Summary
Vi præsenterer her, en protokol for antistof arrays til at identificere ændringer i signaling veje i forskellige cellulære modeller. Disse ændringer, forårsaget af narkotika/hypoxi/ultra-violet lys/stråling, eller overekspression/downregulation/knockouts, er vigtige for forskellige sygdomsmodeller og kan angive, om en behandling vil være effektive eller kan identificere mekanismer af narkotika modstand.
Abstract
Kræftpatienter med en afvigende regulering af protein fosforylering netværk behandles ofte med tyrosin kinase hæmmere. Responsrater nærmer sig 85% er fælles. Desværre, patienter ofte bliver ildfaste til behandling ved at ændre deres signaltransduktionsveje. En implementering af udtryk profilering med microarrays kan identificere de samlede mRNA-niveau ændringer, og proteomforskning kan identificere de samlede ændringer i protein niveauer eller kan identificere de proteiner involveret, men aktiviteten af signaltransduktion veje kan kun etableres ved spørgekriterierne posttranslationelle modifikationer af proteiner. Som et resultat, er evnen til at identificere om et stof behandling er vellykket eller om opstod der modstand, eller evnen til at karakterisere enhver aendring i de signaling veje, en vigtig klinisk udfordring. Her give vi en detaljeret forklaring af antistof arrays som et redskab, som kan identificere ordning-omfattende ændringer i forskellige posttranslationelle modifikationer (fx, fosforylering). En af fordelene ved at bruge antistof arrays omfatter deres tilgængelighed (et array ikke kræver enten en ekspert i proteomics eller dyrt udstyr) og hastighed. Tilgængeligheden af arrays rettet mod en kombination af posttranslationelle modifikationer er den primære begrænsning. Derudover kan upartiske tilgange (fosfoproteomanalyse) være mere egnet til den nye opdagelse, antistof arrays er ideel til de mest udbredte karakteriseret mål.
Introduction
Den kliniske gennemførelse af målrettede tyrosin kinase hæmmere (TKI) har forvandlet kræftbehandling af at give læger med effektive redskaber til at målrette de specifikke proteiner at drive neoplastiske transformation. Disse forbindelser hæmme eller blokere fosforylering af proteiner målrettet af tyrosin kinaser1,2. TKIs blev udviklet til dels fordi genetiske ændringer i forskellige nøglen signalering gener er tilstrækkelig til at drive kræft indledningen og progression [fxepidermal vækstfaktor receptor (EGFR), proto-oncogene tyrosin-protein kinase Src (SRC), BCR-ABL, og human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2)]3,4. TKIs indvirkning på cellecyklus5 og den molekylære signaling veje6 repræsenterer en transformation fra de ikke-målrettede at de molekylemæssigt guidede kræftbehandling. Den vigtigste fordel af TKIs versus kemoterapi er øget responsrater og lavere risiko for toksicitet for raske celler7. Som et resultat, har der været stigende fokus på forskning og udvikling af roman TKIs.
Adgang til genomisk sekventering resultaterne startede med Human Genome Project8,9,10 og fortsætter i dag med forskellige næste generation (NextGen) kræft sekventering indsats [fxThe kræft genom Atlas (TCGA)11,12]. Dette har inspireret mange eksperimentelle metoder, der giver samtidig oplysninger om tusindvis af gener og/eller give uvildig snapshots af gener eller proteiner moduleres af biologiske perturbationer13. Da reguleringen af den cellulære funktion opstår på flere niveauer, fra transkription af gener til de posttranslationel modifikation af proteiner og deres aktivitet, vil en komplet forståelse af de begivenheder, kontrol af den cellulære funktion i sidste ende kræve en integration af data fra forskellige biologiske udlæsninger. Evnen til at overvåge messenger RNA (mRNA) niveauer af tusindvis af gener med en enkelt celle gen opløsning har øget evne til at drage slutninger om genfunktioner og interaktioner i hele-genom skala. Men fortolkning af gen expression arrays vil altid være i sagens natur ufuldstændig uden integration af andre niveauer af forordningen: nemlig udtryk proteinniveauet, protein ændring stater og protein posttranslationelle ændringer (fosforylering, ubiquitylation, methylering, osv.). Her beskriver vi nytte af antistof arrays som middel til at afhøre posttranslationelle modifikationer af vigtig signalfunktion komponenter som funktion af forskellige betingelser i en enkelt eksperiment14,15, 16.
Phospho-antistof arrays kan anvendes til at skelne og analysere ændringer i signaltransduktion veje16. Disse kan opstå som følge af en genetisk modifikation eller behandlinger af cellelinjer med kinase hæmmere, kemoterapeutika, stress forårsaget af glucose afsavn, hypoxi eller serum sult. Bemærk, resistens eller et bestemt gen kan op- eller downregulation også forårsage ændringer i signaltransduktion veje17.
Medicinresistens, for eksempel, kan skyldes mutationer af stoffet målet at undgå følsomhed. Lungekræft, kendt EGFR mutationer gøre kræft modtageligt for visse TKIs, men mere modtagelige for andre. Alternativ signalering veje kan aktiveres efter mutation17. Som et bredere program for identifikation af signaltransduktionsveje involveret i modstand og hypoxi, osv., phospho-antistof matrixer giver mere indsigt i, og dermed forståelse af mekanismer involveret.
Teknologier, der foretages en vurdering af protein ændringer udgør en vigtig komponent i systembiologi fordi de ofte tjener en regulerende funktion som modulerende aktiviteten af et enzym eller det fysiske samspil mellem proteiner. Betydningen af posttranslationelle modifikationer er illustreret af protein fosforylering i næsten alle ekstracellulære-udløst signaltransduktion veje18rolle. Traditionelt, kunne indkredsning af kinaser eller fosforylering status af proteiner også bestemmes af Western blot analyse, især hvis forskeren er interesseret i kun 1 – 5 mål. Men Western blotting er meget selektiv og kan være forudindtaget mod forudgående viden og måske gå glip af vigtige mål som et resultat. Antistof array(s) giver en medium-overførselshastighed udlæsning af flere mål ved at integrere forskellige capture-antistoffer [pan-specifikke fosforyleres tyrosine(s), anti-ubiquitin, etc.] på en fast matrix (fx, glas eller nitrocellulose). Sekundære antistoffer give oplysninger om specifikke proteiner i en sandwich-baserede ELISA format (figur 1). Denne analyse bliver mere kraftfulde og relevant som flere mål er af interesse eller den forudgående viden er begrænset15. Phospho-arrays er mere bredt beskæftigelsesegnede, som de kan sammenligne fosforylering samt generelle mængder protein af en bredere vifte af mål i et eksperiment og give en væsentligt forbedret kvantificering over massespektrometri. Denne teknik gælder ikke for identifikation af nye eller hidtil ukendte fosforylering websteder.
Storstilet massespektrometri-baseret proteomics kunne anvendes til at identificere specifikke fosforylering lokaliteter af proteiner19. Selv om denne teknik kan optælle tusindvis af posttranslationelle begivenheder, kræver det dyre instrumentation, dedikeret eksperimentelle rørledninger og en beregningsmæssige ekspertise, der er uden for rækkevidde af de fleste forskere.
Antistof matrixer giver en samtidig udlæsning på forskellige protein udlæsninger16. Disse kan være ændringer i protein ubiquitylation (ubiquitin array) eller fosforylering. Den vigtigste fordel af dette array teknologi er, at det giver vigtig feedback på biologiske tilstand af forskellige biologiske veje tilknyttet vigtigt celle parametre (protein af 53 kDa, p53, receptor tyrosin kinaser og intracellulære veje) samtidigt. Det er derudover muligt at kombinere forskellige matrixtyper for at øge udbredelsen af en analyse (f.eks., apoptose og ubiquitin og fosforylering). Denne evne til at kombinere flere arrays for at vurdere forskellige posttranslationelle ændringer i flere prøver samtidig i en tid og omkostninger effective måde, der ikke kræver særlige instrumentering eller ekspertise er af en betydelig fordel i tilfældet af antistof arrays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. protein udvinding
- Plade 5 x 106 celler på en 10 mm vævskultur plade (eller kolbe) i en vævskultur hætte. Tælle cellerne på tidspunktet for plettering med en automatisk celle counter eller hemocytometer. Alternativt, anslå celletal.
- Skyl celler dyrkes på 10 mm plade (eller kolbe) grundigt 3 x med 10 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (pH = 7.4). Sørg for at fjerne alle PBS før du tilføjer lysisbuffer.
Bemærk: Lysisbuffer normalt leveres med kittet. Hvis ikke, så brug en radioimmunoprecipitation analysebuffer (RIPA) eller enhver anden celle lysisbuffer indeholdende en cocktail af protease og fosfatase hæmmere. - Lyse 1 x 107 celler/mL af celler i lysisbuffer ved at tilføje det korrekte beløb af buffer til cellerne og skrabe cellerne med en celle skraber i lysisbuffer. (fxHeLa celler og MiaPaCa-2, bruge 600 µL pr. 10 cm plade).
- Med pipette udtages en lysate op og ned (ca 10 x) og overføre det til en ny 1,5 mL tube.
- Inkubér lysates i 30 min. ved 4 ° C, fortrinsvis på en rocker/shaker. Tryk på den lysate gennem en sprøjte med en 27 G kanyle til 10 x for at sikre en ordentlig afbrydelse af cell membrane(s). Der sonikeres Alternativt, den lysate. Gemme lysates på-20 ° C eller bruge dem straks.
- Der centrifugeres i lysate på 14.000 x g ved 4 ° C i 15 min og overføre supernatanten til en ren 1,5 mL tube.
- Kvantificere mængden af total protein af bicinchoninic syre assay (BCA)20 eller tilsvarende som Lowry eller Bradford og fortsætte med mindst 50 – 400 μg. Bruge proteiner straks eller delprøve og fryse/gemmer dem ved-70 ° C (undgå flere fryse-tø cykler).
2. menneskelige Phosphokinase Array
- Bringe alle reagenser til stuetemperatur før du starter (for ca. 1 h).
Bemærk: Alle reagenser og plast slid er inkluderet i sættet. - Forberede alle reagenser frisk (array buffere) før du begynder proceduren efter fabrikantens anvisninger (afhængig af valg af mål/arrays, vejledningen kan variere lidt).
- Rekonstruere påvisning antistof cocktails i 100 μL ionbyttet vand eller Følg fabrikantens anvisninger bør de adskiller sig for 1,5 mL reagensglas forudsat.
- Forberede 1 x vaskebuffer ved fortynding af 40 mL 25 x vaskebuffer i 960 mL deioniseret vand og bland dem af invertere.
Bemærk: Krystaller oploeses ved stuetemperatur. Bufferen kan bliver gule over tid, men vil stadig arbejde. - Der afpipetteres 1 mL af array buffer 1 i hver brønd med en 8-godt multi bakke (eller 2 mL i en 4-godt multi bakke).
- Med flad spids pincet, fjerne array membraner mellem de beskyttende ark og placere dem i brøndene. Sørg for tal på membranen vender opad.
Bemærk: Ved neddykning, farvestof på membranen vil forsvinde. - Dække bakken med låg og inkuberes det på en vuggende platform shaker for 60 min. ved stuetemperatur.
Bemærk: Dette er membran blokerende trin. - Under inkubationstiden, forberede protein prøverne. Tilføje 50 – 100 μg af total protein. Fortynd den lysate, at have en maksimal volumen af 334 μL med lysisbuffer til en endelige mængden af 1 mL.
Bemærk: 50 – 100 μg af total protein er normalt tilstrækkeligt. - Opsug array buffer 1 omhyggeligt og inkuberes membraner med 1 mL af prøverne natten over ved 2 – 8 ° C på en vuggende platform shaker.
Bemærk: Ikke touch/scratch membraner. - Den næste dag, vaske array ved omhyggeligt at fjerne hvert array og placere det i enkelte plastbeholdere (ca 8 x 11 cm2) med 20 mL af 1 x vaskebuffer. Vask membraner 3 x 10 min. på en vuggende platform i 1 x vask buffer ved stuetemperatur.
- Tilsæt 20 μl rekonstitueret antistof cocktail fra trin 2,3 til 1 mL 1 x array buffer 2. Tilsæt 1 mL af denne opløsning til hver 8-brønd skal anvendes.
- Fjern forsigtigt membraner fra vask bakker. DUP den nederste kant på papirservietter til at fjerne eventuelle overskydende vaskebuffer og overføre dem tilbage i den bakke, der indeholder antistof cocktails. Dække bakken med låget og der inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur på en vuggende platform. Grundigt skylle de anvendte bakker med dH2O og tør dem til senere brug.
- Omhyggeligt fjerner hver matrix og læg dem tilbage i de rene individuelle plastbeholdere (ca 8 x 11 cm2) med 20 mL af 1 x vaskebuffer. Vask dem 3 x 10 min. med wash buffer på en vuggende platform ved stuetemperatur.
- Fortynd Streptavidin-HRP (leveres med kit) eller streptavidin-fluorescerende farvestof (til en mere kvantitativ påvisning) 1:1,000 i 1 x array buffer 2 i en 15 mL reagensglas.
- Returnere membraner i 8-godt retter der indeholder HP løsning og Inkuber dem i 30 min. ved stuetemperatur på en vuggende platform (hvis ved hjælp af fluorescens, Pak skuffen i aluminiumsfolie at undgå ethvert lys eksponering).
- Fjern den overskydende buffer ved at placere membran mellem 2 stykker af 5 mm 3 M papir. For billeddannelse med en X-ray film/kemiluminescens imager, inkuberes tørrede membraner med en HRP påvisning løsning (mix to kemiluminescens løsninger 1:1) til 3 min og placere membranen i en klar plastfolie protector.
Bemærk: Tørrede membrane(s) kan også være placeret i et fluorescerende imager til at registrere de fluorescerende signal; minimere membran før imaging lys eksponering. For en kvantificering af X-ray film eller imager filer, undgå overeksponering. De fleste kemiluminescens/fluorescerende kameraer har en funktion til at undgå en mætning af signalet.
3. dataanalyse
- Download ImageJ, en billedbehandling program21, og installere softwaren.
- Åbn ImageJ ved at dobbeltklikke på 'ImageJ ikon'. Vælg billedet, der skal analyseres ved at klikke på 'Fil' i menulinjen, og derefter vælge 'Åbn' fra drop-down menuen og gennemse datafiler til billedet af interesse. Klik på filen for at åbne den.
- Invertere billede til analyse (sorte pletter på den hvide baggrund til hvide pletter på sort baggrund) ved at klikke på 'Rediger' i menulinjen og vælge 'Inverter' fra drop-down menuen.
- Vælg ikonet' oval' på værktøjslinjen (den anden mulighed i værktøjslinjen ImageJ). Tegne en cirkel/oval ved at klikke på billede (sort Kors) og flytte musen. Justere størrelse/form af cirkel/oval at omringe prikker på dot skamplet.
- Klik på 'Analysere' i menulinjen og derefter vælge 'Foranstaltning' fra drop-down menuen automatisk vil åbne et nyt vindue med værdier i det markerede område (område, middelværdi, minimum og maksimum).
- Flytte det cirkulære område ved at trække cirklen fra center (Læg punktet af pil til højre i midten) og Anbring det rundt næste måling (dot). Måle alle steder af interesse, den positive kontrol, den negative kontrol og baggrunden for analysen.
Bemærk: Den negative kontrol er PBS, baggrunden er en del af membranen uden nogen stedet (nogen del vil gøre), og den positive kontrol er en kontrol, der er leveret af producenten. - Vælg PBS negativ kontrol steder og trække værdien fra hver plet. Gennemsnitlig intensitet for hvert par af identiske steder der repræsenterer hver receptor tyrosin kinase (RTK). Hver gennemsnitlige intensitet kan være relateret til kontrolelementet til at beregne fold ændringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at undersøge effekten af TKI modstand på signaltransduktionsveje i cellelinjer, blev fire prøver analyseret. Én kontrolprøve (H3255r1) og 3 TKI-resistente cellelinjer (H3255r2-4) (figur 2) var relateret til skabelonen spot antistof (figur 3). Alle 4 prøver blev udarbejdet ved hjælp af denne protokol. Seks fosfoproteiner med differentieret aktivitet blev valgt for demonstration af analysen af antistof arrays (figur 4). Zonekort (figur 5) giver en semi-kvantitative udlæsning på ændringer i protein fosforylering af vigtigt signaltransduktion proteiner. Validering af array resultater kan fuldføres ved at gennemføre ortogonale tilgange, såsom Western blotting.
Figur 1: skematisk af semi-kvantitative antistof arrays. Antistof arrays er baseret på sandwich immunassay princippet, hvor en samling af capture antistoffer er integreret i enten glas eller nitrocellulose støtte. Cellelysater inkuberes med membranen og arrays underkastes sekundær antistoffer. En semi-kvantitative udlæsning kan indhentes fra kemiluminescens substrater eller yderligere kvantitative oplysninger, fluorescerende-baseret tænkelig. Alle signaler, der er afledt fra film eller TIF billeder kan behandles af densitometri og en beregning af fold-ændringer for hvert protein. Hele processen tager omkring dag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksempel phospho-antistof array udviklet med imager. De fluorescerende steder er registreret i to eksemplarer (to steder pr mål). Prøver og positiv kontrol steder viser vekslende intensitet. Vist her er en sammenligning af TKI-følsomme H3255r1 og 3 resistente (H3255r2-4) prøve arrays, hver opdelt i membranen A og B. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: kort over array steder. Kortet sammenkæder steder med antistof mål. Steder er mærket A - G lodret og 1-10 vandret. Den positive kontrol (orange) er til stede på alle membraner og normalt findes i hjørnerne. Den negative PBS kontrol er fremhævet i sort, mens prøven steder er fremhævet med gult. For hver matrix findes en liste over antistoffer også for identifikation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Data analyse eksempel. (A) intensiteten af steder af interesse, positivt kontrol, og baggrunden var identificeret på kortet og målt for alle prøver. (B) relative intensitet (spot intensiteten med baggrunden intensitet fjernet og normaliseres til en positiv kontrol intensitet) vises i et liggende søjlediagram til et par udvalgte kandidater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: zonekort af differential signaling i H3255 følsomme (r1) og resistente (r2-4) cellelinjer. En relativ spot intensitet blev brugt til at generere en zonekort til en sammenligning af ændringerne i CREB, P53, AKT og STAT5 i alle 4 prøver. Nogen høje niveauer vises i forskellige nuancer af rød, mens alle lavere niveauer vises i blå22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tilgange, der kombinerer mange biologiske udlæsninger er i sagens natur mere nøjagtige gengivelser af de cellulære maskiner i et eksperiment udført. Fremkomsten af phospho-antistof matrixer giver mulighed for en hurtig karakterisering af mønster af ændringer, som kan være mere oplysende end modifikation statussen af et enkelt protein. Den generelle arbejdsgang for anvendelsen af phospho-antistof arrays er baseret på en ændring i Serin, threonin eller tyrosin. Dette eksempel fokuseret på kendetegner de ændringer, der er knyttet til modstand mod terapi i lungekræft. Den vigtigste begrundelse for dette program er at protein fosforylering spiller en central rolle i signaltransduktion i mange menneskelige kræftformer18, og denne metode vil kunne overføres til andre systemer. En dysregulering af fosforylering i kræft indebærer sædvanligvis hyperactivation af en tyrosin kinase, og derfor de fosforyleres substrater (ofte herunder den auto-fosforyleret kinase, selv) er til stede på et niveau højere end i normalitet fysiologiske indstillinger og derfor kan udgør en betydelig del af fosfoproteiner i en kræftcelle. Disse højere niveauer af fosforylering vil gøre sporing lettere. Desuden har protein fosforylering en medicinsk betydning da afvigende tyrosin fosforylering er kendetegnende for mange typer af kræft23. Desuden, da denne teknik kan overdrages til undersøgelse af andre biologiske systemer, der udnytter fosforylering, kunne mange af de funktioner beskrevet her nemt justeres til at fokusere på andre typer af protein arrays (ubiquitin, apoptose, etc.).
Phospho-antistof arrays er almindeligt brugt til identifikation af ethvert signal veje involveret, enten som en sonderende metode eller kontrol af én bestemt vej. Forskellige firmaer laver kits for begge fosforylering status og de overordnede niveauer af proteiner. Mens real-time polymerase kædereaktion (PCR) analyse eller microarrays er meget mere kvantitative, de tager kun mRNA niveau i betragtning, og en oversættelse samt posttranslationelle modifikationer kan ikke behandles. Bortset fra fosforylering, kan andre posttranslationelle modifikationer såsom glykosylering eller ubiquitylation også behandles af arrays24,25.
En af de vigtige faktorer at overveje, før du starter antistof arrays er at starte med sund og aktivt dividere celler. Hypoxi, oxidativt stress og inflammation kan producere ændringer i signaltransduktion veje26 der kan forvrænge resultater og gøre en fejlfortolkning, hvis de behandles forkert. Denne stress kan henføres til formulering af medierne eller at plating for lidt eller for mange celler, eller til at udsætte celler til dårligt regulerede miljøer eller til behandling af kontrol versus stikprøveudvælgelsen lidt forskelligt. Vi har ligeledes noteret store forskelle i passage antallet eller tid i kultur efter optøning. Nøglen til at undgå disse kunstigt indførte variabler er at holde alt mellem de prøver så konsekvent som muligt. Ændre ikke FBS procentdelen eller medier volumen, osv., under eksperimentet.
Dataanalyse bør også overvejes inden du begynder et array eksperiment. En kemiluminescens array analyse er kun semi-kvantitative, og dens dynamiske område er cirka én størrelsesorden, mens en fluorescerende tilgang øger det dynamiske område til cirka to størrelsesordener. Skalaen som arrays er udført afhænger af den specifikke biologiske spørgsmål (r). Det er muligt at analysere en specifik resistente cellelinie af interesse for alle ændringer i den posttranslationelle ændringer i forhold til den oprindelige cellelinie eller at fokusere på én bestemt vej for en bred vifte af resistente cellelinjer. Skalerbarheden af denne fremgangsmåde bør betragtes i de tidlige planlægning faser. Resultaterne af en antistof array bør desuden altid bekræftes ved en sekundær metode på friske prøver og/eller den samme lysates. En western blot analyse kan anvendes til at kontrollere ændringer til specifikke mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for den gavmilde økonomiske støtte af Lawrence J. Ellison Institute of Transformative Medicine af USC (en gave til David Agus). Vi sætter pris på støtte fra efteråret Beemer og Lisa Flashner som føre til generation og offentliggørelsen af dette manuskript. Vi takke Laura Ng for hendes administrativ støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
| Tissue Culture dish 100 mm | TRP | 93100 | |
| ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27 G5/8, 1 mL for needle treatment of protein samples |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
| LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |
References
- Knauer, D. J., Smith, G. L. Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).
- Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).
- Di Fiore, P. P., et al. Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells. Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).
- Maguire, H. C., Greene, M. I.
- Busse, D., et al. Reversible G(1) arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27(KIP1) independent of MAPK activity. Journal of Biological Chemistry. 275 (10), 6987-6995 (2000).
- Kondapaka, B. S., Reddy, K. B. Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer. Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).
- Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. [Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).
- Dulbecco, R. A turning point in cancer research: sequencing the human genome. Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).
- Barinaga, M. DoE provides funds for human genome sequencing. Nature. 331 (6152), 103 (1988).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
- McCain, J. The cancer genome atlas: new weapon in old war? Biotechnology Healthcare. 3 (2), 46-51 (2006).
- Weinstein, J. N., et al. The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project. Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Carlson, B. Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials. Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).
- Huang, R. P. Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).
- Rani, S., O'Driscoll, L. Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays. Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).
- Kani, K., et al. JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).
- Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. Jr Signal transduction and the control of gene expression. Science. 295 (5556), 813-818 (2002).
- Rikova, K., et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).
- Chen, V. W., et al. Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system. Cancer. 120, Suppl 23. 3793-3806 (2014).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Ward, J. H. Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function. Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Griffin, J., et al. Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation. Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).
- Zhou, T., et al. Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).
- McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. Hypoxia, oxidative stress and inflammation. Free Radical Biology and Medicine. , In Press (2018).
