Summary
여기, 우리는 다양 한 세포 모델에서 신호 경로 변경을 식별 하기 위해 항 체 배열에 대 한 프로토콜을 제시. 마약/산소/초 violet 빛/방사선, 또는 overexpression/downregulation/녹아웃, 한 이러한 변경 사항을 다양 한 질병 모델에 대 한 중요 하 고 치료 효과가 있을 것입니다 또는 약물의 메커니즘을 확인할 수 있습니다. 여부를 나타낼 수 있습니다. 저항입니다.
Abstract
암 환자는 단백질 인 산화 네트워크의 탈 규제와 종종 tyrosine kinase 억제제와 함께 처리 됩니다. 85%에 접근 하는 응답 속도 일반적 이다입니다. 불행 하 게도, 환자 자주 될 치료에 다루기 힘든 그들의 신호 전달 경로 변경 하 여. Microarrays와 식 프로 파일링의 구현 전체 mRNA 수준 변화를 식별할 수 있습니다 및 단백질 단백질 수준에서 전반적인 변화를 확인할 수 있습니다 또는 단백질, 그러나 신호 변환의 활동을 확인할 수 있다 경로 포스트 번역 상 수정 단백질의 심문 하 여 설정할 수 있습니다. 그 결과, 약물 치료는 성공 여부 또는 저항 발생 여부를 식별 하는 기능 또는 신호 경로에 모든 변경 하는 능력은 중요 한 임상 도전 이다. 여기, 우리는 시스템 차원의 변경 다양 한 포스트 번역 상 수정 (예를 들어, 인 산화)에서 확인할 수 있는 도구로 서 항 체 배열의 자세한 설명을 제공 합니다. 항 체 어레이 사용의 장점 중 하나는 그들의 접근성 (배열 하지 않아도 proteomics에 전문가 또는 비용이 많이 드는 장비) 및 속도 포함 됩니다. 포스트 번역 상 수정 조합 대상 배열의 여부 기본 제한 사항입니다. 또한, 공평한 접근 (phosphoproteomics) 항 체 어레이 가장 널리 특징이 대상에 대 한 이상적인 소설 발견에 대 한 더 적합 한 수 있습니다.
Introduction
타겟된 티로신 키 니 아 제 억제제 (TKI)의 임상 구현 그 드라이브 종양 약 변화에 특정 단백질을 대상으로 효과적인 도구로 의사를 제공 하 여 암 치료를 변화 하고있다. 이러한 화합물을 억제 하거나 tyrosine kinases1,2에 의해 표적으로 하는 단백질의 인 산화를 차단 합니다. TKIs는 유전자를 신호 하는 다양 한 키에 유전 변경 드라이브 암 개시 [예를 들어, 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR), proto-oncogene 티로신 단백질 키 니 아 제 Src (SRC), 진행 하기에 충분 하기 때문에 부분에서 개발 되었다 BCR-ABL, 그리고 인간 표 피 성장 인자 수용 체 2 (HER2)]3,4. 세포 주기5 와6 분자 신호 경로 TKIs의 영향 분자로 가이드 암 치료에는 타겟이 불분명 한에서 변환을 나타냅니다. TKIs 대 화학 요법의 주요 장점은 증가 응답 속도 건강 한 세포7독성의 낮은 위험. 결과적으로, 거기 증가 하고있다 소설 TKIs의 개발과 연구에 대 한 관심.
게놈 시퀀싱 결과에 대 한 액세스 인간 게놈 프로젝트8,,910 함께 시작 하 고 다양 한 다음-세대 (NextGen) 암 시퀀싱 노력 [예를 들면,의 암 게놈 오늘 계속 아틀라스 (TCGA)11,12]. 이 유전자의 수천에 동시 정보를 제공 하 고는 그리고/또한 유전자 또는 생물학 섭13로 변조 하는 단백질의 편견된 스냅샷을 제공 하는 많은 실험 방법론을 영감 하고있다. 포스트 번역 상 수정 단백질 그리고 그들의 활동의 유전자의 녹음 방송에서 여러 수준에서 발생 하는 세포 기능의 규칙 이후 세포질 기능을 제어 하는 이벤트에 대 한 완전 한 이해는 궁극적으로 다양 한 생물 학적 정보에서 데이터의 통합이 필요 합니다. 단일 셀 유전자 해상도와 유전자의 수천의 메신저 RNA (mRNA) 레벨을 모니터링 하는 기능 전체 게놈 규모로 유전자 기능 및 상호 작용에 대 한 추론을 할 수 있는 능력을 증가 했다. 그러나, 유전자 식 배열의 해석 항상 본질적으로 불완전 한 것 없이 규제의 다른 레벨의 통합: 즉, 단백질 표정 수준, 단백질 수정 상태 및 포스트 번역 상 단백질 수정 (인 산화, ubiquitylation, 메 틸 화, 등) 여기, 우리는 하나의 실험14,15, 에서 다양 한 조건의 기능으로 중요 한 신호 구성 요소의 포스트 번역 상 수정이 수단으로 항 체 배열 유틸리티 설명 16.
구별 하 여 신호 변환 통로16에 대 한 변경 내용을 분석 인 항 체 어레이 사용할 수 있습니다. 이러한 유전 수정 또는 셀 라인 kinase 억제제, chemotherapeutics, 포도 당 부족, 저 산소 증, 또는 혈 청 기아로 인 한 스트레스의 치료에서 발생할 수 있습니다. 참고, 약물 내성 또는 특정 유전자의 업 또는 downregulation 발생할 수 있습니다 또한 변화 신호 변환 통로17에.
예를 들어 약물 저항 감도 피하기 위해 마약 대상의 돌연변이에서 발생할 수 있습니다. 폐암, 알려진 EGFR 돌연변이 렌더링 암 특정 TKIs에 무감각 하지만 다른 사람에 게 더 취약. 대체 경로 신호 변이17시 활성화할 수 있습니다. 저항 및 hypoxia, 등등에 관련 된 신호 변환 통로의 식별에 대 한 광범위 한 응용 프로그램으로 인 항 체 배열에, 더 많은 통찰력을 제공 하 고 관련 된 메커니즘의 결과적으로 이해 하 고.
그들은 종종 효소 또는 단백질 사이 육체적 인 상호 작용의 활동을 조절 하는 등 규제 기능을 제공 하기 때문에 단백질 수정의 평가 허용 하는 기술 시스템 생물학의 중요 한 구성 요소를 나타냅니다. 포스트 번역 상 수정의 중요성은 거의 모든 트리거 extracellular 신호 변환 통로18인 산화 단백질의 역할에 의해 나와 있습니다. 전통적으로, kinases 또는 단백질의 인 산화 상태의 식별 수 또한 의해 결정 될 서쪽 오 점 분석 연구원은만 1-5 대상에 관심이 있는 경우에 특히. 그러나, 서쪽 오 점은 매우 선택적 사전 지식으로 바이어스 될 수 있다 고 결과적으로 중요 한 목표를 놓칠 수도 있습니다. 항 체 어레이 (예를 들어, 유리 또는 니트로) 단단한 매트릭스에 다양 한 캡처 항 [팬 전용 phosphorylated tyrosine(s), 안티-유비퀴틴, 등]를 포함 하 여 여러 대상의 중간 처리량 판독을 제공 합니다. 2 차 항 체 ELISA 샌드위치 기반 형식 (그림 1)에 있는 특정 단백질에 정보를 제공합니다. 이 분석 결과 더 많은 목표의 또는 사전 지식이 제한15로 더 강력 하 고 관련 된다. 그들은 뿐만 아니라 일반 양의 다양 한 실험 대상의 단백질 인 산화를 비교 하 고 질량 분석을 통해 크게 향상 된 정량화를 제공 수 인 배열 더 광범위 하 게 자격이 있습니다. 이 기술은 새로운 또는 이전에 알려지지 않은 인 산화 위치의 식별에 대 한 적용 되지 않습니다.
대규모 질량 분석 기반 단백질 단백질19의 인 산화 특정 사이트를 식별 하기 위해 채택 될 수 있습니다. 이 기술은 수천 닢 이벤트를 열거할 수 있습니다, 하지만 비싼 계측, 전용된 실험 파이프라인 및 대부분 연구자의 범위 저쪽에 전산 전문 지식을 필요 합니다.
항 체 배열과 다양 한 단백질 해독16동시 판독을 제공합니다. 이러한 단백질 ubiquitylation (유비퀴틴 배열) 또는 인 산화에 변경 될 수 있습니다. 이 배열 기술의 주요 장점은 그것 중요 한 세포 매개 변수 (53 kDa, p53, 수용 체 tyrosine kinases와 세포내 통로 단백질)와 관련 된 다양 한 생물학 통로의 생물 학적 상태에 중요 한 피드백을 제공 동시에. 또한, 그것이 분석 결과 (예:, apoptosis와 유비퀴틴과 인 산화)의 침투를 증가 하기 위하여 다양 한 배열 형식을 결합 가능 합니다. 이 시간 및 비용 effective 방식으로 특정 계측 또는 전문 지식을 필요로 하지 않는 동시에 여러 샘플에서 다양 한 닢 변경을 평가 하기 위해 여러 개의 배열을 결합 기능은 경우에 중요 한 이점의 항 체 배열.
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Protocol
1. 단백질 추출
- 10 m m 조직 문화 접시 (또는 플라스 크)에 5 x 106 세포 조직 문화 후드에서 플레이트. 자동 셀 카운터 또는 hemocytometer 도금 시 셀을 계산 합니다. 또는, 세포 수를 견적 한다.
- 10 m m (또는 플라스 크)에 성장 셀 린스 철저 하 게 10 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 배 (pH = 7.4). 세포의 용 해 버퍼를 추가 하기 전에 모든 PBS를 제거 되었는지 확인 합니다.
참고: 세포의 용 해 버퍼는 보통 키트와 함께 제공 됩니다. 그렇지 않은 경우에 다음 사용 radioimmunoprecipitation 분석 결과 버퍼 (RIPA) 또는 어떤 다른 세포 세포의 용 해 버퍼 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제의 칵테일을 포함 하. - 셀에 버퍼의 정확한 금액을 추가 하 고 세포의 용 해 버퍼에 셀 스 크레이 퍼와 세포를 근 근이 여 1 x 107 셀/mL의 세포 세포의 용 해 버퍼를 lyse. (예를 들어, HeLa 세포와 MiaPaCa-2, 10 cm 접시 당 600 µ L) 사용 합니다.
- (약 10 배) 위아래로 lysate 플라스틱 하 고 새로운 1.5 mL 튜브에 그것을 전송.
- 선호는 로커/쉐이 커에 4 ° C에서 30 분 동안 lysates 품 어. 눌러 눌러는 lysate 주사기 27 G 바늘 10 x는 cell membrane(s)의 적절 한 중단 되도록 합니다. 또는, lysate를 sonicate. -20 ° C에서 lysates 저장 하거나 즉시 그들을 사용 합니다.
- 15 분 동안 4 ° C에서 14000 x g 에서 lysate 원심 하 고 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 전송.
- Bicinchoninic 산 성 시험 (BCA)20 또는 리 등 브래드포드 동등한 총 단백질의 양을 quantitate 고 적어도 50-400 μ g 계속 합니다. 즉시 단백질 또는 약 수를 사용 하 여 및 동결 /-70 ° C에서 그들 매장 (여러 freeze-thaw 주기를 피하기 위해).
2. 인간의 Phosphokinase 배열
- (약 1 시간)에 대 한 시작 하기 전에 실내 온도에 모든 시 약을가지고.
참고: 모든 시 약 및 플라스틱 마모 키트에 포함 됩니다. - 제조업체의 지침에 따라 절차를 시작 하기 전에 모든 시 약 신선한 (배열 버퍼)를 준비 (대상/배열의 선택에 따라 지침 달라질 수 있습니다 약간).
- 이온을 제거 된 물 100 μ의 탐지 항 체 칵테일을 다시 구성 하거나 제공 1.5 mL 테스트 튜브 다 해야 제조 업체의 지침을 따르십시오.
- 워시 버퍼 이온 물 960 ml에서 x 25의 40 mL를 diluting 하 여 워시 버퍼 x 1을 준비 하 고 반전 하 여 그들을 믹스.
참고: 크리스탈 실 온에서 분해. 버퍼는 시간이 지남에 노란색 설정할 수 있습니다 하지만 여전히 작동 합니다. - 8 잘 멀티 트레이 (또는 4-잘 멀티 트레이 2 mL)의 각 음에 배열 버퍼 1의 1 mL 플라스틱
- 플랫 팁 핀셋 보호 시트 사이 배열 막 제거와 우물에 그들을 배치. 멤브레인에 숫자 위쪽으로 직면 하 고 있는지 확인 합니다.
참고: 침수, 시 막에 염료 사라질 것 이다. - 뚜껑 트레이 커버 하 고 실 온에서 60 분에 대 한 락 플랫폼 통에 품 어.
참고: 이것은 막 차단 단계입니다. - 인큐베이션 기간 동안 단백질 샘플 준비. 총 단백질의 50-100 μ g을 추가 합니다. 희석 lysate 334 μ 1 mL의 최종 볼륨을 세포의 용 해 버퍼의 최대 볼륨을 데.
참고: 총 단백질의 50-100 μ g는 일반적으로 충분합니다. - 신중 하 게 배열 버퍼 1을 aspirate 하 고 품 어 락 플랫폼 통에 2-8 ° C에서 하룻밤 샘플의 1 mL로 세포 막.
참고: 않습니다 하지 터치/스크래치는 막. - 다음 날, 신중 하 게 각 배열을 제거 하 고 개별 플라스틱 용기 (약 8 x 11 cm2)에 그것을 배치 하 여 20 mL 1 x 워시 버퍼의 배열 씻어. 실 온에서 버퍼를 세척 x 1에서 락 플랫폼에 막 3 x 10 분을 씻어.
- 재구성 된 항 체 칵테일의 20 μ 플라스틱에서 단계 배열 버퍼 2 x 1의 2.3 1 mL. 각 8 잘 사용할 수에이 솔루션의 1 mL를 추가 합니다.
- 조심 스럽게 세척 쟁반에서 멤브레인을 제거. 어떤 과잉 워시 버퍼를 제거 하 고 항 체 칵테일을 포함 하는 쟁반으로 다시 그들을 전송 하는 종이 타 올에 아래쪽 가장자리를 되 리. 뚜껑 트레이 커버 하 고 락 플랫폼에 실 온에서 2 h에 품 어. 철저 하 게 dH2O 사용된 트레이 헹 구 고 나중 사용을 위해 그들을 건조.
- 조심 스럽게 각 배열 제거 하 고 다시 1 x 워시 버퍼의 20 mL와 함께 깨끗 한 개별 플라스틱 용기 (약 8 x 11 cm2)에 배치. 실 온에서 락 플랫폼에 워시 버퍼와 3 x 10 분 워시 그들.
- 희석 Streptavidin HRP (키트와 함께 제공) 또는 streptavidin 형광 염료 (더 양적 감지)에 대 한 15 mL 테스트 튜브에서 배열 버퍼 2 x 1에 1:1,000.
- HP 솔루션을 포함 8 잘 요리에 멤브레인을 (해당 되는 경우 형광를 사용 하 여 모든 빛에 노출을 피하기 위해 알루미늄 호 일에 트레이 포장) 락 플랫폼에 실 온에서 30 분 동안 그들을 품 어.
- 3m 종이 5 mm의 2 조각 사이 막 배치 하 여 초과 버퍼를 제거 합니다. X 선 필름/chemiluminescent 이미징 이미징, HRP 탐지 솔루션 (믹스 두 chemiluminescent 솔루션 1:1) 3 분 건조 막 품 어 고 막 투명 한 플라스틱 시트 보호 합니다.
참고: 말린된 membrane(s); 형광 신호를 검출 하는 형광 영상에 배치 될 수 있습니다 또한 영상 전에 막에 빛 노출을 최소화 합니다. X 선 필름 또는 영상 파일의 정량화에 대 한 노출 과도를 하지 마십시오. 대부분 chemiluminescent/형광 감시 신호 포화를 방지 하는 기능이 있다.
3. 데이터 분석
- ImageJ, 처리 프로그램21, 이미지를 다운로드 하 고 소프트웨어를 설치.
- ImageJ 'ImageJ 아이콘'을 더블 클릭 하 여 엽니다. 메뉴 표시줄에서 '파일' 을 클릭 하 여 분석할 이미지 선택 다음 드롭 다운 메뉴에서 '열기' 를 선택 하 고 관심의 이미지에 대 한 컴퓨터 파일 검색. 열려는 파일을 클릭 합니다.
- 메뉴 표시줄에서 '편집' 을 클릭 하 고 드롭 다운 메뉴에서 '반전' 을 선택 하 여 분석 (검은색에 흰색 반점에 흰색 바탕에 검은 반점)에 대 한 그림을 반전.
- 도구 모음 (ImageJ 도구 모음에서 두 번째 옵션)에서 '타원형 아이콘'을 선택 합니다. (블랙 십자가) 그림을 클릭 하 고 마우스를 이동 하 여 원/타원을 그립니다. 점 오 점에 점 들을 둘러싸 자 원형/타원형의 크기/모양 조정 합니다.
- 메뉴 막대에서 '분석' 을 클릭 하 고 자동으로 선택 된 영역 (지역, 평균, 최소, 및 최대)의 값으로 새로운 창을 열고 드롭 다운 메뉴에서 '측정' 을 선택 합니다.
- 원형 지역 센터 (넣어 중간에 화살표 오른쪽 지점)에서 동그라미를 드래그 하 여 이동 하 고 측정 (도트) 주변 장소. 관심, 긍정적인 통제, 부정적인 컨트롤 및 분석에 대 한 백그라운드의 모든 관광 명소를 측정 합니다.
주: 부정적인 컨트롤은 PBS, 배경 없이 어떤 자리 (어떤 부분을 할 것입니다), 막의 한 부분 이다 고 긍정적인 컨트롤은 제조업체에서 제공 하는 컨트롤. - PBS 부정적인 제어 관광 명소를 선택 하 고 각 자리 값을 뺍니다. 각 수용 체 티로신 키나 제 (RTK)를 대표 하는 중복 명소의 각 쌍에 대 한 강도 평균. 각 평균 강도 겹 변경 계산 컨트롤 관련이 있을 수 있습니다.
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Representative Results
TKI 저항 세포에서 신호 변환 통로에 효과 조사, 4 개의 샘플 분석 되었다. 한 컨트롤 샘플 (H3255r1) 및 3 TKI 저항 셀 라인 (H3255r2-4) (그림 2) 자리 항 체 서식 파일 (그림 3)에 관련 되었다. 모든 4 샘플은이 프로토콜을 사용 하 여 준비 되었다. 차동 활동 6 phosphoproteins 항 체 배열 (그림 4)의 분석의 데모에 대 한 선정 됐다. 열 지도 (그림 5)는 중요 한 신호 전달 단백질의 단백질 인 산화에 변화에 반 양적 판독을 제공합니다. 배열 결과의 유효성 검사는 서쪽에 게 더 럽 히기 등 직교 방법을 구현 하 여 완료할 수 있습니다.
그림 1: 반 정량 항 체 배열의 도식. 항 체 어레이 캡처 항 체의 컬렉션 유리 또는 니트로 지원에 포함 된 샌드위치 immunoassay 원리를 기반으로 합니다. 세포 lysates 멤브레인와 함께 알을 품는 그리고 배열 2 차 항 체를 받게 됩니다. 반 정량적 판독 chemiluminescent 기판에서 또는, 더 많은 양적 정보 얻을 수 있습니다 형광 기반 이미징. 영화 또는 TIF 이미지에서 파생 된 모든 신호 densitometry 및 각 단백질에 대 한 배 변경의 계산에 의해 처리할 수 있습니다. 전체 프로세스에 대해 하루 걸립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 예 인 항 체 배열은 이미징 개발. 형광 명소 중복 (대상 당 두 개의 관광 명소)에서 검색 됩니다. 샘플 및 긍정적인 제어 명소 다양 한 농도 표시합니다. 각 막 A와 B에에서 분할 표시 여기 TKI 민감한 H3255r1 및 3 저항 (H3255r2-4) 샘플의 비교는, 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 배열 명소의 지도. 지도 항 체 표적에 관광 명소를 연결합니다. 관광 명소는 표시 A-G 수직으로 그리고 1-10 가로. 긍정적인 통제 (오렌지) 모든 세포 막에 존재 하 고 일반적으로 모서리에서 발견. 부정적인 PBS 컨트롤 샘플 명소는 노란색으로 강조 표시 하는 동안 검정색으로 강조 표시 됩니다. 모든 배열에 대 한 항 체의 목록이 식별을 위해 제공 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 데이터 분석 예. (A), 긍정의 관광 명소의 강도 컨트롤 배경 지도 그리고 모든 샘플에 대 한 측정. (B) 상대 강도 (배경 강도 제거 하 고 긍정적인 통제 강도 정규화 자리 강도)는 몇 가지 선택 된 후보자에 대 한 가로 막대형 차트에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: H3255 민감한 (r1)와 저항 (r 2-4) 셀 라인 차동 시그널링의 열 지도. 상대 자리 강도 CREB, P53, AKT, 및 STAT5 모든 4 샘플에서 변경의 비교에 대 한 열 맵을 생성 하 사용 되었다. 모든 하위 수준에 블루22표시 됩니다 어떤 높은 수준의 레드의 다양 한 음영에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
많은 생물학 정보를 결합 하는 접근은 수행 하는 실험에서 세포 기계의 본질적으로 더 정확한 표현입니다. 인 항 체 배열의 출현의 어떤 단일 단백질의 수정 상태 보다 더 유익 될 수 있는 수정 패턴의 신속한 특성화 수 있습니다. 인 항 체 배열의 응용 프로그램에 대 한 일반적인 워크플로 수정 떠들고, 트레오닌, 또는 티로신을 기반으로 합니다. 이 예제에서는 변경 연관 된 폐암에 치료에 저항을 특성화에 집중 했다. 이 응용 프로그램에 대 한 주요 근거는 많은 인간 암18, 신호 변환에서 중심 역할을 담당 하는 단백질 인 산화 그리고이 메서드는 다른 시스템에 양도 될 것입니다. 암 인 산화의 dysregulation는 티로신 키 니 아 제, hyperactivation에 일반적으로 포함 한다 존재 하 고 따라서, phosphorylated 기판 (자동 phosphorylated 키 자체를 포함 하 여 종종) 보다 높은 수준에서 정상에 생리 적 설정 및, 따라서, 암 세포에 phosphoproteins의 중요 한 일부를 만들 수 있습니다. 인 산화의 이러한 높은 수준의 탐지를 쉽게 만들 것입니다. 또한, 단백질 인 산화 탈 티로신 인 산화 다양 한 유형의 암23의 특징 이므로 의료 의미가 있다. 또한,이 기술은 인 산화를 활용 하는 다른 생물 학적 시스템의 조사에 게 양도할 수 있기 때문에, 여기에 설명 된 기능을 많이 쉽게 조정 될 수 있었다 단백질 배열 (유비퀴틴, apoptosis, 의 다른 종류에 초점을 등).
인 항 체 배열 탐사 방법으로 또는 특정 한 통로의 확인으로 참여, 모든 신호 경로의 식별을 위해 널리 이용 된다. 다양 한 회사 장비 인 산화 상태 및 단백질의 전반적인 수준을 확인합니다. 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 분석 또는 microarrays는 훨씬 더 양적, 그들은 고려만 mRNA 수준, 그리고 포스트 번역 상 수정 뿐 아니라 번역 해결 될 수 없습니다. 인 산화, 떨어져 glycosylation 또는 ubiquitylation 같은 다른 포스트 번역 상 수정 또한 배열24,25에 의해 해결할 수 있습니다.
항 체 어레이 시작 하기 전에 고려해 야 할 중요 한 요소 중 하나는 건강 하 고 적극적으로 나누어 셀 시작 하는 것입니다. 산소, 산화 스트레스와 염증 결과 왜곡 하 고 잘못 취급 하는 경우 오해를 렌더링 수 있는 신호 변환 통로26 에 변화를 생산할 수 있습니다. 이 스트레스는 너무 적거나 너무 많은 셀, 도금 또는 미디어의 정립 또는 셀 제대로 규제 환경, 또는 약간 다르게는 제어 대 는 sample(s) 치료에 노출 인할 수 있다. 우리 또한 통로 수에 있는 큰 다름 또는 문화 포스트 녹고에 시간을 지적 했다. 이러한 인위적으로 도입된 변수를 피하고 키 모든 가능한 일관 된 샘플 사이 유지 하는. 실험 기간 동안 FBS 백분율 또는 미디어 볼륨, 등을 변경 하지 마십시오.
데이터 분석은 또한 배열 실험을 시작 하기 전에 고려해 야 합니다. Chemiluminescent 배열 분석 반 정량만 이며 그것의 동적 범위는 대략 1 개의 크기 순서, 형광 접근 약 두 배나 동적 범위를 증가 하는 동안. 어레이 수행 됩니다 규모 특정 생물 학적 질문에 따라 달라 집니다. 한 저항 하는 특정 셀의 모든 변경에 대 한 원래 셀 라인에 비해 포스트 번역 상 수정 분석 하거나 저항 세포 라인의 다양 한 특정 한 통로에 초점을 가능 하다. 이 방식의 확장성은 초기 기획 단계에서 고려 되어야 한다. 또한, 항 체 배열 결과 항상 신선한 샘플에 보조 방법 또는 동일한 lysates로 확인 한다. 서쪽 오 점 분석은 특정 대상에 변경 사항을 확인 하려면 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 관대 한 재정 지원의 로렌스 J. 엘리슨의 Transformative 의학 연구소의 USC (데이비드 Agus을 선물)에 대 한 감사. 우리가 Beemer와 세대에 이어질 리사 Flashner의 지원과이 원고에의 게시 주셔서 감사 합니다. 우리는 그녀의 행정 지원에 대 한로 라 니 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
| Tissue Culture dish 100 mm | TRP | 93100 | |
| ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27 G5/8, 1 mL for needle treatment of protein samples |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
| LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |
References
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