Summary
Qui, presentiamo un protocollo per le matrici di anticorpo di identificare le alterazioni in vie di segnalazione in vari modelli di cellulari. Questi cambiamenti, causati da farmaci/ipossia/ultra-ultravioletti luce/radiazione, o da sovraespressione/downregulation/Ko, sono importanti per vari modelli di malattia e possono indicare se una terapia sarà efficace oppure può identificare meccanismi di farmaci resistenza.
Abstract
Malati di cancro con un regolamento aberrante delle reti di fosforilazione della proteina sono spesso trattati con gli inibitori della chinasi della tirosina. Si avvicina l'85% i tassi di risposta sono comuni. Purtroppo, i pazienti diventano spesso refrattari al trattamento, modificando la loro vie di trasduzione del segnale. Un'implementazione di delineamento di espressione con microarrays può identificare le modifiche nel complesso a livello di mRNA e proteomica può identificare le modifiche globali nei livelli della proteina o in grado di identificare le proteine coinvolte, ma l'attività della trasduzione del segnale le vie possono essere stabilite solo interrogando modificazioni post-traduzionali delle proteine. Di conseguenza, la capacità di identificare se un trattamento farmacologico è successo o se la resistenza è sorto, o la possibilità di caratterizzare eventuali alterazioni nelle vie di segnalazione, è una sfida clinica importante. Qui, forniamo una spiegazione dettagliata di matrici di anticorpo come uno strumento che può identificare le alterazioni a livello di sistema in varie modificazioni post-traduzionali (ad es., fosforilazione). Uno dei vantaggi dell'utilizzo di matrici di anticorpo include la loro velocità e accessibilità (matrice non richiede sia un esperto di proteomica o costose apparecchiature). La disponibilità di una combinazione di modificazioni post-traduzionali di targeting di matrici è il limite principale. Inoltre, approcci imparziali (fosfoproteomica) possono essere più adatti per la scoperta di romanzo, considerando che le matrici dell'anticorpo sono ideali per le destinazioni più ampiamente caratterizzate.
Introduction
L'implementazione clinica degli inibitori mirati tirosina chinasi (TKI) ha trasformato il trattamento del cancro, fornendo i medici con strumenti efficaci per indirizzare le proteine specifiche che promuovere la trasformazione neoplastica. Questi composti inibiscono o bloccano la fosforilazione delle proteine bersaglio di tirosina chinasi1,2. TKI sono state sviluppate in parte perché le alterazioni genetiche in chiave di vari geni di segnalazione sono sufficienti per l'inizio del cancro di unità e progressione [ad es., recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), tirosina-chinasi di proto-oncogene Src (SRC), BCR-ABL e il recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2)]3,4. L'impatto di TKI il ciclo cellulare5 e la segnalazione molecolare vie6 rappresenta una trasformazione dal non mirati per il trattamento del cancro molecolarmente guidate. Il vantaggio chiave di TKI versus chemioterapia è i tassi di risposta aumentata e il minor rischio di tossicità per le cellule sane7. Di conseguenza, sta aumentando l'attenzione sulla ricerca e lo sviluppo del romanzo TKI.
Accesso ai risultati di sequenziamento genomico iniziato con il progetto genoma umano8,9,10 e continua ancora oggi con vari generazione (NextGen) cancro sequenziamento sforzi [ad es., The Cancer Genome Atlas (TCGA)11,12]. Questo ha ispirato molte metodologie sperimentali che forniscono informazioni simultanee su migliaia di geni e/o forniscono imparziale istantanee di geni o proteine modulate da perturbazioni biologiche13. Poiché il regolamento della funzione cellulare avviene a più livelli, dalla trascrizione di geni per la modificazione post-traduzionale delle proteine e la loro attività, una completa comprensione degli eventi controllando la funzione cellulare sarà in definitiva richiede un'integrazione di dati da varie letture biologiche. La possibilità di monitorare i livelli di RNA messaggero (mRNA) di migliaia di geni con una risoluzione di singole cellule gene ha aumentato la capacità di fare inferenze circa la funzione del gene e le interazioni a livello di intero genoma. Tuttavia, l'interpretazione di matrici di espressione genica sarà sempre intrinsecamente incompleta senza l'integrazione di altri livelli del regolamento: vale a dire, i livelli di espressione della proteina, gli Stati di modificazione della proteina e la post-traduzionale della proteina modifiche (fosforilazione, ubiquitylation, metilazione, ecc.). Qui, descriviamo l'utilità delle matrici di anticorpo come mezzo per interrogare le modificazioni post-traduzionali delle componenti importanti di segnalazione in funzione delle diverse condizioni in un singolo esperimento14,15, 16.
Matrici di fosfo-anticorpo possono essere impiegate per distinguere e analizzare i cambiamenti nelle vie di trasduzione segnale16. Questi possono derivare da una modificazione genetica o trattamenti di linee cellulari con gli inibitori della chinasi, chemioterapici, stress causato da inedia di privazione, ipossia o nel siero di glucosio. Di nota, di resistenza ai farmaci o di un gene specifico - up o downregulation può anche causare cambiamenti nelle vie di trasduzione segnale17.
Resistenza ai farmaci, ad esempio, possa derivare da mutazioni dell'obiettivo della droga per evitare la sensibilità. Nel cancro del polmone, noto le mutazioni di EGFR rendono il cancro insensibile a certe TKI, ma più suscettibili di altri. Vie di segnalazione alternativa può essere attivato su mutazione17. Come applicazione più ampia per l'identificazione delle vie di trasduzione del segnale coinvolte nella resistenza e ipossia, ecc., matrici di fosfo-anticorpo forniscono ulteriori approfondimenti, e di conseguenza capire, i meccanismi coinvolti.
Tecnologie che permettono una valutazione delle modifiche della proteina rappresentano una componente importante della biologia dei sistemi, perché spesso servono una funzione regolatrice, ad esempio modulando l'attività di un enzima o le interazioni fisiche tra proteine. L'importanza delle modificazioni post-traduzionali è illustrata dal ruolo di fosforilazione della proteina in quasi tutti i segnale extracellulare indotta trasduzione vie18. Tradizionalmente, l'identificazione delle chinasi o lo stato di fosforilazione di proteine anche potrebbe essere determinato da analisi Western blot, soprattutto se il ricercatore è interessato a soltanto 1 – 5 destinazioni. Tuttavia, Western blot sono molto selettivi e può essere orientato alla conoscenza preventiva e potrebbe perdere importanti obiettivi di conseguenza. Anticorpo Array forniscono una lettura di medio-velocità effettiva di bersagli multipli incorporando vari anticorpi di cattura [tortiera specifica fosforilato tyrosine(s), anti-ubiquitina, ecc.], su una matrice solida (ad es., vetro o nitrocellulosa). Anticorpi secondari forniscono informazioni su proteine specifiche in un formato di base di sandwich ELISA (Figura 1). Questo test diventa più potente e pertinenti come più bersagli sono di interesse o la conoscenza è limitata15. Il phospho-matrici sono più largamente impiegabili come possono confrontare fosforilazione come pure la quantità generale di proteine di una più ampia varietà di obiettivi in un esperimento e fornire una quantificazione significativamente migliorata tramite spettrometria di massa. Questa tecnica non è applicabile per l'identificazione dei siti di fosforilazione di nuove o sconosciute.
Su larga scala basati sulla spettrometria di massa proteomica potrebbe essere impiegato per identificare i siti di fosforilazione specifico di proteine19. Sebbene questa tecnica può enumerare migliaia di eventi post-traduzionali, richiede strumentazione costosa, pipeline sperimentale dedicati e un know-how computazionale che sono oltre la portata della maggior parte dei ricercatori.
Le matrici anticorpo forniscono una lettura simultanea su varie proteine letture16. Questi possono essere cambiamenti nella proteina ubiquitylation (ubiquitina matrice) o fosforilazione. Il vantaggio principale di questa tecnologia di matrice è che esso fornisce importanti feedback sullo stato biologico dei vari percorsi biologici associati ai parametri di cellula importante (proteina di kDa 53, p53, recettori tirosino-chinasi e vie intracellulari) contemporaneamente. Inoltre, è possibile combinare diversi tipi di matrici per aumentare la penetrazione di un test (ad es., apoptosi e ubiquitina e la fosforilazione). Questa capacità di combinare più matrici per valutare varie alterazioni post-traduzionali in diversi campioni contemporaneamente in un modo di tempo e costi efficaci che non necessita di strumentazione specifica o esperienza è un significativo vantaggio nel caso di matrici di anticorpo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. estrazione di proteine
- Piastra 5 x 106 cellule su una piastra di coltura del tessuto di 10 mm (o beuta) in una cappa di coltura del tessuto. Contare le celle al momento della placcatura con un contatore automatico delle cellule o un emocitometro. In alternativa, stimare il numero di celle.
- Sciacquare le cellule coltivate sulla piastra di 10 mm (o beuta) accuratamente 3 x 10 ml di tampone fosfato salino (PBS) (pH = 7.4). Assicurarsi di rimuovere tutti i PBS prima di aggiungere il buffer di lisi.
Nota: Il buffer di Lisi è di solito fornito con il kit. In caso contrario, utilizzare un tampone del saggio di radioimmunoprecipitation (RIPA) o qualsiasi altri buffer di lisi delle cellule contenenti un cocktail di inibitori di proteasi e fosfatasi. - Lyse 1 x 107 cellule/mL di cellule nel buffer di lisi aggiungendo la giusta quantità di buffer per le cellule e raschiando le cellule con un raschietto di cella nel buffer di lisi. (ad es., per le cellule HeLa e MiaPaCa-2, utilizzare 600 µ l per piastra di 10 cm).
- Pipettare lisato su e giù (circa 10 volte) e trasferirlo in una nuova provetta da 1,5 mL.
- Incubare i lisati per 30 min a 4 ° C, preferibilmente in un rocker/agitatore. Premere il lisato attraverso una siringa con un ago da 27 G x 10 assicurare un'interruzione corretta della cell membrane(s). In alternativa, Sonicare lisato. Memorizzare i lisati a-20 ° C o utilizzarli immediatamente.
- Centrifugare il lisato a 14.000 x g a 4 ° C per 15 min e trasferire il surnatante in una provetta pulita da 1,5 mL.
- Quantificare la quantità di proteina totale di bicinconinico dosaggio acido (BCA)20 o un equivalente come Lowry o Bradford e continuare con almeno 50 – 400 μg. Utilizzare le proteine immediatamente o aliquota e congelare/negozio a-70 ° C (evitare più cicli di gelo-disgelo).
2. umano Phosphokinase Array
- Portare tutti i reattivi a temperatura ambiente prima di iniziare (per circa 1 h).
Nota: Tutti i reagenti ed usura in plastica sono inclusi nel kit. - Preparare tutto il fresco di reagenti (buffer di matrice) prima di iniziare la procedura seguendo le istruzioni del produttore (a seconda della scelta di obiettivi/matrici, le istruzioni potrebbero variare leggermente).
- Ricostituire i cocktail di anticorpo di rilevazione in 100 μL di acqua deionizzata o seguire le istruzioni del produttore dovrebbe si differenziano per la provetta da 1,5 mL fornita.
- Preparare il tampone di lavaggio 1X diluendo 40 mL di tampone di lavaggio in 960 mL di acqua deionizzata: 25x e mescolare capovolgendo.
Nota: I cristalli si dissolvono a temperatura ambiente. Il buffer può ingiallire nel tempo, ma continuerà a funzionare. - Pipettare 1 mL di buffer di matrice 1 in tutti i pozzetti di un multi-vassoio 8 pozzetti (o 2 mL in un multi-vassoio 4 pozzetti).
- Con pinzette piatto-punta, togliere le membrane di matrice tra i fogli protettivi e metterli nei pozzetti. Assicurarsi che i numeri sulla membrana siano rivolti verso l'alto.
Nota: Al momento dell'immersione, il colorante sulla membrana scomparirà. - Coprire la piastra con un coperchio e incubare su un dondolo shaker a piattaforma per 60 min a temperatura ambiente.
Nota: Questo è il passo di blocco di membrana. - Durante il periodo di incubazione, è necessario preparare i campioni della proteina. Aggiungere 50 – 100 μg di proteine totali. Diluire il lisato, avendo un volume massimo di 334 μL, con buffer di Lisi ad un volume finale di 1 mL.
Nota: 50 – 100 μg di proteina totale è sufficiente di solito. - Aspirare con cura il buffer di matrice 1 e incubare le membrane con 1 mL dei campioni durante la notte a 2 – 8 ° C in un agitatore di piattaforma a dondolo.
Nota: Non toccare/zero le membrane. - Il giorno successivo, lavare la matrice accuratamente rimuovendo ogni matrice e posizionarla in singoli contenitori di plastica (circa 8 x 11 cm2) con 20 mL di tampone di lavaggio 1x 1. Lavare le membrane 3 x 10 min su una piattaforma a dondolo in 1x tampone di lavaggio a temperatura ambiente.
- Aggiungere 20 μL dell'anticorpo ricostituito cocktail dal passaggio 2.3 a 1 mL di tampone di matrice 2 1x. Aggiungere 1 mL di questa soluzione ad ogni 8-pozzetto per essere utilizzato.
- Rimuovere con cautela le membrane dai vassoi di lavaggio. Asciugare il bordo inferiore su carta assorbente per rimuovere qualsiasi tampone di lavaggio in eccesso e trasferirli nuovamente dentro il cassetto contenente i cocktail di anticorpi. Coprire la piastra con il coperchio e incubare per 2 ore a temperatura ambiente su una piattaforma a dondolo. Sciacquate i vassoi usati con dH2O bene e asciugarli per un successivo utilizzo.
- Ogni matrice di rimuovere delicatamente e inserire nuovamente i contenitori di plastica pulito individuali (circa 8 x 11 cm2) con 20 mL di tampone di lavaggio 1X. Lavare 3 x 10 min con il tampone di lavaggio su una piattaforma a dondolo a temperatura ambiente.
- Diluire la streptavidina-HRP (fornito con il kit) o tintura di streptavidina-fluorescente (per una rilevazione più quantitativa) 1:1,000 in 1x tampone di matrice 2 in una provetta da 15 mL.
- Restituire le membrane nei piatti 8 pozzetti contenenti la soluzione HP e li Incubare 30 min a temperatura ambiente su una piattaforma a dondolo (se usando la fluorescenza, avvolgere il vassoio nella carta stagnola per evitare qualsiasi esposizione alla luce).
- Rimuovere il tampone in eccesso ponendo la membrana tra 2 pezzi di 5 mm di carta 3M. Per l'imaging con un imager chemiluminescente/pellicola di raggi x, incubare le membrane secche con una soluzione di rilevamento di HRP (mescolare le due soluzioni chemiluminescente 1:1) per 3 min e posizionare la membrana in un foglio di plastica trasparente di protezione.
Nota: Membrane(s) secchi può essere anche inserito in un imager fluorescente per rilevare il segnale fluorescente; ridurre al minimo l'esposizione alla luce per la membrana prima di formazione immagine. Per una quantificazione dei file x-ray film o imager, evitare la sovraesposizione. La maggior parte a chemiluminescenza/fluorescente Imager hanno una funzione per evitare una saturazione del segnale.
3. analisi dei dati
- ImageJ, un'immagine elaborazione programma21, di scaricare e installare il software.
- Aprire ImageJ facendo doppio clic sul 'Icona ImageJ'. Selezionare l'immagine per essere analizzati facendo clic su 'File' nella barra dei menu, quindi selezionare 'Apri' dal menu a discesa e Sfoglia i file del computer per l'immagine di interesse. Fare clic sul file per aprirlo.
- Invertire l'immagine per l'analisi (macchie nere su fondo bianco a macchie bianche su sfondo nero) facendo clic su 'Modifica' nella barra dei menu e selezionando 'Invert' dal menu a discesa.
- Selezionare l'icona' ovale' dalla barra degli strumenti (la seconda opzione nella barra degli strumenti di ImageJ). Cliccando sulla foto (traversa nera) e muovendo il mouse per disegnare un cerchio o ovale. Regolare la dimensione/forma di cerchio o ovale per circondare i puntini sulla macchia del puntino.
- Fare clic su 'Analizzare' nella barra dei menu e quindi selezionare 'Misura' dal menu a discesa per aprire automaticamente una nuova finestra con i valori dell'area selezionata (zona, media, minimo e massimo).
- Spostare l'area circolare trascinando il cerchio dal centro (mettere il punto di destra freccia nel mezzo) e posizionarlo intorno alla zona di misurazione (dot) successiva. Misurare tutti i punti di interesse, il controllo positivo, controllo negativo e lo sfondo per l'analisi.
Nota: Il controllo negativo è il PBS, lo sfondo è una parte della membrana senza alcuna macchia (qualsiasi parte farà) e il controllo positivo è un controllo fornito dal produttore. - Selezionare i punti di controllo negativo di PBS e sottrarre il valore da ogni posto. Media intensità per ogni coppia di punti duplicati che rappresentano ogni recettore tirosina chinasi (RTK). Ogni intensità media può essere correlato al controllo per calcolare la variazione di piega.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Per studiare l'effetto di resistenza TKI su vie di trasduzione del segnale nelle linee cellulari, quattro campioni sono stati analizzati. Esempio di un controllo (H3255r1) e 3 linee di cellulari TKI-resistente (H3255r2-4) (Figura 2) sono stati collegati al modello spot anticorpo (Figura 3). Tutti e 4 i campioni sono stati preparati usando questo protocollo. Sei fosfoproteine con attività differenziale sono stati scelti per la dimostrazione dell'analisi delle matrici dell'anticorpo (Figura 4). La mappa di calore (Figura 5) consente una lettura semi-quantitativa sui cambiamenti nella fosforilazione della proteina di proteine di transduction del segnale importante. La convalida dei risultati matrice può essere completata implementando approcci ortogonali, come Western blotting.
Figura 1: schematico di matrici semi-quantitativa degli anticorpi. Le matrici di anticorpo si basano sul principio sandwich immunoassay, dove una raccolta di anticorpi di cattura è incorporata in vetro o il supporto di nitrocellulosa. I lisati cellulari vengono incubati con la membrana e le matrici sono sottoposti ad anticorpi secondari. Una semi-quantitativa della lettura può essere ottenuta dal substrato chemiluminescente o, per ulteriori informazioni quantitative, acquisizione di immagini basata su fluorescente. Tutti i segnali derivati da film o immagini TIF possono essere trattati mediante densitometria e un calcolo delle piega-modifiche per ogni proteina. L'intero processo dura circa giorno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: matrice di fosfo-anticorpo di esempio sviluppato con l'imager. Le macchie fluorescenti vengono rilevate in duplice copia (due punti per ogni destinazione). I campioni e i punti di controllo positivo mostrano intensità variabile. Mostrato qui è il confronto tra il H3255r1 TKI-sensibile e 3 matrici di campione resistente (H3255r2-4), ognuno diviso in membrana A e B. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: mappa dei luoghi matrice. La mappa collega i punti agli obiettivi dell'anticorpo. Le macchie sono etichettate A - G in verticale e 1-10 in orizzontale. Il controllo positivo (arancione) è presente su tutte le membrane e solitamente si trova negli angoli. Il controllo negativo di PBS è evidenziato in nero, mentre le macchie di campione sono evidenziate in giallo. Per ogni matrice, viene anche fornito un elenco degli anticorpi per l'identificazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: esempio di analisi di dati. Controllo (A), l'intensità dei luoghi di interesse, il positivo e lo sfondo sono stati identificati sulla mappa e misurato per tutti i campioni. (B), la relativa intensità (intensità spot con l'intensità di sfondo rimosso e normalizzato ad un'intensità di controllo positivo) viene visualizzata in un grafico a barre per pochi candidati scelti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: mappa termica di segnalazione differenziale in H3255 sensibili (r1) e linee cellulari resistenti (r2-4). Un'intensità relativa di spot è stata utilizzata per generare una mappa di calore per un confronto dei cambiamenti in CREB, P53, AKT e STAT5 in tutti e 4 i campioni. Qualsiasi alti livelli vengono visualizzati in varie tonalità di rosso, mentre qualsiasi livelli inferiori sono visualizzati in blu22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Approcci che combinano molte letture biologiche sono intrinsecamente più accurate rappresentazioni del macchinario cellulare in un esperimento effettuato. L'avvento di matrici di fosfo-anticorpo consente una rapida caratterizzazione del modello di modifiche che possono essere più informativo dello stato di aggiornamento di ogni singola proteina. Il flusso di lavoro generale per l'applicazione di matrici di fosfo-anticorpo si basa su una modifica in serina, treonina o tirosina. In questo esempio viene focalizzata su che caratterizza i cambiamenti connessi con la resistenza alla terapia nel cancro polmonare. La motivazione principale per questa applicazione è che la fosforilazione della proteina svolge un ruolo centrale nella trasduzione del segnale in molti tumori umani18, e questo metodo saranno trasferibile ad altri sistemi. Una disregolazione della fosforilazione in cancro coinvolge solitamente l'iperattivazione di una tirosina chinasi, e di conseguenza, i substrati fosforilati (spesso compreso la chinasi fosforilata auto stessa) sono presenti a livelli superiori nel normale impostazioni di fisiologiche e, di conseguenza, può rendere una frazione significativa di fosfoproteine in una cellula tumorale. Questi livelli elevati di fosforilazione renderà più facile la rilevazione. Inoltre, fosforilazione della proteina ha un significato medico, dal momento che la fosforilazione della tirosina aberrante è un segno distintivo di molti tipi di cancro23. Inoltre, poiché questa tecnica è trasferibile all'indagine su altri sistemi biologici che utilizzano fosforilazione, molte delle caratteristiche descritte qui potrebbe facilmente essere regolati a concentrarsi su altri tipi di matrici di proteina (ubiquitina, apoptosi, ecc).
Matrici di fosfo-anticorpo sono ampiamente usate per l'identificazione di eventuali vie di segnale coinvolte, un metodo esplorativo o come verifica di una via particolare. Varie aziende fanno kit per sia lo stato di fosforilazione e per i livelli complessivi di proteine. Mentre l'analisi di reazione a catena (PCR) in tempo reale della polimerasi o microarrays sono molto più quantitativi, prendono solo i livelli del mRNA in considerazione, e non possono essere affrontate una traduzione, come pure le modificazioni post-traduzionali. Oltre a fosforilazione, altre modifiche post-traduzionali come la glicosilazione o ubiquitylation possono essere indirizzate anche da matrici24,25.
Uno dei fattori importanti da considerare prima di iniziare le matrici dell'anticorpo è di iniziare con cellule sane e attivamente demarcazione. Ipossia, stress ossidativo e l'infiammazione può produrre cambiamenti nel di vie di trasduzione di segnale26 che possono falsare i risultati e rendere un'interpretazione errata se trattata in modo non corretto. Questo stress può essere attribuito per la formulazione dei media o di placcatura troppo poco o troppo molte celle o per esposizione delle cellule agli ambienti scarsamente regolamentati, o a trattare il controllo contro i campioni in modo leggermente diverso. Abbiamo anche notato grandi differenze nel numero di passaggio o il tempo della cultura post-scongelamento. La chiave per evitare queste variabili introdotte artificialmente è tenere tutto tra i campioni più costanti possibile. Non modificare la percentuale FBS o il volume dei supporti, ecc., durante l'esperimento.
L'analisi dei dati dovrebbe anche essere considerato prima di iniziare un esperimento di matrice. Un'analisi chemiluminescente matrice è solo semi-quantitativa, e la sua gamma dinamica è circa un ordine di grandezza, mentre un approccio fluorescente aumenta la gamma dinamica di circa due ordini di grandezza. La scala su cui vengono eseguite le matrici dipende le domande biologiche specifiche. È possibile analizzare una linea cellulare resistente specifici di interesse per tutte le modifiche traduzionali rispetto alla linea cellulare originale o di concentrarsi su un particolare percorso per un'ampia varietà di linee cellulari resistenti. La scalabilità di questo approccio dovrebbe essere considerata nelle fasi iniziali di pianificazione. Inoltre, i risultati di una matrice di anticorpo sempre dovrebbero essere confermati da un metodo secondario su campioni freschi e/o i lisati stessi. Un'analisi di western blot può essere impiegata per verificare le modifiche per obiettivi specifici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati per il generoso sostegno finanziario del Lawrence J. Ellison Istituto di Transformative medicina di USC (un regalo di David Agus). Apprezziamo il sostegno dell'autunno Beemer e Lisa Flashner che portano alla generazione e pubblicazione di questo manoscritto. Ringraziamo Laura Ng per il suo sostegno amministrativo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
| Tissue Culture dish 100 mm | TRP | 93100 | |
| ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27 G5/8, 1 mL for needle treatment of protein samples |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
| LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |
References
- Knauer, D. J., Smith, G. L. Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).
- Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).
- Di Fiore, P. P., et al. Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells. Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).
- Maguire, H. C., Greene, M. I.
- Busse, D., et al. Reversible G(1) arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27(KIP1) independent of MAPK activity. Journal of Biological Chemistry. 275 (10), 6987-6995 (2000).
- Kondapaka, B. S., Reddy, K. B. Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer. Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).
- Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. [Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).
- Dulbecco, R. A turning point in cancer research: sequencing the human genome. Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).
- Barinaga, M. DoE provides funds for human genome sequencing. Nature. 331 (6152), 103 (1988).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
- McCain, J. The cancer genome atlas: new weapon in old war? Biotechnology Healthcare. 3 (2), 46-51 (2006).
- Weinstein, J. N., et al. The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project. Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Carlson, B. Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials. Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).
- Huang, R. P. Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).
- Rani, S., O'Driscoll, L. Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays. Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).
- Kani, K., et al. JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).
- Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. Jr Signal transduction and the control of gene expression. Science. 295 (5556), 813-818 (2002).
- Rikova, K., et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).
- Chen, V. W., et al. Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system. Cancer. 120, Suppl 23. 3793-3806 (2014).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Ward, J. H. Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function. Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Griffin, J., et al. Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation. Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).
- Zhou, T., et al. Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).
- McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. Hypoxia, oxidative stress and inflammation. Free Radical Biology and Medicine. , In Press (2018).
