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Bioengineering

Microscopía de fluorescencia de la hoja de luz para capturar imágenes de 4 dimensiones de los efectos de la modulación de la tensión de esquileo en el corazón de pez cebra en desarrollo

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57763
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar el desarrollo de corazón en pez cebra en 4 dimensiones (4D). Imagen 4-D, mediante microscopía de fluorescencia de luz-hoja (LSFM), toma 3 dimensiones (3D) imágenes en el tiempo, reconstruir el corazón en desarrollo. Mostramos cualitativamente y cuantitativamente que esa tensión de esquileo activa endocárdica muesca señalización durante el desarrollo de la cámara, que promueve la trabeculación cardiaca.

Abstract

Las fuerzas hemodinámicas experimentadas por el desarrollo cardíaco corazón influencia, especialmente trabeculación, que forma una red de ramificación crecimientos del miocardio. Programa genético de defectos en la muesca de señalización cascada participan en defectos ventriculares como cardiomiopatía no compactación Ventricular izquierda o síndrome de corazón izquierdo hipoplásico. Mediante este protocolo, puede determinarse que tensión de esquileo conducido trabeculación y señalización Notch están relacionados con uno otro. Usando microscopía de fluorescencia de luz-hoja, visualización del corazón de pez cebra en desarrollo era posible. En este manuscrito, se evaluó si las fuerzas hemodinámicas modulan el inicio de la trabeculación vía de señalización Notch y por lo tanto, influyen en la función contráctil se produce. Cualitativa y cuantitativa del esquileo tensión análisis, 4-D (3-D + tiempo) imágenes fueron adquiridas durante la morfogénesis cardiaca de pez cebra, y de microscopía de fluorescencia de luz hoja integrada con 4 D sincronización capturado el movimiento ventricular. Viscosidad de la sangre se redujo gata1a- morfolino oligonucleótidos (MO) micro-inyectable para disminuir la tensión de esquileo, de tal modo, abajo-regulación de la muesca señalización y atenuando trabeculación. La inyección de mRNA de Nrg1 con gata1a MO rescatado genes relacionados con la muesca para restaurar trabeculación. Para confirmar la tensión de esquileo por señalización Notch influencias trabeculación, contracción de cardiomiocitos más fue detenida por tnnt2a-MO para reducir las fuerzas hemodinámicas, por lo tanto, abajo-regulan genes de la blanco del muesca para desarrollar no trabeculada miocardio. Por último, corroboración de los patrones de expresión de genes sensibles a la tensión de esquileo de muesca se realizó sometiendo las células endoteliales a flujo pulsátil. Así, la microscopía de luz-hoja 4-D al descubierto las fuerzas hemodinámicas subyacentes de señalización Notch y trabeculación con importancia clínica a la cardiomiopatía no compactación.

Introduction

Fuerzas biomecánicas, como hemodinámica tensión de esquileo, están involucradas íntimamente en la morfogénesis cardiaca. En respuesta a las fuerzas de corte hemodinámica, surcos y crestas miocardio desarrollan en una red trabecular ondulatorio en alineación con la dirección de la tensión de esquileo en el auriculoventricular (AV) válvula1. Trabeculación cardiaca es necesario aumentar la función contráctil y masa miocárdica2. Mutaciones en vías de señalización Notch dan lugar a defectos congénitos del corazón en los seres humanos y otros vertebrados3. Por ejemplo, gata1a4 y tnnt2a5 morfolino oligonucleótidos (MO) han demostrado reducir la eritropoyesis, mientras aumenta el de mRNA (EPO) la eritropoyetina6 y7 de Isoproterenol (ISO) rojos de la sangre las células y la frecuencia cardíaca respectivamente y por lo tanto la pared tensión de esquileo (WSS). Además, señalización de ErbB2, aguas abajo de la muesca, promueve la proliferación de los cardiomiocitos y la diferenciación para generar la fuerza contráctil, que a su vez activa la muesca señalización8,9. Se sugiere que tensión de esquileo gobierna conducido trabeculación ventricular desarrollo de señalización de Notch. Actualmente, hay muchos estudios que intentan comprender aún más los eventos programación genéticos conduce a cardiopatía congénita (CHD) de defectos10,11,12, pero muy poco están investigando cómo fuerzas mecánicas influyen en el centro de formación.

Para investigar las fuerzas mecánicas actuando sobre el endocardio, una observación más cercana durante el período de desarrollo debe aplicarse. Sin embargo, es difícil obtener imágenes de buena calidad en vivo a las muestras debido a la injerencia de microscopía tradicional13. Para observar el desarrollo en el tiempo dentro de una muestra, física de seccionamiento y coloración, por lo tanto, deben ocurrir13,14,15. Aunque la microscopía confocal es ampliamente utilizada a la imagen de la estructura 3D de las muestras14,16, adquisición de estos sistemas de imagen todavía está limitado por bajas velocidades de barrido.

Microscopía de fluorescencia de luz-hoja (LSFM) es una única técnica de imagen que permite visualizar en vivo eventos dinámicos con largos de distancia de trabajo13. Esta técnica utiliza un microscopio fluorescente de luz de hoja a la sección ópticamente una muestra17. Debido a la iluminación de solo una hoja fina de la luz sobre la muestra, hay una reducción en el blanqueo de foto y foto toxicidad13,18. El gran campo de visión y distancia de funcionamiento larga permite muestras grandes a permanecer intacto como imagen13,14,17. La ampliación baja permite un área más grande al ser reflejada, mientras que la larga distancia de trabajo permite para que muestras más gruesas ser reflejada sin comprometer la relación señal a ruido. Muchos grupos han utilizado LSFM a imagen todo embriones17, cerebros de14,18, músculos y corazón19 entre otros tejidos, mostrando los diversos tipos de muestras que pueden ser reflejadas.

Aunque investigaciones previas demostraron fuerza hemodinámica reducida por oclusión de las vías de entrada o salida del corazón del pez cebra, la información es exclusivamente cualitativa. Traduce en una sala tercera anormal, bucle cardiaca disminuida y válvula deteriorada formación20. Las imágenes de 4D LSFM dan una nueva perspectiva en la manera de que la cizalla hemodinámica las fuerzas afectan el desarrollo del tejido cardiaco. Estas fuerzas mecánicas pueden activar moléculas de señalización sensibles a la fuerza e inducir la formación de las crestas trabeculares. Por el aspecto de mayor tiempo de proyección de imagen de 4-D, uno es capaz de seguir los cambios en el desarrollo en tiempo real, que podría conducir a nuevas revelaciones que habían pasado desapercibidas anteriormente. El pez cebra es un modelo ideal para la proyección de imagen porque los científicos pueden observar un animal vertebrado todo versus sólo interacciones de célula. Oxígeno puede difundir también por el embrión completo, que permite el desarrollo que se produzca sin dependiendo del sistema vascular, a diferencia de en el desarrollo de mamífero. A pesar de que el corazón del pez cebra carece de los órganos pulmonares, que requieren un corazón de cuatro cámaras, hay un gran número de genes cardíacos que se conservan entre el pez cebra y los seres humanos21.

En este manuscrito, se describe cómo utilizar microscopía de fluorescencia de la hoja de luz a la imagen de las trabéculas en desarrollo en el corazón del pez cebra bajo circunstancias diversas. En primer lugar, la inyección de gata1a4 o tnnt2a5 MOs utilizaron para baja la viscosidad de la sangre y por lo tanto WSS. Luego se registró la morfología del corazón. En un grupo separado de los peces, aumentamos el WSS mediante la administración de EPO mRNA6 o isoproterenol7 y observa los resultados. También se realizó un estudio de la célula con las tasas de flujo pulsátil u oscilatoria diferente. Después de cada grupo de imágenes, encontramos que WSS percibido por el endocardio mediante muesca señalización inicia trabeculación.

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Protocol

Los métodos siguientes se realizaron en cumplimiento de protocolos de UTA y UCLA IACUC. Estos grupos experimentales fueron utilizados con transgénicos Tg(cmlc2:gfp), los mutantes wea (atrio débil) o clo (cloche) : (a) tipo salvaje (WT) control, (b) gata1a MO y (c) tnnt2a MO inyecciones (tabla 1).

Modelo Nombre Genes modificados Fenotipo Referencia
Control Tipo salvaje Ninguno N / A
TG(cmlc2:GFP) Cadena ligera de la miosina cardiaca Fluorescencia verde específicamente expresado en el miocardio 34
Tensión de esquileo de la pared menor Mutante de atrio débil (wea) Cadena de heacy atrio específicos miosina Atrio no contrato, compacto grosor de la pared miocárdica, lumen estrecho, ventrículo, aurícula dilatada, 37
Mutante de Cloche (clo) N / A Retiro completo del endocardio, unaturally atrio grande con pequeño ventrículo, colchones cardiaca inexistente 41
gata1a MO gata1a  Anemia por falta de glóbulos rojos 4
tnnt2a MO tnnt2a 39
Tensión de esquileo de la pared mayor MRNA de la EPO Ninguno Policitemia severa, aumento de circulación de las células de la sangre, aumenta la viscosidad 6
Isoprotenerol Ninguno Aumento de la frecuencia cardiaco 7

Tabla 1: Descripción de pez cebra. Definiciones y descripciones de pez cebra utilizados en experimentos.

1. estudiar la configuración

  1. Preparar Nrg1 y EPO mRNA para rescate de trabeculación.
    1. Obtener cDNA humano Nrg1 y amplificación de un plásmido donante.
      Nota: El cDNA humano Nrg1 fue dotado de William Talbot de la Universidad de Stanford.
      1. Sacar los reactivos necesarios y materiales, es decir PCR mastermix (almacenados en-20 ° C), iniciadores (ver tabla 2) (almacenados en-20 ° C), una placa PCR (almacenado a temperatura ambiente) y una pipeta de 20 μL (almacenado a temperatura ambiente). Ver la tabla de materiales para productos de ejemplo.
        Table 2
        Tabla 2: Cartillas para Nrg1 clonación.
      2. Preparar el mastermix para cada cartilla en triplicado usando la pipeta de 20 μL. 1 conjunto de triplicados, uso 37.5 μL del mastermix, 3 μL de agua libre de ADN, 4.5 μL de cebador. Para más de triplicado, simplemente multiplique por el número de muestras.
      3. Diluir la solución de trabajo del cDNA humano Nrg1 (concentración de 20 ng/μg) en la franja de imprimación con agua libre de ADN por lo que hay 10 μL por pozo por muestra total.
        Nota: Asegúrese de que cada solución en el paso 1.1.1 está distribuido uniformemente. Para ello, mezclar cada solución mediante pipeteo arriba y abajo. Para evitar la contaminación cruzada, utilizar una pipeta para sólo una muestra.
      4. Alícuota del cDNA Nrg1 con la pipeta de varios canales de 10 μL a deseado pozos en la placa de la polimerización en cadena.
      5. Añadir 14,5 μL del mastermix a cDNA en los pozos. Aplicar una cubierta pegajosa a la placa de la polimerización en cadena para sellar los pozos y colocar en la máquina de la polimerización en cadena.
      6. En marcha la máquina de la polimerización en cadena y garantizar que el ciclo llegue a temperaturas adecuadas según las enzimas y los cebadores utilizados.
    2. Clon de cDNA Nrg1 en el plásmido pCS2+ en los sitios BamHI y EcoRI usando exceso enzimas BamHI y EcoRI para cDNA está ligado en los plásmidos.
      1. Mezclar el Nrg1 cDNA con el donante plásmido pCS2+, disponible en el mercado principal mezcla solución y cartillas (tabla 2).
        Nota: El volumen de reacción total debe ser 50 μL con 25 μL de la mezcla principal, 3 μL de primers y 1 μL del plásmido de donante de 20 ng/μL con cDNA Nrg1 .
      2. Coloque la mezcla del paso 1.1.2.1 en la máquina de la polimerización en cadena y establezca los parámetros para cumplir con las siguientes especificaciones: 98 ° C por 10 s, 55 ° C de 5 y 15 s y 72 ° C durante 5 s/kb.
      3. Purificar el producto PCR utilizando un kit de purificación siguiendo las instrucciones del fabricante. Responsables del producto en 50 μL de tampón de elución.
      4. Digerir el producto PCR purificado y 5 μg de pCS2+ con BamHI y EcoRI por separado en 37 ° C durante 2 h en un volumen de 200 μL de la reacción. Purificar la digestión resultante con un kit comercial y eluir en 20 μL y 100 μL de Tris-HCl (pH 8,5), respectivamente.
      5. Ligar 4 μL de cDNA Nrg1 y 2 μL de la pCS2 digerido+ plásmido en 25 μL reacción con 1 μL de un catalizador de ligasa a 16 ° C durante la noche.
        Nota: El procedimiento puede detener aquí por incubación durante la noche.
      6. Utilice 2 μL de la solución de la ligadura del paso 1.1.2.5 y transformar en 50 μL de células de las bacterias e. coli adecuadas para la clonación (véase Tabla de materiales).
    3. Confirman que la transformación llevó a cabo por proyección que el Nrg1 cDNA clones usando PCR. Elegir al azar clones y añadir a una solución de iniciadores específicos, polimerasa y trifosfatos de desoxirribonucleótidos (dNTPs).
      Nota: Los controles fueron el vector (pCS2+) con y sin el inserto (cDNA humano). No demasiado grande de una colonia porque las bacterias excesiva pueden inhibir la PCR.
      1. Recoger 8 colonias de la pCS2 transformación y pantalla+-Nrg1 clones usando los cebadores PCR de tabla 2.
      2. Cultura un clon con Nrg1 cDNA para aislar la pCS2+-Nrg1 plasmid DNA. Inocular con 100 μL de la bacteria e. coli con pCS2+-plásmido Nrg1 en 100 mL de medio LB y cultura agitando (160-225 RPM) a 37 ° C.
    4. Transfectar pCS2 purificada+-plásmido Nrg1 en HEK-293 células en una placa de 6 pozos utilizando un reactivo de transfección comerciales siguiendo las instrucciones del fabricante.
    5. 24 h después de la transfección, lyse las células usando un tampón de lisis y ejecutar a través de un gel de SDS-PAGE, transferencia a una membrana de gel y luego la mancha con anti-Nrg1 anticuerpo22. Verificar la expresión de proteína Nrg1 mediante un Western Blot.
      Nota: El control es un pCS2 vacío+ plásmido. Puede hacer una pausa aquí si transferencia de membrana de gel se presenta durante la noche.
    6. Sintetizar mRNA Nrg1 utilizando un producto comercial similar a la de la Tabla de materiales y seguir las instrucciones del fabricante.
      1. Tomar 5 μL de la pCS2+-Nrg1 ADN de la bacteria aislada cultura y digerir con NotI en una reacción de 200 μL por 2 h a 37 ° C para alinear el plásmido.
      2. Purificar el plásmido linearizado con un kit comercial y eluir en 20 μL de Tris-HCl (pH 8.5).
      3. Conducta en vitro la transcripción con un kit comercial de aislamiento de RNA en una reacción de 20 μL con 5 μL del plásmido lineal siguiendo las instrucciones del fabricante.
      4. Añadir que el en vitro transcritos Nrg1 a 350 μL de tampón de lisis de RNA y luego purificar con un kit de aislamiento de RNA. Eluir el RNA en 60 μL de Tris-HCl (pH 8.5).
      5. Medir la concentración de RNA y almacenar a-80 ° C para su uso futuro.
    7. Siga los pasos 1.1.6.1 - 1.1.6.5 encima para el cDNA EPO y preparación de ARNm pero clon cDNA en el plásmido pCS2 + en EcoRI y XhoI sitios en lugar de otro.
  2. Inyecte morfolino en pez cebra
    1. Diseño23 las inyecciones MO utilizando una herramienta en línea (Tabla de materiales) contra la secuencia ATG de gata1a4 (5-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3 ') y tnnt2a5 (5-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3 ').
    2. Agregar por separado gata1a y tnnt2a MO al agua libre de nucleasa para hacer las concentraciones finales de 8 ng/nL y 4 ng/nL, respectivamente. Repita con el mRNA de la EPO con una concentración final de 20 pg/nL. Asegúrese de que el volumen final es de 1 mL.
    3. Inyectar 1 nL de la ng/nL 8 de gata1a MO y 1 nL de los 4 ng/nL del tnnt2a MO en embriones de pez cebra independiente en el 1 a la fase de 4 células para reducir la tensión de esquileo (WSS) de pared ventricular24. Para aumentar la WSS, inyectar 1 nL de 20 pg/nL de EPO mRNA6 en los embriones de pez cebra en la etapa de 1 a 4 células.
  3. Tratar químicamente el pez cebra para inhibir la trabeculación
    1. Con una pipeta de 20 mL, diluir 10 mg/mL AG1478 en DMSO 1% en medio de la E3 a una concentración final de 5 μM a 30 hpf en un tubo de 15 mL. Como control, tratar cada pescado con DMSO 1% solamente.
    2. Añadir éster del t-butil N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine (DAPT) en DMSO 1% (100 μM) al medio de E3 en un tubo de 15 mL para inhibir la señalización de Notch en 40 hpf en una manera similar. Como control, tratar con DMSO 1% solamente.

2. técnicas de imagen

  1. 4-D cardiaca LSFM proyección de imagen con algoritmo de sincronización
    1. Tomar imágenes 2-D del embrión de pez todo sobre múltiples cardiaco a ciclos con los siguientes pasos (figura 1). Asegúrese de que el espesor de la hoja de luz es de aproximadamente 5 μm. Tomar 500 marcos de x-y con un tiempo de exposición de 10 ms. sistema de la exploración de z a 1 μm para el muestreo digital sin pérdidas según el muestreo de Nyquist principio25.
      1. Agregar 1 g de agarosa a 100 mL y calentar hasta que se disuelva la agarosa todos para crear un gel de agarosa al 1% (p/v). Cargar un tubo de plástico pequeño con el embrión y con una pipeta de 20 μL de la agarosa y fijarlo en el escenario.
      2. Abra el software de visualización de imagen y haga clic en Live para ver la vista en vivo de la muestra. Ajustar el objetivo usando la perilla para que la muestra está en foco. Del mismo modo, mover el escenario para que la vista en vivo de la muestra muestra la parte superior del embrión.
      3. Tomar imágenes 500 veces durante 5 s a 10 aumentos, utilizando software26 del microscopio.
      4. Mover el escenario utilizando el motor a una nueva capa (1 μm en el eje z) y repetir el procedimiento por imágenes.
      5. Repita los 2 pasos anteriores hasta que todo corazón está plenamente reflejada.
    2. Haciendo caso omiso de las imágenes del primer y último ciclo cardiaco para asegurar integridad de datos. Encontrar el período del ciclo cardíaco haciendo coincidir las imágenes que fueron tomadas en el mismo momento en el ciclo cardiaco, pero en diferentes períodos. Utilice la siguiente ecuación desarrollada para encontrar el período:
      Equation 1(1)
      donde D es la función de coste utilizada para el montaje de una hipótesis del período, m la imagen capturada, τ' el tiempo la imagen fue capturada, zk el índice de la dirección z de la imagen, xm es la Vector de los índices del pixel, y T' es la hipótesis de periódicos.
    3. Utilice la siguiente ecuación para encontrar el desplazamiento relativo entre dos imágenes en etapas similares:
      Equation 2(2)
      donde Qk', k denota una función de costo para el cambio relativo, R es la vecindad espacial posible, L es el tiempo total de la captura de la imagen, x es la z pixel índice, zk y k' son los cortes de primera y segunda de la dirección de z, t es el tiempo, y s es la hipótesis de cambio relativo.
    4. Convertir el cambio relativo a cambio absoluto con respecto a la primera imagen y resolver la ecuación lineal que utilizan el enfoque pseudo inverso, para encontrar la relación absoluta para alinear la siguiente sección de imágenes como se describió anteriormente27.
    5. Las imágenes 4-D finales se procesaron utilizando el software de procesamiento de imagen (Tabla de materiales).
      1. Apilar imágenes 2-D en 3-d
        1. Abra un software de procesamiento de imágenes comerciales.
        2. Haga clic en datos abiertos.
        3. Seleccione todas las imágenes que se apilan en 3-d > haga clic en carga.
        4. Añadir en el tamaño del voxel de 0.65 x 0.65 x 1 > haga clic en Aceptar.
        5. Haga clic en el cuadro Vista de reformación para visualizar la imagen 3D.
        6. Haga clic en el cuadro azul slice_1.tiff > seleccione visualización > seleccionar Volren.
        7. Haga clic en Editar > seleccionar Opciones > seleccionar Editar mapa de colores.
        8. Ajustar el color utilizando las casillas en rojo > haga clic en Aceptar.
      2. Conversión de 3D a 4D
        1. Haga clic en "archivo > abrir datos de Series temporales.
        2. Seleccione el TIFF 3D que se acaba de hacer > haga clic en carga.
        3. Entrar en el mismo tamaño de voxel como antes.
        4. Haga clic con el botón derecho el cuadro azul slice_1.tiff > seleccione "Display" > seleccionar Volren.
        5. Haga clic en Editar > seleccionar Opciones > seleccionar Editar mapa de colores. Ajustar el color utilizando las casillas de > haga clic en Aceptar.
        6. Haga clic con el botón derecho Control de Series de tiempo > Movie maker , haga clic en > Pulse el botón Play para ver la película.
        7. Agregar un nombre de archivo, tamaño, velocidad de fotogramas, calidad igual a 1, tipo monoscópicas > haga clic en aplicar
        8. Exportar el vídeo. Abrir el video en un software apropiado.

3. Análisis de qRT-PCR

  1. Pez cebra aislamiento de RNA para cuantificar los ligandos de la muesca, receptores, del corazón y destino expresiones de genes
    1. Sacrificar el pez cebra sometiéndolos a una sobredosis de Metanosulfonato metilato28,29. Utilizando un protocolo descrito previamente de30, el corazón del pez cebra se suprimida y preparado para el aislamiento de RNA.
    2. Aislar el RNA total y sintetizar el cDNA usando el cDNA síntesis kit siguiendo las instrucciones del fabricante.
    3. Diseño de los cebadores PCR de los ligandos de la muesca Jag1, Jag2, Dll4, receptor Notch1by señalización relacionados con genes Nrg1 y ErbB2. Consulte la tabla 3 para los iniciadores que utilizamos.
    4. Añadir los cebadores de paso 3.1.3, el mRNA aislado de paso 3.1.2 y un comercial mastermix a la placa de la polimerización en cadena. Ejecute la qRT-PCR en las temperaturas adecuadas y los tiempos según las enzimas utilizadas. Normalizar los resultados a la α-actina de pez cebra.
      Nota: Se calcula para calcular los niveles de expresión de cada uno de los ligandos, receptores y genes.

4. in vitro de la célula endotelial aórtica humana (HAEC) experimentos

  1. Modelo dinámico de tensión de esquileo
    1. Células en cultivo HAEC con HAEC medios de cultivo. Una vez completamente confluente, exponer las células a flujo laminar y flujo pulsátil de 23 x 10-5 N a razón de 1 Hz durante 24 h.
      1. Calentamiento de EC media/DMEM 10% FBS en un agua de baño durante 20 minutos.
      2. Recuperar las células HAEC de tanque de nitrógeno líquido y coloque el frasco en baño María hasta que se derritan.
      3. Usando una pipeta μL 1.000, eliminar las células descongeladas y poner en un tubo de 15 mL con 3-5 mL de medio. Centrifugue la solución celular 53 x g durante 3 minutos.
      4. Aspirar la solución de y agregar suficiente medios para un volumen total de 10 mL. Añadir la solución de células a un frasco estéril de T75, tapa el matraz y distribuir las células uniformemente en la parte inferior de la placa.
      5. Marcar el frasco con las iniciales, fecha, tipo de células y número de paso. Incube el frasco a 37 ° C, 5% CO2, hasta que las células son 80% confluente. No olvide cambiar el medio cada 2-3 días.
      6. Usando una bomba comercial, acople el tubo al matraz y establecer los parámetros mencionados en el paso 4.1.131,32,33.
    2. Añadir a GI254023X a 50 mL de medio de HAEC a una concentración final de 5 μM por 30 min.
    3. Con el GI254023X premezclado ADAM10 inhibidor que suprime la muesca señalización, realizar el mismo flujo laminar o flujo pulsátil experimentos como en 4.1.1.
    4. Cuantificar los ligandos de la muesca (Jag1, Jag2 y Dll4) y genes de la blanco de muesca (peludo y potenciador de split [Hes]) mediante qRT-PCR para cuatro grupos de muestras HAEC (flujo laminar, flujo laminar + GI254023X, flujo pulsátil, flujo pulsátil + GI254023X) se ha descrito anteriormente32.

5. rescate y sobreexpresión de la señalización de Notch

  1. Inyectar 1 nL del mRNA Nrg1 preparado a una concentración de 5 pg/nL (del paso 1.1.6) en la etapa de 1 a 4 células con la gata1a MO para sobreexpresar muesca target genes24.
  2. Inyectar 1 nL del mRNA Nrg1 en wea mutante en forma similar24.
  3. Doble de la concentración de mRNA Nrg1 (10 pg/nL) e inyectar24 1 nL en pez cebra para observar la morfología ventricular.
  4. Inyectar 1 nL de los 20 pg/nL de EPO mRNA6 en los embriones de pez cebra en la etapa de 1 a 4 células para aumentar la hematopoyesis para WSS ventricular previamente mostrado24.
  5. Inyectar 1 nL de Isoproterenol de 50 μM7, que aumenta el índice de contractilidad, al medio del E3 para 24 h mientras el pez cebra se cultivan como anteriormente se indica24.
  6. Realizar la proyección de imagen de LSFM 4-D para cada grupo. Siga las instrucciones en pasos 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. cuantificación del acortamiento fraccional y el volumen de cambio con el tiempo

  1. Realizar la proyección de imagen de LSFM 4-D para cada grupo de 50, 75 y 100 hpf. Siga las instrucciones en pasos 2.1.1-2.1.5.2.8. Dividir cada imagen por lo que cada uno tiene 600 nodos para la replicación de la propuesta de la pared cardiaca.
  2. Medir el cambio en el diámetro del ventrículo durante la diástole y la sístole con la siguiente fórmula:
    Equation 3(3)
    Carga de imágenes 3-d ventriculares en cada 0.1 s con software de visualización y medir el volumen.
  3. Parcela el cambio de volumen con el tiempo para cada grupo experimental 75 hpf y 100 hpf.

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Representative Results

LSFM fue utilizado en este manuscrito para adquirir 2-D y 3-d imágenes de alta resolución. Como se ve en la figura 1A y 1B, el lente de la iluminación indica la ficha técnica de iluminación en la muestra. Debido a la delgadez de la ficha técnica de iluminación, se ilumina solamente un solo plano. El objetivo de la detección es colocada perpendicular a la lente de la iluminación y se centra en el plano iluminado (figura 1B). La hoja de luz de la lente de la iluminación luego escanea la muestra de izquierda a derecha (figura 1). La exploración permite menos blanqueo de foto, Foto-toxicidad y tiene una baja relación señal a ruido.

LSFM que estaba aplicando a los embriones de Tg(cmlc2a:gfp) para visualizar la estructura cardiaca34 rápida exploración (> 30 s) con una resolución de voxel de 0.65 x 0.65 x 1 μm. debido a la iluminación de un solo plano, ruido de fondo fue significativamente reducida (Figura 1). Crestas trabeculares resaltaron en el lumen ventricular 75 hpf y una red trabecular fue demostrado claramente a 100 hpf (figura 2A, B). Gata1a MO micro inyección reduce la hematopoyesis y viscosidad 90%4,35. Esta viscosidad disminuida atenuada hemodinámica tensión de esquileo, dando por resultado una iniciación tardía y la densidad de la red trabecular en 75 hpf y 100 hpf comparado con grupo control (figura 2 C, D). Además, la muesca ligandos (Dll4 Jag1y Jag2), del receptor (Notch1b), y componentes de señalización corriente abajo (Nrg1 y ErbB2) fueron regulados hacia abajo en respuesta a gata1a MO inyección (p < 0.05, n = 5) (figura 2 K)2,8,36. Coinyección de gata1a MO con 5 μM de Nrg1 mRNA regulada hasta muesca relacionadas con señalización de genes y formación trabecular rescatada 75 hpf y 100 hpf (Figura 2E, F, K). Así, gata1a MO redujo las fuerzas hemodinámicas hacia abajo-regulación de la señalización de Notch, mientras que el mRNA Nrg1 rescatar para arriba-regula genes relacionados con la muesca e inició a trabeculación.

Para más lejos probar nuestra hipótesis que cambio hemodinámico y trabeculación vía de señalización Notch, introdujimos a la wea mutante desarrolla un atrio no contráctil37. En la ausencia de flujo de entrada ventricular y fuerzas hemodinámicas durante la sístole atrial, wea mutantes expresan inferior cardiaca niveles de ARNm de genes de componente de señalización Notch y genes diana en comparación con los controles y del puerto no trabeculada, pequeño y débil contratación ventrículos (figura 2, L). Sin embargo, Nrg1 mRNA microinyección en los mutantes de wea arriba regulados por la muesca que se vía, acompañado por el rescate parcial de crestas trabeculares, de señalización hacia un ventrículo contráctil más pronunciado a pesar de un atrio no contráctil ( Figura 2 H, L)2. En este contexto, los mutantes wea corroboran a la relación entre la no-contráctil aurícula y un ventrículo no trabeculada, subrayando la modulación hemodinámica de trabeculación vía de señalización Notch.

Tnnt2a MO fue entregado para detener la contracción cardiaca por inhibición de la troponina cardiaca T38,39. Los peces inyectados MO tnnt2a eran totalmente desprovisto de circulación y WSS ventricular debido a la significativa muesca regula señalización, llevando a una lisa pared ventricular de superficial y fina comparado con grupo control (figura 2I, M) . Para investigar si WSS en el endocardio era un requisito para la trabeculación, también contamos con mutantes de cloche (clo) para la cual endocardio y el revestimiento endotelial del corazón no se desarrollan40,41. El mutante de clo no pudo desarrollar trabéculas cardiacas y mostraron más pequeños tamaño ventrículo y cardiaca incompleta bucle (figura 2J). Así, el revestimiento endocárdico es necesario sentido hemodinámica tensión de esquileo para activar Notch signaling (figura 2 M). Sin embargo, cuando la tensión de esquileo hemodinámica fue aumentada por aumento de la hematopoyesis o tratamiento de isoproterenol para aumentar la contractilidad, no aumentó los niveles de expresión de genes relacionados con la muesca y no cambió la morfología de la red trabecular (Figura 3).

Para demostrar aún más la relación entre esfuerzo cortante y la señalización de Notch, HAECs fueron utilizados para las pruebas en vitro . Un flujo pulsátil se ejerce sobre las células confluentes para simular la tensión de esquileo hemodinámica observada por las células endoteliales. Está demostrado que respecto al estático, cultura pulsátil aumenta la expresión de genes relacionados con la muesca (figura 4). Además, el tratamiento con el inhibidor de ADAM10 redujo significativamente la muesca de señalización (figura 4).

A continuación, se calculó el acortamiento fraccional ventricular y cavidad ventricular cambio en volumen con el tiempo para el tipo salvaje, gata1a MO, AG1478, y los rescataron por Nrg1 grupos de inyección en 50 hpf, 75 hpf y 100 hpf (figura 5A- C) . El tratamiento con ErbB señalización inhibidor, AG1478, significativamente retrasado y reduce acortamiento fraccional durante ventricular diástole 100 hpf (figura 5A). Gata1a MO y AG1478 tratamiento reducen el tamaño de la Cámara ventricular durante la contracción, según lo determinado por los cambios en 4-D LSFM (figura 5E, F). Ambos grupos desarrollaron un mayor volumen telesistólico y - diastólico en comparación con el tipo salvaje. La inyección de mRNA de Nrg1 con gata1a MO había restaurado acortamiento fraccional y fracción de eyección hacia los de tipo salvaje.

Figure 1
Figura 1 : Fluorescente luz Resumen de la hoja. (A) sistema de representante LSFM donde la muestra se coloca en la intersección de la hoja de luz de la lente de la iluminación (IL) y la trayectoria de detección de la lente de la detección (DL). (B) la lente cilíndrica detrás el IL crea el tamaño micrométrico ficha técnica de iluminación (púrpura) dentro de la muestra, que excita una hoja fina de la muestra. El objetivo de la detección registra la señal fluorescente emitida. (C) un esquema de la hoja fina láser (púrpura) seccionar ópticamente el embrión de pez cebra que se mueve de derecha a izquierda. Esta figura ha sido modificada de Lee et al17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Morfologías ventriculares manipularon genéticamente TG(CMLC:GFP) pez cebra con ligando de Notch, receptor y expresión del gen objetivo. (A) la red trabecular se muestra en 75 hpf de pez cebra de control. (B) la red trabecular en 100 hpf de pez cebra de control. (C) inyección de gata1a MO en la etapa de 1 a 4 células mostraron poco o ningún trabeculación 75 hpf. (D) inyección de gata1a MO en pez cebra había retrasado la formación de la red trabecular. (E) coinyección de gata1a MO y mRNA Nrg1 humana parcialmente restaurado trabeculación 75 hpf. (F) coinyección de gata1a MO y mRNA Nrg1 humano restaurado casi por completo la red trabecular en 100 hpf. (G) wea mutante en 100 hpf muestra sin trabeculación y liso de la pared ventricular. (H) inyección de humano Nrg1 en pez cebra mutante wea parcialmente restaurado trabeculación en 100 hpf. (I) inyección de tnnt2a MO no mostró trabeculación 75 hpf (no mostrado) y 100 hpf. (J) CLO mutante no mostró trabeculación en 100 hpf. (K) la inyección de la gata1a MO redujo significativamente la expresión del mRNA de Notch1, Nrg1 y Jag2 (t-test, * P < 0.05, n = 5 vs control). Coinyección de gata1a MO y humano Nrg1 mRNA aumentó significativamente la expresión de Notch1b, Nrg1 y ErbB, Jag1 en comparación con el control. (L) la wea mutante tenía la menor expresión de genes relacionados con la muesca (prueba de t * P < 0.05, n = 5 vs control). Inyección de humano Nrg1 aumentó la expresión de genes relacionados con la muesca; Jag1 y Jag2 fueron significativamente mayores que el control. (M) el tnnt2a MO inyección y clo mutante mostró una menor expresión de genes relacionados con la muesca (prueba de t * P < 0.05, n = 5 vs control). Barras de escala: 50 μm. Datos se presentan como la media desviación estándar. Esta figura ha sido modificada de Lee et al17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Aumento de WSS en manipulado TG(CMLC:GFP) pez cebra con expresión de gene de ligando, el receptor y el destino de muesca en vivo . Aumento de la WSS por sobreexpresión de la hematopoyesis con la inyección de EPO(A) o la adición de ISO (B) vía aumento de la frecuencia cardíaca no aumentó la trabeculación y tenía una red trabecular similar a la del control. (C) la inyección de mRNA de la EPO o Isoproterenol no cambió la expresión de genes de ligando, el receptor o destino de muesca (prueba de t * P < 0.05, n = 5 vs control). Esta figura ha sido modificada de Lee et al17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Células endoteliales sometidos a estrés de cizalla oscilatoria o pulsátil en vitro . HAECs sujeta a la tensión de esquileo pulsátil de τpromedio = 30 x 10-5 N/s a 1 Hz tenía expresiones de genes relacionados con la muesca del alza y regulada de las expresiones de genes relacionados con la muesca cuando se aplicó el inhibidor de ADAM10 (prueba de t * P < 0.05, n = 5 vs control). Esta figura ha sido modificada de Lee et al17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Efecto de trabeculación de fracciones fracción de acortamiento y eyección. (A-C) Además de AG1478 y gata1a MO disminuyeron significativamente el acortamiento fraccional en 100 hpf, pero coinyección de humanos Nrg1 y gata1a MO mejora. (D) inyección de gata1a y AG1478 disminuyeron significativamente el acortamiento fraccional en 100 hpf (prueba de t * P < 0.05, n = 5 vs control). La inyección de gata1a y mRNA Nrg1 mejoró el acortamiento fraccional. (E-F) Integrar el algoritmo de sincronización 4-D con LSFM demostró que AG1478 y gata1a MO habían aumentado los volúmenes sistólico y diastólico final 75 hpf (E) y 100 hpf (F). Datos se presentan como la media desviación estándar. Esta figura ha sido modificada de Lee et al17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Pez cebra Jag1 Hacia adelante CCGCGTATGTTTGAAGGAGTATCAGTCG
Hacia atrás CAGCACGATCCGGGTTTTGTCG
Pez cebra Jag2 Hacia adelante AGCCCTAGCAAAACGAGCGACG
Hacia atrás GCGTGAATGTGCCGTTCGATCAA
Pez cebra Dll4 Hacia adelante CAAAGTGGGAAGCAGACAGAGCTAAGG
Hacia atrás CGGTCATCCCTGGGTGTGCATT
Pez cebra BMP10 Hacia adelante GCATCAAGGGGCCACTCGTGTAGA
Hacia atrás TCGTCTCACTCCACTAGGTCCCATACTG
Pez cebra ErBb2 Hacia adelante GATCAGGACTGCCAAACATTGACGTCT
Hacia atrás AGCAGCACACTGAACATGGCAGCA
Pez cebra Nrg-1 Hacia adelante GTGTGTTTGTCCCTGTGGACGCGT
Hacia atrás CCTCCTGGAGCTTCCCCTCAAACA
Pez cebra Notch1b Hacia adelante CAGAGAGTGGAGGCACAGTGCAATCC
Hacia atrás GCCGTCCCATTCACACTCTGCATT

Tabla 3: Primers utilizados para la detección de pez cebra.

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Discussion

En este protocolo, hemos demostrado que la proyección de imagen 4-D puede utilizarse para rastrear el desarrollo de una red trabecular en respuesta a cambios en las fuerzas biomecánicas. En particular, la tensión de corte experimentado por las células endoteliales inicia la muesca señalización cascada, que a su vez promueve la trabeculación. En este manuscrito, hemos demostrado que (1) gata1a MO inyección disminuyó la hematopoyesis y por lo tanto redujo la tensión de esquileo de la pared, (2) tnnt2a MO inyección inhibe la función contráctil ventricular para reducir la tensión de esquileo de la pared y (3) wea mutantes carecían de la contracción auricular, que entonces disminuyó la fuerza hemodinámica ejercida sobre el ventrículo. Reduciendo el estrés de cizalla en las paredes cardiacas, cuantificó la señalización de Notch mediante qRT-PCR y encontró que con WSS reducida, reducido de señalización Notch. Para más lejos probar nuestra hipótesis, clo mutantes que carecían de endocardio no formó trabéculas, y sometiendo a las células endoteliales a tensión de esquileo pulsátil con ADAM10 presente demostró que tensión de esquileo activa la señalización de Notch.

Las otras técnicas de imagen tales como microscopia confocal pueden utilizarse para muestras de la imagen en 3-d14. Sin embargo, esta técnica y otros tienen muchos inconvenientes. Por ejemplo, la proyección de imagen confocal no puede penetrar profundamente en las muestras, la baja resolución axial y lenta exploración velocidades19,42. Debido al límite de la profundidad de la penetración en proyección de imagen confocal, muestras pequeñas, tales como embriones de pez cebra, sólo pueden ser reflejadas en su totalidad. Dos fotones microscopía confocal mejora la profundidad de la penetración, pero la resolución, velocidad de barrido lento y alto costo que este indeseable técnica13. Se han realizado estudios que combinan la microscopia de dos fotones y LSFM con éxito18, sin embargo, los inconvenientes son aún prominente42.

LSFM, por el contrario, tiene la menos foto-blanqueo y daños13,18,42, velocidad rápida adquisición y de profundidad de penetración similares13. Además, debido a las lentes duales y la excitación de un solo plano (figura 1), el ruido de fondo es sustancialmente reducido43. Sin embargo, las muestras necesitan ser encajado en geles para inmovilizar la muestra, lo que dificulta aplicar a en vivo modelos distintos de pez cebra14,17,19. También, la utilización de luz fluorescente limita la penetración de profundidad a unos pocos milímetros. Aunque LSFM es un gran método para la visualización, es fundamental que se complementa con datos cuantitativos. Porque LSFM es sólo cualitativa, puede ser sujeto a diversas interpretaciones. Mediante qRT-PCR, podemos confirmar que las imágenes de 4D LFSM eran una representación correcta de los hechos ocurridos en las muestras vivas. De vez en cuando en muestras más grandes, rayas y sombras pueden formarse en las imágenes. Sin embargo, la iluminación de doble cara o mSPIM puede ser utilizado para reducir estos artefactos42. Porque LSFM es tan versátil, su capacidad de captura de alta resolución e imágenes en general de mejor calidad hace que el futuro de LSFM prometiendo. Mencionó anteriormente, LSFM puede combinarse con otros sistemas de representación para la exitosa proyección de imagen de18,42.

Hemos demostrado previamente que aplicando una tensión de esquileo pulsátil de 23 x 10-5 N a 1 Hz para 24 h substancialmente upregulates muesca señalización en vitro(figura 4)17. Hemos demostrado además que las fuerzas de corte activan Notch señalización por manipulación genética de la hematopoyesis (gata1a MO)4, contracción cardiaca (tnnt1a MO)5, la contracción atrial (wea mutante), el la eliminación (clo mutante) y localización de la muesca señalización (Tg [flk:mCherry; tp1:gfp]). Describimos aquí a al disminuir la tensión de esquileo de la pared en el ventrículo, que genes relacionados con la muesca fueron regulados hacia abajo (figura 2 K, L, M). Además, hemos podido demostrar que Nrg1 mRNA fue capaz de rescatar trabeculación, restaurar la señalización de Notch y mejorar el acortamiento fraccional ventricular y fracción de eyección (Figura 2E, F, H, K-M, figura 5) . La restauración de la función cardiaca fue demostrada por el incremento contráctiles mediada por la función hemodinámicas fuerzas que activan la muesca de señalización (Figura 2 K- M).

También se determinó que la señalización de Notch activa por el esfuerzo cortante depende del Canal auriculoventricular. Gata1a MO, tnnt2a MO, wea mutante o tratamiento AG1478, trabeculación fue inhibida y muesca de señalización fue regulado hacia abajo (Figura 2 K- M). Sin embargo, Nrg1 rescatado trabeculación y señalización de Notch en mutantes de la wea y cuando inyectó gata1a CO MO (Figura 2D, H, K, L). Cuando aumentaba la tensión de esquileo de la pared (inyección deEPO ) o muesca señalización ( Nrg1 inyección de 10 pg/nL), no hubo cambios en el grupo EPO en términos de morfología y morfogénesis ventricular anormal estaban presente en la Nrg1 mayor dosis (figura 3).

En conclusión, hemos demostrado que la mecanotransducción de tensión de esquileo activa la muesca que se vía de señalización. Aplicando LSFM 4-D y peces cebra transgénicos, hemos desarrollado un nuevo modelo de sistema que muestra la importancia del flujo sanguíneo es durante el desarrollo cardiaco a su morfología, contractilidad y funciones generales.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a William Talbot de la Universidad de Stanford para proporcionar al ser humano Nrg1 cDNA y Deborah Yelon de UCSD para proporcionar la WEA mutantes. Los autores también desean agradecer a Cynthia Chen por ayudar con la adquisición de la imagen. Este estudio fue apoyado por subvenciones de NIH HL118650 (a T.K. Hsiai), HL083015 (a T.K. Hsiai), HD069305 (a Carolina del norte Chi y T.K. Hsiai.), HL111437 (a T.K. Hsiai y Chi de Carolina del norte), HL129727 (a T.K. Hsiai), T32HL007895 (a R.R. Sevag Packard), HL 134613 (a V. Messerschmidt) y Universidad de Texas sistema estrellas financiación (J. Lee).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clontech Hifi PCR pre-mix  Takara  639298 PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N/A Used for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855201 PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+ GE Health Plasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit   Clontech 740609.25 DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase  Clontech 2011A PCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cells Clontech 636763 E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent Life Technologies 11668027 Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kit Invitrogen AM1340 Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820 Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8 GeneTools N/A Software for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA Creative Biogene CDFH006026 Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478 Sigma-Aldrich  T4182 ErbB inhibitor
1.3.1
E3 medium To grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT Sigma-Aldrich  D5942 γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose  Sigma-Aldrich  A9539 Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software FEI Software N/A Visualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  Sigma-Aldrich  886-86-2 Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge Eppendorf 05-400-005 Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023X Sigma-Aldrich  260264-93-5 ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich  I5627 Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLAB Mathworks N/A Cardiac mechanics analysis

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Bioingeniería número 138 microscopía de iluminación plano selectivo señalización de Notch trabeculación hemodinámica pez cebra desarrollo cardíaco tensión de esquileo proyección de imagen de corazón 4-Dimensional mecanobiología corazón microscopía de fluorescencia de luz hoja

Erratum

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 09/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

Microscopía de fluorescencia de la hoja de luz para capturar imágenes de 4 dimensiones de los efectos de la modulación de la tensión de esquileo en el corazón de pez cebra en desarrollo
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Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, … More

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, K. I., Ding, Y., Hsu, J. J., Bryant, R., Li, R., Hsiai, T. K., Lee, J. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (138), e57763, doi:10.3791/57763 (2018).

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