Summary
Her presenterer vi en protokoll for antistoff matriser til å identifisere endringer i signalveier i ulike mobilnettet modeller. Disse endringene, forårsaket av narkotika/hypoksi/ultra-violet lys/stråling, eller overuttrykte/downregulation/knockouts, er viktige for ulike sykdom modeller og kan indikere om en behandling vil være effektiv eller kan identifisere mekanismer av narkotika motstand.
Abstract
Pasienter med en avvikende regulering av protein fosforylering nettverk er ofte behandlet med tyrosine kinase hemmere. Svarprosenten nærmer 85% er vanlig. Dessverre bli pasienter ofte ildfaste til behandling ved å endre deres signaltransduksjon trasé. Implementering av expression profilering med microarrays kan identifisere endres samlet mRNA nivå og Proteomikk kan identifisere de samlede endringene i protein nivå eller kan identifisere proteiner involvert, men aktiviteten til signaltransduksjon veier kan bare opprettes av avhør post-translasjonell modifikasjoner av proteiner. Følgelig er evnen til å identifisere enten en behandling er vellykket eller motstand oppsto, eller evnen til å beskrive noen endringer i signalveier, en viktig klinisk utfordring. Her gir vi en detaljert forklaring av antistoff matriser som et verktøy som kan identifisere systemomfattende endringer i ulike post-translasjonell endringer (f.eks, fosforylering). En av fordelene med å bruke antistoff matriser inkluderer deres tilgjengelighet (en matrise ikke krever enten en ekspert i Proteomikk eller dyrt utstyr) og hastighet. Tilgjengeligheten av matriser målretting en kombinasjon av post-translasjonell modifikasjoner er den største begrensningen. I tillegg kan upartiske tilnærminger (phosphoproteomics) være mer egnet for romanen oppdagelsen, mens antistoff matriser er ideelle for de mest preget mål.
Introduction
Klinisk gjennomføring av målrettede tyrosine kinase hemmere (TKI) har transformert kreftbehandling ved å gi leger med effektive verktøy for å målrette bestemte proteiner at stasjonen neoplastic transformasjon. Disse forbindelsene hemmer eller blokkere fosforylering proteiner målrettet av tyrosin kinaser1,2. TKIs ble utviklet delvis fordi genetiske endringer i ulike nøkkel signalering gener er tilstrekkelig til å kjøre kreft initiering og progresjon [f.eksepidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), proto-oncogene tyrosin protein kinase Src (SRC), BCR-ABL og menneskelige epidermal vekstfaktor reseptor 2 (HER2)]3,4. Virkningen av TKIs på cellen syklus5 og molekylære signalnettverk trasé6 representerer en transformasjon fra den uønskede til molecularly guidede kreftbehandling. Den viktigste fordelen av TKIs versus kjemoterapi er de økte svarprosenten og lavere risiko for toksisitet for friske celler7. Som et resultat har det økt fokus på forskning og utvikling av Roman TKIs.
Tilgang til genomisk sekvensering resultatene begynte med Human Genome Project8,9,10 og fortsetter i dag med ulike neste generasjon (NextGen) kreft sekvensering innsats [f.eksThe kreft Genome Atlas (TCGA)11,12]. Dette har inspirert mange eksperimentell metodikk som gir samtidig informasjon om tusenvis av gener og/eller gi saklig øyeblikksbilder av gener eller proteiner modulert av biologiske forstyrrelser13. Siden regulering av funksjonen mobilnettet skjer på flere nivåer, fra transkripsjon av gener til den post-translasjonell modifikasjonen av proteiner og deres aktivitet, vil en fullstendig forståelse av hendelsene kontrollere den cellulære funksjonen til slutt kreve en integrasjon av data fra ulike biologiske readouts. Evnen å dataskjerm budbringer RNA (mRNA) nivåer av gener med en enkeltcelle genet oppløsning har økt mulighet til å gjøre slutninger om gen funksjon og interaksjoner i hele-genome skala. Men tolkningen av gene expression matriser vil alltid være iboende ufullstendig uten integrering av andre nivåer av regulering: nemlig protein uttrykk nivåene, protein endring statene og protein post-translasjonell endringer (fosforylering, ubiquitylation, metylering, osv.). Her beskriver vi verktøyet antistoff matriser som betyr å forhøre post-translasjonell modifikasjoner av viktig signalnettverk komponenter som en funksjon av ulike forhold i et enkelt eksperiment14,15, 16.
Phospho-antistoff matriser kan brukes til å skille og analysere endringer i signal signaltransduksjon trasé16. Dette kan oppstå fra en genetisk modifisering eller behandlinger cellen linjer med kinase hemmere, chemotherapeutics, stress forårsaket av glukose deprivasjon, hypoksi eller serum sult. Merk, resistens eller et bestemt gen kan opp- eller downregulation også forårsake endringer i signal signaltransduksjon trasé17.
Resistens, for eksempel kan oppstå fra mutasjoner av narkotika målet å unngå følsomhet. Lungekreft, kjent EGFR mutasjoner gjengi kreft insusceptible til visse TKIs, men mer utsatt for andre. Alternativ signalnettverk trasé kan aktiveres på mutasjon17. Som et bredere program til å identifisere de signaltransduksjon trasé involvert i motstand og hypoksi, etc., phospho-antistoff matriser gir mer innsikt i, og dermed forståelse av, mekanismer involvert.
Teknologi som tillater en vurdering av protein modifikasjoner representerer en viktig komponent for systemer biologi fordi de ofte tjene en regulerende funksjon, for eksempel modulerende aktiviteten til et enzym eller fysiske interaksjonene mellom proteiner. Betydningen av post-translasjonell modifikasjoner er illustrert av rollen protein fosforylering i nesten alle ekstracellulære utløser signal signaltransduksjon trasé18. Tradisjonelt kunne identifikasjon av kinaser eller statusen fosforylering proteiner også fastslås ved Western blot analyse, spesielt hvis hun er interessert i bare 1 – 5 mål. Men vestlige blots er svært selektive og kan være partisk mot forkunnskaper og kanskje savne viktige mål som et resultat. Antistoff array(s) gir en medium gjennomstrømming avlesning av flere mål ved å bygge ulike fange antistoffer [pan-spesifikke fosforylert tyrosine(s), anti-ubiquitin, etc.] på en solid matrise (f.eks, glass eller nitrocellulose). Sekundær antistoffer gir informasjon om spesifikke proteiner i en sandwich-basert ELISA format (figur 1). Denne analysen blir kraftigere og mer relevant som flere mål av interesse eller tidligere kunnskap er begrenset15. Phospho-arrayene er videre arbeidsføre som de kan sammenligne fosforylering samt generelle mengder protein av flere mål i et eksperiment og gir en betydelig forbedret kvantifisering over massespektrometri. Denne teknikken er ikke anvendelig for identifisering av nye eller tidligere ukjente fosforylering nettsteder.
Store masse massespektrometri-baserte Proteomikk kan brukes til å identifisere bestemte fosforylering områder proteiner19. Selv om denne teknikken kan liste opp tusenvis av post-translasjonell hendelser, krever det dyre instrumentering, dedikert eksperimentelle rørledninger og en beregningsformelen kompetanse som er utenfor rekkevidden av de fleste forskere.
Antistoff matriser gir en samtidige avlesning på ulike protein readouts16. Disse kan være endringer i protein ubiquitylation (ubiquitin matrise) eller fosforylering. Hovedfordelen ved denne matrisen teknologi er at det gir viktig tilbakemelding om biologiske tilstanden av ulike biologiske forbundet med viktig celle parametere (protein 53 kDa, p53, receptor tyrosine kinaser og intracellulær veier) samtidig. I tillegg er det mulig å kombinere ulike matrisetyper å øke gjennomtrengning av analysen (f.eks, apoptose og ubiquitin og fosforylering). Denne muligheten til å kombinere flere matriser for å vurdere ulike post-translasjonell endringer på flere prøver samtidig på en gang - og kostnadseffektive måte som ikke krever bestemte instrumentering eller ekspertise er en betydelig fordel i tilfelle antistoff matriser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. protein utvinning
- Plate 5 x 106 celler på et 10 mm vev kultur plate (eller kolbe) i vev kultur hette. Telle celler ved plating med en automatisk celle teller eller hemocytometer. Alternativt, anslå celletall.
- Skyll celler dyrket på 10 mm plate (eller kolbe) grundig 3 x med 10 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) (pH = 7.4). Husk å fjerne alle PBS før du legger lyseringsbuffer.
Merk: Lyseringsbuffer tilbys vanligvis med kit. Hvis ikke, bruk en radioimmunoprecipitation analysebuffer (RIPA) eller noen andre cellen lyseringsbuffer som inneholder en blanding av protease og fosfatase hemmere. - Lyse 1 x 107 celler/mL av celler i lyseringsbuffer ved å legge riktig mengde buffer til cellene og skraping cellene med cellen skraper i lyseringsbuffer. (f.eksfor HeLa celler og MiaPaCa-2, bruker 600 µL per 10 cm plate).
- Pipetter lysate opp og ned (ca 10 x) og overføre den til en ny 1,5 mL tube.
- Inkuber lysates i 30 min ved 4 ° C, fortrinnsvis på en rocker/shaker. Trykk på lysate gjennom en sprøyte med en 27 G nål 10 x å sikre et riktig avbrudd i cell membrane(s). Eventuelt sonicate i lysate. Lagre lysates på 20 ° C eller bruk.
- Sentrifuge lysate 14.000 x g på 4 ° C i 15 min og overføre nedbryting til en ren 1,5 mL tube.
- Quantitate mengden av totale protein bicinchoninic syre analysen (BCA)20 eller tilsvarende som Lowry eller Bradford og fortsette med minst 50-400 μg. Bruke proteiner umiddelbart eller aliquot og fryse/store dem ved-70 ° C (unngå flere fryse-Tin sykluser).
2. menneskets Phosphokinase matrise
- Bringe reagenser til romtemperatur før du starter (for ca 1 time).
Merk: Alle reagenser og plast slitasje er inkludert i pakken. - Forberede alle reagenser friske (matrise buffere) før du starter prosedyren følge instruksjonene fra produsenten (avhengig av valg av mål/matriser, instruksjonene kan variere litt).
- Rekonstituer oppdagelsen antistoff cocktailer i 100 μL deionisert vann eller følge instruksjonene fra produsenten bør de forskjellige for 1,5 mL reagensglasset gitt.
- Forberede 1 x vaskebuffer fortynne 40 mL 25 x vaskebuffer i 960 mL deionisert vann og bland dem ved å snu.
Merk: Krystaller løses ved romtemperatur. Bufferen kan gule over tid men vil fortsatt fungere. - Pipetter 1 mL av matrise buffer 1 i hver brønn med en 8-og flere skuff (eller 2 mL i en 4-og flere skuff).
- Flat-tip pinsett, fjerne matrise membraner mellom beskyttende ark og plassere dem i brønnene. Kontroller at tallene på membranen er vendt oppover.
Merk: Ved neddykking, fargestoff på membranen forsvinner. - Dekke skuffen med lokk og ruge det på en rocking plattform shaker for 60 min ved romtemperatur.
Merk: Dette er membran blokkerer skritt. - Under inkubasjonstiden, forberede protein prøvene. Legge til 50-100 μg totale protein. Fortynne den lysate, har en maksimal mengde 334 μL, med lyseringsbuffer til et siste volum 1 ml.
Merk: 50-100 μg totale protein vanligvis tilstrekkelig. - Sug opp matrise-buffer 1 nøye og ruge membraner med 1 mL av prøvene overnatting på 2-8 ° C på en rocking plattform shaker.
Merk: Ikke touch/bunnen membraner. - Neste dag, vask matrisen ved nøye fjerne hver matrise og plassere det i enkelte plastbeholdere (ca 8 x 11 cm2) med 20 mL 1 x vaskebuffer. Vask membraner 3 x 10 min på en rocking plattform i 1 x vaske bufferen ved romtemperatur.
- Pipetter 20 μL av rekonstituert antistoffer cocktail fra trinn 2.3 1 mL 1 x matrise-buffer 2. Tilsett 1 mL av denne løsningen hver 8-brønn skal brukes.
- Fjern forsiktig membraner fra vask skuffene. Blot nedre kant på papirhåndklær for å fjerne alle overflødig vaskebuffer og overføre dem tilbake i skuffen som inneholder antistoff cocktailer. Dekke skuffen med lokk og ruge det for 2 timer ved romtemperatur på en rocking plattform. Grundig skyll brukte skuffene med dH2O og tørk dem for senere bruk.
- Nøye fjerne hver matrise og legg dem tilbake i ren personlige plast beholdere (ca 8 x 11 cm2) med 20 mL 1 x vaskebuffer. Vask dem 3 x 10 min med vaskebuffer på en rocking plattform ved romtemperatur.
- Fortynn Streptavidin-HRP (følger med kit) eller streptavidin-fluorescerende farge (for en mer kvantitativ oppdagelsen) 1:1,000 i 1 x matrise buffer 2 i et 15 mL reagensrør.
- Hjem membraner i 8-vel rettene som inneholder HP løsningen ruge dem i 30 min ved romtemperatur på en rocking plattform (hvis bruker fluorescens, Pakk skuffen i aluminiumsfolie å unngå noen lyseksponering).
- Fjern overflødig bufferen ved å plassere membranen mellom 2 stk 5 mm 3 M papir. For bildebehandling med en X-ray film/chemiluminescent imager, ruge tørket membraner med en HRP oppdagelsen løsning (blanding to chemiluminescent solutions 1:1) for 3 min og plasser membranen i en klar plast ark beskytter.
Merk: Tørket membrane(s) kan også plasseres i et fluorescerende imager å oppdage fluorescerende signalet; minimere lys eksponering membranen før bildebehandling. En kvantifisering av X-ray film eller imager filene, unngå overeksponering. De fleste chemiluminescent/fluorescerende imagers har en funksjon for å unngå en metning av signalet.
3. dataanalyse
- Dataoverføre ImageJ, en bildebehandling programmet21, og installere programvaren.
- Åpne ImageJ ved å dobbeltklikke på 'ImageJ ikon'. Velg bildet som skal analyseres ved å klikke "Fil" i menylinjen, og velg "Åpne" fra det miste-ned menyen og bla gjennom filene for bildet av interesse. Klikk filen for å åpne den.
- Inverter bildet for analyse (svarte flekker på den hvite bakgrunnen til hvite flekker på svart bakgrunn) ved å klikke "Rediger" i menylinjen og velge "Inverter" fra det miste-ned menyen.
- Velg "oval ikonet" på verktøylinjen (det andre alternativet i verktøylinjen ImageJ). Tegne en sirkel/oval ved å klikke på bildet (svart kors) og flytte musen. Justere størrelsen/sirkel/oval å omringe prikkene på dot blot.
- Klikk 'Analyser' i menylinjen, og velg deretter "Mål" fra rullegardinmenyen automatisk åpne et nytt vindu med verdiene i det merkede området (området, betyr, minimum og maksimum).
- Flytte sirkulær området ved å dra sirkelen fra center (sett poenget med pil høyre i midten) og plassere den rundt området for neste måling (dot). Måle alle steder av interesse, kontrollen positive, negative kontrollen og bakgrunnen for analyse.
Merk: Kontrollen negative er PBS, bakgrunnen er en del av membranen uten et sted (helst vil gjøre), og positiv kontrollen er en kontroll fra produsenten. - Velg PBS negativ kontroll flekkene, og trekke verdien fra hver spot. Gjennomsnittlig intensiteten for hvert par av like flekker som representerer hver receptor tyrosine kinase (RTK). Hver gjennomsnittlig intensitet kan knyttes til kontrollen til å beregne kaste endring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å undersøke effekten av TKI motstand på signaltransduksjon trasé i linjer, ble fire prøver analysert. Én kontroll prøven (H3255r1) og 3 TKI-resistente cellelinjer (H3255r2-4) (figur 2) var knyttet til malen spot antistoff (Figur 3). Alle 4 prøver ble utarbeidet bruker denne protokollen. Seks fosfoproteiner med differensial aktivitet ble valgt for demonstrasjon av analyse av antistoff arrayene (Figur 4). Varmekartet (figur 5) gir en semi kvantitative avlesning på endringene i protein fosforylering viktig signal signaltransduksjon proteiner. Validering av matrise resultatene kan fullføres ved å implementere ortogonale tilnærminger, slik som vestlige blotting.
Figur 1: skjematisk semi kvantitative antistoff matriser. Antistoff arrayene er basert på sandwich immunanalyse prinsippet, der en samling av fange antistoffer er innebygd i glasset eller nitrocellulose støtte. Celle lysates er ruges med membran og arrayene er utsatt for sekundær antistoffer. En semi kvantitative avlesning kan fås fra chemiluminescent underlag eller, mer kvantitativ informasjon fluorescerende-basert bildebehandling. Noen signaler fra film eller TIF-bilder kan behandles av densitometry og en beregning av Brett-endringene for hver protein. Hele prosessen tar om dagen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksempel phospho-antistoff matrise utviklet med imager. Fluorescerende flekker oppdages i duplikat (to flekker per mål). Prøver og positiv kontroll flekker vise varierende intensitet. Vist her er sammenligningen av TKI-sensitive H3255r1 og 3 resistente (H3255r2-4) eksempel matriser, hver delt i membranen A og B. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: kart over matrise flekkene. Kartet kobler stedene til antistoff målene. De er merket med A - G vertikalt og 1-10 vannrett. Positiv kontrollen (oransje) finnes på alle membraner og vanligvis finnes i hjørnene. Kontrollen negative PBS utheves i svart mens eksempel flekker utheves i gult. For hver matrise finnes også en liste over antistoffer for identifikasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Data analyse eksempel. (A) intensiteten av stedene av interesse, positive kontroll og bakgrunnen ble identifisert på kartet og målt for alle prøvene. (B) relative intensiteten (spot intensiteten med bakgrunn intensiteten fjernet og normalisert til en positiv kontroll intensitet) vises i et stolpediagram for noen få utvalgte kandidater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: varmekartet av differensial signalering i H3255 følsom (r1) og resistente (r2-4) cellelinjer. En relativ spot intensitet ble brukt til å generere en varmekart for en sammenligning av endringer i CREB, P53, AKT og STAT5 i alle 4 prøver. Noen høye nivåer vises i ulike nyanser av rødt mens noen lavere nivåer vises i blå22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Innfallsvinkler som kombinerer mange biologiske readouts er iboende mer nøyaktig representasjoner av den cellulære maskineriet i et eksperiment utført. Ankomsten av phospho-antistoff matriser kan en rask karakterisering av mønster av endringer som kan være mer informative enn endringsstatusen for enhver enkelt protein. Den generelle arbeidsflyten for anvendelse av phospho-antistoff matriser er basert på en endring i serine, threonin eller Tyrosin. Dette eksemplet fokusert på karakteriserer endres forbundet med motstanden mot behandling av lungekreft. Den viktigste begrunnelsen for dette programmet er at protein fosforylering spiller en sentral rolle i signaltransduksjon mange kreft hos mennesker18, og denne metoden er overførbare til andre systemer. En feilregulering av fosforylering i kreft innebærer vanligvis hyperactivation av en tyrosin kinase, og derfor phosphorylated substrater (ofte inkludert i auto-fosforylert kinase selv) finnes på nivåer høyere enn i vanlig fysiologiske innstillinger, og derfor kan gjøre opp en betydelig andel av fosfoproteiner i en kreftcelle. Disse høyere nivåer av fosforylering vil gjøre deteksjon enklere. Videre har protein fosforylering en medisinsk betydning siden fosforylering avvikende Tyrosin er et kjennetegn på mange typer kreft23. I tillegg, siden denne teknikken er overførbar til granskingen av andre biologiske systemer som utnytter fosforylering, kan mange av funksjonene som er beskrevet her enkelt justeres å fokusere på andre typer protein matriser (ubiquitin, apoptose, etc.).
Phospho-antistoff matriser er mye brukt til å identifisere eventuelle signal trasé involvert, som en utforskende metode eller som verifisering av en bestemt sti. Flere selskaper gjør prosjektpakker for både fosforylering status og det generelle nivået av proteiner. Mens sanntid polymerase kjedereaksjon (PCR) analyse eller microarrays er mye mer kvantitativ, de tar bare mRNA nivåer hensyn, og en oversettelse, så vel som post-translasjonell modifikasjon ikke kan håndteres. Bortsett fra fosforylering, kan andre post-translasjonell endringer som glykosylering eller ubiquitylation også løses ved matriser24,25.
En av de viktige faktorene å vurdere før du starter antistoff matriser er å starte med sunn og aktivt dele celler. Hypoksi og oksidativt stress betennelse kan produsere endringer i signal signaltransduksjon trasé26 kan forskyve resultatene og gjengi en feiltolkning behandles riktig. Dette stress kan tilskrives utformingen av media eller plating for lite eller for mange celler, eller utsette cellene dårlig regulerte miljøer, eller behandle det kontroll versus den prøven (e) litt annerledes. Vi har også bemerket store forskjeller i hvor passasje eller tiden i kultur etter tining. Nøkkelen til å unngå disse kunstig introdusert variablene er å holde alt mellom prøvene så konsekvent som mulig. Ikke endre FBS prosentandelen eller media volumet, etc., under eksperimentet.
Dataanalyse bør også vurderes før et utvalg eksperiment. En chemiluminescent array analysen er bare semi kvantitative dens dynamiske område er omtrent en bestilling av omfanget, mens en fluorescerende tilnærming øker det dynamiske området til ca to størrelsesordener. Skalaen som matriser utføres avhenger på bestemte biologiske spørsmålene. Det er mulig å analysere en bestemt motstandsdyktig celle linje med interesse for alle endringer i post-translasjonell endringene i forhold til den opprinnelige celle linjen eller å fokusere på en bestemt veien for en rekke motstandsdyktig linjer. Skalerbarhet av denne tilnærmingen bør vurderes på de tidlige stadiene av planleggingen. Videre bør resultatene av tabelldata antistoff alltid bekreftes av en sekundær metode på fersk prøver og/eller den samme lysates. En western blot analyse kan brukes til å bekrefte endringene i konkrete mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for den finansiell støtten av Lawrence J. Ellison Institute of Transformative Medicine av USC (en gave til David Agus). Vi setter pris på støtte fra høsten Beemer og Lisa Flashner som fører til generering og publisering av dette manuskriptet. Vi takker Laura Ng for hennes Administrativ støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
| Tissue Culture dish 100 mm | TRP | 93100 | |
| ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27 G5/8, 1 mL for needle treatment of protein samples |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
| LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |
References
- Knauer, D. J., Smith, G. L. Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).
- Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).
- Di Fiore, P. P., et al. Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells. Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).
- Maguire, H. C., Greene, M. I.
- Busse, D., et al. Reversible G(1) arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27(KIP1) independent of MAPK activity. Journal of Biological Chemistry. 275 (10), 6987-6995 (2000).
- Kondapaka, B. S., Reddy, K. B. Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer. Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).
- Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. [Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).
- Dulbecco, R. A turning point in cancer research: sequencing the human genome. Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).
- Barinaga, M. DoE provides funds for human genome sequencing. Nature. 331 (6152), 103 (1988).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
- McCain, J. The cancer genome atlas: new weapon in old war? Biotechnology Healthcare. 3 (2), 46-51 (2006).
- Weinstein, J. N., et al. The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project. Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Carlson, B. Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials. Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).
- Huang, R. P. Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).
- Rani, S., O'Driscoll, L. Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays. Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).
- Kani, K., et al. JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).
- Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. Jr Signal transduction and the control of gene expression. Science. 295 (5556), 813-818 (2002).
- Rikova, K., et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).
- Chen, V. W., et al. Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system. Cancer. 120, Suppl 23. 3793-3806 (2014).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Ward, J. H. Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function. Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Griffin, J., et al. Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation. Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).
- Zhou, T., et al. Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).
- McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. Hypoxia, oxidative stress and inflammation. Free Radical Biology and Medicine. , In Press (2018).
