Summary
Nous présentons ici un protocole pour les alignements d’anticorps identifier les altérations dans les voies de signalisation dans divers modèles cellulaires. Ces changements, causées par les médicaments/hypoxie/ultra-ultra-violet lumière/rayonnement, ou par surexpression/régulation/débouchures, sont importants pour les différents modèles de la maladie et peuvent indiquer si une thérapie sera efficace ou peut identifier des mécanismes de médicaments résistance.
Abstract
Patients atteints de cancer avec une régulation aberrante des réseaux de la phosphorylation de protéines sont souvent traités avec des inhibiteurs de tyrosine kinase. Près de 85 % de taux de réponse sont communs. Malheureusement, les patients deviennent souvent réfractaires au traitement en altérant leurs voies de transduction de signal. Une implémentation du profilage de l’expression avec puces peut identifier les modifications dans l’ensemble au niveau des ARNm et protéomique peut identifier l’évolution globale des niveaux de protéine ou permet d’identifier les protéines impliquées, mais l’activité de la transduction du signal les voies ne peuvent être établies qu’en interrogeant les modifications post-traductionnelles des protéines. Par conséquent, la capacité d’identifier si un traitement médicamenteux est réussi ou si la résistance s’est posée, ou la possibilité de caractériser toute modification dans les voies de signalisation, est un défi clinique important. Ici, nous fournissons une explication détaillée des alignements d’anticorps comme un outil qui peut identifier les altérations systémiques aux diverses modifications post-traductionnelles (par exemple, la phosphorylation). Un des avantages de l’utilisation des alignements d’anticorps comprend leur accessibilité (un tableau ne nécessite pas un expert en protéomique ou équipement coûteux) et la vitesse. La disponibilité de tableaux ciblant une combinaison de modifications poteau-de translation est la principale limite. En outre, des approches non biaisées (phosphoprotéomique) peuvent être plus appropriés pour la découverte, tandis que les alignements d’anticorps sont idéales pour les cibles plus largement caractérisés.
Introduction
L’application clinique des inhibiteurs ciblées tyrosine kinase (TKI) a transformé le traitement du cancer en fournissant aux médecins des outils efficaces pour cibler les protéines spécifiques cette transformation néoplasique en voiture. Ces composés inhibent ou bloquent la phosphorylation des protéines ciblées par la tyrosine kinases1,2. Inhibiteurs ont été développées en partie parce que les altérations génétiques dans clé de différents gènes de signalisation ne suffisent pas à déclenchement du cancer en voiture et de progression [par exemple, récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), proto-oncogène tyrosine-protéine kinase Src (SRC), BCR-ABL et récepteur de facteur de croissance épidermique humain (HER2) de 2]3,4. L’impact de cette sur le cycle cellulaire5 et signalisation moléculaire voies6 représente une transformation de la non ciblés pour le traitement du cancer moléculairement guidées. L’avantage majeur d’utilisation par rapport à la chimiothérapie est le taux d’augmentation de la réponse et le moindre risque de toxicité pour les cellules saines,7. En conséquence, il a augmenté l’attention sur la recherche et le développement de nouveaux inhibiteurs.
Accès aux résultats de séquençage génomique a commencé avec le projet du génome humain8,9,10 et se poursuit aujourd'hui avec divers nouvelle génération (NextGen) cancer du séquençage efforts [par exemple, le génome du Cancer Atlas (TCGA)11,,12]. Cela a inspiré de nombreuses méthodologies expérimentales qui informent simultanément sur des milliers de gènes et/ou fournissent impartiales instantanés de gènes ou de protéines modulées par des perturbations biologiques13. Étant donné que la régulation de la fonction cellulaire se situe à plusieurs niveaux, de la transcription des gènes à la modification post-traductionnelle des protéines et leur activité, une compréhension complète des événements contrôlant la fonction cellulaire sera en fin de compte nécessite une intégration des données provenant de diverses lectures biologiques. La capacité de surveiller les niveaux d’ARN messager (ARNm) de milliers de gènes avec une résolution de cellule unique gène a augmenté la capacité de tirer des conclusions sur la fonction des gènes et les interactions à l’échelle du génome entier. Toutefois, l’interprétation des tableaux d’expression de gène sera toujours par nature incomplète sans l’intégration des autres niveaux de régulation : à savoir, les niveaux d’expression de protéine, les États de modification de protéine et la protéine post-traductionnelles modifications (phosphorylation, ubiquitination, méthylation, etc.). Nous décrivons ici l’utilité des alignements d’anticorps comme moyen pour interroger les modifications post-traductionnelles des éléments importants de la signalisation en fonction des diverses conditions dans une seule expérience14,,15, 16.
Tableaux de phospho-anticorps peuvent être utilisées pour distinguer et d’analyser les changements dans le signal transduction pathways16. Ceux-ci peuvent en découler une modification génétique ou traitements de lignées cellulaires avec les inhibiteurs de la kinase, agents chimiothérapeutiques, stress causé par la famine privation, hypoxie ou le sérum de glucose. Remarque, la résistance aux médicaments ou un gène spécifique up - ou diminution de l’expression peut aussi provoquer des changements dans le signal transduction pathways17.
La résistance aux médicaments, par exemple, peut en découler des mutations de la cible de médicaments pour éviter la sensibilité. Dans le cancer du poumon, connu des mutations EGFR rendent le cancer aide à certains inhibiteurs, mais plus sensible aux autres. Alternative, voies de signalisation peut être activé à la mutation17. Comme une application plus large pour l’identification des voies de transduction du signal impliqués dans la résistance et l’hypoxie, etc., tableaux de phospho-anticorps donnent un aperçu plus, et par conséquent comprendre, les mécanismes impliqués.
Les technologies qui permettent une évaluation des modifications protéiques représentent une composante importante de la biologie des systèmes parce qu’ils ont souvent une fonction de réglementation, comme la modulation de l’activité d’une enzyme ou les interactions physiques entre les protéines. L’importance des modifications post-traductionnelles est illustrée par le rôle de la phosphorylation de la protéine dans presque tous les extracellulaire déclenchée signal transduction pathways18. Traditionnellement, l’identification de kinases ou de l’état de phosphorylation de protéines pourrait également déterminer par analyse par Western blot, surtout si le chercheur est intéressé par seulement 1 – 5 cibles. Cependant, transferts Western sont très sélectives et peuvent être biaisés vers une connaissance préalable et pourraient manquer des cibles importantes en conséquence. Anticorps ou les baies offrent un affichage du débit moyen de cibles multiples en incorporant divers anticorps de capture [pan-spécifique tyrosine(s) phosphorylé, anti-ubiquitine, etc.], sur une matrice solide (par exemple, verre ou nitrocellulose). Anticorps secondaires des renseignements sur les protéines spécifiques dans un "sandwich" ELISA format (Figure 1). Ce test devient plus puissant et plus pertinentes comme plus de cibles sont d’intérêt ou la connaissance préalable est restreinte15. Les phospho-tableaux sont plus largement apte au travail parce qu’elles peuvent comparer la phosphorylation ainsi que des quantités générales de protéines d’une plus grande variété de cibles dans une expérience et une quantification nettement améliorée au cours de spectrométrie de masse. Cette technique n’est pas applicable à l’identification des sites de phosphorylation nouveaux ou inconnus auparavant.
Protéomique de basé sur la spectrométrie de masse à grande échelle pourrait être employés pour identifier les sites spécifiques de la phosphorylation de protéines19. Bien que cette technique peut énumérer plusieurs milliers d’événements post-traductionnelles, requiere instrumentation coûteuse, les pipelines expérimentales dédiées et une expertise informatique qui sont hors de portée de la plupart des chercheurs.
Alignements d’anticorps fournissent une lecture simultanée sur différentes protéines lectures16. Il peut s’agir de changements dans la protéine non-dégradante (tableau d’ubiquitine) ou la phosphorylation. Le principal avantage de cette technologie est qu’elle fournit des informations essentielles sur l’état biologique des diverses voies biologiques associés aux paramètres cellulaires importants (protéine de 53 kDa, p53, tyrosine kinase et voies intracellulaires) en même temps. En outre, il est possible de combiner différents types de tableaux afin d’accroître la pénétration d’un test (p. ex., l’apoptose et ubiquitine et phosphorylation). Cette capacité à combiner plusieurs baies afin d’évaluer diverses modifications post-traductionnelles dans plusieurs échantillons simultanément d’une façon temps - et rapport coût - entrée qui ne nécessite pas d’instrumentation spécifique ou une expertise revêt un avantage significatif dans le cas des alignements d’anticorps.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Extraction des protéines
- Plaque de 5 x 106 cellules sur une plaque de culture de tissu de 10 mm (ou ballon) dans une hotte de culture de tissus. Compter les cellules au moment de l’ensemencement avec un compteur de cellules automatique ou un hémocytomètre. Par ailleurs, estimer le nombre d’éléments.
- Rincer les cellules cultivées sur la plaque de 10 mm (ou ballon) soigneusement 3 x 10 ml d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH = 7,4). Assurez-vous de retirer tous les PBS avant d’ajouter le tampon de lyse.
Remarque : Le tampon de lyse est généralement fournie avec le kit. Si ce n’est pas le cas, puis utilisez un tampon d’immunoprécipitation (RIPA) ou tout autre tampon de lyse cellulaire contenant un cocktail d’inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase. - Lyse 1 x 107 cellules/mL de cellules dans le tampon de lyse en ajoutant la quantité correcte de la mémoire tampon vers les cellules et racler les cellules avec un grattoir de cellules dans le tampon de lyse. (par exemple, pour les cellules HeLa et MiaPaCa-2, utilisez 600 µL par plaque de 10 cm).
- Pipeter le lysat de haut en bas (environ 10 x) et transférez-le dans un nouveau tube de 1,5 mL.
- Incuber les lysats pendant 30 min à 4 ° C, de préférence sur un rocker/shaker. Appuyez sur le lysat grâce à une seringue avec une aiguille de 27 G pour 10 x assurer une bonne perturbation de la cell membrane(s). Sinon, laisser agir le lysate. Stocker les lysats à-20 ° C ou utilisez-les immédiatement.
- Centrifuger le lysat à 14 000 x g à 4 ° C pendant 15 min et transférer le surnageant dans un tube propre 1,5 mL.
- Doser la quantité de protéines totales par bicinchoninic acid test (BCA)20 ou un équivalent comme Lowry ou Bradford et continuer avec au moins 50 à 400 μg. Utiliser les protéines immédiatement ou partie aliquote et gel/magasin à-70 ° C (éviter de multiples cycles de gel-dégel).
2. humain Phosphokinase Array
- Ramener tous les réactifs à température ambiante avant de commencer (pendant environ 1 h).
Remarque : Tous les réactifs et l’usure en plastique sont inclus dans le kit. - Préparer tous les frais de réactifs (tampons de tableau) avant d’entamer la procédure en suivant les instructions du fabricant (selon le choix des cibles/baies, les instructions peuvent varier légèrement).
- Reconstituer les cocktails d’anticorps de détection dans 100 μL d’eau désionisée ou suivez les instructions du fabricant devraient elles diffèrent pour le tube à essai 1,5 mL fourni.
- Préparer 1 x tampon de lavage par dilution 40 mL de 25 x tampon de lavage en 960 mL d’eau désionisée et mélanger par retournement.
Remarque : Les cristaux se dissoudre à température ambiante. Le tampon peut jaunir avec le temps mais fonctionne toujours. - Pipette 1 mL de tampon de tableau 1 dans chaque puits d’un multi-plateau 8 puits (ou 2 mL dans un multi-plateau 4 puits).
- Avec embout plat pince à épiler, retirer les membranes de tableau entre les feuilles protectrices et placez-les dans les puits. Assurez-vous que les numéros sur la membrane sont vers le haut.
Remarque : Lors de l’immersion, la teinture sur la membrane va disparaître. - Recouvrir le plateau avec un couvercle et laisser incuber à elle sur un agitateur basculant de la plate-forme pendant 60 min à température ambiante.
NOTE : Ceci est l’étape de blocage de membrane. - Au cours de la période d’incubation, préparer les échantillons de protéine. Ajouter 50 à 100 μg de protéines totales. Diluer le lysat, d’un volume maximal de 334 μL, avec tampon de lyse pour un volume final de 1 mL.
Remarque : 50 à 100 μg de protéines totales suffit généralement. - Aspirer le tampon de tableau 1 soigneusement et incuber les membranes avec 1 mL des échantillons du jour au lendemain à 2 et 8 ° C sur un agitateur basculant de la plate-forme.
Remarque : Ne pas touch/scratch les membranes. - Le lendemain, laver le tableau par soigneusement retirer chaque tableau et en le plaçant dans des récipients en plastique individuels (environ 8 x 11 cm2) avec 20 mL de tampon de lavage 1 x. Laver les membranes 3 x 10 min sur une plate-forme bascule en 1 x tampon de lavage à température ambiante.
- Distribuer 20 μL de l’anticorps reconstitué cocktail d’après l’étape 2.3 à 1 mL de 1 x tampon de tableau 2. Ajouter 1 mL de cette solution dans chaque 8 puits à utiliser.
- Retirer délicatement les membranes des bacs de lavage. Épongez le bord inférieur sur le papier absorbant pour enlever n’importe quel tampon de lavage excessif et les transférer vers le bac contenant les cocktails d’anticorps. Recouvrir le plateau avec le couvercle et il incuber pendant 2 h à température ambiante sur une plate-forme bascule. Rincez les plateaux utilisés avec dH2O et les faire sécher pour un usage ultérieur.
- Retirer chaque tableau soigneusement et placez-les dans les contenants en plastique propre individuels (environ 8 x 11 cm2) avec 20 mL de tampon de lavage 1 x. Laver 3 x 10 min avec le tampon de lavage sur une plate-forme bascule à température ambiante.
- Diluer la Streptavidine-HRP (fourni avec le kit) ou streptavidine-fluorescent de colorant (pour une détection plus quantitative) 1 : 1 000 à 1 x tampon de tableau 2 dans un tube de 15 mL.
- Les membranes de retour dans les plats de 8 puits contenant la solution HP et les incuber 30 min à température ambiante sur une plate-forme bascule (si l’utilisation de fluorescence, le plateau en papier d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière).
- Enlever l’excès de tampon en plaçant la membrane entre 2 morceaux de 5 mm de papier de 3 M. Pour l’imagerie avec un imageur chimiluminescent/film de rayons x, incuber les membranes séchées avec une solution de détection HRP (mélangez les deux solutions de chimiluminescence 1:1) pendant 3 min et placer la membrane dans un protecteur de feuille en plastique transparent.
NOTE : Eau séchée peut également être placé dans un imageur fluorescent pour détecter le signal fluorescent ; minimiser l’exposition à la lumière de la membrane avant l’imagerie. Pour une quantification des fichiers x-ray film ou imager, éviter une surexposition. La plupart des imageurs chimiluminescent/fluorescent ont une fonction pour éviter une saturation du signal.
3. analyse des données
- Télécharger ImageJ, une programme21, de traitement d’image et installer le logiciel.
- Ouvrez ImageJ en double-cliquant sur l' « Icône ImageJ ». Sélectionnez l’image à analyser en cliquant sur « Fichier » dans la barre de menus, puis sélectionnez « Ouvrir » dans le menu déroulant et parcourir les fichiers de l’ordinateur pour l’image d’intérêt. Cliquez sur le fichier pour l’ouvrir.
- Inverser l’image pour l’analyse (taches noires sur fond blanc à taches blanches sur fond noir) en cliquant sur « Modifier » dans la barre de menu et en sélectionnant « Inverser » dans le menu déroulant.
- Sélectionnez l’icône de « ovale » de la barre d’outils (la deuxième option dans la barre d’outils ImageJ). Dessinez un cercle/ovale en cliquant sur la photo (croix noire) et en déplaçant la souris. Ajuster la taille/forme le cercle/ovale d’encercler les points sur la tache de la dot.
- Cliquez sur « Analyser » dans la barre de menus, puis sélectionnez « Mesure » dans le menu déroulant s’ouvre automatiquement une nouvelle fenêtre avec les valeurs de la zone sélectionnée (zone, moyenne, minimum et maximum).
- Déplacer la zone circulaire en faisant glisser le cercle du Centre (mis au point de la droite de la flèche au milieu) et les placer autour de la prochaine zone de mesure (dot). Mesurer tous les points d’intérêt, le contrôle positif, le témoin négatif et le fond pour l’analyse.
Remarque : Le témoin négatif est le PBS, le fond est une partie de la membrane sans n’importe quel endroit (n’importe quelle partie fera l’affaire), et le contrôle positif est un contrôle fourni par le fabricant. - Sélectionnez les points de contrôle négatif de PBS et soustraire la valeur de chaque tache. Moyenne de l’intensité pour chaque paire de taches en double, ce qui représente chaque récepteur tyrosine kinase (RTK). Chaque intensité moyenne peut être liée à la commande pour calculer la variation de pli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pour étudier l’effet de résistance TKI sur des voies de transduction de signal dans les lignées cellulaires, quatre échantillons ont été analysés. Un témoin (H3255r1) et 3 lignées TKI résistant (H3255r2-4) (Figure 2) sont liées au modèle spot anticorps (Figure 3). Tous les 4 échantillons ont été préparés à l’aide de ce protocole. Six phosphoprotéines avec activité différentielle ont été choisis pour la démonstration de l’analyse des tableaux anticorps (Figure 4). La carte thermique (Figure 5) fournit une lecture semi-quantitatives sur les changements dans la phosphorylation de la protéine de protéines de transduction de signal important. La validation des résultats tableau peut être complétée par la mise en œuvre d’approches orthogonales, comme le Western Blot.
Figure 1 : schéma des alignements d’anticorps semiquantitative. Les alignements d’anticorps sont basés sur le principe de dosage immunologique "sandwich", où une collection des anticorps de capture est incorporée dans le verre ou le soutien de la nitrocellulose. Les lysats cellulaires sont incubées avec la membrane et les baies sont soumis à des anticorps secondaires. Une lecture semi-quantitatives peut-être être obtenue de substrats par chimiluminescence ou, pour plus d’informations quantitatives, imagerie fluorescentes. Tous les signaux provenant de films ou images TIF peuvent être traitées par densitométrie et un calcul des pli-changements à chaque protéine. L’ensemble du processus prend environ jour. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : tableau de phospho-anticorps exemple mis au point avec l’imageur. Les taches fluorescentes sont détectés en double (deux places par cible). Les échantillons et les points de contrôle positif montrent des intensités variables. Montré ici est la comparaison de la H3255r1 TKI sensibles et 3 tableaux d’échantillon (H3255r2-4) résistants, chacun divisé en membrane A et B. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : carte des spots tableau. La carte relie les taches sur les objectifs de l’anticorps. Les taches sont étiquetés A - G verticalement et 1 à 10 horizontalement. Le contrôle positif (orange) est présent sur toutes les membranes et se trouve généralement dans les coins. Le contrôle négatif de PBS est mis en évidence en noir tandis que les taches de l’échantillon sont surlignés en jaune. Pour chaque tableau, une liste des anticorps est également fournie pour l’identification. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : exemple d’analyse de données. Contrôle (A), l’intensité des taches d’intérêt, le positif et le fond ont été identifiés sur la carte et mesurée pour tous les échantillons. (B), la relative intensité (l’intensité spot avec l’intensité de l’arrière-plan supprimé et normalisée à une intensité de contrôle positif) est affichée dans un graphique à barres pour quelques candidats choisis. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : carte de chaleur de signalisation différentielle à H3255 sensibles (r1) et des lignées cellulaires (r2-4) résistantes au. Une intensité relative du spot a été utilisée pour générer une carte de chaleur pour une comparaison des changements au CREB, P53, AKT et STAT5 dans tous les 4 échantillons. Des niveaux élevés sont affichent dans diverses nuances de rouge, tandis que les niveaux inférieurs est affichés en bleu22. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les approches qui combinent plusieurs lectures biologiques sont des représentations intrinsèquement plus précises de la machinerie cellulaire dans une expérience effectuée. L’avènement des alignements d’anticorps phospho permet une caractérisation rapide de la configuration des modifications qui peuvent être plus informatif que le statut de modification d’une seule protéine. Le déroulement général de l’application des tableaux de phospho-anticorps est basé sur une modification en sérine, thréonine ou tyrosine. Cet exemple a été consacrée qui caractérisent les changements liés à la résistance au traitement dans le cancer du poumon. La principale raison d’être de cette application est que la phosphorylation des protéines joue un rôle central dans la transduction des signaux dans de nombreux cancers humains18, et cette méthode sera transférable à d’autres systèmes. Un dérèglement de la phosphorylation dans le cancer implique généralement l’hyperactivation d’une kinase de tyrosine, et par conséquent, les substrats phosphorylés (incluant souvent la kinase auto-phosphorylés lui-même) sont présents à des niveaux plus élevés que dans la normale paramètres physiologiques et, par conséquent, peut compenser une fraction significative des phosphoprotéines dans une cellule cancéreuse. Ces niveaux plus élevés de la phosphorylation facilitera la détection. En outre, la phosphorylation des protéines a une signification médicale puisque la phosphorylation de tyrosine aberrante est une caractéristique de nombreux types de cancer23. En outre, étant donné que cette technique n’est transférable à l’enquête d’autres systèmes biologiques qui utilisent la phosphorylation, bon nombre des fonctionnalités décrites ici pourraient facilement être ajustés pour se concentrer sur d’autres types d’alignements de protéine (ubiquitine, apoptose, etc.).
Tableaux de phospho-anticorps sont largement utilisés pour l’identification de n’importe quel signal de voies impliquées, comme une méthode d’exploration ou vérification d’une voie particulière. Diverses entreprises faire des kits pour les deux l’état de phosphorylation et les niveaux globaux de protéines. Tandis que l’analyse de Real-Time polymerase chain reaction (PCR) ou les puces sont beaucoup plus quantitative, ils prennent uniquement les niveaux d’ARNm en considération, et une traduction, mais aussi des modifications post-traductionnelles ne peuvent être traitées. En dehors de la phosphorylation, autres modifications post-traductionnelles telles que la glycosylation ou non-dégradante peuvent également être adressées par les tableaux24,25.
Un des facteurs importants à considérer avant de commencer les alignements d’anticorps est de commencer par des cellules saines et activement en division. L’hypoxie, le stress oxydatif et l’inflammation peuvent produire des changements dans le signal transduction pathways26 qui peuvent fausser les résultats et rendre un contresens si traitée incorrectement. Ce stress peut être attribué à la formulation des médias ou de placage trop peu ou trop de cellules, ou à exposer les cellules pour environnements mal réglementées ou pour traiter le contrôle par rapport à des échantillons légèrement différemment. Nous avons également noté de grandes différences dans le nombre de passage ou l’heure dans la culture après décongélation. La clé pour éviter ces variables introduites artificiellement est pour maintenir le tout entre les échantillons aussi cohérents que possible. Ne modifiez pas le pourcentage FBS ou le volume de médias, etc., pendant l’expérience.
L’analyse des données devrait également considérer avant de commencer une expérience du tableau. Une analyse du tableau par chimiluminescence est seulement semi-quantitative et sa plage dynamique est un ordre de grandeur, alors qu’une approche fluorescente augmente la plage dynamique d’environ deux ordres de grandeur. L’échelle sur laquelle sont effectuées les tableaux dépend de l’ou les questions biologique spécifique. Il est possible d’analyser une ligne de cellules résistantes spécifiques d’intérêt pour tous les changements dans les modifications poteau-de translation par rapport à la ligne originale de la cellule ou de se concentrer sur une voie particulière pour une grande variété de lignées cellulaires résistantes. On envisagera l’évolutivité de cette approche dans les premiers stades de planification. En outre, les résultats d’un tableau d’anticorps devraient toujours être confirmés par une méthode secondaire sur des échantillons frais et/ou les lysats mêmes. Une analyse par western blot peut être utilisée pour vérifier les modifications sur des objectifs précis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants pour le soutien financier généreux de la Lawrence J. Ellison Institute of Transformative Medicine de l’USC (un cadeau à David Agus). Nous apprécions le soutien de l’automne Beemer et Lisa Flashner conduisant à la génération et la publication de ce manuscrit. Nous remercions Laura Ng pour son soutien administratif.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
| Tissue Culture dish 100 mm | TRP | 93100 | |
| ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27 G5/8, 1 mL for needle treatment of protein samples |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
| LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |
References
- Knauer, D. J., Smith, G. L. Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).
- Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).
- Di Fiore, P. P., et al. Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells. Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).
- Maguire, H. C., Greene, M. I.
- Busse, D., et al. Reversible G(1) arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27(KIP1) independent of MAPK activity. Journal of Biological Chemistry. 275 (10), 6987-6995 (2000).
- Kondapaka, B. S., Reddy, K. B. Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer. Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).
- Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. [Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).
- Dulbecco, R. A turning point in cancer research: sequencing the human genome. Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).
- Barinaga, M. DoE provides funds for human genome sequencing. Nature. 331 (6152), 103 (1988).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
- McCain, J. The cancer genome atlas: new weapon in old war? Biotechnology Healthcare. 3 (2), 46-51 (2006).
- Weinstein, J. N., et al. The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project. Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Carlson, B. Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials. Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).
- Huang, R. P. Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).
- Rani, S., O'Driscoll, L. Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays. Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).
- Kani, K., et al. JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).
- Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. Jr Signal transduction and the control of gene expression. Science. 295 (5556), 813-818 (2002).
- Rikova, K., et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).
- Chen, V. W., et al. Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system. Cancer. 120, Suppl 23. 3793-3806 (2014).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Ward, J. H. Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function. Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Griffin, J., et al. Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation. Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).
- Zhou, T., et al. Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).
- McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. Hypoxia, oxidative stress and inflammation. Free Radical Biology and Medicine. , In Press (2018).
