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Bioengineering

Microscopia de fluorescência de luz-folha para capturar imagens 4-Dimensional dos efeitos de modulação de tensão de cisalhamento sobre o coração em desenvolvimento de Zebrafish

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57763
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar desenvolvendo corações no zebrafish em 4 dimensões (4D). Imagem 4-D, através de microscopia de fluorescência de luz-folha (LSFM), tem 3-Dimensional (3D) de imagens ao longo do tempo, para reconstruir corações em desenvolvimento. Nós mostramos qualitativa e quantitativamente que a tensão de cisalhamento ativa endocárdico entalhe sinalização durante o desenvolvimento da câmara, que promove trabeculação cardíaca.

Abstract

As forças hemodinâmicas experimentadas pelo coração influência cardíaca desenvolvimento, especialmente trabeculação, que forma uma rede de Humanisme ramificação do miocárdio. Programa genético defeitos no entalhe sinalização cascata estão envolvidos em defeitos ventriculares como cardiomiopatia de Non-compactação Ventricular Esquerda ou hipoplasia do síndrome do coração esquerdo. Usando este protocolo, que seja determinado que tensão de cisalhamento conduzido trabeculação e sinalização Notch estão relacionados um ao outro. Visualização do desenvolvimento do zebrafish coração usando microscopia de fluorescência de luz-folha, foi possível. Neste manuscrito, apurou-se forças hemodinâmicas modulam a iniciação da trabeculação via de sinalização Notch e, assim, influenciam a função contrátil ocorre. Qualitativa e quantitativa shear stress análise, 4-D (3-D + tempo) imagens foram adquiridas durante a morfogênese cardíaca zebrafish e microscopia de fluorescência de luz-folha integrado com sincronização 4D capturou o movimento ventricular. Viscosidade do sangue foi reduzida através de gata1a- Morpholinos oligonucleotides (MO) microinjeção para diminuir a tensão de cisalhamento, desse modo, para baixo-regulação entalhe atenuantes trabeculação e sinalização. Co injeção de mRNA Nrg1 com gata1a MO resgatados genes relacionados com entalhe para restaurar trabeculação. Para confirmar a tensão de cisalhamento conduzido de sinalização Notch influencia trabeculação, contração de casos mais foi preso através de tnnt2a-MO para reduzir forças hemodinâmicas, desse modo, para baixo-regulação genes-alvo entalhe para desenvolver um não-trabeculada miocárdio. Finalmente, corroboração dos padrões de expressão de genes responsivos-tensão de cisalhamento de entalhe foi conduzida sujeitando células endoteliais de fluxo pulsátil. Assim, a microscopia de luz-folha 4-D descoberto hemodinâmicas forças subjacentes de sinalização Notch e trabeculação com relevância clínica para cardiomiopatia não-compactação.

Introduction

Forças biomecânicas, tais como tensão de cisalhamento hemodinâmica, estão intimamente envolvidas na morfogênese cardíaca. Em resposta a forças de cisalhamento hemodinâmica, sulcos e cristas miocárdica desenvolvem-se em uma rede trabecular ondulatória em alinhamento com a direção da tensão de cisalhamento através da válvula atrioventricular (AV)1. Trabeculação cardíaca é necessária aumentar a função contrátil e massa do miocárdio2. Mutações no entalhe de vias de sinalização resultam em defeitos cardíacos congênitos em seres humanos e outros vertebrados,3. Por exemplo, gata1a4 e tnnt2a5 Morpholinos oligonucleotides (MO) foram mostrados para reduzir a eritropoiese, enquanto eritropoietina (EPO) de mRNA6 e Isoproterenol (ISO)7 aumentam o sangue vermelho células e frequência cardíaca, respectivamente e, portanto, parede tensão de cisalhamento (WSS). Além disso, ErbB2 sinalização, a jusante do entalhe, promove a proliferação de casos e diferenciação para gerar força contrátil, que por sua vez ativa o entalhe sinalização8,9. Sugere-se que a tensão de cisalhamento governa entalhe sinalização trabeculação orientada para o desenvolvimento ventricular. Atualmente, existem muitos estudos que tentam entender melhor os eventos de programação genéticos levando a cardiopatias congênitas defeitos (CHD)10,11,12, mas muito pouco está investigando como forças mecânicas influenciam o formação do coração.

A fim de investigar as forças mecânicas agindo sobre o endocárdio, estreita observação durante o período de desenvolvimento precisa ser implementada. No entanto, é desafiador para obter imagens de boa qualidade na vivo batendo amostras devido a inerência de microscopia tradicional13. Fim de observar o desenvolvimento ao longo do tempo dentro de uma amostra, físico de corte e coloração, portanto, precisam ocorrer de14,13,15. Apesar da microscopia confocal é amplamente utilizada para a imagem da estrutura 3-d de amostras14,16, aquisição dos sistemas de imagem, estes ainda é limitada pela velocidades de varredura lentas.

Microscopia de fluorescência de luz-folha (LSFM) é uma técnica de imagem exclusiva que permite a visualização do in vivo eventos dinâmicos com longa distância trabalho13. Esta técnica usa uma microscopia fluorescente luz-folha de opticamente seção uma amostra de17. Devido a iluminação de apenas uma folha fina de luz na amostra, há uma redução na foto-branqueamento e foto toxicidade13,18. O grande campo de visão e de longa distância de trabalho permite grandes amostras de permanecer intacta, como eles são imagem13,14,17. A ampliação baixa permite uma área maior ser fotografada, enquanto a longa distância de trabalho permite amostras mais grossas ser fotografada sem comprometer a relação sinal-ruído. Muitos grupos têm utilizado LSFM a imagem inteira embriões17, cérebro14,18, músculos e corações19 entre outros tecidos, mostrando os diversos tipos de amostras que podem ser fotografadas.

Embora pesquisas anteriores demonstraram força de cisalhamento hemodinâmica reduzida por oclusão as faixas de entrada ou de saída do coração zebrafish, a informação é exclusivamente qualitativa. Isso resulta em um anormal Terceira Secção loop cardíaca diminuída e prejudicada válvula formação20. As imagens LSFM 4-D dar uma nova perspectiva para a maneira que a hemodinâmica distorcer as forças afetam o desenvolvimento do tecido cardíaco. Estas forças mecânicas podem ativar moléculas sinalizadoras de força-sensível e induzir a formação de cumes trabecular. Devido ao aspecto de tempo adicionado de imagem de 4-D, um é capaz de controlar as alterações no desenvolvimento em tempo real, o que poderia levar a novas revelações que tinham passado despercebidas anteriormente. O peixe-zebra é um modelo ideal de imagem porque os cientistas observam-se um animal vertebrado inteiro contra apenas as interações célula-célula. Oxigênio pode também difundir através do embrião inteiro, que permite o desenvolvimento ocorra sem dependendo do sistema vascular, ao contrário, no desenvolvimento dos mamíferos. Mesmo que o coração de zebrafish carece de órgãos pulmonares, que exigem um coração de quatro cavidades, há um grande número de genes cardíacos que são conservadas entre zebrafish e humanos21.

Este manuscrito, descrevemos como usar microscopia de fluorescência de luz-folha imagem as trabéculas em desenvolvimento no zebrafish corações sob várias circunstâncias. Primeiro, injeção de gata1a4 ou tnnt2a5 MOs foram usados para inferior a viscosidade do sangue e, portanto, do WSS. A morfologia do coração foi então gravada. Em um grupo separado de peixe, estamos aumentado o WSS através da administração de EPO mRNA6 ou isoproterenol7 e observados os resultados. Também foi realizado um estudo de célula com taxas de fluxo pulsátil ou oscilatório diferentes. Após cada grupo de imagem, encontramos que a WSS detetada pelo endocárdio através do entalhe trabeculação inicia a sinalização.

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Protocol

Os métodos a seguir foram realizados em conformidade com os protocolos de UTA e UCLA IACUC. Estes grupos experimentais foram usados com transgénicos, Tg(cmlc2:gfp), os mutantes wea (átrio fraco) ou clo (cloche) : (a) tipo-selvagem (WT) controle, (b) gata1a MO e (c) tnnt2a MO injeções (tabela 1).

Modelo Nome Genes modificados Fenótipo Referência
Controle Tipo selvagem Nenhum N/A
TG(cmlc2:GFP) Cadeia leve de miosina cardíaca Flourescence verde especificamente expressado no miocárdio 34
Parede de diminuição da tensão de cisalhamento Mutante do átrio fraco (wea) Cadeia de heacy específicas do átrio miosina Átrio não pode contrair, compactas, ventrículo, átrio de seleção inteiramente, espessura parede miocárdica, lúmen estreito 37
Mutante de Cloche (clo) N/A Remoção completa do endocárdio, unaturally grande átrio com pequeno ventrículo, cushins cardíaca inexistente 41
gata1a MO gata1a  Anemia por falta de células vermelhas do sangue 4
tnnt2a MO tnnt2a 39
Tensão de cisalhamento da parede maior MRNA EPO Nenhum Grave policitemia, aumento do número de células do sangue, em circulação aumentou a viscosidade 6
Isoprotenerol Nenhum Aumento da frequência cardíaco 7

Tabela 1: Descrições de Zebrafish. Definições e descrições de Zebrafish utilizados em experiências.

1. estudo de instalação

  1. Prepare Nrg1 e EPO mRNA para trabeculação resgate.
    1. Obter o cDNA humano Nrg1 e amplificar de um plasmídeo de doador.
      Nota: O cDNA humano Nrg1 era dotado de William Talbot, da Universidade de Stanford.
      1. Tire os reagentes necessários e materiais, nomeadamente PCR mastermix (armazenado em-20 ° C), as primeiras demão (ver tabela 2) (armazenadas em-20 ° C), um prato PCR (armazenada em temperatura ambiente) e uma pipeta de 20 μL (armazenada em temperatura ambiente). Consulte tabela de materiais para os produtos de exemplo.
        Table 2
        Tabela 2: Primers para Nrg1 a clonagem humana.
      2. Prepare o mastermix para cada primeira demão definida em triplicado usando a pipeta de 20 μL. 1 conjunto de triplica, use 37,5 μL do mastermix, 3 μL de água livre de DNA, 4,5 μL de primer. Por mais que triplica, basta multiplica pelo número de amostras.
      3. Dilua a solução de trabalho humano Nrg1 cDNA (20 μg/ng concentração) na faixa de cartilha com água livre de DNA para que haja total por alvéolo por amostra de 10 μL.
        Nota: Certifique-se de que cada solução sob passo 1.1.1 é uniformemente distribuída. Fazer isso através da mistura de cada solução pipetando para cima e para baixo. Para evitar contaminação cruzada, use uma ponta de pipeta para apenas uma amostra.
      4. Alíquota do cDNA Nrg1 com pipeta multicanal 10 μL desejado aos poços da placa de PCR.
      5. Adicione 14.5 μL do mastermix para o cDNA em poços. Aplica uma capa pegajosa para a placa PCR para selar os poços e coloque na máquina de PCR.
      6. Iniciar a máquina PCR e certifique-se de que o ciclo atinge temperaturas adequadas, de acordo com os primers utilizados e enzimas.
    2. Clonagem do cDNA Nrg1 em pCS2 o plasmídeo+ no BamHI e EcoRI sites usando enzimas excesso BamHI e EcoRI para garantir que o cDNA é ligado em todos os plasmídeos.
      1. Misture o cDNA Nrg1 com o doador do plasmídeo pCS2+, mestre comercialmente disponível mistura solução e primers (tabela 2).
        Nota: O volume total de reação deve ser 50 μL com 25 μL de mistura de mestre, 3 μL de primers e 1 μL do plasmídeo de doador 20 ng / µ l com Nrg1 cDNA.
      2. Coloque a mistura da etapa 1.1.2.1 na máquina de PCR e definir os parâmetros para atender as seguintes especificações: 98 ° C por 10 s, 55 ° C, durante 5 ou 15 s e 72 ° C para 5KB/s.
      3. Purifica o produto do PCR usando um kit de purificação, seguindo as instruções do fabricante. Eluir o produto em 50 μL de tampão de eluição.
      4. Digerir o produto do PCR purificado e 5 μg de pCS2+ com BamHI e EcoRI separadamente a 37 ° C, durante 2 h em um volume de reação de 200 μL. Purificar a digestão resultante com um kit comercial e eluir em 20 μL e 100 μL de Tris-HCl (pH 8,5), respectivamente.
      5. Ligate 4 μL de cDNA Nrg1 e 2 μL do digerido pCS2+ plasmídeo em 25 μL reação com 1 μL de um catalisador de ligase a 16 ° C durante a noite.
        Nota: O procedimento pode ser parado aqui para incubação durante a noite.
      6. Use 2 μL da solução de ligadura da etapa 1.1.2.5 e transformar em 50 μL de células de bactérias Escherichia coli apropriadas para clonagem (ver Tabela de materiais).
    3. Confirme que a transformação ocorreu por triagem que NRG1 cDNA clones usando PCR. Escolha de clones de forma aleatória e adicionar a uma solução de trifosfatos dNTP (dNTPs), polimerase e primers específicos.
      Nota: Os controles foram o vector (pCS2+) com e sem a inserção (cDNA humano). Não muito grande de uma colónia porque bactérias excessivas podem inibir o PCR.
      1. Escolher 8 colônias da transformação e tela pCS2+-Nrg1 clones usando as primeiras demão do PCR da tabela 2.
      2. Cultura um clone com cDNA Nrg1 para isolar o pCS2+-Nrg1 plasmídeo. Inocular com 100 μL de bactéria e. coli com pCS2+-Nrg1 plasmídeo em 100 mL de LB mídia e cultura agitando (160-225 RPM) a 37 ° C.
    4. Transfect purificado pCS2+-Nrg1 plasmídeo em HEK-293 células em uma placa de 6 usando um reagente de transfeccao comercial seguindo as instruções do fabricante.
    5. 24 h após a transfeccao, lisar as células com um tampão de Lise e executado através de um gel de SDS-PAGE, transferir para uma membrana de gel e então mancha com anti-Nrg1 anticorpo22. Verifique se a expressão de proteínas Nrg1 usando um Western Blot.
      Nota: O controle é um vazio pCS2+ plasmídeo. Pode ser pausado aqui se gel membrana transferência ocorre durante a noite.
    6. Sintetizar o mRNA Nrg1 usando um produto comercial similar na Tabela de materiais e siga as instruções do fabricante.
      1. Leve 5 μL do pCS2+-Nrg1 DNA da cultura de bactérias isoladas e digerir com NotI em uma reação de 200 μL de 2 h a 37 ° C para linearizar o plasmídeo.
      2. Purificar o plasmídeo linear com um kit comercial e eluir em 20 μL de Tris-HCl (pH 8,5).
      3. Conduta em vitro transcrição com um kit comercial de isolamento de RNA em uma reação de 20 μL usando 5 μL do plasmídeo linear, seguindo as instruções do fabricante.
      4. Adicione que o em vitro transcritas Nrg1 para 350 μL de tampão de lise de RNA e depois purificar com um kit de isolamento de RNA. Eluir o RNA em 60 μL de Tris-HCl (pH 8,5).
      5. Medir a concentração de RNA e armazenar a-80 ° C para uso futuro.
    7. Siga os passos 1.1.6.1 - 1.1.6.5 acima para o EPO do cDNA e preparação de mRNA mas clone do cDNA no plasmídeo pCS2 + EcoRI e XhoI sites em vez disso.
  2. Injetar Morpholinos zebrafish
    1. Projeto23 as injeções de MO, utilizando uma ferramenta online (Tabela de materiais) contra a sequência ATG de gata1a4 (5 '-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3 ') e tnnt2a5 (5 '-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3 ').
    2. Adicione o gata1a e tnnt2a MO separadamente à água nuclease-livre para fazer as concentrações finais de 8 ng/nL e 4 ng/nL, respectivamente. Repita com EPO mRNA com uma concentração final de 20 pg/nL. Certifique-se de que o volume final é de 1 mL.
    3. Injectar 1 nL da 8 ng/nL de gata1a MO e 1 nL da 4 ng/nL de tnnt2a MO em embriões de zebrafish separado no 1 para o estágio de 4 células para reduzir a tensão de cisalhamento (WSS) de parede ventricular24. Para aumentar o WSS, injetar 1 nL de 20 pg/nL de EPO mRNA6 nos zebrafish embriões na fase de 1 a 4-células.
  3. Tratar quimicamente zebrafish para inibir trabeculação
    1. Utilizando uma pipeta de 20 mL, diluir a 10 mg/mL AG1478 em 1% DMSO E3 médio e uma concentração final de 5 μM 30 hpf em um tubo de 15 mL. Como um controle, trate cada peixe com 1% DMSO somente.
    2. Adicionar o éster de N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t-butílico (DAPT) em 1% DMSO (100 μM) a E3 médio em um tubo de 15 mL para inibir a sinalização de entalhe em 40 hpf em uma forma similar. Como um controle, trate com apenas 1% de DMSO.

2. técnicas de imagem

  1. 4-D LSFM cardíaca Imaging com algoritmo de sincronização
    1. 2-D imagens do embrião peixe inteiro assuma múltiplas cardíaco batendo ciclos usando as etapas abaixo (Figura 1). Certifique-se de que a luz-folha de espessura é aproximadamente 5 μm. Leve 1 μm para amostragem digital sem perdas de acordo com a amostragem de Nyquist princípio25500 frames x-y com um tempo de exposição de 10 ms. conjunto a varredura-z.
      1. Crie um gel de agarose 1% (p/v), adicionar 1 g de agarose a 100 mL e aquecê-lo até que todos os agarose é dissolvido. Carregar um pequeno tubo de plástico com o embrião e agarose utilizando uma pipeta de 20 μL e fixá-lo no palco.
      2. Abra a imagem de software de visualização e clique em Live para ver a exibição ao vivo da amostra. Ajuste o objetivo usando o botão de modo que a amostra está em foco. Da mesma forma, mova o palco para a exibição ao vivo da amostra mostra a parte superior do embrião.
      3. Tirar fotos 500 vezes para 5 s na ampliação de 10x usando software26 do microscópio.
      4. Palco usando o motor para uma nova camada (1 μm no eixo z) e repita o procedimento da imagem latente.
      5. Repita 2 passos acima até que todo o coração é totalmente fotografado.
    2. Garantir a integridade dos dados por desrespeitar as imagens do primeiro e último ciclo cardíaco. Encontre o período do ciclo cardíaco combinando imagens que foram tiradas no mesmo tempo ponto no ciclo cardíaco, mas em períodos diferentes. Use a seguinte equação foi desenvolvida para encontrar o período:
      Equation 1(1)
      onde D é a função de custo utilizada para a montagem de uma hipótese de período, eum a imagem capturada, τ» o tempo que a imagem foi capturada, zk o índice z-direção da imagem, xm é o vetor do índice de pixel, e T' é a hipótese de periódica.
    3. Use a seguinte equação para encontrar o deslocamento relativo entre duas fotos em estágios semelhantes:
      Equation 2(2)
      onde Qk', k denota uma função de custo para o deslocamento relativo, R é a vizinhança espacial possível, L é o tempo total de capturar a imagem, x é o pixel índice, zk e zk' são as fatias de primeira e segunda direção-z, t é o tempo e s é a hipótese de deslocamento relativo.
    4. Converter a mudança relativa a mudança absoluta no que diz respeito a primeira imagem e resolver a equação linear usando a abordagem pseudo inversa, para encontrar a relação absoluta para alinhar a próxima seção de imagens, como descrito anteriormente,27.
    5. As imagens finais de 4-D foram processadas usando o software de processamento de imagem (Tabela de materiais).
      1. Empilhamento de imagens 2D em 3D
        1. Abra uma software de processamento de imagem comercial.
        2. Clique em dados abertos.
        3. Selecione todas as imagens para ser empilhada em 3-d > clique em Load.
        4. Adicione o tamanho de voxel de 0,65 x 0,65 x 1 > clique Okey.
        5. Clique na caixa de Visualização Multi-Planar para visualizar a imagem em 3D.
        6. Botão direito do mouse a caixa azul slice_1.tiff > selecione Exibir > Selecionar Volren.
        7. Clique em Editar > Selecionar Opções > selecione Editar Colormap.
        8. Ajustar a cor, usando as caixas delineadas em vermelho > clique Okey.
      2. Conversão de 3-d 4-d
        1. Clique em "arquivo > abrir dados de série temporal.
        2. Selecione o tiffs 3D que só foram feito > clique em Load.
        3. Insira o mesmo tamanho de voxel como antes.
        4. Direita-estale a caixa azul slice_1.tiff > selecione "Exibir" > selecione Volren.
        5. Clique em Editar > Selecionar Opções > selecione Editar Colormap. Ajustar a cor, usando as caixas > clique Okey.
        6. Controle de série de tempo de clique direito > clique em Movie maker > pressione o botão Play para assistir ao filme.
        7. Adicionar um nome de arquivo, tamanho do quadro, taxa de quadros, qualidade igual a 1, digite Monoscopic > clique em aplicar
        8. Exporte o vídeo. Abra o vídeo em um software apropriado.

3. análise qRT-PCR

  1. Zebrafish isolamento de RNA para quantificar ligantes Notch, receptores, de coração e expressões dos genes-alvo
    1. Sacrifica o zebrafish submetendo-os a uma overdose de tricaina metilato28,29. Usando um protocolo descrito anteriormente30, os zebrafish corações foram extirpados e preparados para isolamento de RNA.
    2. Isolar o RNA total e sintetizar o cDNA usando o kit de síntese do cDNA seguindo as instruções do fabricante.
    3. Desenha os primers PCR para os ligantes Notch Jag1, Jag2, Dll4, receptor Notch1be sinalização relacionados genes Nrg1 e ErbB2. Consulte a tabela 3 para os primers que usamos.
    4. Adicione os primers da etapa 3.1.3, o mRNA isolado da etapa 3.1.2 e mastermix um comercial para a chapa de PCR. Execute o qRT-PCR nos tempos de acordo com as enzimas usadas e temperaturas adequadas. Normalize os resultados de zebrafish α-actina.
      Nota: Isto irá calcular os níveis de expressão para cada um dos ligantes, receptores e genes.

4. in vitro as experiências humanas de célula endotelial da aorta (HAEC)

  1. Modelo tensão de cisalhamento dinâmico
    1. Células de cultura HAEC com HAEC meios de cultura. Uma vez totalmente confluente, expor as células de fluxo laminar e fluxo pulsátil de 23 x 10-5 N à taxa de 1 Hz para 24h.
      1. Aquecer a CE mídia/DMEM 10% FBS em uma água de banho por 20 min.
      2. Recuperar células HAEC do tanque de nitrogênio líquido e coloque o frasco em banho-maria até derreter.
      3. Usando uma pipeta μL 1.000, remover as células descongeladas e colocá-los em um tubo de 15 mL com 3-5 mL de mídia. Centrifugue a solução de célula a 53 x g, durante 3 min.
      4. Aspirar a solução fora e adicionar suficiente mídia para um volume total de 10 mL. Adicionar a solução de célula para um balão de T75 estéril, tampa do frasco e distribuir as células uniformemente na parte inferior da placa.
      5. Marca o balão com as iniciais, data, tipo de célula e número de passagem. Incube o frasco a 37 ° C, 5% de CO2, até que as células são 80% de Confluencia. Lembre-se de mudar os meios de comunicação a cada 2-3 dias.
      6. Usando uma bomba comercial, anexar a tubulação para o balão e definir os parâmetros acima mencionados na etapa 4.1.131,32,33.
    2. Adicione GI254023X para 50 mL de meio HAEC em uma concentração final de 5 μM por 30 min.
    3. Com a pré-mistura GI254023X, um inibidor de ADAM10 que suprime o entalhe, sinalização, realizar o mesmo fluxo laminar ou experimentos de fluxo pulsátil como em 4.1.1.
    4. Quantificar ligantes Notch (Jag1, Jag2 e Dll4) e genes-alvo Notch (peludo e potenciador de split [Hes]) usando qRT-PCR para quatro grupos de amostras HAEC (fluxo laminar, fluxo laminar + GI254023X, fluxo pulsátil, fluxo pulsátil + GI254023X) descrita anteriormente,32.

5. resgate e sobre-expressão de sinalização Notch

  1. Injectar 1 nL do mRNA Nrg1 preparada na concentração de 5 pg/nL (da etapa 1.1.6) na fase 1 - a 4-célula com o gata1a MO fim overexpress entalhe de genes alvo24.
  2. Injectar 1 nL do mRNA Nrg1 em wea mutantes em um semelhante caminho24.
  3. Dobro da concentração de mRNA Nrg1 (10 pg/nL) e injetar24 1 nL em zebrafish para observar a morfologia ventricular.
  4. Injectar 1 nL da 20 pg/nL de EPO mRNA6 para os embriões de zebrafish na fase 1 - a 4-célula para aumentar a hematopoiese para aumentar ventricular do WSS, como anteriormente mostrado24.
  5. Injectar 1 nL dos 50 μM Isoproterenol7, que aumenta a taxa de contratilidade, para o meio de E3 para 24h enquanto zebrafish são cultivadas como mostrada anteriormente24.
  6. Execute a imagem latente de LSFM 4-D para cada grupo. Siga as instruções em passos 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. quantificação de encurtamento fracionário e volume mudança ao longo do tempo

  1. Executar a imagem latente de LSFM 4-D para cada grupo de 50, 75 e 100 hpf. Siga as instruções em passos 2.1.1-2.1.5.2.8. Divida cada imagem para que cada um tem 600 nós para replicação do movimento da parede cardíaca.
  2. Medir a mudança de diâmetro do ventrículo durante a diástole e sístole usando a seguinte fórmula:
    Equation 3(3)
    Carregar imagens ventriculares em 3D a cada 0.1 s com software de visualização e medir o volume.
  3. Plotar a alteração de volume ao longo do tempo para cada grupo experimental em 75 hpf e 100 hpf.

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Representative Results

LSFM foi usado neste manuscrito para adquirir imagens 2D e 3D de alta resolução. Como visto na figura 1A e 1B, a lente de iluminação direciona a folha de luz na amostra. Por causa da magreza da folha de luz, apenas um único avião é iluminado. A lente é posicionada perpendicular para a lente da iluminação e é focado no avião iluminado (figura 1B). A folha de luz da lente de iluminação, em seguida, examina a amostra da esquerda para a direita (Figura 1). A digitalização permite menos toxicidade-foto foto-branqueamento e tem uma baixa relação sinal-ruído.

LSFM foi aplicada aos embriões de Tg(cmlc2a:gfp) para visualizar a toda estrutura cardíaca34 por rápida digitalização (> 30 s) com uma resolução de voxel de 0,65 x 0,65 x 1 µm. devido a uma iluminação de nenhum avião, ruído de fundo foi significativamente reduzida (Figura 1). Trabecular cumes se projetava no lúmen ventricular em 75 hpf e uma rede trabecular foi mostrado claramente em 100 hpf (Figura 2A, B). Gata1a MO a microinjecção diminuído hematopoiese e viscosidade 90%4,35. Esta diminuição da viscosidade atenuadas hemodinâmica tensão de cisalhamento, resultando em um atraso de iniciação e densidade da rede trabecular em 75 hpf e 100 hpf quando comparado ao grupo controle (Figura 2, C, D). Além disso, a fenda ligantes (Dll4, Jag1e Jag2), do receptor (Notch1b), e componentes de sinalização downstream (Nrg1 e ErbB2) foram para baixo-regulado em resposta a gata1a MO injeção (p < 0,05, n = 5) (Figura 2 K)2,8,36. Injeção de co de gata1a MO com 5 μM de mRNA Nrg1 acima-regulada entalhe expressão dos genes relacionados com a sinalização e formação trabecular resgatada em 75 hpf e 100 hpf (Figura 2E, F, K). Assim, gata1a MO reduzido forças hemodinâmicas levando para baixo-regulamento de sinalização Notch, Considerando que o Nrg1 mRNA resgatar acima-regulada genes relacionados com entalhe e re-iniciado trabeculação.

Para provar ainda mais a nossa hipótese de que a alteração hemodinâmica forças e, portanto, trabeculação via de sinalização Notch, introduzimos o mutante wea , que se desenvolve um átrio não-contrátil37. Na ausência de influxo ventricular e forças hemodinâmicas durante a sístole atrial, wea mutantes expressam níveis mais baixos de mRNA cardíaca de entalhe sinalização genes de componente e genes-alvo em comparação aos controles e do porto não-trabeculada, pequena e fraca contratantes ventrículos (Figura 2, L). No entanto, microinjecção Nrg1 mRNA nos mutantes wea acima-regulada no entalhe sinalização percurso, acompanhado o resgate parcial de cristas trabecular, levando a um ventrículo contrátil mais pronunciado, apesar de um não-contrátil do átrio ( Figura 2 H, L)2. Neste contexto, os mutantes wea corroboram a relação entre o não-contráteis átrio e um ventrículo não-trabeculada, ressaltando a modulação hemodinâmica da trabeculação via de sinalização Notch.

Tnnt2a MO foi entregue para parar a contração cardíaca, inibindo a troponina cardíaca T38,39. Os tnnt2a MO-injetado peixes foram completamente desprovido de circulação e WSS ventricular devido a significativa entalhe para baixo-regulado sinalização, levando a uma suave superfície e fina parede ventricular quando comparado ao grupo controle (Figura 2I, M) . Para investigar se o WSS no endocárdio era uma exigência para trabeculação, temos também os mutantes cloche (clo), para o qual endocárdio e o revestimento endotelial do coração não desenvolvem40,,41. O mutante de clo não conseguiu desenvolver trabéculas cardíacas e mostrou menor porte ventrículo e cardíaco incompleto loop (Figura 2J). Assim, o forro endocárdico é necessário sentido hemodinâmica tensão de cisalhamento para ativar o entalhe de sinalização (Figura 2 M). No entanto, quando a tensão de cisalhamento a hemodinâmica foi aumentada pelo aumento da hematopoiese ou tratamento de isoproterenol para aumentar a contratilidade, não aumentar os níveis de expressão de genes relacionados com entalhe, e a morfologia da rede trabecular não muda (Figura 3).

Para demonstrar ainda mais a relação entre a tensão de cisalhamento e sinalização Notch, HAECs foram usados para testes in vitro . Um fluxo pulsátil foi exercido sobre confluentes para simular a tensão de cisalhamento hemodinâmica observada por células endoteliais. É mostrado que a cultura em relação ao estático, pulsátil aumenta a expressão de genes relacionados ao entalhe (Figura 4). Além disso, o tratamento com o inibidor de ADAM10 reduziu significativamente o entalhe de sinalização (Figura 4).

Em seguida, calculamos o encurtamento fracional ventricular e alteração da cavidade ventricular no volume ao longo do tempo para o selvagem-tipo, gata1a MO, AG1478, e aqueles resgataram por grupos de injeção Nrg1 50 hpf, 75 hpf e 100 hpf (Figura 5A- C) . Tratamento com ErbB sinalização inibidor, AG1478, significativamente atrasado e reduzido o encurtamento fracional durante a diástole ventricular em 100 hpf (Figura 5A). Ambos gata1a MO e tratamento AG1478 câmara ventricular tamanho reduziram durante a contração, avaliada pelas mudanças em 4-D LSFM (Figura 5E, F). Ambos os grupos desenvolveram um volume sistólico final e - diastólico aumentado quando comparado com o selvagem-tipo. Co injeção de mRNA Nrg1 com gata1a MO restaurada tanto encurtamento fracionário e fração de ejeção para com aqueles do tipo selvagem.

Figure 1
Figura 1 : Fluorescente luz visão geral da folha. (A) sistema LSFM representante onde a amostra é colocada na interseção da folha de luz da lente de iluminação (IL) e o caminho de deteção da lente deteção (DL). (B) a lente cilíndrica para trás o IL cria a micro-empresas folha de luz (roxa) dentro da amostra, que excita uma folha fina de amostra. A lente registra o sinal fluorescente emitido. (C) um esquema de folha fina do laser (roxo) opticamente, seccionando o embrião de zebrafish que move-se bem para a esquerda. Esta figura foi modificada de Lee et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Morfologias ventriculares de manipularam geneticamente TG(cmlc:GFP) zebrafish com Notch ligante, receptores e expressão do gene alvo. (A) a rede trabecular é mostrada em 75 hpf de controle zebrafish. (B) a rede trabecular em 100 hpf de controle zebrafish. (C) injeção de gata1a MO na fase 1 - a 4-célula mostrou pouca ou nenhuma trabeculação em 75 hpf. (D) injeção de gata1a MO em zebrafish tinha atrasado a formação da rede trabecular. (E) co injeção de gata1a MO e humano do mRNA Nrg1 parcialmente restaurado trabeculação em 75 hpf. (F) co injeção de gata1a MO e humano do mRNA Nrg1 quase completamente restaurada, a rede trabecular em 100 hpf. (G) wea mutante em 100 hpf mostra nenhum trabeculação e uma parede lisa ventricular. (H) injeção de humano Nrg1 no zebrafish mutante wea parcialmente restaurado trabeculação em 100 hpf. (I) injeção de tnnt2a MO não mostrou nenhum trabeculação em 75 hpf (não mostrado) e 100 hpf. (J) CLO mutante não mostrou nenhum trabeculação em 100 hpf. (K) injeção do gata1a MO reduziu significativamente a expressão de RNAm de Notch1, Nrg1 e Jag2 (teste-t, * P < 0.05, n = 5 vs controle). Co injeção de gata1a MO e humano Nrg1 mRNA aumentou significativamente a expressão de Notch1b, Nrg1, ErbB e Jag1 comparado ao controle. (L) o mutante wea tinha a expressão significativamente menor de genes relacionados ao entalhe (teste-t, * P < 0.05, n = 5 vs controle). Injeção de humano Nrg1 aumentou a expressão de genes relacionados ao entalhe; Jag1 e Jag2 foram significativamente maiores do que controle. (M) o mutante de injeção e clo tnnt2a MO mostrou uma expressão significativamente menor de genes relacionados ao entalhe (teste-t, * P < 0.05, n = 5 vs controle). Barras de escala: 50 μm. Dados são mostrados como o desvio padrão da médio. Esta figura foi modificada de Lee et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Aumento do WSS no manipulado TG(cmlc:GFP) zebrafish com expressão de gene Notch ligante, o receptor e o destino na vivo . Aumentar o WSS através de sobre-expressão da hematopoiese com a injeção de EPO(A) ou adição de ISO (B) através do aumento da frequência cardíaca não aumentar trabeculação e tinha uma rede trabecular semelhante do controle. (C) a injeção de mRNA EPO ou Isoproterenol não alterou a expressão de genes de ligante, o receptor ou alvo de entalhe (teste-t, * P < 0.05, n = 5 vs controle). Esta figura foi modificada de Lee et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Células endoteliais sujeitos a tensão de cisalhamento oscilatório ou pulsátil em vitro . HAECs sujeito a tensão de cisalhamento pulsátil demédia τ = 30 x 10-5 n/s a 1 Hz tinha expressões de genes relacionados com entalhe upregulated e ativador de expressões relacionadas com entalhe gene quando o inibidor de ADAM10 foi aplicado (teste-t, * P < 0.05, n = 5 vs. controle). Esta figura foi modificada de Lee et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Efeito da trabeculação da fração de encurtamento e ejeção fracionária. (A-C) Adição de AG1478 e gata1a MO diminuiu significativamente o encurtamento fracional em 100 hpf, mas co injeção de humano Nrg1 e gata1a MO melhorou. Injeção de gata1a (D) e AG1478 diminuíram significativamente o encurtamento fracional em 100 hpf (teste-t, * P < 0.05, n = 5 vs controle). Co injeção de gata1a e mRNA Nrg1 melhorou o encurtamento fracional. (E-F) Integrar o algoritmo de sincronização de 4-D com LSFM mostrou que a AG1478 e gata1a MO tinham aumentado volumes sistólico e diastólico final 75 hpf (E) e 100 hpf (F). Dados são mostrados como o desvio padrão da médio. Esta figura foi modificada de Lee et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Zebrafish Jag1 Para a frente CCGCGTATGTTTGAAGGAGTATCAGTCG
Para trás CAGCACGATCCGGGTTTTGTCG
Jag2 de zebrafish Para a frente AGCCCTAGCAAAACGAGCGACG
Para trás GCGTGAATGTGCCGTTCGATCAA
Dll4 de zebrafish Para a frente CAAAGTGGGAAGCAGACAGAGCTAAGG
Para trás CGGTCATCCCTGGGTGTGCATT
BMP10 de zebrafish Para a frente GCATCAAGGGGCCACTCGTGTAGA
Para trás TCGTCTCACTCCACTAGGTCCCATACTG
zebrafish ErBb2 Para a frente GATCAGGACTGCCAAACATTGACGTCT
Para trás AGCAGCACACTGAACATGGCAGCA
Zebrafish Nrg-1 Para a frente GTGTGTTTGTCCCTGTGGACGCGT
Para trás CCTCCTGGAGCTTCCCCTCAAACA
Notch1b de zebrafish Para a frente CAGAGAGTGGAGGCACAGTGCAATCC
Para trás GCCGTCCCATTCACACTCTGCATT

Tabela 3: Primers utilizados para triagem de Zebrafish.

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Discussion

Neste protocolo, mostramos que a imagem 4-D pode ser usada para controlar o desenvolvimento de uma rede trabecular em resposta às mudanças nas forças biomecânicas. Em particular, a tensão de cisalhamento experientes por células endoteliais inicia o entalhe em cascata, que por sua vez, promove trabeculação de sinalização. Neste manuscrito, mostramos que injeção de gata1a MO (1) diminuição da hematopoiese e, portanto, reduziu a tensão de cisalhamento da parede, injeção de tnnt2a MO (2) inibiu a função contrátil ventricular para reduzir a tensão de cisalhamento da parede e wea (3) mutantes carecia de contração atrial, que então diminuiu a hemodinâmica força aplicada para o ventrículo. Ao reduzir a tensão de cisalhamento nas paredes cardíacas, nós quantificada a sinalização Notch através de qRT-PCR e encontrado com o WSS reduzido, foi reduzido de sinalização Notch. Para provar ainda mais nossa hipótese, clo mutantes que faltava endocárdio não formou trabéculas, e submetendo-as células endoteliais a tensão de cisalhamento pulsátil com ADAM10 presente mostrou que aquela tensão de cisalhamento ativa de sinalização Notch.

As outras técnicas de imagem, tais como a microscopia confocal podem ser usado para as amostras de imagem em 3-d14. No entanto, esta técnica e outros têm muitas desvantagens. Por exemplo, a imagem latente confocal não pode penetrar profundamente em amostras, tem a baixa resolução axial e lenta velocidade digitalização19,42. Por causa do limite de profundidade de penetração na imagem latente confocal, pequenas amostras, como embriões de peixe-zebra, só podem ser fotografadas em sua totalidade. Microscopia confocal dois fotões melhora a profundidade de penetração, mas a resolução, velocidade de varredura lenta e alto custo de fazer esta técnica indesejáveis13. Há estudos que combinam dois fotões microscopia e LSFM com sucesso18, no entanto, as desvantagens são ainda proeminente42.

LSFM, por outro lado, tem o menos foto-branqueamento e danos13,18,42, velocidade rápida aquisição e de profundidade de penetração similares13. Além disso, por causa das lentes duas e excitação de um único plano (Figura 1), o ruído de fundo é substancialmente reduzida43. No entanto, as amostras precisam ser incorporado em géis para imobilizar a amostra, o que torna difícil aplicar em vivo modelos diferente de zebrafish14,17,19. Também, a utilização da luz fluorescente limita a penetração de profundidade de alguns milímetros. Mesmo que o LSFM é um ótimo método para visualização, é fundamental que ela é complementada com dados quantitativos. Porque LSFM é apenas qualitativa, pode ser sujeito a várias interpretações. Usando o qRT-PCR, confirmamos que as imagens de 4-D LFSM eram uma representação correta dos eventos ocorridos nas amostras ao vivo. Ocasionalmente em amostras maiores, listras e sombras podem formar nas imagens. No entanto, duas faces de iluminação ou mSPIM pode ser utilizada para reduzir esses artefatos42. Porque LSFM é tão versátil, sua capacidade de captura de alta resolução e imagens em geral melhor qualidade faz com que o futuro do LSFM promissor. Mencionado anteriormente, o LSFM pode ser combinado com outros sistemas de imagem para a bem sucedida de imagens18,42.

Demonstramos anteriormente que aplicando uma tensão de cisalhamento pulsátil de 23 x 10-5 N a 1 Hz para 24h substancialmente upregulates a fenda sinalização em vitro(Figura 4)17. Temos ainda mais demonstrado que as forças de cisalhamento ativar entalhe sinalização por manipulação genética de hematopoiese (gata1a MO)4, contração cardíaca (tnnt1a MO)5, contração atrial (wea mutante), endocárdico exclusão (clo mutante) e localização de entalhe de sinalização (Tg [flk:mCherry; tp1:gfp]). Descrevemos aqui que diminuindo a tensão de cisalhamento da parede no ventrículo, que genes relacionados com entalhe foram para baixo-regulado (Figura 2, K, L, M). Além disso, fomos capazes de demonstrar que o Nrg1 mRNA foi capaz de resgatar trabeculação, restaurar a sinalização Notch e melhorar o encurtamento fracional ventricular e fração de ejeção (Figura 2E, F, H, K-M, Figura 5) . A restauração da função cardíaca foi mostrada pelo aumento contrátil forças hemodinâmicas mediada por função que ativou o entalhe de sinalização (Figura 2 K- M).

Nós também determinou que a sinalização Notch ativado por tensão de cisalhamento é dependente de endocárdico. Usando o gata1a MO, tnnt2a MO, wea mutante ou AG1478 tratamento, trabeculação foi inibida e sinalização Notch foi para baixo-regulado (Figura 2-K- M). No entanto, Nrg1 resgatados trabeculação e entalhe sinalização na wea mutantes e quando co injetado com gata1a MO (Figura 2D, H, K, L). Quando foi aumentada a tensão de cisalhamento da parede (injeção deEPO ) ou entalhe sinalização (10 pg/nL Nrg1 injeção), não houve alteração no grupo EPO em termos de morfologia, mas morfogênese ventricular anormal estava presente no Nrg1 dose aumentada (Figura 3).

Em conclusão, temos mostrado que as mechanotransduction de tensão de cisalhamento ativa o entalhe via de sinalização. Aplicando a 4-D LSFM e geneticamente zebrafish, desenvolvemos um novo sistema de modelo que mostra o fluxo de sangue como crítico é durante o desenvolvimento cardíaco a sua morfologia, contratilidade e função global.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostaria de expressar a gratidão a William Talbot, da Universidade de Stanford para a prestação do ser humano Nrg1 cDNA e Deborah Yelon de UCSD para fornecer o WEA mutantes. Os autores também gostaria de agradecer a ajuda com a aquisição de imagens de Cynthia Chen. Este estudo foi suportado por bolsas NIH HL118650 (para Hsiai tk), HL083015 (para Hsiai de T.K.), HD069305 (para N.C. Chi e T.K. Hsiai...), HL111437 (para Hsiai de T.K. e Chi N.F.), HL129727 (para Hsiai de T.K.), T32HL007895 (para R.R Sevag Packard), HL 134613 (para V. Messerschmidt) e Universidade de Texas sistema estrelas financiamento (de J. Lee).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clontech Hifi PCR pre-mix  Takara  639298 PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N/A Used for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855201 PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+ GE Health Plasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit   Clontech 740609.25 DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase  Clontech 2011A PCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cells Clontech 636763 E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent Life Technologies 11668027 Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kit Invitrogen AM1340 Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820 Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8 GeneTools N/A Software for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA Creative Biogene CDFH006026 Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478 Sigma-Aldrich  T4182 ErbB inhibitor
1.3.1
E3 medium To grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT Sigma-Aldrich  D5942 γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose  Sigma-Aldrich  A9539 Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software FEI Software N/A Visualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  Sigma-Aldrich  886-86-2 Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge Eppendorf 05-400-005 Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023X Sigma-Aldrich  260264-93-5 ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich  I5627 Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLAB Mathworks N/A Cardiac mechanics analysis

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Bioengenharia edição 138 microscopia de iluminação seletiva de avião sinalização Notch trabeculação hemodinâmica zebrafish desenvolvimento cardíaco tensão de cisalhamento imagem de coração 4-Dimensional mechanobiology coração microscopia de fluorescência folha de luz

Erratum

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 09/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

Microscopia de fluorescência de luz-folha para capturar imagens 4-Dimensional dos efeitos de modulação de tensão de cisalhamento sobre o coração em desenvolvimento de Zebrafish
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Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, … More

Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, K. I., Ding, Y., Hsu, J. J., Bryant, R., Li, R., Hsiai, T. K., Lee, J. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (138), e57763, doi:10.3791/57763 (2018).

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