Summary
在这里, 我们提出了抗体阵列的协议, 以确定各种细胞模型中信号通路的变化。这些变化, 由药物/缺氧/紫外线光/辐射, 或过度表达/下调/挖空, 是重要的各种疾病模型, 并可以表明治疗是否有效或能识别药物的机制电阻。
Abstract
癌症患者对蛋白质磷酸化网络的异常调节通常是用酪氨酸激酶抑制剂治疗的。反应率接近85% 是常见的。不幸的是, 患者往往通过改变信号转导通路而成为治疗的顽固。使用微阵列的表达式分析的实现可以识别整个 mRNA 水平的变化, 蛋白质组学可以识别蛋白质水平的总体变化, 或者可以识别所涉及的蛋白质, 但信号传导的活动途径只能通过询问翻译后的蛋白质的修改来建立。因此, 确定药物治疗是否成功或是否出现抗药性的能力, 或者是否能够表征信号通路的任何改变, 是一项重要的临床挑战。在这里, 我们提供了一个详细的解释抗体阵列作为一个工具, 可以识别全系统的变化, 在不同的翻译后修改 (例如, 磷酸化)。使用抗体阵列的优点之一包括它们的可访问性 (阵列不需要蛋白质组学或昂贵设备的专家) 和速度。针对组合后翻译修改的阵列的可用性是主要的限制。此外, 无偏方法 (phosphoproteomics) 可能更适合于新发现, 而抗体阵列是最广泛的特征目标的理想。
Introduction
靶向酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 的临床应用, 为医生提供了有效的工具来靶向推动肿瘤转化的特定蛋白, 从而改变了癌症治疗的效果。这些化合物抑制或阻止酪氨酸激酶1,2靶蛋白的磷酸化。TKIs 的发展部分是因为各种关键信号基因的基因改变足以推动癌症的启动和进展 [如表皮生长因子受体 (EGFR), 原癌基因酪氨酸-蛋白激酶 src (src),BCR, 人表皮生长因子受体 2 (HER2)]3,4。TKIs 对细胞周期5和分子信号通路6的影响代表了从不相关到分子导向肿瘤治疗的转变。TKIs与化疗的主要优点是反应速度增加, 对健康细胞的毒性风险降低7。因此, 对新型 TKIs 的研究与开发越来越受到重视。
对基因组测序结果的访问开始于人类基因组项目8、9、10 , 并在今天继续进行各种下一代 (NextGen) 癌症测序工作 [例如, 癌症基因组阿特拉斯 (TCGA)11,12]。这启发了许多实验方法, 提供成千上万基因的同时信息和/或提供无偏见的快照的基因或蛋白质调制的生物扰动13。由于细胞功能的调节发生在多个层次, 从基因的转录到蛋白质的后转化修饰和它们的活动, 对控制细胞功能的事件的完全理解将最终需要从各种生物读数中集成数据。通过单细胞基因分辨率来监测成千上万基因的信使 RNA (mRNA) 水平, 提高了对基因功能和整个基因组的相互作用进行推断的能力。然而, 基因表达阵列的解释将永远是完全不完整的, 没有整合其他水平的调节: 即蛋白质表达水平, 蛋白质修饰状态, 和蛋白质后转化修改 (磷酸化、泛素化、甲基化等)。在这里, 我们描述的效用, 抗体阵列作为手段, 以审问后修改的重要信号元件作为一个功能的各种条件在一个实验14,15,16。
磷抗体阵列可以用来区分和分析信号传导通路16的变化。这些可能来自基因修饰或细胞系的治疗与激酶抑制剂, 化疗, 压力引起的葡萄糖剥夺, 缺氧, 或血清饥饿。注意, 耐药性或特定基因的下调也可能导致信号转导通路17的变化。
例如, 药物耐药性可以从药物靶的突变中产生, 以避免敏感。在肺癌中, 已知的 EGFR 突变使癌症不受影响到某些 TKIs, 但更容易受到其他人的影响。替代信号通路可以激活后, 突变17。作为一个更广泛的应用, 以识别的信号转导通路参与抵抗和缺氧等, 磷抗体阵列提供更多的洞察, 并因此了解, 所涉及的机制。
允许对蛋白质修饰进行评估的技术是系统生物学的一个重要组成部分, 因为它们通常服务于调节功能, 例如调节酶的活性或蛋白质之间的物理相互作用。在几乎所有细胞外触发信号传导通路18中, 蛋白质磷酸化的作用说明了转化后修饰的重要性。传统上, 蛋白激酶的鉴定或蛋白质的磷酸化状态也可以由西方的印迹分析来确定, 特别是如果研究者只对1–5目标感兴趣。然而, 西方的印迹是非常有选择性的, 可以偏向先验知识, 可能会错过重要的目标, 结果。抗体阵列通过嵌入各种捕获抗体 [泛特异磷酸化酪氨酸 (s)、反泛素等] 在固体基质 (如玻璃或硝化纤维素) 中, 提供了多目标的中等吞吐量读数。次级抗体提供了基于三明治的 ELISA 格式的特定蛋白质的信息 (图 1)。随着更多的目标感兴趣或先前的知识被限制在15, 这种分析变得更加强大和相关。磷阵列是更广泛的可就业, 因为他们可以比较的磷酸化和一般数量的蛋白质的更广泛的目标在一个实验, 并提供了显着改善量化的质谱。这种技术不适用于鉴定新的或以前未知的磷酸化地点。
基于大规模质谱的蛋白质组学可以用来识别特定的磷酸化部位的蛋白质19。虽然这项技术可以列举数以千计的翻译后事件, 它需要昂贵的仪器, 专用的实验管道, 和计算专长, 是超出了大多数研究人员。
抗体阵列提供了在不同的蛋白质读数16的同时读数。这些可能是蛋白质泛素化 (泛素阵列) 或磷酸化的变化。该阵列技术的主要优点是, 它提供了重要的反馈, 对与重要细胞参数相关的各种生物通路 (蛋白质 53 kDa, p53, 受体酪氨酸激酶, 细胞内通路) 的生物状态。同时。此外, 可以结合各种阵列类型, 以增加检测的渗透 (例如, 凋亡和泛素和磷酸化)。这种将多个阵列组合在一起以时间和成本效益的方式来评估多个样本中的各种平移后更改的能力, 在这种情况下是一个很大的优势。抗体阵列。
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Protocol
1. 蛋白质提取
- 板 5 x 106细胞在10毫米组织培养板 (或烧瓶) 在组织培养敞篷。使用自动单元格计数器或 hemocytometer 计算电镀时的单元格。或者, 估计单元格计数。
- 用10毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 冲洗10毫米板 (或烧瓶) 上生长的细胞 (pH 值 = 7.4)。在添加裂解缓冲液之前, 一定要卸下所有 PBS。
注: 溶解缓冲通常与试剂盒一起提供。如果没有, 则使用 radioimmunoprecipitation 检测缓冲器 (马国贤) 或任何其他细胞裂解缓冲液, 其中含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的鸡尾酒。 - 溶解 1 x 107细胞/毫升细胞在裂解缓冲液中添加正确的缓冲量的细胞和刮的细胞与细胞刮刀进入裂解缓冲。(例如, 对于 HeLa 细胞和 MiaPaCa-2, 每10厘米板使用600µL)。
- 将裂解液吸管向上和向下 (大约 10x), 并将其转移到一个新的1.5 毫升管。
- 孵化裂解物30分钟, 在4摄氏度, 最好在摇杆/振动筛。将裂解液通过注射器用27克针进行 10x, 以确保细胞膜的适当中断。或者, 油脂实验裂解液。将裂解物存放在-20 摄氏度或立即使用。
- 离心裂解在 1.4万 x g在4°c 15 分钟和转移上清到一个干净的1.5 毫升管。
- 通过二辛可宁酸测定 (定量)20或当量如劳瑞或布拉德福德, 并继续至少50–400微克, 对总蛋白的含量进行了分析。立即使用蛋白质或整除, 冷冻/储存在-70 摄氏度 (避免多个冻融循环)。
2. 人激酶阵列
- 在开始前将所有试剂带到室温 (大约1小时)。
注: 所有试剂和塑料磨损均包括在套件中。 - 在按照制造商的说明 (取决于目标/阵列的选择) 开始过程之前, 准备所有试剂新鲜 (阵列缓冲区), 说明可能稍有不同。
- 在 100 ul 的去离子水中重建检测抗体鸡尾酒, 或者按照制造商的指示, 它们对于所提供的1.5 毫升试管是不同的。
- 在960毫升的去离子水中稀释40毫升的25x 洗涤缓冲器, 并通过反相混合来制备1x 洗涤缓冲器。
注意: 晶体在室温下溶解。缓冲区可能会随着时间的推移而变黄, 但仍会起作用。 - 将1毫升的阵列缓冲器1放入8井多托盘 (或2毫升的4井多托盘) 中的每个井中。
- 用平端镊子, 除去保护片之间的阵列膜, 把它们放进井中。确保膜上的数字朝上。
注: 浸没后, 膜上的染料将消失。 - 将托盘盖上盖子, 在60分钟的室温下在摇床上孵化。
注: 这是膜阻挡步骤。 - 在潜伏期内, 准备蛋白质样品。添加50–100微克的总蛋白。稀释裂解液, 最大容积为 334 ul, 溶解缓冲至最终体积1毫升。
注: 总蛋白的50–100微克通常是足够的。 - 仔细吸入阵列缓冲器 1, 并在一个摇摆的平台振动筛上, 在2–8°c 一夜之间, 用1毫升的样品孵化膜。
注意: 不要碰/刮膜。 - 第二天, 通过仔细删除每个阵列并将其放入单独的塑料容器 (大约 8 x 11 厘米2), 用20毫升1x 的洗涤缓冲器来清洗阵列。在1x 洗涤缓冲器的室温下, 在摇摆平台上清洗膜 3 x 10 分钟。
- 吸管 20 ul 的重组抗体鸡尾酒从步骤2.3 到1毫升1x 阵列缓冲2。将此解决方案的1毫升添加到每个 8-很好使用。
- 小心地从洗涤盘中取出膜。将下边缘涂抹在纸巾上, 除去多余的洗涤缓冲液, 并将其转移回含有抗体鸡尾酒的托盘中。用盖子盖上托盘, 在摇晃的平台上在室温下孵化2小时。用 dH2O 彻底冲洗用过的托盘, 晾干后再使用。
- 小心地删除每个阵列, 并把它们放回干净的单独的塑料容器 (大约 8 x 11 厘米2) 与20毫升1x 洗涤缓冲器。在室温下, 用一个摇摆平台上的洗涤缓冲器清洗 3 x 10 分钟。
- 稀释链亲和素 (提供与套件) 或链亲和素荧光染料 (为一个更定量的检测) 1:1, 000 在1x 阵列缓冲2在15毫升的试管。
- 将膜恢复到含有 HP 溶液的8井菜肴中, 并在摇摆平台上在室温下孵化30分钟 (如果使用荧光, 将托盘包装在铝箔上以避免任何光线照射)。
- 将膜放在2片5毫米的3米纸之间, 卸下多余的缓冲器。对于用 X 射线胶片/化学发光成像仪进行成像, 用 HRP 检测解决方案 (混合两种化学发光溶液 1:1) 将干膜孵化为3分钟, 并将膜置于透明的塑料片保护器中。
注: 还可以将干膜放在荧光成像仪中检测荧光信号;在成像前尽量减少暴露在薄膜上的光线。对于 X 射线胶片或成像文件的量化, 避免过度曝光。大多数化学发光/荧光摄影机有一个功能, 以避免信号的饱和度。
3. 数据分析
- 下载 ImageJ, 一个图像处理程序21, 并安装软件。
- 通过双击"ImageJ 图标"打开 ImageJ。选择要分析的图像, 方法是单击菜单栏中的"文件" , 然后从下拉菜单中选择"打开" , 然后浏览计算机文件以查找感兴趣的图像。单击该文件以将其打开。
- 通过单击菜单栏中的"编辑"并从下拉菜单中选择"反转" , 将分析的图片 (白色背景上的黑色斑点与黑色背景上的白色斑点) 反转。
- 从工具栏中选择 "椭圆形图标" (ImageJ 工具栏中的第二个选项)。通过点击图片 (黑色十字) 和移动鼠标来绘制圆形/椭圆形。调整圆/椭圆形的大小/形状, 以包围斑点印迹上的点。
- 单击菜单栏中的"分析" , 然后从下拉菜单中选择"度量" , 以使用所选区域 (区域、平均值、最小和最大值) 的数值自动打开新窗口。
- 通过从中心拖动圆圈来移动圆形区域 (将箭头的点放在中间), 并将其放在下一个测量 (点) 区域周围。测量所有感兴趣的点, 积极的控制, 消极的控制, 以及分析的背景。
注: 负控制是 PBS, 背景是膜的一部分, 没有任何斑点 (任何部分将做), 积极的控制是由制造商提供的控制。 - 选择 PBS 负控制点并减去每个点的值。平均每对代表每个受体酪氨酸激酶 (RTK) 的重复点的强度。每个平均强度都可以与控件相关, 以计算褶皱变化。
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Representative Results
为探讨 TKI 抗性对细胞系信号传导通路的影响, 对四例进行了分析。一个控制样本 (H3255r1) 和 3 TKI 的细胞线 (H3255r2-4) (图 2) 与现场抗体模板 (图 3) 相关。所有4个样本都是使用本议定书编写的。六磷酸有差异活性的选择, 以证明对抗体阵列的分析 (图 4)。热图 (图 5) 提供了关于重要信号转导蛋白磷酸化变化的半定量读数。对阵列结果的验证可以通过实施正交方法 (如西方印迹) 来完成。
图 1: 半定量抗体阵列示意图.抗体阵列是基于夹层免疫分析原理, 其中采集抗体的收集是嵌入在玻璃或硝化棉的支持。细胞裂解物与细胞膜一起孵化, 阵列受二次抗体的作用。半定量读数可从化学发光基底或, 以更多的定量信息, 荧光为基础的成像。从胶片或 TIF 图像中提取的任何信号都可以通过密度测量和计算每种蛋白质的褶皱变化来处理。整个过程需要一天的时间。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 示例磷-使用该成像仪开发的抗体阵列.荧光斑点检测重复 (每目标两个点)。样品和正面控制点显示不同的强度。这里显示的是比较 TKI 敏感 H3255r1 和3抗 (H3255r2-4) 样本阵列, 每分裂在膜 A 和 B.请单击此处查看此图的较大版本。
图 3: 阵列点的映射.地图把斑点和抗体靶联系起来。斑点被标记 A G 垂直和 1-10 水平上。阳性控制 (橙色) 是存在于所有的细胞膜上, 通常发现在角落里。负 PBS 控件以黑色突出显示, 而示例点以黄色突出显示。对于每个阵列, 还提供了用于识别的抗体列表。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 数据分析示例.(A) 在地图上确定了兴趣点的强度、积极的控制和背景, 并对所有样品进行了测量。(B) 相对强度 (去除背景强度的光斑强度, 并将其规范化为正控制强度) 显示在条形图中, 供少数选定的候选者使用。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: H3255 敏感 (r1) 和抗 (r2-4) 细胞系的差分信号的热图.在所有4样品中, 使用相对光斑强度来生成热图, 以比较 CREB、P53、AKT 和 STAT5 的变化。任何高级别都以不同的红色色调显示, 而任何较低级别都显示为蓝色22。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
将许多生物读数结合在一起进行的实验中, 是细胞机械的更准确的表示方法。磷抗体阵列的出现使对修饰模式的快速表征, 这可能比任何单一蛋白质的修饰状态更具信息量。应用磷抗体阵列的一般工作流程是基于对丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的修饰。这个例子集中于描述与肺癌治疗的抗性相关的变化。这个应用的主要依据是蛋白质磷酸化在许多人的癌症18的信号转导中起着中心作用, 并且这个方法将被转移到其他系统。癌症的磷酸化失调通常涉及酪氨酸激酶的 hyperactivation, 因此, 磷酸基基质 (通常包括自动磷酸化激酶本身) 存在于高于正常的水平。生理上的设置, 因此, 可以构成一个很大一部分的磷酸在癌细胞。这些更高层次的磷酸化将使检测更容易。此外, 蛋白质磷酸化具有医学意义, 因为异常的酪氨酸磷酸化是许多类型的癌症的标志23。此外, 由于这种技术可转移到其他利用磷酸化的生物系统的调查中, 此处描述的许多功能可以很容易地调整, 以集中于其他类型的蛋白质阵列 (泛素、凋亡、 等)。
磷抗体阵列广泛用于识别所涉及的任何信号通路, 无论是探索方法还是验证某一特定通路。不同的公司为磷酸化状态和蛋白质的整体水平做成套工具。虽然实时聚合酶链反应 (PCR) 分析或微阵列的数量更高, 但它们只考虑 mRNA 水平, 而且翻译和后转换修改都不能解决。除了磷酸化, 其他的翻译后修改, 如糖基化或泛素化也可以解决的数组24,25。
启动抗体阵列前需要考虑的一个重要因素是从健康和积极的细胞分裂开始。缺氧、氧化应激和炎症可能导致信号转导通路26的变化, 如果治疗不当, 可以扭曲结果并引起误解。这种压力可以归结为介质的形成或镀太少或太多的细胞, 或使细胞暴露在受调控的环境中, 或者对对照样品的处理略有不同。我们也注意到在文化解冻后的段落数或时间上有很大的差异。避免这些人为引入的变量的关键是保持样本之间尽可能一致的东西。在实验期间不要改变血清的百分比或介质体积等。
在启动阵列实验之前, 还应考虑数据分析。化学发光阵列分析只是半定量的, 其动态范围大约是一个数量级, 而荧光方法将动态范围增加到大约两个数量级。执行数组的刻度取决于特定的生物学问题。与原细胞系相比, 对转化后修饰的所有变化有一个特定的抗性细胞线, 或者将重点放在一个特定的通路上, 用于各种耐药性细胞系。这种方法的可伸缩性应在早期规划阶段加以考虑。此外, 抗体阵列的结果应始终由二次方法的新鲜样品和/或相同的裂解物确认。可以使用西方污点分析来验证对特定目标的更改。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢劳伦斯·埃里森变革医学研究所的慷慨财政支持 (大卫 Agus 的礼物)。我们感谢秋宝马和丽莎 Flashner 的支持, 这导致了这篇手稿的产生和出版。我们感谢劳拉. 吴的行政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
| Tissue Culture dish 100 mm | TRP | 93100 | |
| ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27 G5/8, 1 mL for needle treatment of protein samples |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
| LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |
References
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