15. Хотя конфокальная микроскопия широко используется для изображения 3-D структуры образцов14,16, приобретение этих тепловизионных систем по-прежнему ограничивается медленной скорости сканирования.

Свет лист флуоресцентной микроскопии (LSFM) это уникальный изображений техника, которая позволяет визуализировать в естественных условиях динамических событий с длиной рабочей расстояние13. Этот метод использует свет лист флуоресцентной микроскопии для оптически раздел пример17. Из-за освещения только тонкого листа света на образце является снижение отбеливание фото и фото токсичности13,18. Большое поле зрения и рабочим расстоянием позволяет для больших образцов остаются нетронутыми, поскольку они фотосъемка13,14,17. Низкий масштаб позволяет для большей площади для записи образа, а длинный рабочее расстояние позволяет толще образцов для записи образа без ущерба для отношение сигнал шум. Многие группы использовали LSFM для изображения, все эмбрионы17, мозги14,18, мышц и сердца19 среди других тканей, показаны различные виды образцов, которые могут быть образы.

Хотя предыдущие исследования показали снижение гемодинамического поперечной силы поглощения приток или отток треков сердца данио рерио, информация является исключительно качественные. Это приводит к ненормальной третьей камеры, снижение сердечного цикла и нарушением клапан формирования20. 4-D LSFM изображения дают новую перспективу в гемодинамических сдвига силы влияют на путь развития сердечной ткани. Эти механических сил может активировать силы чувствительных сигнальных молекул и стимулировать формирование трабекулярной хребтов. Из-за добавленного времени аспект 4-D изображений одна способна отслеживать изменения в развитии в режиме реального времени, что может привести к новые откровения, которые ранее незамеченным. Данио рерио является идеальной моделью для визуализации потому, что ученые могут наблюдать весь позвоночных животных против только ячеек взаимодействий. Кислород может также диффузных через весь эмбриона, который позволяет развитие происходит без зависимости от сосудистой системы, в отличие от млекопитающих развития. Даже несмотря на то, что сердце данио рерио не хватает легких органов, которые требуют четыре-сердце, существует большое количество сердца генов, которые сохраняются между21данио рерио и людей.

В этой рукописи мы опишем, как использовать свет лист флуоресцентной микроскопии для изображения развивающихся трабекулы в zebrafish сердца при различных обстоятельствах. Во-первых инъекции gata1a4 или tnnt2a5 MOs были использованы для ниже вязкости крови и поэтому WSS. Морфологии сердца, затем был записан. В отдельную группу рыб мы увеличилось WSS управляющими ЕПВ мРНК6 или isoproterenol7 и отметила результаты. Мы также провели исследование клеток с различными пульсирующего или колебательных расхода. После визуализации каждой группы, мы обнаружили, что WSS воспринимается эндокарда через выемку сигнализации начинает trabeculation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Следующие методы были исполнены в соответствии с протоколами Ута и UCLA IACUC. Эти экспериментальные группы были использованы с трансгенных Tg(cmlc2:gfp), wea (слабый Атриум) или clo (cloche) мутантов: управления () одичал тип (WT), (b) gata1a MO и (c) tnnt2a MO инъекции (Таблица 1).

Модель Имя Измененные гены Фенотип Ссылка
Управления Дикого типа Нет Н/Д
TG(cmlc2:GFP) Легкие цепи миозина сердца Зеленый flourescence, конкретно выражена в миокарде 34
Снижение стены касательное напряжение Мутант слабые Атриум (wea) Heacy цепи миозина Атриум конкретных Атриум не контракт, компактный желудочка, толстые стенки миокарда, узкий просвет, dialated Атриум, 37
Мутант Cloche (clo) Н/Д Полное удаление эндокарда, unaturally большой атриум с малого желудочка, несуществующие сердечной cushins 41
gata1a MO gata1a  Анемия из-за отсутствия красных кровяных клеток 4
tnnt2a MO tnnt2a 39
Увеличение стены касательное напряжение ЕПВ мРНК Нет Тяжелые полицитемией, увеличение количества циркулирующих клеток крови, увеличение вязкости 6
Isoprotenerol Нет Увеличение сердечного ритма 7

Таблица 1: Данио рерио описания. Определения и описания данио рерио, используемых в экспериментах.

1. исследование установки

  1. Подготовьте Nrg1 и ЕПВ мРНК для спасения trabeculation.
    1. Получить людей Nrg1 cDNA и усилить от доноров плазмиды.
      Примечание: CDNA человека Nrg1 был подарен от Уильям Талбот от Стэнфордского университета.
      1. Вывезти необходимые реактивы и материалы, а именно ПЦР mastermix (хранится в-20 ° C), грунты (см. таблицу 2) (хранится в-20 ° C), ПЦР-планшете (хранится при комнатной температуре) и 20 мкл пипетки (хранится при комнатной температуре). Таблица материалов для примера продуктов.
        Table 2
        Таблица 2: Праймеры для клонирования человека Nrg1 .
      2. Подготовьте mastermix для каждого праймера, в трех экземплярах с помощью пипетки 20 мкл. 1 набор triplicates используйте 37,5 мкл mastermix, 3 мкл ДНК свободной воды, 4,5 мкл праймера. Для более triplicates просто умножьте на количество выборок.
      3. Разбавьте рабочий раствор человеческого Nrg1 cDNA (20 нг/мкг концентрации) в полосе грунт с ДНК свободной воды, так что есть 10 мкл всего за хорошо на сэмпл.
        Примечание: Убедитесь, что каждое решение под шаг 1.1.1 равномерно распределены. Сделать это путем смешивания каждого решения, закупорить вверх и вниз. Для предотвращения перекрестного загрязнения, используйте один наконечник пипетки для только одного образца.
      4. Алиготе Nrg1 cDNA с 10 мкл многоканальные пипетки желаемого скважин в ПЦР-планшете.
      5. Добавьте 14,5 мкл mastermix cDNA в скважинах. Применять липкие Обложка к пластине ПЦР для герметизации скважин и место в машину ПЦР.
      6. Запустите машину ПЦР и гарантировать, что цикл достигает соответствующей температуры согласно ферментов и грунтовки используется.
    2. Клонировать Nrg1 cDNA в плазмиду pCS2+ на BamHI и EcoRI участках, с использованием избыточного ферменты BamHI и EcoRI для обеспечения cDNA перевязано в всех плазмид.
      1. Смешать Nrg1 cDNA с донором плазмида pCS2+, коммерчески доступных мастер смешать раствор и грунтовки (Таблица 2).
        Примечание: Общая реакция объем должен быть 50 мкл с 25 мкл мастер смеси, 3 мкл праймеров и 1 мкл 20 нг/мкл доноров плазмида с Nrg1 cDNA.
      2. Поместите смесь из шага 1.1.2.1 в машину ПЦР и установите параметры для удовлетворения следующих спецификаций: 98 ° C 10 s, 55 ° C за 5 или 15 s и 72 ° C для 5 s/КБ.
      3. Очищайте продукт PCR, используя набор для очистки следуя инструкциям производителя. Элюировать продукта в 50 мкл буфера.
      4. Дайджест очищенный продукт PCR и 5 мкг pCS2+ с BamHI и EcoRI отдельно при 37 ° C на 2 ч в объеме 200 мкл реакции. Очистить результате пищеварения с комплектом коммерческих и элюировать в 20 мкл и 100 мкл трис-HCl (рН 8,5), соответственно.
      5. Перевязать 4 мкл Nrg1 cDNA и 2 мкл усваивается pCS2+ плазмид в 25 мкл реакции с 1 мкл лигаза катализатора на 16 ° C на ночь.
        Примечание: Процедура может быть остановлено здесь на ночь инкубации.
      6. Используйте 2 мкл лигирование решения из шага 1.1.2.5 и преобразование в 50 мкл клеток бактерий E. coli подходит для клонирования (см. Таблицу материалы).
    3. Убедитесь, что преобразование имело место, скрининг, что Nrg1 cDNA клоны с помощью ПЦР. Выберите клоны наугад и добавить в решение конкретных грунты, полимеразы и deoxyribonucleotide трифосфаты (дНТФ).
      Примечание: Элементы управления были вектор (pCS2+) и без вставки (человека cDNA). Не выбрать слишком большой колонии, потому что чрезмерное бактерий может ингибировать ПЦР.
      1. Выберите 8 колоний от преобразования и экран pCS2+-Nrg1 клоны, используя праймеры PCR из таблицы 2.
      2. Культура один клон с Nrg1 cDNA изолировать pCS2+-Nrg1 плазмидной ДНК. Прививать с 100 мкл бактерий кишечной палочки с pCS2+-Nrg1 плазмида в 100 мл LB СМИ и культуры путем встряхивания (160-225 RPM) при 37 ° C.
    4. Transfect очищенный pCS2+-Nrg1 плазмида в ГЭС-293-клеток в 6-ну пластину, используя коммерческие трансфекции реагент следуя инструкциям производителя.
    5. 24 ч после трансфекции, Лизируйте клетки с помощью буфера lysis и запустить через геля SDS-PAGE, передать гель мембраны и затем пятно с анти-Nrg1 антитела22. Проверка Nrg1 выражения протеина используя Вестерн блоттинга.
      Примечание: Элемент управления является пустым pCS2+ плазмиды. Может быть приостановлена здесь если гель мембраны передача происходит в одночасье.
    6. Синтезировать Nrg1 мРНК с помощью коммерческого продукта аналогична в Таблице материалов и следуйте инструкциям производителя.
      1. Возьмите 5 мкл pCS2+-Nrg1 ДНК от культуры бактерий изолированные и дайджест с Ноти в 200 мкл реакции втечение 2 ч при 37 ° C для линеаризации плазмиды.
      2. Очистить линеаризованного плазмида с комплектом коммерческих и элюировать в 20 мкл трис-HCl (рН 8,5).
      3. Проведение в vitro транскрипция с комплектом изоляции коммерческих РНК в 20 мкл реакции с использованием 5 мкл линеаризованного плазмида следуя инструкциям производителя.
      4. Добавить в vitro расшифрованный Nrg1 350 мкл буфера lysis РНК и затем очистить комплект изоляции РНК. Элюировать РНК в 60 мкл трис-HCl (рН 8,5).
      5. Измерение концентрации РНК и хранить при температуре-80 ° C для использования в будущем.
    7. Выполните шаги 1.1.6.1 - 1.1.6.5 выше для ЕПВ cDNA и мРНК подготовки, но также клона cDNA в плазмиду pCS2 + EcoRI и XhoI сайтов вместо.
  2. Придать Морфолино данио рерио
    1. Дизайн23 MO инъекции, используя онлайн инструмент (Таблица материалов) против ГПТ последовательность gata1a4 (5 ' CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3′) и tnnt2a5 (5 ' CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3′).
    2. Добавьте gata1a и tnnt2a MO отдельно от нуклеиназы свободной воды, чтобы сделать окончательный концентрации 8 нг/nL и 4 нг/nL, соответственно. Повторите с ЕПВ мРНК с конечной концентрации 20 ПГ/nL. Убедитесь, что конечный объем 1 мл.
    3. Придать 1 nL 8 нг/nL gata1a MO и 1 nL 4 нг/nL tnnt2a MO в отдельные данио рерио эмбрионов на 1 до стадии 4-секционный для сокращения желудочков стены касательное напряжение (WSS)24. Чтобы увеличить WSS, придать 1 nL 20 ПГ/nL ЕПВ мРНК6 в zebrafish эмбрионы на стадии 1 - 4-клеток.
  3. Химически лечения данио рерио ингибировать trabeculation
    1. С помощью пипетки 20 мл, разбавить 10 мг/мл AG1478 в 1% ДМСО в E3 среднего до конечной концентрации 5 мкм 30 ФВЧ в 15 мл трубку. Как элемент управления рассматривать каждую рыбу с только 1% ДМСО.
    2. Добавить N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t бутилового эфира (DAPT) в 1% ДМСО (100 мкм) средний E3 в 15 мл трубки для ингибирования Notch сигнализации на 40 hpf аналогичным образом. Как элемент управления лечить с только 1% ДМСО.

2. изображений техники

  1. 4-D сердечной LSFM изображений с алгоритм синхронизации
    1. Захватить изображения 2-D эмбриона всю рыбу несколько сердечных, победив циклов, используя шаги ниже (рис. 1). Убедитесь, что свет лист толщиной около 5 мкм. Взять 1 мкм для потерь цифровой выборки согласно принципу проб Найквиста25500 x-y кадров с выдержка 10 г-жа набор z сканирование.
      1. Создайте гель агарозы 1% (w/v), добавив 1 g агарозы в 100 мл и Отопление, до тех пор, пока все агарозы растворяется. Загрузить небольшой пластиковой трубки с эмбриона и агарозы с помощью пипетки 20 мкл и закрепите его на сцене.
      2. Открыть изображение просмотра программного обеспечения и нажмите кнопку Live чтобы увидеть живой вид образца. Отрегулируйте цели, используя регулятор, так что образец находится в фокусе. Аналогичным образом переместите сцену, чтобы жить образца отображаются в верхней части зародыша.
      3. Возьмите изображения 500 раз за 5 сек при 10-кратном с помощью микроскопа программного обеспечения26.
      4. Переместить стадии, используя двигатель на новый слой (1 мкм в оси z) и повторите процедуру визуализации.
      5. Повторите вышеуказанные 2 шага до тех пор, пока весь сердце полностью отражаться.
    2. Обеспечить целостность данных, игнорируя изображения первого и последнего сердечного цикла. Найти период сердечного цикла, сопоставляя фотографии, которые были приняты в один и тот же момент времени сердечного цикла, но в разные периоды. Используйте следующее уравнение, который был разработан, чтобы найти в период:
      Equation 1(1)
      где D -это стоимость функция, используемая для установки периода гипотеза, яm образа, τ' время, образ был захвачен, zk z направлении индекс изображения, xm является вектор пиксель индекса, и Т ' периодических гипотеза.
    3. Для поиска относительный переход между двумя изображениями в аналогичных этапов используется следующее уравнение:
      Equation 2(2)
      где Qk', k обозначает стоимость функция для относительного сдвига, R — возможные пространственных окрестности, L является общее время захвата изображения, x является пиксель индекс, zk и zk' являются первый и второй z направлении ломтиками, t — время и s является гипотеза относительный сдвиг.
    4. Преобразовать относительный сдвиг в абсолютный сдвиг в отношении первое изображение и решить линейное уравнение с помощью псевдо-обратный подход, чтобы найти абсолютное отношение для выравнивания в следующем разделе изображений как описано27.
    5. Окончательный 4-D изображения были обработаны с помощью программного обеспечения для обработки изображений (Таблица материалов).
      1. Укладка изображения 2-D в 3-D
        1. Откройте Коммерческая обработки изображений программное обеспечение.
        2. Нажмите кнопку открыть данные.
        3. Выберите все изображения, чтобы быть уложены в 3-D > нажмите кнопку Load.
        4. Добавить в размере voxel 0,65 x 0.65 x 1 > нажмите кнопку ОК.
        5. Щелкните поле Зрения Multi-Planar для визуализации 3-D изображения.
        6. Щелкните правой кнопкой мыши поле синий slice_1.tiff > выберите дисплея > выберите Volren.
        7. Нажмите кнопку изменить > выберите функции > выберите редактировать Colormap.
        8. Настройка цвета с помощью поля красным > нажмите кнопку ОК.
      2. Преобразование 3-D в 4-D
        1. Нажмите кнопку «файл > открыть данных временных рядов.
        2. Выберите 3-D ссоры, которые были только что сделаны > нажмите кнопку Load.
        3. Введите же размера voxel, как раньше.
        4. Щелкните правой кнопкой мыши поле синий slice_1.tiff > выберите «экран» > выберите Volren.
        5. Нажмите кнопку изменить > выберите функции > выберите редактировать Colormap. Настройка цвета с помощью поля > нажмите кнопку ОК.
        6. Щелкните правой кнопкой мыши Время серии управления > выберите киностудия > нажмите кнопку Play для того, чтобы смотреть фильм.
        7. Добавьте имя файла, размер кадра, частоту кадров, качество, равным 1, тип стереокартинки > нажмите кнопку Применить
        8. Экспорт видео. Откройте видео в соответствующее программное обеспечение.

3. qRT ПЦР-анализа

  1. Данио рерио сердца РНК изоляции для количественного определения Notch лигандов, рецепторы и целевых генов выражения
    1. Пожертвуйте данио рерио, подвергая их передозировки tricaine Метилат28,29. С помощью описанных протокол30, данио рерио сердца были подакцизным и подготовлен для изоляции РНК.
    2. Изолировать всего РНК и синтез cDNA, используя комплект для синтеза cDNA следуя инструкциям производителя.
    3. Дизайн праймеры PCR для лигандов паз Jag1, Jag2, Dll4, рецептор Notch1bи сигнализации связанных генов ErbB2и Nrg1 . Смотрите таблицу 3 грунты, которые мы использовали.
    4. Добавьте грунты из шага 3.1.3, изолированные mRNA от шага 3.1.2 и коммерческих mastermix ПЦР-планшете. Запустите qRT ПЦР в соответствующей температуры и время согласно ферментов, используемых. Нормализовать результаты данио рерио α-миозина.
      Примечание: Это будет рассчитать уровни выражения для каждого лигандов, рецепторы и генов.

4. в vitro эксперименты человека аорты эндотелиальных клеток (HAEC)

  1. Модель динамического напряжения сдвига
    1. Культура клетки HAEC с HAEC культуры средств массовой информации. После того, как полностью вырожденная, разоблачить клетки для ламинарного потока и пульсирующего потока 23 х 10-5 N со скоростью 1 Гц за 24 ч.
      1. Разминка EC СМИ/DMEM 10% FBS в воде ванна 20 мин.
      2. Извлечение HAEC клетки из бака жидким азотом и поместите ампулу в водяной бане до растаял.
      3. С помощью пипетки 1000 мкл, удаление талой клетки и положил их в 15 мл с 3-5 мл средства массовой информации. Центрифуга клетки решение на 53 g x 3 мин.
      4. Аспирационная решение покинуть и добавить достаточно СМИ за общим объемом 10 мл. Добавить решение клеток в стерильную колбу T75, крышка колбу и распространять ячейки равномерно на нижней пластине.
      5. Марк колбу с инициалами, Дата, тип ячейки и номер прохода. Инкубируйте настой при 37 ° C, 5% CO2, до тех пор, пока клетки являются 80% притока. Не забудьте изменить СМИ каждые 2-3 дня.
      6. Использование коммерческих насос, прикрепите трубы колбу и задайте параметры, упомянутые выше в шаге 4.1.131,,3233.
    2. Добавьте GI254023X в 50 мл HAEC среды в конечной концентрации 5 мкм, 30 мин.
    3. С предварительно смешанные GI254023X ADAM10 ингибитор, который подавляет Notch сигнализации, проведение же ламинарного потока или потока ударные эксперименты как 4.1.1.
    4. Количественно лигандов паз (Jag1, Jag2 и Dll4) и паз целевых генов (волосатые и усилитель Сплит [ГЭС]) с помощью qRT ПЦР для четырех групп HAEC образцов (ламинарного потока, ламинарные + GI254023X, пульсирующего потока, пульсирующего потока + GI254023X) описано выше32.

5. спасение и Гиперэкспрессия Notch сигнализации

  1. Придать 1 nL подготовленный Nrg1 мРНК в концентрации 5 ПГ/nL (от шага 1.1.6) на стадии 1-4-клеток с gata1a MO для того, чтобы overexpress Notch целевых генов24.
  2. Придать 1 nL Nrg1 мРНК в wea мутант в аналогичный способ24.
  3. Двойной концентрации мРНК Nrg1 (10 ПГ/nL) и придать24 1 nL в zebrafish соблюдать желудочков морфологии.
  4. Придать 1 nL 20 ПГ/nL ЕПВ мРНК6 в zebrafish эмбрионы на стадии 1-4-секционный дополнить кроветворения увеличить желудочков WSS как ранее показанный24.
  5. Придать 1 nL 50 мкм Isoproterenol7, который увеличивает скорость сократимости, E3 средний за 24 часа при данио рерио культивировали как ранее показанного24.
  6. Выполните 4-D LSFM изображений для каждой группы. Следуйте инструкциям шагов 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. Количественная оценка фракционного сокращения и объем изменений с течением времени

  1. Выполнение визуализации LSFM 4-D для каждой группы в 50, 75 и 100 hpf. Следуйте инструкциям шагов 2.1.1-2.1.5.2.8. Разделите каждое изображение так, что каждый имеет 600 узлов для репликации движения сердца стены.
  2. Измерить изменение в диаметре желудочка во время диастола и систолы, по следующей формуле:
    Equation 3(3)
    Загрузить 3-D желудочков изображения на каждый 0,1 s с программного обеспечения визуализации и измерения объема.
  3. Участок изменения объема со временем для каждой экспериментальной группы в 75 hpf и 100 hpf.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LSFM был использован в этой рукописи для того, чтобы приобрести 2-D и 3-D изображений с высоким разрешением. Как видно на рисунке 1A и 1B, освещение объектива направляет свет лист на образец. Из-за тонкости света листа горит только одной плоскости. Линза обнаружения устанавливается перпендикулярно к освещенности объектива и сосредоточена на световые плоскости (рис. 1B). Затем свет лист от освещенности объектива сканирует образец слева направо (рис. 1 c). Сканирование позволяет меньше фото отбеливание, Фото токсичность и имеет меньше соотношение сигнал шум.

LSFM был применен к Tg(cmlc2a:gfp) эмбрионы визуализировать всю структуру сердца34 путем быстрого сканирования (> 30 х) с разрешением voxel 0,65 x 0.65 x 1 µm. из-за освещения одной плоскости, фоновый шум был значительно более (Рис. 1). Трабекулярная хребтов торчали в желудочковой просвета на 75 hpf, Трабекулярная сеть и явно был показан на 100 hpf (рисунок 2A, B). Gata1a MO микро инъекции снижена кроветворения и вязкости на 90%4,35. Это снижение вязкости ослабленных гемодинамики касательное напряжение, в результате задержки начала и плотность трабекулярной сети на 75 hpf и 100 hpf по сравнению с контрольной группой (рис. 2 C, D). Кроме того, надрезать лигандами (Dll4, Jag1и Jag2), рецептор (Notch1b), и компонентов нисходящего потока сигналов (Nrg1 и ErbB2) были регулируются вниз в ответ на gata1a MO инъекции (p < 0,05, n = 5) (рис. 2 K)2,8,36. Совместное инъекций gata1a MO с 5 мкм экспрессии генов, связанных с сигнализацией Notch вверх регулируемых Nrg1 мРНК и спасли трабекулярной формирования на 75 hpf и 100 hpf (Рисунок 2E, F, K). Таким образом, gata1a MO сокращены гемодинамики сил, ведущих к вниз регулирование Notch сигнализации, тогда как Nrg1 мРНК спасти вверх регулируемых Notch связанных генов и повторно начато trabeculation.

С целью дальнейшего доказать нашу гипотезу, что изменения гемодинамики силы и, таким образом, trabeculation через выемку сигнализации, мы ввели wea мутант, развивается не сократительной Атриум37. В отсутствие гемодинамики сил во время систолы предсердий и желудочков приток wea мутантов express ниже сердца уровни mRNA Notch сигнализации компонент генов и целевых генов по сравнению с элементами управления и гавань не trabeculated, малые и слабо Договаривающиеся желудочков (Рисунок 2 g, L). Однако Nrg1 мРНК микро инъекции в мутантов wea вверх регулируется Notch сигнальный путь, сопровождаются частичной спасения трабекулярной хребтов, приводит к более выраженным сократительной желудочка, несмотря на не сократительная Атриум ( Рисунок 2 H, L)2. В этом контексте wea мутантов подтверждают связь между не сократительная атриум и не trabeculated желудочка, подчеркнув гемодинамики модуляции trabeculation через выемку сигнализации.

Tnnt2a MO был доставлен остановить сердечные сокращения, подавляя сердца тропонина T38,39. Tnnt2a MO-вводят рыбы были полностью лишены циркуляции и желудочковая WSS из-за значительных вниз регулируемая Notch сигнализации, ведущих к гладкой желудочковой поверхности и тонкие стены по сравнению с контрольной группой (Рисунок 2I, M) . Расследовать ли WSS на эндокарда является требованием для trabeculation, мы также имеем мутантов cloche (clo), для которых эндокарда и эндотелиальных накладки сердца не развиваются40,41. Clo мутант смогла разработать сердца трабекул и показал меньшего размера желудочка и неполной сердечного цикла (Рисунок 2J). Таким образом эндокарда накладки необходимо чувство гемодинамики касательное напряжение для того чтобы активировать Notch сигнализации (рис. 2 M). Однако когда гемодинамики касательное напряжение был увеличен путем увеличения кроветворения или лечение isoproterenol для повышения сократительной способности, уровень выражение генов, связанных с паз не увеличилось, и морфология Трабекулярная сеть не изменился (Рис. 3).

Чтобы продемонстрировать связь между касательное напряжение и Notch сигнализации, HAECs были использованы для в пробирке тестов. Пульсирующего потока было оказано на вырожденная клетки для имитации гемодинамики касательное напряжение, отмеченные эндотелиальных клеток. Показано, что по сравнению с статические, пульсирующего культуры увеличивает экспрессии генов, связанных с паз (рис. 4). Кроме того лечение ингибитором ADAM10 значительно сократить выемку, сигнализации (рис. 4).

Далее, мы рассчитали желудочков дробных укорочение и полости желудочков изменения в объеме со временем для одичал тип, gata1a MO, AG1478, и тех, кто спасены Nrg1 инъекций группами на 50 hpf, 75 hpf и 100 hpf (Рисунок 5A- C) . Лечение с ErbB сигнализации ингибитор, AG1478, значительно задерживается и дробные укорочение при желудочковой диастола в 100 сокращено hpf (Рисунок 5A). Gata1a MO и AG1478 лечения сокращен размер желудочка камеры во время сокращения, как оцениваются изменения в 4-D LSFM (Рисунок 5E, F). Обе группы разработали увеличение конце систолическое и - диастолического объема по сравнению с одичал типа. Совместное инъекций Nrg1 мРНК с gata1a MO восстановлен как дробные шортинг, так и фракция изгнания к тем из дикого типа.

Figure 1
Рисунок 1 : Флуоресцентный свет обзор листа. (A) представитель LSFM система, где образец помещается в пересечении света листа от освещенности объектива (IL) и обнаружения пути обнаружения объектива (DL). (B) Цилиндрические линзы позади IL создает микронного размера свет лист (фиолетовый) в образце, который захватывает тонкий лист образца. Линза обнаружения записи излучаемый сигнал флуоресцентные. (C) схема листа тонкий лазерный (фиолетовый), оптически секционирование zebrafish эмбриона, который перемещается справа налево. Эта цифра была изменена от Lee et al17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Желудочковая морфологии из генетически манипулировать TG(cmlc:GFP) рыбки данио рерио с Notch лиганд, рецептор и целевого выражения гена. (A) Трабекулярная сеть отображается в 75 hpf данио рерио управления. (B) Трабекулярная сеть 100 hpf данио рерио управления. (C) инъекций gata1a MO на этапе 1 - 4-клеток показали мало, чтобы не trabeculation на 75 hpf. (D) для инъекций gata1a MO в zebrafish отложила формирование трабекулярной сети. (E) совместное инъекций gata1a MO и человека Nrg1 мРНК частично восстановлена trabeculation 75 hpf. (F) совместное инъекций gata1a MO и человека Nrg1 мРНК почти полностью восстановлен Трабекулярная сеть 100 hpf. (G) wea мутант 100 hpf показывает не trabeculation и гладкими желудочков. (H) инъекции человеческого Nrg1 в zebrafish мутант wea частично восстановлена trabeculation на 100 hpf. (I) для инъекций tnnt2a MO, показал не trabeculation на 75 hpf (не показан) и 100 hpf. (J) CLO мутант, показал не trabeculation на 100 hpf. (K) для инъекций gata1a MO значительно сократила выражение mRNA Notch1, Nrg1, и Jag2 (т тест, * P < 0,05, n = 5 против управления). Совместное инъекций gata1a MO и человека Nrg1 мРНК значительно увеличили выражение Notch1b, Nrg1, ErbB и Jag1 по сравнению с контролем. (L) wea мутант был значительно ниже экспрессии генов, связанных с Notch (t тест, * P < 0,05, n = 5 против управления). Инъекции человеческого Nrg1 увеличение экспрессии генов, связанных с паз; Jag1 и Jag2 были значительно выше, чем элемент управления. (M) tnnt2a MO инъекций и clo мутант показали значительно ниже экспрессии генов, связанных с Notch (t тест, * P < 0,05, n = 5 против управления). Масштаб бары: 50 мкм. Данные отображаются как среднее стандартное отклонение. Эта цифра была изменена от Lee et al17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Увеличение WSS в манипулировали TG(cmlc:GFP) данио рерио с Notch лиганд, рецептор и целевых экспрессии генов в естественных условиях . Увеличение WSS через гиперэкспрессия кроветворения с введения EPO(A) или Добавление ISO (B) через увеличение сердечного ритма не увеличить trabeculation и имел Трабекулярная сеть похож на элемент управления. (C) введения EPO mRNA или Isoproterenol не изменить выражение Notch лиганд, рецептор или целевых генов (t тест, * P < 0,05, n = 5 против управления). Эта цифра была изменена от Lee et al17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Эндотелиальных клеток при условии колебательной или пульсирующего касательное напряжение в пробирке . HAECs при условии пульсирующего касательное напряжение τсредний = 30 x 10-5 н / с частотой 1 Гц имел выражения Notch связанных генов upregulated и downregulated паз связанных генов выражений, когда был применен ADAM10 ингибитор (t тест, * P < 0,05, n = 5 против управления). Эта цифра была изменена от Lee et al17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Эффект trabeculation дробные укорочение и выброса дроби. (A-C) AG1478 и gata1a MO значительно сократилось дробных сокращение на 100 hpf, но совместное инъекций человеческого Nrg1 и gata1a MO улучшить его. (D) gata1a инъекции и AG1478 значительно сократилось дробных сокращение на 100 hpf (t тест, * P < 0,05, n = 5 против управления). Совместное инъекций gata1a и Nrg1 мРНК улучшена дробных сокращение. (E-F) Интеграция алгоритма синхронизации 4-D с LSFM показал, что AG1478 и gata1a MO увеличилось конце систолы и диастолы томов на 75 hpf (E) и 100 hpf (F). Данные отображаются как среднее стандартное отклонение. Эта цифра была изменена от Lee et al17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Данио рерио Jag1 Вперед CCGCGTATGTTTGAAGGAGTATCAGTCG
Назад CAGCACGATCCGGGTTTTGTCG
Данио рерио Jag2 Вперед AGCCCTAGCAAAACGAGCGACG
Назад GCGTGAATGTGCCGTTCGATCAA
Данио рерио Dll4 Вперед CAAAGTGGGAAGCAGACAGAGCTAAGG
Назад CGGTCATCCCTGGGTGTGCATT
Данио рерио BMP10 Вперед GCATCAAGGGGCCACTCGTGTAGA
Назад TCGTCTCACTCCACTAGGTCCCATACTG
Данио рерио ErBb2 Вперед GATCAGGACTGCCAAACATTGACGTCT
Назад AGCAGCACACTGAACATGGCAGCA
Данио рерио Nrg-1 Вперед GTGTGTTTGTCCCTGTGGACGCGT
Назад CCTCCTGGAGCTTCCCCTCAAACA
Данио рерио Notch1b Вперед CAGAGAGTGGAGGCACAGTGCAATCC
Назад GCCGTCCCATTCACACTCTGCATT

Таблица 3: Праймеры для данио рерио скрининга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом протоколе мы показали, что 4-D изображений может использоваться для отслеживания развития трабекулярной сети в ответ на изменения в биомеханических сил. В частности касательное напряжение опытных эндотелиальных клеток инициирует паз, сигнальный Каскад, который в свою очередь способствует trabeculation. В этой рукописи мы показали, что (1) gata1a MO инъекций снизилась кроветворения и поэтому она сократила стены касательное напряжение, (2) tnnt2a MO инъекции тормозится желудочков сократительной функции уменьшить напряжение сдвига стены и (3) wea мутантов не хватало предсердий сжатия, который затем снижение гемодинамического усилие желудочка. Уменьшая напряжение сдвига на стенах сердца, мы количественно Notch сигнализации через qRT-PCR и обнаружил, что с сокращением WSS, был сокращен Notch сигнализации. Дальнейшего доказать нашу гипотезу, clo -мутантов, которые не хватало эндокарда не образуют трабекул, и подвергая эндотелиальных клеток пульсирующего напряжения сдвига с ADAM10 настоящее время показал, что что касательное напряжение активирует сигнализацию Notch.

Другие методы обработки изображений, например confocal микроскопии может использоваться для изображения образцов в 3-D14. Однако этот метод и другие имеют много недостатков. К примеру конфокальная томография не проникают глубоко в образцы, обладает низкой осевой резолюции и медленно сканирования скорости19,42. Из-за предел глубины проникновения в конфокальная томография небольшие образцы, такие как zebrafish эмбриона, может быть только imaged во всей его полноте. Двух Фотон confocal микроскопии улучшает глубину проникновения, но резолюции, медленный скорость сканирования и высокой стоимости делают этот метод нежелательным13. Там были исследования, которые успешно сочетают два Фотон микроскопии и LSFM18, однако недостатки, по-прежнему видно42.

LSFM, с другой стороны, имеет наименее фото отбеливания и повреждения13,18,42, быстрое приобретение скорость и аналогичные глубина проникновения13. Кроме того из-за двойной линзы и возбуждения одной плоскости (рис. 1), фоновый шум является существенно сократить43. Однако образцы должны быть встроен в гели для иммобилизации образца, что делает его трудно применять к моделям в естественных условиях помимо данио рерио14,17,19. Кроме того использование флуоресцентного света ограничивает глубину проникновения в несколько миллиметров. Несмотря на то, что LSFM является большой метод для визуализации, важно, что она дополняется количественными данными. Потому что LSFM только качественные, она может быть предметом различных толкований. С помощью ПЦР qRT, мы смогли подтвердить, что изображения 4-D LFSM были правильное представление событий, происходящих в живых образцов. Иногда в крупных выборок, полосы и тени могут образовывать в изображениях. Однако двусторонняя освещения или mSPIM могут быть использованы для уменьшения этих артефактов42. Потому что LSFM настолько универсален, его возможности захвата и общего повышения качества изображения с высоким разрешением делает будущее обещает LSFM. Упоминалось ранее, LSFM может сочетаться с другими систем тепловидения для успешной обработки изображений18,42.

Мы продемонстрировали ранее которые применение пульсирующего касательное напряжение 23 х 10-5 N 1 Гц для 24 h существенно upregulates насекают сигнализации в пробирке(рис. 4)17. Мы также продемонстрировали, что сдвига активировать Notch сигнализации генетические манипуляции кроветворения (gata1a MO)4, сокращение сердца (tnnt1a MO)5, предсердная сужением (wea мутант), эндокарда Удаление (clo мутант) и локализация Notch сигнализации (Tg [flk:mCherry; tp1:gfp]). Мы опишем здесь, снижая напряжение сдвига стены в желудочке, что связанные с Notch гены были регулируется вниз (рис. 2 K, L, M). Кроме того, мы смогли продемонстрировать, что Nrg1 мРНК смогла спасти trabeculation, восстановление Notch сигнализации и улучшить желудочков дробных укорочение и фракция изгнания (Рисунок 2E, F, H, K-M, рис. 5) . Восстановление функции сердца было показано увеличение сократительная функция опосредованной гемодинамики сил активированные Notch сигнализации (Рис. 2 K- M).

Мы также установили, что касательное напряжение активированный Notch сигнализации эндокарда зависит. С помощью gata1a MO, tnnt2a MO, wea мутанта или AG1478 лечения, ингибирует trabeculation и Notch сигнализации был регулируются вниз (Рис. 2 K- M). Однако, Nrg1 спасены trabeculation и Notch сигнализации в wea мутантов и когда совместно вводили с gata1a MO (Рисунок 2D, H, K, L). Когда стены касательное напряжение (ЕПВ инъекций) или Notch сигнализации (10 ПГ/nL Nrg1 инъекций) было увеличено, никаких изменений в группе ЕПВ по морфологии, но ненормальное желудочков морфогенеза присутствовал в Nrg1 увеличение дозы (рис. 3).

В заключение мы показали, что mechanotransduction касательное напряжение активирует паз, сигнальный путь. Применяя 4-D LSFM и генетически данио рерио, мы разработали новую модель системы, которая показывает как критический поток крови при сердечной развития его морфологии, сократимость и общей функции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы выразить благодарность Уильям Талбот Стэнфордского университета для предоставления человека Nrg1 cDNA и Дебора Yelon от UCSD для обеспечения WEA мутантов. Авторы хотели бы также поблагодарить за помощь с приобретением изображений Синтия Чэнь. Это исследование было поддержано грантов низ HL118650 (к Hsiai т.к.), HL083015 (к Hsiai т.к.), HD069305 (чтобы оплата Чи и т.к. Hsiai.), HL111437 (к Hsiai т.к. и оплата Чи), HL129727 (к Hsiai т.к.), T32HL007895 (для р.р. Севак Packard), 134613 HL (чтобы V. Мессершмидта) и Университет Техаса системы звезды финансирования (Джей ли).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clontech Hifi PCR pre-mix  Takara  639298 PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N/A Used for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855201 PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+ GE Health Plasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit   Clontech 740609.25 DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase  Clontech 2011A PCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cells Clontech 636763 E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent Life Technologies 11668027 Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kit Invitrogen AM1340 Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820 Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8 GeneTools N/A Software for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA Creative Biogene CDFH006026 Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478 Sigma-Aldrich  T4182 ErbB inhibitor
1.3.1
E3 medium To grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT Sigma-Aldrich  D5942 γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose  Sigma-Aldrich  A9539 Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software FEI Software N/A Visualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  Sigma-Aldrich  886-86-2 Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge Eppendorf 05-400-005 Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023X Sigma-Aldrich  260264-93-5 ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich  I5627 Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLAB Mathworks N/A Cardiac mechanics analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924 (2013).
  2. Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish. Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).
  3. High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).
  4. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos. Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).
  5. Chi, N. C., et al. Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662 (2010).
  6. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110 (7), 2718 (2007).
  7. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898 (2014).
  8. Liu, J., et al. A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation. Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).
  9. Samsa, L. A., et al. Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish. Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).
  10. Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521, 520 (2015).
  11. Sifrim, A., et al. Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing. Nature Genetics. 48, 1060 (2016).
  12. Hu, Z., et al. A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations. Nature Genetics. 45, 818 (2013).
  13. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).
  14. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).
  15. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
  16. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12, 2081 (2016).
  17. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
  18. Lavagnino, Z., et al. 4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM). Scientific Reports. 6, 23923 (2016).
  19. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007 (2004).
  20. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
  21. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  22. BioRad. General Protocol for Western Blotting. 6376, http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2018).
  23. GeneTools. Gene Tools Oligo Design Website. , https://oligodesign.gene-tools.com/request/ (2018).
  24. Mullins, M. Zebrafish Course. , ed University of Chicago (2013).
  25. Grenander, U. Probability and Statistics: The Harald Cramér Volume. , Alqvist & Wiksell. (1959).
  26. Fei, P., et al. Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function. Scientific Reports. 6, 22489 (2016).
  27. Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences. Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).
  28. Adeoye, A. A., et al. Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome. Aquaculture. 463, 61-70 (2016).
  29. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165 (2011).
  31. Li, R., et al. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxidants & Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).
  32. Li, R., et al. Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).
  33. Baek, K. I., et al. Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).
  34. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).
  35. Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), (2009).
  36. Grego-Bessa, J., et al. Notch signaling is essential for ventricular chamber development. Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).
  37. Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish. Development. 130 (24), 6121 (2003).
  38. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).
  39. Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biol. 6 (5), e109 (2008).
  40. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124 (2), 381-389 (1997).
  41. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).
  42. Santi, P. A. Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  43. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).

Tags

Биоинженерии выпуск 138 селективный плоскости освещения микроскопии Notch сигнализации trabeculation гемодинамики данио рерио сердца развития касательное напряжение сердце 4-мерной визуализации mechanobiology сердце микроскопии флуоресцирования света лист

Erratum

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 09/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

Свет лист флуоресцентной микроскопии для захвата 4-мерного изображения эффектов модуляции напряжения сдвига на развивающихся сердце данио рерио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, … More

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, K. I., Ding, Y., Hsu, J. J., Bryant, R., Li, R., Hsiai, T. K., Lee, J. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (138), e57763, doi:10.3791/57763 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter