Summary
यहाँ, हम विभिन्न सेलुलर मॉडल में संकेत रास्ते में परिवर्तन की पहचान करने के लिए एंटीबॉडी arrays के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इन परिवर्तनों को, दवाओं/हाइपोक्सिया/अल्ट्रा वायलेट प्रकाश/विकिरण, या द्वारा व्यक्त की वजह से downregulation/नॉकआउट, विभिंन रोग मॉडल के लिए महत्वपूर्ण है और संकेत कर सकते है कि एक चिकित्सा प्रभावी हो जाएगा या दवाओं के तंत्र की पहचान कर सकते है प्रतिरोध.
Abstract
प्रोटीन फास्फारिलीकरण नेटवर्क के एक ंयायपालिका विनियमन के साथ कैंसर रोगियों अक्सर tyrosine कळेनासे अवरोधकों के साथ इलाज कर रहे हैं । प्रतिक्रिया ८५% की दर आ आम हैं । दुर्भाग्य से, रोगियों को अक्सर उनके संकेत transduction रास्ते बदलकर उपचार के लिए दुर्दम्य हो जाते हैं । microarrays के साथ अभिव्यक्ति की रूपरेखा का एक कार्यांवयन समग्र mRNA स्तर के परिवर्तन की पहचान कर सकते हैं, और प्रोटियोमिक् प्रोटीन के स्तर में समग्र परिवर्तन की पहचान कर सकते है या शामिल प्रोटीन की पहचान कर सकते हैं, लेकिन संकेत की गतिविधि transduction रास्ते केवल प्रोटीन के बाद अनुवाद संशोधन पूछताछ द्वारा स्थापित किया जा सकता है । एक परिणाम के रूप में, की पहचान करने की क्षमता है कि क्या एक दवा उपचार सफल है या कि प्रतिरोध उठी, या संकेत रास्ते में किसी भी परिवर्तन की विशेषता की क्षमता, एक महत्वपूर्ण नैदानिक चुनौती है । यहां, हम एक उपकरण है जो विभिंन पद-शोधों संशोधनों में प्रणाली व्यापक परिवर्तन की पहचान कर सकते है (जैसे, फास्फारिलीकरण) के रूप में एंटीबॉडी arrays की एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं । एंटीबॉडी arrays का उपयोग कर के लाभों में से एक उनकी पहुंच भी शामिल है (एक सरणी या तो प्रोटियोमिक् या महंगा उपकरण में एक विशेषज्ञ की आवश्यकता नहीं है) और गति । पोस्ट-शोधों के संशोधनों के संयोजन को लक्षित करने वाली सरणियों की उपलब्धता प्राथमिक सीमा है । इसके अलावा, निष्पक्ष दृष्टिकोण (phosphoproteomics) उपंयास खोज के लिए और अधिक उपयुक्त हो सकता है, जबकि एंटीबॉडी arrays सबसे व्यापक रूप से विशेषता लक्ष्य के लिए आदर्श होते हैं ।
Introduction
लक्षित tyrosine कळेनासे अवरोधकों (TKI) के नैदानिक कार्यांवयन प्रभावी उपकरण के साथ चिकित्सकों प्रदान करने के लिए विशिष्ट प्रोटीन है कि नवोत्पादित परिवर्तन ड्राइव लक्ष्य द्वारा कैंसर के उपचार बदल गया है । इन यौगिकों को रोकती है या tyrosine kinases1,2द्वारा लक्षित प्रोटीन के फास्फारिलीकरण ब्लॉक । TKIs भाग में विकसित किया गया क्योंकि विभिंन प्रमुख संकेत जीन में आनुवंशिक परिवर्तन के लिए कैंसर दीक्षा और प्रगति ड्राइव पर्याप्त है [जैसे, एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR), आद्य-oncogene tyrosine-प्रोटीन कळेनासे src (src), BCR-ABL, और मानव एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 (HER2)]3,4. सेल चक्र पर TKIs का प्रभाव5 और आणविक संकेतन रास्ते6 आणविक निर्देशित कैंसर के इलाज के लिए लक्ष्य से एक परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है । कीमोथेरेपी बनाम TKIs का महत्वपूर्ण लाभ वृद्धि की प्रतिक्रिया दर और स्वस्थ कोशिकाओं को विषाक्तता के कम जोखिम है7. नतीजतन, उपंयास TKIs के अनुसंधान और विकास पर ध्यान बढ़ रहा है ।
जीनोमिक अनुक्रमण परिणामों के लिए उपयोग मानव जीनोम परियोजना8,9,10 के साथ शुरू किया और विभिन्न अगली पीढ़ी (NextGen) कैंसर sequencing प्रयासों के साथ आज जारी है [जैसे, कैंसर जीनोम एटलस (TCGA)११,१२]. यह कई प्रयोगात्मक तरीके कि जीन के हजारों पर एक साथ जानकारी प्रदान करने के लिए प्रेरित किया है और/या जीन या जैविक perturbations13द्वारा संग्राहक प्रोटीन की निष्पक्ष स्नैपशॉट प्रदान करते हैं । सेलुलर समारोह के विनियमन के बाद से कई स्तरों पर होता है, जीन की प्रतिलेखनी से प्रोटीन और उनकी गतिविधि, सेलुलर समारोह को नियंत्रित करने की घटनाओं की एक पूरी समझ के बाद अनुवाद करने के लिए होगा अंततः विभिंन जैविक readouts से डेटा के एकीकरण की आवश्यकता है । एक एकल सेल जीन संकल्प के साथ हजारों जीन के दूत आरएनए (mRNA) स्तर पर नजर रखने की क्षमता एक पूरे जीनोम पैमाने पर जीन समारोह और बातचीत के बारे में अनुमान बनाने की क्षमता बढ़ गई है । हालांकि, जीन अभिव्यक्ति arrays की व्याख्या हमेशा स्वाभाविक विनियमन के अंय स्तरों के एकीकरण के बिना अधूरा होगा: अर्थात्, प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर, प्रोटीन संशोधन राज्यों, और प्रोटीन के बाद अनुवाद संशोधन (फास्फारिलीकरण, ubiquitylation, मिथाइल, आदि) । यहां, हम एंटीबॉडी arrays की उपयोगिता का वर्णन के रूप में एक ही प्रयोग14,15में विभिंन स्थितियों के एक समारोह के रूप में महत्वपूर्ण संकेतन घटकों के पोस्ट अनुवाद संशोधन पूछताछ का मतलब है, 16.
Phospho-एंटीबॉडी arrays को भेद और संकेत transduction रास्ते16में परिवर्तन का विश्लेषण नियोजित किया जा सकता है । ये एक आनुवंशिक संशोधन या कळेनासे अवरोधकों, chemotherapeutics, ग्लूकोज अभाव, हाइपोक्सिया, या सीरम भुखमरी की वजह से तनाव के साथ सेल लाइनों के उपचार से पैदा कर सकते हैं । के नोट, दवा प्रतिरोध या एक विशिष्ट जीन अप-या downregulation भी संकेत transduction रास्ते में परिवर्तन के कारण कर सकते हैं17.
दवा प्रतिरोध, उदाहरण के लिए, संवेदनशीलता से बचने के लिए दवा लक्ष्य के उत्परिवर्तनों से पैदा कर सकते हैं । फेफड़ों के कैंसर में जाना जाता EGFR उत्परिवर्तनों कुछ TKIs के लिए अतिसंवेदनशील कैंसर प्रदान करते हैं, लेकिन अधिक दूसरों के लिए अतिसंवेदनशील । वैकल्पिक संकेत रास्ते17उत्परिवर्तन पर सक्रिय किया जा सकता है । संकेत transduction प्रतिरोध और हाइपोक्सिया, आदिमें शामिल रास्ते की पहचान के लिए एक व्यापक आवेदन के रूप में, phospho-एंटीबॉडी arrays में और अधिक जानकारी प्रदान करते हैं, और फलस्वरूप की समझ, शामिल तंत्र ।
प्रौद्योगिकियों कि प्रोटीन संशोधनों के एक आकलन की अनुमति प्रणालियों के एक महत्वपूर्ण घटक का प्रतिनिधित्व करते है क्योंकि वे अक्सर एक नियामक समारोह की सेवा, इस तरह के एक एंजाइम या प्रोटीन के बीच शारीरिक बातचीत की गतिविधि संग्राहक के रूप में । पोस्ट-शोधों के संशोधनों का महत्व लगभग सभी extracellular-ट्रिगर्ड सिग्नल transduction18में प्रोटीन फास्फारिलीकरण की भूमिका से सचित्र है । परंपरागत रूप से, kinases या प्रोटीन की फास्फारिलीकरण स्थिति की पहचान भी पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, खासकर अगर शोधकर्ता केवल 1 में रुचि है-5 लक्ष्य । हालांकि, पश्चिमी दाग बहुत चयनात्मक है और पूर्व ज्ञान की ओर पक्षपातपूर्ण किया जा सकता है और एक परिणाम के रूप में महत्वपूर्ण लक्ष्य याद हो सकता है । एंटीबॉडी सरणी (ओं) एक ठोस मैट्रिक्स (जैसे, कांच या ubiquitin) पर विभिंन कब्जा एंटीबॉडी [पैन विशिष्ट phosphorylated tyrosine (एस), विरोधी nitrocellulose, आदि] embedding द्वारा एकाधिक लक्ष्यों का एक मध्यम प्रवाह readout प्रदान करते हैं । माध्यमिक एंटीबॉडी एक सैंडविच आधारित एलिसा प्रारूप में विशिष्ट प्रोटीन के बारे में जानकारी प्रदान (चित्रा 1) । इस परख और अधिक शक्तिशाली और प्रासंगिक हो जाता है के रूप में अधिक लक्ष्य हित के है या पूर्व ज्ञान15प्रतिबंधित है । phospho-arrays और अधिक मोटे तौर पर काम कर रहे है के रूप में वे फास्फारिलीकरण तुलना के रूप में अच्छी तरह से एक प्रयोग में लक्ष्य की एक व्यापक विविधता के प्रोटीन की सामांय मात्रा में कर सकते है और एक महत्वपूर्ण जन स्पेक्ट्रोमेट्री पर सुधार ठहराव प्रदान करते हैं । यह तकनीक नई या पहले से अज्ञात फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान के लिए लागू नहीं है ।
बड़े पैमाने पर जन स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटियोमिक् प्रोटीन की विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान करने के लिए नियोजित किया जा सकता है19. हालांकि इस तकनीक के बाद अनुवाद की घटनाओं के हजारों गणना कर सकते हैं, यह महंगा उपकरण, समर्पित प्रयोगात्मक पाइपलाइनों की आवश्यकता है, और एक गणना विशेषज्ञता है कि सबसे शोधकर्ताओं की पहुंच से परे हैं ।
एंटीबॉडी arrays16readouts विभिंन प्रोटीन पर एक साथ readout प्रदान करते हैं । ये प्रोटीन ubiquitylation (ubiquitin ऐरे) या फास्फारिलीकरण में परिवर्तन हो सकता है. इस सरणी प्रौद्योगिकी का मुख्य लाभ यह है कि यह महत्वपूर्ण सेल मापदंडों के साथ जुड़े विभिन्न जैविक रास्ते की जैविक स्थिति पर महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया प्रदान करता है (५३ केडीए के प्रोटीन, p53, रिसेप्टर tyrosine kinases, और intracellular रास्ते) साथ. इसके अलावा, यह एक परख (जैसे, apoptosis और ubiquitin और फास्फारिलीकरण) के प्रवेश को बढ़ाने के लिए विभिंन सरणी प्रकार गठबंधन करने के लिए संभव है । इस क्षमता एकाधिक arrays कई नमूनों में एक साथ एक समय में विभिंन पद-अनुवाद परिवर्तन का आकलन करने के लिए गठबंधन और लागत प्रभावी तरीके से है कि विशिष्ट उपकरण या विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है मामले में एक महत्वपूर्ण लाभ की है एंटीबॉडी arrays की ।
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Protocol
1. प्रोटीन निष्कर्षण
- प्लेट 5 एक्स 106 एक ऊतक संस्कृति हूड में एक 10 मिमी ऊतक संस्कृति की थाली (या कुप्पी) पर कोशिकाओं. एक स्वचालित सेल काउंटर या hemocytometer के साथ चढ़ाना के समय कोशिकाओं गिनती । वैकल्पिक रूप से, कक्ष गणना का अनुमान लगाएं ।
- कुल्ला 10 मिमी प्लेट पर हो कोशिकाओं (या कुप्पी) अच्छी तरह से फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 10 मिलीलीटर (पीएच = ७.४) के साथ 3x । lysis बफर को जोड़ने से पहले सभी पंजाबियों को हटाना सुनिश्चित करें ।
नोट: lysis बफ़र आमतौर पर किट के साथ प्रदान की जाती है । यदि नहीं, तो एक radioimmunoprecipitation परख बफर (RIPA) या किसी अंय कोशिका lysis बफर और फॉस्फेट अवरोधकों का एक कॉकटेल युक्त बफ़र का उपयोग करें । - लाइसे 1 x 107 कक्ष/lysis बफ़र में कक्षों के लिए बफ़र की सही मात्रा को जोड़ कर कक्षों को lysis बफ़र में एक कक्ष खुरचनी के साथ कक्षों को स्क्रैप कर रहा है । (जैसे, हेला कोशिकाओं और MiaPaCa-2 के लिए, ६०० µ एल प्रति 10 सेमी प्लेट) का उपयोग करें ।
- पिपेट lysate ऊपर और नीचे (लगभग 10x) और यह एक नया १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए lysates गर्मी, अधिमानतः एक झूली कुरसी पर/ सेल झिल्ली (ओं) का एक उचित व्यवधान सुनिश्चित करने के लिए 10x के लिए एक 27 जी सुई के साथ एक सिरिंज के माध्यम से lysate दबाएँ. वैकल्पिक रूप से, sonicate lysate । lysates-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या उंहें तुरंत का उपयोग करें ।
- 15 मिनट के लिए 4 ° c पर १४,००० x g पर lysate केंद्रापसारक और एक साफ १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए supernatant हस्तांतरण ।
- bicinchoninic अम्ल परख (बीसीए)20 या एक समकक्ष जैसे Lowry या ब्रैडफोर्ड के द्वारा कुल प्रोटीन की मात्रा Quantitate और कम से 50 – 400 μg के साथ जारी रखें । तुरंत प्रोटीन का प्रयोग करें या aliquot और फ्रीज/-७० ° c (एकाधिक फ्रीज-गल चक्र से बचें) ।
2. मानव Phosphokinase सरणी
- (लगभग 1 ज के लिए) शुरू करने से पहले कमरे के तापमान के लिए सभी रिएजेंट लाओ ।
नोट: किट में सभी रिएजेंट और प्लास्टिक वियर शामिल हैं । - निर्माता के निर्देशों के बाद प्रक्रिया शुरू करने से पहले सभी रिएजेंट्स (सरणी बफ़र्स) को तैयार करें (लक्ष्य के चुनाव के आधार पर, निर्देश थोड़ा भिंन हो सकते हैं) ।
- १०० μL में पता लगाने एंटीबॉडी कॉकटेल का पुनर्गठन या निर्माता के निर्देशों का पालन करें वे प्रदान की १.५ मिलीलीटर परीक्षण ट्यूब के लिए अलग करना चाहिए ।
- कमजोर द्वारा 1x धो बफर तैयार 25x धोने बफर के ४० मिलीलीटर में ९६० मिलीलीटर पानी की और उंहें पलटने से मिश्रण ।
नोट: क्रिस्टल कमरे के तापमान पर भंग । बफ़र समय के साथ पीला हो सकता है, लेकिन अभी भी काम करेगा । - सरणी बफर 1 के पिपेट 1 मिलीलीटर एक 8 अच्छी तरह से बहु ट्रे (या एक 4-अच्छी तरह से बहु ट्रे में 2 मिलीलीटर) के प्रत्येक कुआं में ।
- फ्लैट टिप चिमटी के साथ, सुरक्षात्मक चादरें के बीच सरणी झिल्ली को हटाने और उन्हें कुओं में जगह है । सुनिश्चित करें कि झिल्ली पर संख्या ऊपर की ओर का सामना कर रहे हैं ।
नोट: डुबकी पर, झिल्ली पर डाई गायब हो जाएगा । - एक ढक्कन के साथ ट्रे कवर और कमरे के तापमान पर ६० मिनट के लिए एक कमाल का मंच शेखर पर यह मशीन ।
नोट: यह झिल्ली अवरुद्ध कदम है । - मशीन अवधि के दौरान, प्रोटीन के नमूनों को तैयार करें । कुल प्रोटीन के 50 – 100 μg जोड़ें । lysate पतला, ३३४ μL की एक अधिकतम मात्रा होने, lysis बफर के साथ 1 मिलीलीटर के अंतिम खंड के लिए ।
नोट: 50-कुल प्रोटीन के 100 μg आमतौर पर पर्याप्त । - महाप्राण सरणी बफर 1 ध्यान से और 2-8 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के नमूनों की 1 मिलीलीटर के साथ झिल्ली गर्मी एक कमाल का मंच शेखर पर ।
नोट: झिल्ली को छूने/ - अगले दिन, ध्यान से प्रत्येक सरणी हटाने और यह व्यक्तिगत प्लास्टिक कंटेनर में रखने से सरणी धोने (लगभग 8 x 11 सेमी2) 1x धोने बफर के 20 मिलीलीटर के साथ । झिल्ली धो 3 एक्स 10 मिन में एक रॉकिंग मंच पर कमरे के तापमान पर 1x धोने बफर ।
- पिपेट 20 μL के पुनर्गठन एंटीबॉडी कॉकटेल के चरण २.३ से 1 मिलीलीटर के 1x सरणी बफर 2 । प्रत्येक 8 के लिए इस समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें-अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा करने के लिए ।
- ध्यान से झिल्ली को धो ट्रे से हटा दें । कागज तौलिए पर कम बढ़त दाग किसी भी अतिरिक्त धोने बफर हटाने के लिए और उंहें वापस हस्तांतरण एंटीबॉडी कॉकटेल युक्त ट्रे में । ढक्कन के साथ ट्रे को कवर और एक कमाल मंच पर कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए यह मशीन । अच्छी तरह से डीएच2ओ के साथ इस्तेमाल किया ट्रे कुल्ला और बाद में उपयोग के लिए उंहें सूखी ।
- ध्यान से प्रत्येक सरणी को हटाने और उंहें साफ व्यक्तिगत प्लास्टिक कंटेनर में वापस जगह (लगभग 8 x 11 सेमी2) 1x धोने बफर के 20 मिलीलीटर के साथ । उन्हें धो बफर के साथ कमरे के तापमान पर एक कमाल मंच पर 3 एक्स 10 मिनट धोने ।
- पतला Streptavidin-एचआरपी (किट के साथ प्रदान की) या Streptavidin-फ्लोरोसेंट डाई (एक अधिक मात्रात्मक पता लगाने के लिए) 1:1000 में 1x सरणी बफर 2 में एक 15 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब ।
- 8-अच्छी तरह से हिमाचल प्रदेश समाधान युक्त व्यंजन में झिल्ली लौटें और उंहें एक कमाल का मंच पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए गर्मी (यदि प्रतिदीप्ति का उपयोग कर, एल्यूमीनियम पंनी में ट्रे लपेटो किसी भी प्रकाश जोखिम से बचने के लिए) ।
- 3 मीटर कागज के 5 मिमी के 2 टुकड़ों के बीच में झिल्ली रखकर अतिरिक्त बफर निकालें । एक एक्स-रे फिल्म के साथ इमेजिंग के लिए/chemiluminescent imager, एक एचआरपी का पता लगाने समाधान के साथ सूख झिल्ली की मशीन (मिश्रण दो chemiluminescent समाधान 1:1) 3 मिनट के लिए और एक स्पष्ट प्लास्टिक शीट रक्षक में झिल्ली जगह है ।
नोट: सूखे झिल्ली (ओं) को भी फ्लोरोसेंट संकेत का पता लगाने के लिए एक फ्लोरोसेंट imager में रखा जा सकता है; इमेजिंग से पहले झिल्ली के लिए प्रकाश जोखिम को कम करें । एक्स-रे फिल्म या imager फ़ाइलों के एक ठहराव के लिए, जोखिम से बचें । अधिकांश chemiluminescent/फ्लोरोसेंट imagers एक समारोह के लिए संकेत की एक संतृप्ति से बचने के है ।
3. डेटा विश्लेषण
- डाउनलोड ImageJ, एक छवि संसाधन कार्यक्रम21, और सॉफ्टवेयर स्थापित करें ।
- ' ImageJ आइकॉन 'पर डबल क्लिक करके ओपन ImageJ । छवि का चयन करें मेनू पट्टी में ' फ़ाइल ' पर क्लिक करके विश्लेषण किया जा करने के लिए, तो ड्रॉप डाउन मेनू से ' ओपन ' का चयन करें और ब्याज की छवि के लिए कंप्यूटर फ़ाइलों को ब्राउज़. फ़ाइल को खोलने के लिए उसे क्लिक करें ।
- विश्लेषण के लिए चित्र उलटा (एक काली पृष्ठभूमि पर सफेद धब्बे को सफेद पृष्ठभूमि पर काले धब्बे) मेनू पट्टी में ' संपादित करें ' पर क्लिक करके और ड्रॉप-डाउन मेनू से ' पलटना ' का चयन करके ।
- उपकरण पट्टी से ' अंडाकार चिह्न ' का चयन करें (ImageJ टूलबार में दूसरा विकल्प). चित्र (ब्लैक क्रॉस) पर क्लिक करके और माउस ले जाकर एक सर्कल/ डॉट ब्लाटर पर डॉट्स को घेरना के लिए सर्कल/अंडाकार का आकार समायोजित करें ।
- मेनू पट्टी में ' विश्लेषण ' पर क्लिक करें और फिर चयनित क्षेत्र (क्षेत्र, मतलब, न्यूनतम, और अधिकतम) के मूल्यों के साथ एक नई विंडो को स्वचालित रूप से खोलने के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू से ' माप ' चुनें.
- केंद्र से वृत्त खींचकर वृत्ताकार क्षेत्र में ले जाएँ (दाएँ तीर की बात को बीच में रखें) और उसे अगले माप (डॉट) क्षेत्र के आसपास रखें. ब्याज के सभी स्थानों को मापने, सकारात्मक नियंत्रण, नकारात्मक नियंत्रण, और विश्लेषण के लिए पृष्ठभूमि ।
नोट: नकारात्मक नियंत्रण पंजाबियों है, पृष्ठभूमि किसी भी स्थान (किसी भी भाग करना होगा) के बिना झिल्ली का एक हिस्सा है, और सकारात्मक नियंत्रण एक निर्माता द्वारा प्रदान नियंत्रण है । - पंजाब के नकारात्मक नियंत्रण स्थानों का चयन करें और प्रत्येक स्थान से मूल्य घटाना । प्रत्येक प्रत्येक रिसेप्टर tyrosine कळेनासे (RTK) का प्रतिनिधित्व डुप्लिकेट स्पॉट के प्रत्येक जोड़ी के लिए तीव्रता औसत. प्रत्येक औसत तीव्रता मोड़ परिवर्तन की गणना करने के लिए नियंत्रण से संबंधित हो सकता है ।
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Representative Results
सेल लाइनों में सिग्नल transduction मार्ग पर TKI प्रतिरोध के प्रभाव की जांच करने के लिए, चार नमूनों का विश्लेषण किया गया । एक नियंत्रण नमूना (H3255r1) और 3 TKI-प्रतिरोधी कोशिका लाइनों (H3255r2-4) (चित्रा 2) स्पॉट एंटीबॉडी टेम्पलेट (चित्रा 3) से संबंधित थे. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए सभी 4 नमूने तैयार किए गए । अंतर गतिविधि के साथ छह phosphoproteins एंटीबॉडी arrays (चित्रा 4) के विश्लेषण के प्रदर्शन के लिए चुना गया । हीट मैप (चित्रा 5) महत्वपूर्ण संकेत transduction प्रोटीन के प्रोटीन फास्फारिलीकरण में परिवर्तन पर एक अर्द्ध मात्रात्मक readout प्रदान करता है । सरणी परिणामों की मांयता को पश्चिमी सोख्ता जैसे ओर्थोगोनल दृष्टिकोणों को लागू करके पूरा किया जा सकता है ।
चित्रा 1: अर्द्ध मात्रात्मक एंटीबॉडी arrays की योजनाबद्ध । एंटीबॉडी arrays सैंडविच immunoassay सिद्धांत है, जहां पर कब्जा एंटीबॉडी का संग्रह या तो गिलास या nitrocellulose समर्थन में एंबेडेड है पर आधारित हैं । कोशिका lysates झिल्ली और arrays माध्यमिक एंटीबॉडी के अधीन है के साथ मशीन हैं । एक अर्द्ध मात्रात्मक readout chemiluminescent सब्सट्रेट से प्राप्त किया जा सकता है या, अधिक मात्रात्मक जानकारी के लिए, फ्लोरोसेंट आधारित इमेजिंग. किसी भी फिल्म या TIF छवियों से व्युत्पंन संकेतों densitometry द्वारा संसाधित किया जा सकता है और एक प्रोटीन के लिए गुना परिवर्तन की गणना । पूरी प्रक्रिया में दिन के बारे में लेता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: उदाहरण phospho-एंटीबॉडी imager के साथ विकसित सरणी । फ्लोरोसेंट धब्बे डुप्लिकेट (लक्ष्य प्रति दो स्थानों) में पाए जाते हैं । नमूने और सकारात्मक नियंत्रण धब्बे अलग तीव्रता दिखाने के लिए । यहां दिखाया गया है TKI के प्रति संवेदनशील H3255r1 और 3 प्रतिरोधी (H3255r2-4) नमूना arrays, झिल्ली में एक विभाजन और बी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: सरणी स्थानों का नक्शा. नक्शा एंटीबॉडी लक्ष्यों को धब्बे लिंक । स्पॉट एक-जी खड़ी और 1-10 क्षैतिज लेबल कर रहे हैं । सकारात्मक नियंत्रण (नारंगी) सभी झिल्ली पर मौजूद है और आम तौर पर कोनों में पाया । इसमें निगेटिव पंजाबन कंट्रोल ब्लैक में डाला गया है जबकि सैंपल स्पॉट पीले रंग में हाइलाइट किए गए हैं । हर सरणी के लिए, पहचान के लिए एंटीबॉडी की एक सूची भी प्रदान की जाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4: डेटा विश्लेषण उदाहरण । (क) ब्याज के धब्बे की तीव्रता, सकारात्मक नियंत्रण, और पृष्ठभूमि के नक्शे पर पहचान की और सभी नमूनों के लिए मापा गया । (ख) सापेक्षिक तीव्रता (पृष्ठभूमि तीव्रता के साथ स्पॉट तीव्रता को हटाया गया और एक सकारात्मक नियंत्रण तीव्रता को सामान्यीकृत) कुछ चुने हुए उम्मीदवारों के लिए एक बार चार्ट में प्रदर्शित किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5: अंतर H3255 संवेदनशील (r1) और प्रतिरोधी (r2-4) सेल लाइनों में सिग्नलिंग का हीट मैप । सभी 4 नमूनों में CREB, P53, एकेटी, और STAT5 में परिवर्तन की तुलना के लिए एक ऊष्मा मानचित्र उत्पन्न करने के लिए एक सापेक्षिक स्थान तीव्रता का प्रयोग किया गया । किसी भी उच्च स्तर लाल रंग के विभिन्न रंगों में प्रदर्शित कर रहे हैं, जबकि किसी भी निचले स्तर नीले22में प्रदर्शित कर रहे हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
दृष्टिकोण है कि कई जैविक readouts गठबंधन एक प्रयोग में सेलुलर मशीनरी के स्वाभाविक अधिक सटीक प्रतिनिधित्व कर रहे है प्रदर्शन किया । phospho के आगमन-एंटीबॉडी arrays संशोधनों के पैटर्न जो किसी भी एक प्रोटीन के संशोधन की स्थिति से अधिक जानकारीपूर्ण हो सकता है की एक तेजी से लक्षण वर्णन सक्षम बनाता है । phospho-एंटीबॉडी arrays के आवेदन के लिए सामांय कार्यप्रवाह serine, threonine, या tyrosine में एक संशोधन पर आधारित है । इस उदाहरण फेफड़ों के कैंसर में चिकित्सा के लिए प्रतिरोध के साथ जुड़े परिवर्तन निस्र्पक पर ध्यान केंद्रित । इस आवेदन के लिए मुख्य तर्क है कि प्रोटीन फास्फारिलीकरण कई मानव कैंसर18में संकेत transduction में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है, और इस विधि अन्य प्रणालियों के लिए हस्तांतरणीय हो जाएगा । कैंसर में फास्फारिलीकरण के एक dysregulation आम तौर पर एक tyrosine कळेनासे के hyperactivation शामिल है, और फलस्वरूप, phosphorylated सब्सट्रेट (अक्सर ऑटो phosphorylated कळेनासे ही सहित) सामान्य से अधिक स्तर पर मौजूद हैं शारीरिक सेटिंग्स और, तदनुसार, एक कैंसर कोशिका में phosphoproteins का एक महत्वपूर्ण अंश बना सकते हैं । फास्फारिलीकरण के इन उच्च स्तर का पता लगाने आसान बना देगा । इसके अलावा, प्रोटीन फास्फारिलीकरण ंयायपालिका tyrosine फास्फारिलीकरण कैंसर के कई प्रकार की एक बानगी है के बाद से एक चिकित्सा महत्व है23। इसके अलावा, के बाद से इस तकनीक के अंय जैविक प्रणालियों की जांच करने के लिए हस्तांतरणीय है कि फास्फारिलीकरण का उपयोग, यहां वर्णित सुविधाओं के कई आसानी से प्रोटीन arrays के अंय प्रकार पर ध्यान समायोजित किया जा सकता है (ubiquitin, apoptosis, आदि) ।
Phospho-एंटीबॉडी arrays व्यापक रूप से शामिल किसी भी संकेत रास्ते की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है, या तो एक खोजपूर्ण विधि के रूप में या एक विशेष मार्ग के सत्यापन के रूप में । विभिंन कंपनियों फास्फारिलीकरण स्थिति दोनों के लिए किट बनाने के लिए और प्रोटीन के समग्र स्तर के लिए । जबकि वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) विश्लेषण या microarrays अधिक मात्रात्मक होते हैं, वे केवल mRNA स्तर को ध्यान में रखते हैं, और एक अनुवाद के साथ ही पोस्ट-शोधों संशोधनों को संबोधित नहीं किया जा सकता है । फास्फारिलीकरण के अलावा, अंय पोस्ट अनुवाद ऐसे glycosylation या ubiquitylation के रूप में संशोधन भी24,25arrays द्वारा संबोधित किया जा सकता है ।
महत्वपूर्ण कारकों में से एक एंटीबॉडी arrays शुरू करने से पहले विचार के लिए स्वस्थ और सक्रिय रूप से विभाजित कोशिकाओं के साथ शुरू है । हाइपोक्सिया, ऑक्सीडेटिव तनाव, और सूजन संकेत transduction रास्ते में परिवर्तन का उत्पादन हो सकता है26 कि परिणाम विषम कर सकते है और एक गलत व्याख्या प्रदान अगर अनुचित तरीके से इलाज किया । यह तनाव मीडिया के निर्माण के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है या बहुत कम या बहुत अधिक कोशिकाओं को चढ़ाना, या खराब विनियमित वातावरण के लिए कोशिकाओं को उजागर करने के लिए, या नमूना बनाम नियंत्रण (एस) थोड़ा अलग इलाज । हमने भी पारित संख्या में बड़े अंतर का उल्लेख किया है या कल्चर पोस्ट में समय गल रहा है. इन कृत्रिम रूप से शुरू की चर से बचने के लिए कुंजी के रूप में संभव के रूप में अनुरूप नमूने के बीच सब कुछ रखने के लिए है । प्रयोग के दौरान FBS प्रतिशत या मीडिया की मात्रा आदि को न बदलें ।
सरणी प्रयोग प्रारंभ करने से पहले डेटा विश्लेषण पर भी विचार किया जाना चाहिए. एक chemiluminescent सरणी विश्लेषण केवल अर्द्ध मात्रात्मक है, और अपने गतिशील रेंज परिमाण के लगभग एक आदेश है, जबकि एक फ्लोरोसेंट दृष्टिकोण परिमाण के लगभग दो आदेश के लिए गतिशील रेंज बढ़ जाती है । जिस पैमाने पर arrays प्रदर्शन कर रहे है विशिष्ट जैविक प्रश्न (ओं) पर निर्भर करता है । यह पोस्ट में सभी परिवर्तनों के लिए ब्याज की एक विशिष्ट प्रतिरोधी कोशिका लाइन का विश्लेषण संभव है अनुवाद संशोधन मूल सेल लाइन की तुलना में या प्रतिरोधी कोशिका लाइनों की एक विस्तृत विविधता के लिए एक विशेष मार्ग पर ध्यान केंद्रित । इस दृष्टिकोण की दरिद्रता को शीघ्र नियोजन के चरणों में माना जाना चाहिए. इसके अलावा, एक एंटीबॉडी सरणी के परिणाम हमेशा ताजा नमूनों और/या एक ही lysates पर एक द्वितीयक विधि द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए । एक पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए विशिष्ट लक्ष्यों को परिवर्तन सत्यापित नियोजित किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम लॉरेंस जे एलिसन संस्थान की परिवर्तनकारी चिकित्सा के उदार वित्तीय सहायता के लिए आभारी है यूएससी (डेविड Agus के लिए एक उपहार) । हम शरद ऋतु Beemer और लिसा Flashner जो पीढ़ी और इस पांडुलिपि के प्रकाशन के लिए नेतृत्व के समर्थन की सराहना करते हैं । हम उसे प्रशासनिक समर्थन के लिए लौरा एनजी धंयवाद ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
| Tissue Culture dish 100 mm | TRP | 93100 | |
| ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27 G5/8, 1 mL for needle treatment of protein samples |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
| LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |
References
- Knauer, D. J., Smith, G. L. Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).
- Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).
- Di Fiore, P. P., et al. Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells. Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).
- Maguire, H. C., Greene, M. I.
- Busse, D., et al. Reversible G(1) arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27(KIP1) independent of MAPK activity. Journal of Biological Chemistry. 275 (10), 6987-6995 (2000).
- Kondapaka, B. S., Reddy, K. B. Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer. Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).
- Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. [Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).
- Dulbecco, R. A turning point in cancer research: sequencing the human genome. Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).
- Barinaga, M. DoE provides funds for human genome sequencing. Nature. 331 (6152), 103 (1988).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
- McCain, J. The cancer genome atlas: new weapon in old war? Biotechnology Healthcare. 3 (2), 46-51 (2006).
- Weinstein, J. N., et al. The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project. Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Carlson, B. Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials. Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).
- Huang, R. P. Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).
- Rani, S., O'Driscoll, L. Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays. Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).
- Kani, K., et al. JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).
- Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. Jr Signal transduction and the control of gene expression. Science. 295 (5556), 813-818 (2002).
- Rikova, K., et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).
- Chen, V. W., et al. Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system. Cancer. 120, Suppl 23. 3793-3806 (2014).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Ward, J. H. Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function. Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Griffin, J., et al. Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation. Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).
- Zhou, T., et al. Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).
- McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. Hypoxia, oxidative stress and inflammation. Free Radical Biology and Medicine. , In Press (2018).
