Summary
Burada, bir protokol sinyal yolları çeşitli hücresel modellerinde değişiklikler tanımlamak antikor diziler için mevcut. Uyuşturucu/hipoksi/ultra-violet ışık/radyasyon, veya overexpression/downregülasyon/altını gizleme, neden bu değişiklikleri çeşitli hastalık modelleri için önemlidir ve bir tedavi etkili olacak veya mekanizmaları ilaçların belirleyebilirsiniz olup olmadığını gösterir direnç.
Abstract
Kanserli hastalarda anormal bir protein fosforilasyon ağları Yönetmeliği ile sık sık Tirozin kinaz inhibitörleri ile tedavi edilir. Yanıt oranları % 85 yaklaşan yaygındır. Ne yazık ki, hastalar sık sık onların sinyal iletim yollarının değiştirerek tedaviye refrakter hale. İfade ile microarrays profil uygulaması genel olarak mRNA düzeyinde yapılan değişiklikler belirleyebilir ve proteomik protein düzeyleri genel değişiklikleri belirleyebilir veya proteinler yer ama sinyal iletimi etkinliğini belirleyebilirsiniz yollar yalnızca proteinlerin translasyonel modifikasyonlar sorguya tarafından kurulmuş. Sonuç olarak, uyuşturucu tedavisi başarılı olup veya direnç ortaya çıktı olup olmadığını tanımlama yeteneği veya sinyal yolları, herhangi bir değişiklik karakterize yeteneği bir önemli klinik mücadeledir. Burada, sistem genelinde değişiklikler çeşitli post-translational değişiklikleri (Örneğin, fosforilasyon) tanımlayabilirsiniz bir araç olarak antikor diziler ayrıntılı bir açıklama sağlamak. Bir antikor dizileri kullanma avantajları onların Erişilebilirlik (bir dizi proteomik bir uzman ya da pahalı ekipman gerektirmez) da içerir. Dizilerin birleşimi translasyonel modifikasyonlar hedefleme birincil sınırlama olduğunu. Buna ek olarak, antikor diziler en çok karakterize hedefler için idealdir, ancak tarafsız yaklaşımlar (phosphoproteomics) yeni keşif için daha uygun olabilir.
Introduction
Hedeflenen Tirozin kinaz inhibitörleri (TKI) klinik uygulama hekimler etkili araçlar ile spesifik proteinlerin hedef o sürücü neoplastik dönüşüm sağlayarak kanser tedavisi dönüştürdü. Bu bileşiklerin inhibe veya tarafından Tirozin kinaz1,2hedeflenen protein fosforilasyon engeller. Çünkü genetik değişiklikler içinde çeşitli anahtar genlerin sinyal sürücü kanser başlama ve ilerleme [Örneğin, epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), proto-oncogene protein Tirozin kinaz Src (SRC), yeterli TKIs kısmen geliştirilmiştir BCR-ABL ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2)]3,4. Hücre döngüsü5 ve moleküler sinyal yolları6 TKIs etkisi hedefsiz bir dönüşüm tatlı rehberli kanser tedavisi için temsil eder. TKIs karşı kemoterapi önemli avantajı artan yanıt oranları ve toksisite sağlıklı hücreleri7düşük riski var. Sonuç olarak, orada araştırma ve geliştirme roman TKIs dikkat artmaktadır.
Genomik sıralama sonuçlarına erişim insan genom projesi8,9,10 ile başladı ve bugün çeşitli yeni nesil (NextGen) kanser sıralama çabaları ile [Örneğin, kanser genom devam ediyor Atlas (TCGA)11,12]. Bu genler binlerce üzerinde eş zamanlı bilgi sağlar ve/veya tarafsız anlık görüntülerini genleri veya biyolojik tedirginlikler13tarafından modüle proteinler sağlamak birçok deneysel metodolojileri ilham kaynağı olmuştur. Proteinler ve faaliyetlerini, translasyon modifikasyon için genlerin transkripsiyon üzerinden birden çok düzeyinde hücresel fonksiyon Yönetmeliği oluşur bu yana hücresel fonksiyon kontrol olayları tam bir anlayış olacaktır Sonuçta çeşitli biyolojik veriler veri tümleştirme gerektirir. Bir tek hücreli gen çözünürlük ile gen binlerce mesajcı RNA (mRNA) düzeyde izleme olanağı bir bütün-genom ölçekte gen işlev ve etkileşimleri hakkında çıkarımlar yapma yeteneğini artmıştır. Ancak, gen ifade dizi yorumu her zaman doğal olarak yönetmeliğin diğer düzeyleri Integration eksik olacaktır: Yani, protein ifade düzeyleri, protein değişiklik Birleşik ve protein translasyon değişiklikler (fosforilasyon, ubiquitylation, metilasyon, vb). Burada, antikor diziler yardımcı programını bir tek deneme14,15, çeşitli koşullarda bir fonksiyonu olarak önemli sinyal bileşenlerinden translasyonel modifikasyonlar sorgulamak için araç olarak tarif 16.
Fosfo-antikor diziler ayırt etmek ve sinyal iletim yollarının16değişiklikleri analiz etmek için istihdam edilebilir. Bunlar bir genetik değişiklik veya hücre hatları ile kinaz inhibitörleri, chemotherapeutics, glikoz yoksunluğu, hipoksi veya serum açlık tarafından neden stres tedaviler ortaya çıkabilir. Not, ilaç direnci veya belirli bir gen yukarı veya downregülasyon da değişiklikler sinyal iletim yollarının17' neden olabilir.
İlaç direnci, örneğin, hassasiyeti önlemek için uyuşturucu hedefinin mutasyonlar ortaya çıkabilir. EGFR mutasyon render kanser belirli TKIs ettirilecektir ama diğerleri daha duyarlı akciğer kanseri bilinen. Alternatif yollar sinyal mutasyon17etkinleştirilebilir. Sinyal iletim yollarının direnç ve hipoksi, vbdahil tanımlanması için daha geniş bir uygulama olarak Fosfo-antikor diziler daha fazla içgörü sağlamak ve sonuç olarak anlaşılmasını, mekanizmaları dahil.
Çünkü onlar sık sık bir enzim veya proteinler arasındaki fiziksel etkileşim aktivitesinin oransal gibi düzenleyici bir işlevi, hizmet protein değişiklikleri bir değerlendirmesini izin teknolojileri sistemleri biyoloji önemli bir bileşeni temsil eder. Translasyonel modifikasyonlar önemini rolü neredeyse tüm hücre dışı tetikleyen sinyal iletim yollarının18protein fosforilasyon tarafından gösterilmektedir. Özellikle araştırmacı sadece 1-5 hedefleri ilgi ise geleneksel olarak, kimlik kinaz veya protein fosforilasyon durumunu da Western blot analizi ile tespit edilemedi. Ancak, Batı lekesi çok seçici ve ön bilgi doğru önyargılı ve önemli hedefler sonucunda kaçırabilirsiniz. Antikor array(s) katı bir matris (Örneğin, cam veya nitroselüloz) [pan özgü fosforile tyrosine(s), anti-Ubikuitin, vb] çeşitli yakalama antikorlar gömerek birden çok hedef bir orta-den geçerek okuma sağlar. İkincil antikorlar spesifik proteinlerin bir sandviç tabanlı ELISA biçiminde (Şekil 1) hakkında bilgi vermek. Bu tahlil daha fazla hedefleri ilgi veya ön bilgi sınırlı15gibi daha güçlü ve uygun olur. Fosforilasyon yanı sıra genel hedefleri bir denemede daha çok protein miktarda karşılaştırın ve önemli ölçüde geliştirilmiş bir miktar üzerinde kütle spektrometresi sağlamak gibi Fosfo-diziler daha geniş istihdam vardır. Bu teknik yeni veya önceden bilinmeyen fosforilasyon siteleri tanımlanması için geçerli değildir.
Büyük ölçekli kütle spektrometresi tabanlı proteomik proteinler19belirli fosforilasyon siteleri belirlemek için istihdam olabilir. Her ne kadar bu teknik post-translational olaylar binlerce sıralayabilirsiniz, pahalı araçları, adanmış deneysel boru hatları ve ötesinde çoğu araştırmacı olan sayısal bir uzmanlık gerektirir.
Antikor dizileri çeşitli protein dökümanları16tarihinde bir eşzamanlı okuma sağlar. Bunlar protein ubiquitylation (Ubikuitin dizi) veya fosforilasyon değişiklikler olabilir. Bu önemli hücre parametreleri (protein 53 kDa, p53, reseptör Tirozin kinaz ve hücre içi yollar) ile ilişkili çeşitli biyolojik yollar biyolojik durumunu önemli geri bildirim sağlar bu dizi teknoloji önemli avantajı olduğunu aynı anda. Buna ek olarak, bir tahlil (Örneğin, apoptozis ve ubiquitin ve fosforilasyon) penetrasyonu artırmak için çeşitli dizi türlerini birleştirmek mümkündür. Çeşitli örnekleri çeşitli post-translational değişiklikler aynı anda belirli araçları veya uzmanlık gerektirmeyen bir zaman ve cost effective şekilde değerlendirmek için birden çok dizi birleştirmek için bu durumda önemli bir avantaj yeteneğidir antikor dizileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. protein çıkarma
- 5 x 106 hücre 10 mm doku kültürü plaka (veya cep şişesi) doku kültürü mahallede plaka. Bir otomatik hücre sayaç veya hemasitometre ile kaplama zaman içindeki hücreleri saymak. Alternatif olarak, hücre sayısı tahmin ediyoruz.
- 10 mm plaka (veya cep şişesi) yetiştirilen hücrelerin durulama iyice 3 x 10 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ile (pH 7.4 =). Lizis arabellek eklemeden önce tüm PBS kaldırdığınızdan emin olun.
Not: Lizis arabellek genellikle kit ile sağlanır. Eğer değilse, daha sonra bir radioimmunoprecipitation tahlil arabellek (RIPA) veya kokteyl fosfataz ve proteaz inhibitörleri içeren herhangi bir diğer hücre lizis arabellek kullanın. - 1 x 107 hücre/mL hücre lizis arabellek arabellek doğru miktarda hücrelere ekleyerek ve hücreleri hücre sıyırıcı lizis arabelleğine kazıma parçalayıcı. (Örneğin, HeLa hücreleri ve MiaPaCa-2, için kullanın 10 cm tabak başına 600 µL).
- Lysate (yaklaşık 10 x) yukarı ve aşağı pipette ve yeni bir 1,5 mL tüp transferi.
- Lysates tercihen bir rocker/shaker üzerinde 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. Lysate bir şırınga ile 27 G iğneyle cell membrane(s) uygun bir bozulma emin olmak 10 x için tuşuna basın. Alternatif olarak, lysate solüsyon içeren temizleyicide. Lysates-20 ° C'de depolayın veya onları hemen kullanın.
- Lysate 14.000 x g 15dk için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant temiz 1.5 mL tüp aktarın.
- Bicinchoninic asit tahlil (BCA)20 veya eşdeğer Lowry veya Bradford gibi toplam protein miktarı quantitate ve en az 50-400 μg ile devam edin. Hemen proteinler veya aliquot kullanın ve donma/onları-70 ° C'de mağaza (birden çok donma-çözülme döngüsü önlemek).
2. insan fosfokinaz dizi
- Tüm reaktifler (yaklaşık 1 h için) başlamadan önce oda sıcaklığına getirmek.
Not: Tüm reaktifler ve plastik aşınma kiti dahildir. - Üreticinin yönergelerini izleyerek yordamına başlamadan önce tüm reaktifler taze (dizi arabellekleri) hazırlamak (hedefler/diziler seçime bağlı olarak, yönergeler biraz farklı olabilir).
- Deiyonize su 100 μL algılama antikor kokteyller yeniden oluşturmak veya 1,5 mL test sağlanan tüp için farklıdırlar üreticinin yönergeleri izleyin.
- 1 yıkama arabellek x 25 x 960 mL deiyonize su yıkama arabellekte 40 mL sulandrarak hazırlamak ve onları ters çevirme ile karıştırın.
Not: Oda sıcaklığında kristalleri geçiyoruz. Arabellek zamanla sararma ama yine de işe yarayacaktır. - 8-şey çoklu tepsi (veya 4-şey çoklu Tepsi 2 mL) dizi arabelleğe 1 her şey 1 mL pipet.
- Düz uçlu cımbız ile dizi membranlar koruyucu sayfaları arasına kaldırmak ve kuyu koyun. Zar üzerindeki sayılar yukarı bakacak şekilde emin olun.
Not: batma, membran üzerine boya yok olacaktır. - Tepsiyi bir kapak ile kapak ve oda sıcaklığında 60 dk için sallanan bir platform çalkalayıcı üzerinde kuluçkaya.
Not: Membran engelleme adım bu. - Kuluçka döneminde protein örnekleri hazırlayın. 50-100 μg toplam protein ekleyin. Lysate, son Hacim 1 ml lizis arabelleğe ile 334 μL maksimum hacmi olan sulandırmak.
Not: 50-100 μg toplam protein genellikle yeterlidir. - Dizi arabellek 1 dikkatle Aspire edin ve membranlar üzerinde sallanan bir platform shaker 2-8 ° C'de gecede örnekleri 1 mL ile kuluçkaya.
Not: touch/zarı çizik değil. - Ertesi gün, dizi ile 20 mL 1 x yıkama arabellek dikkatle her dizi kaldırma ve bireysel plastik kaplara (yaklaşık 8 x 11 cm2) yerleştirerek yıkayın. Arabellek oda sıcaklığında yıkama x 1 sallanan bir platformda membranlar 3 x 10 dk yıkayın.
- Sulandırılan antikor kokteyl 20 μL pipet 2.3-1 mL 1 x dizi arabellek 2 adım. Bu çözüm 1 mL her 8-kullanılmak üzere şey için ekleyin.
- Dikkatli bir şekilde membranlar yıkama tepsileri çıkarın. Herhangi bir fazla yıkama arabellek kaldırmak ve geri antikor kokteyller içeren tepsi aktarmak için kağıt havlu üzerine alt kenar leke. Tepsiyi kapak ile kapak ve sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya. İyice dH2O ile kullanılan tepsi durulayın ve kuru onları daha sonra kullanım için.
- Dikkatle her dizi kaldırmak ve yeniden 20 mL 1 x yıkama arabelleği ile temiz bireysel plastik kaplar (yaklaşık 8 x 11 cm2) içine koyun. 3 x 10 min yıkama arabellek ile Oda sıcaklığında sallanan bir platformda yıkar.
- Streptavidin-HRP (kit ile sağlanan) veya streptavidin-floresan boya (daha nicel bir algılama için) 1:1,000 dizi arabellekte 15 mL tüp bebek 2 x 1 oranında seyreltin.
- Membranlar HP çözüm içeren 8-iyi yemekleri dönün ve (floresan, kullanarak sararsan tepsiyi herhangi bir ışık maruz önlemek için alüminyum folyo) onları sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
- Aşırı arabellek membran arasında 2 adet 5 mm 3 M kağıt koyarak kaldırın. Görüntüleme ile bir x-ışını film/chemiluminescent Imager için 3 dk bir HRP algılama çözüm (mix iki chemiluminescent çözümleri 1:1) ile kurutulmuş membranlar kuluçkaya ve membran şeffaf plastik levha koruyucuya yerleştirmek.
Not: Kurutulmuş membrane(s) Floresan sinyali bir floresan Imager içinde yerleştirilebilir; membran görüntüleme önce ışık maruz en aza indirmek. Röntgen film ya da Imager dosyaları bir miktar için dozun kaçının. Çoğu chemiluminescent/floresan görüntüleme cihazları bir doygunluk sinyal önlemek için bir işlevi vardır.
3. veri analizi
- ImageJ, bir görüntü işleme programı21, download ve install belgili tanımlık bilgisayar yazılımı.
- ImageJ 'ImageJ simgesi'çift tıklatarak açın. 'Dosya' menü çubuğu tıklatarak analiz edilecek resmi seçin, ardından 'Açık' aþaðý açýlan menüsünden seçin ve faiz görüntüsünü bilgisayar dosyalara gözatmak. Dosyayı açmak için tıklatın.
- Resim analizi (beyaz arka planda siyah bir arka plan üzerinde beyaz lekeler için siyah noktalar) için 'Düzenle' menü çubuğunu tıklatıp 'Ters çevir' aþaðý açýlan menüsünden seçerek tersine çevirin.
- 'Oval simgesi' araç çubuğu (ImageJ araç çubuğundaki ikinci seçenek) seçin. Bir daire/oval resmi (siyah cross)'i tıklatarak ve fareyi hareket ettirerek çizin. Boyutu/nokta leke üzerinde nokta çembere daire/oval şeklini ayarlamak.
- Menü çubuğunda 'Analiz et' düğmesini tıklayın ve 'Ölçü' otomatik olarak seçili alanı (alan, ortalama, en az ve en fazla) değerleri ile yeni bir pencere açmak için aþaðý açýlan menüsünden seçin.
- Dairesel alan daire Merkezi (yerine ok sağ orta noktası) sürükleyerek hareket ve sonraki ölçüm (nokta) çevresini yerleştirin. Tüm spot renkleri faiz, pozitif kontrol, negatif kontrol ve arka plan analizi için ölçmek.
Not: PBS negatif denetimidir, arka plan membran (herhangi bir parçası yapacak) herhangi bir nokta olmadan bir parçasıdır ve olumlu denetim üreticisi tarafından sağlanan bir denetimdir. - PBS negatif kontrol noktaları seçin ve her nokta değerinden çıkarın. Ortalama Yoğunluk her yinelenen noktalar her reseptör Tirozin kinaz (RTK) temsil eden bir çifti için. Her ortalama yoğunluğu kat değişikliği hesaplamak için denetimi ile ilgili.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TKI direnci sinyal iletim yollarının hücre hatlarında üzerinde etkisini araştırmak için dört örnekleri analiz edildi. Bir denetimi örneğini (H3255r1) ve 3 TKI dayanıklı hücre hatları (H3255r2-4) (Şekil 2) spot antikor şablonu (Şekil 3) ile ilgili. Bu iletişim kuralını kullanan tüm 4 örnekleri hazırlanmıştır. Altı phosphoproteins fark aktivite ile antikor diziler (Şekil 4) analizini gösteri için seçilmiştir. Isı haritası (Şekil 5) protein fosforilasyon önemli sinyal iletim proteinlerin değişimler yarı nicel bir okuma sağlar. Dizi sonuçları doğrulanmasını Western Blot gibi dik yaklaşımlar, uygulama tarafından tamamlanabilir.
Şekil 1: yarı kantitatif antikor diziler şematik. Antikor diziler yakalama antikorlar topluluğu cam veya nitroselüloz destek nerede gömülü sandviç immunoassay ilkesine dayanır. Hücre lysates membran ile inkübe ve diziler için ikincil antikorlar tabi tutulmaktadır. Yarı nicel bir okuma chemiluminescent yüzeylerde veya daha fazla nicel bilgi alınabilir floresan tabanlı görüntüleme. Film ya da TIF görüntüler elde edilen herhangi bir sinyal Dansitometresi ve kat-değişiklikler her protein için bir hesaplama tarafından işlenen. Tüm süreç hakkında gün sürer. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: örnek Fosfo-antikor dizi geliştirilen ile Imager. Floresan noktalar Çoğalt (hedef başına iki noktalar) tespit edilir. Örnekleri ve olumlu denetim noktaları değişen şiddetlerde göster. TKI-duyarlı H3255r1 ve 3 dayanıklı (H3255r2-4) örnek dizilerin karşılaştırılması burada gösterilir, her bölme membran A ve b Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: dizi noktalar haritası. Harita noktalar antikor hedefe bağlar. Noktalar A - G 1-10 dikey hem de yatay olarak etiketlenir. Pozitif kontrol (turuncu) tüm Membranlar mevcuttur ve genellikle köşe kısımlarda bulunan. Örnek noktalar sarı ile vurgulanmış ise negatif PBS kontrol siyah vurgulanır. Her dizi için antikorlar, listesini de tanımlama için sağlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: veri analizi örneği. (A) faiz, olumlu noktalar yoğunluğunu kontrol ve arka plan harita üzerinde tespit ve tüm örnekler için ölçülür. (B) göreli yoğunluğunu (kaldırıldı ve yoğunluğunu pozitif kontrol için normalleştirilmiş arka plan yoğunluğu ile nokta yoğunluğu) birkaç seçilen adaylar için bir çubuk grafik olarak görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: H3255 duyarlı (r1) ve dayanıklı (r2-4) hücre satırlarını diferansiyel sinyal, ısı haritası. Göreli bir nokta yoğunluğu değişiklikleri karşılaştırması için bir ısı haritası CREB, P53, AKT ve STAT5 tüm 4 örnekleri oluşturmak için kullanılmıştır. Herhangi bir alt düzey mavi22görüntülenirken herhangi bir yüksek düzey çeşitli Kırmızı tonlarında görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Birçok biyolojik veriler birleştirmek yaklaşımlar yapılan bir deneyde hücresel makine doğal olarak daha doğru ifadeleridir. Fosfo-antikor diziler gelişiyle değişiklikler daha fazla protein var tek değişiklik durumundan daha bilgilendirici olabilir desen hızlı bir karakterizasyonu sağlar. Genel iş akışı Fosfo-antikor diziler uygulanması için bir değişiklik serin, treonin veya Tirozin temel alır. Bu örnek akciğer kanseri tedavi direnci ile ilişkili değişiklikler karakterize üzerinde duruldu. Bu uygulama için ana mantığı protein fosforilasyon sinyal iletimi birçok insan kanser18içinde merkezi bir rol oynar ve bu yöntem-ecek var olmak diğer sistemlere devredilemez olduğunu. Kanser fosforilasyon bir bozukluk genellikle Tirozin kinaz hyperactivation içerir, ve sonuç olarak, (genellikle otomatik fosforile kinaz kendisi de dahil olmak üzere) fosforile yüzeylerde daha yüksek düzeylerde normal mevcuttur fizyolojik ayarları ve buna göre kanser hücre phosphoproteins önemli bir kısmını yapabilir. Bu daha yüksek düzeyleri fosforilasyon algılama daha kolay hale getirecek. Ayrıca, anormal Tirozin fosforilasyon bir hallmark kanser23birçok türde olduğundan protein fosforilasyon tıbbi bir önemi vardır. Bu teknik fosforilasyon kullanmak diğer biyolojik sistemlerin incelenmesi için transfer edilebilir olduğundan, buna ek olarak, burada açıklanan özelliklerin çoğu kolayca diğer tip-in protein diziler (Ubikuitin, apoptozis, odaklanmak için ayarlanmış olabilir vb).
Fosfo-antikor diziler dahil, herhangi bir sinyal yolları bir keşif yöntemi veya doğrulama bir özel yolu olarak tanımlanması için yaygın olarak kullanılır. Çeşitli şirketler kitleri fosforilasyon durum ve proteinler genel düzeyde yapmak. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) analiz veya microarrays çok daha nicel olmakla birlikte, onlar göz önünde sadece mRNA düzeyleri ve bir çeviri yanı sıra translasyonel modifikasyonlar ele alınamaz. Fosforilasyon dışında diğer translasyonel modifikasyonlar glikozilasyon veya ubiquitylation gibi diziler24,25tarafından saptanabilir.
Bir antikor dizi başlamadan önce dikkat edilmesi gereken önemli faktör sağlıklı ve aktif sayesinde bunun bölünen hücreler ile başlamaktır. Hipoksi, oksidatif stres ve inflamasyon sonuçları çarpık ve yanlış tedavi Eğer bir yanlış yorumlama render sinyal iletim yollarının26 değişiklikler neden olabilir. Bu stres formülasyonu medya veya çok az veya çok fazla sayıda hücre kaplama veya kötü düzenlenmiş ortamlara veya denetim karşı sample(s) biraz daha farklı tedavi için hücreleri açıklamanızı bağlanabilir. Ayrıca geçiş numarası büyük farklılıklar veya sonrası kültür çözdürme zamanında kaydetti var. Yapay olarak tanıtılan bu değişkenler kaçınarak örnek olarak tutarlı arasında her şeyi tutmak için anahtarıdır. FBS yüzde veya ortam birimi, vb, deneme sırasında değiştirmeyin.
Veri Analizi bir dizi deney başlamadan önce de durulmalıdır. Bir chemiluminescent dizi analizi yalnızca yarı kantitatif floresan bir yaklaşım için yaklaşık iki büyüklük dinamik aralığını artırır iken yaklaşık bir büyüklük, dinamik menzili kadar var... Diziler gerçekleştirildiği ölçek belirli biyolojik soru (lar) üzerinde bağlıdır. Bir özel dayanıklı hücre satır özgün hücre hattına göre translasyonel modifikasyonlar tüm değişiklikleri için ilgi analiz etmek veya belirli bir yolu dayanıklı hücre hatları geniş bir yelpazesi için odaklanmak için mümkündür. Bu yaklaşım ölçeklenebilirliği planlama aşamalarında erken düşünülmelidir. Ayrıca, sonuçları bir antikor dizinin her zaman taze örnekler üzerinde ikincil bir yöntem ve/veya aynı lysates tarafından onaylanması. Bir western blot analizi belirli hedefleri için değişiklikleri doğrulamak için istihdam edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Cömert mali destek, Lawrence J. Ellison dönüştürücü Tıp Enstitüsü USC (David Agus hediye) için sana şükrediyoruz. Sonbahar Beemer ve Lisa Flashner kurşun üretimi için destek ve bu el yazması yayınlanması için teşekkür ederiz. Laura Ng onun yönetim destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
| Tissue Culture dish 100 mm | TRP | 93100 | |
| ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27 G5/8, 1 mL for needle treatment of protein samples |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
| LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |
References
- Knauer, D. J., Smith, G. L. Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).
- Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).
- Di Fiore, P. P., et al. Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells. Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).
- Maguire, H. C., Greene, M. I.
- Busse, D., et al. Reversible G(1) arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27(KIP1) independent of MAPK activity. Journal of Biological Chemistry. 275 (10), 6987-6995 (2000).
- Kondapaka, B. S., Reddy, K. B. Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer. Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).
- Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. [Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).
- Dulbecco, R. A turning point in cancer research: sequencing the human genome. Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).
- Barinaga, M. DoE provides funds for human genome sequencing. Nature. 331 (6152), 103 (1988).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
- McCain, J. The cancer genome atlas: new weapon in old war? Biotechnology Healthcare. 3 (2), 46-51 (2006).
- Weinstein, J. N., et al. The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project. Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Carlson, B. Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials. Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).
- Huang, R. P. Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).
- Rani, S., O'Driscoll, L. Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays. Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).
- Kani, K., et al. JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).
- Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. Jr Signal transduction and the control of gene expression. Science. 295 (5556), 813-818 (2002).
- Rikova, K., et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).
- Chen, V. W., et al. Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system. Cancer. 120, Suppl 23. 3793-3806 (2014).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Ward, J. H. Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function. Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Griffin, J., et al. Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation. Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).
- Zhou, T., et al. Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).
- McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. Hypoxia, oxidative stress and inflammation. Free Radical Biology and Medicine. , In Press (2018).
