Summary
Hier beschrijven we een eencellige proteomic aanpak om te evalueren van immuun fenotypische en functionele (intracellulaire cytokine inductie) veranderingen in het perifere bloedmonsters geanalyseerd via massale cytometry.
Abstract
Cytokines spelen een centrale rol in de pathogenese van auto-immune ziekten. Vandaar, de meting van cytokine niveaus is de focus van meerdere onderzoeken in een poging om de precieze mechanismen die tot de verdeling van self-tolerance en latere autoimmuniteit leiden begrijpen. Benaderingen tot nu toe zijn gebaseerd op de studie van een specifiek aspect van het immuunsysteem (een single of paar celtypes of cytokines), en bieden niet een algemene beoordeling van ingewikkelde auto-immuunziekte. Terwijl de patiënt sera gebaseerde studies veroorloofd hebben belangrijke inzichten in autoimmuniteit, bieden ze niet de specifieke cellulaire bron van de dysregulated cytokines gedetecteerd. Een totaalaanpak van de eencellige te evalueren van cytokine productie in meerdere immuun cel subsets, in het kader van "intrinsieke" plasma van de patiënt-specifieke factoren, circulerende wordt hier beschreven. Deze aanpak maakt controle van de patiënt-specifieke immune fenotype (oppervlakte markeringen) en functie (cytokines), beide in de native "intrinsieke pathogene" ziekte staat, of in de aanwezigheid van therapeutische agenten (in vivo of ex vivo).
Introduction
Auto-immune ziekten zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit 3-8% van de bevolking. In de Verenigde Staten, auto-immune aandoeningen behoren tot de belangrijkste doodsoorzaken onder jonge en middelbare leeftijd vrouwen (leeftijden < 65 jaar)1,2. Auto-immune aandoeningen worden gekenmerkt door heterogene Vaatwandpathologie en diverse onderliggende immunologische processen. Het spectrum van heterogeniteit is goed vertegenwoordigd in verschillende aandoeningen, zoals gezamenlijke betrokkenheid bij reumatoïde artritis (RA) en neurologische ziekte bij multiple sclerose (MS). Echter, dit niveau van heterogeniteit ook binnen een enkele stoornis, zoals systemische lupus erythematosus (SLE) wordt geïllustreerd: sommige patiënten kunnen presenteren met Renale pathologie, terwijl anderen van hematologic of gezamenlijke betrokkenheid3 last.
De onderliggende immunopathogenese in auto-immune aandoeningen komt overeen met de klinische heterogeniteit, met betrekking tot auto - en hyper-activering van meerdere aangeboren en adaptieve immuun cel subsets, en daarmee gepaard gaande dysregulated cytokine productie. Hoewel cytokines een centrale rol in de pathogenese van auto-immune ziekte spelen, heeft inzicht in hun specifieke rol in het mechanisme van de ziekte bewezen uitdagend. Cytokines worden gekenmerkt door Pleiotropie (een cytokine kan het hebben van meerdere effecten op verschillende soorten cellen), redundantie (meerdere cytokines kan hetzelfde effect hebben), dualiteit (een cytokine kan pro - of anti - inflammatory effecten onder verschillende omstandigheden hebben), en plasticiteit (cytokines kan worden gegoten in een rol die verschillend van de "originele", afhankelijk van de omgeving)4,5,6. Bijgevolg onderscheiden niet populatieniveau methoden heterogene cellulaire reacties op de dezelfde "cytokine milieu". Studie ontwerpen die zich richten op een specifiek aspect van het immuunsysteem (één celtype of cytokine), bieden ook niet een algemene beoordeling van alle elementen die betrokken zijn bij complexe auto-immuunziekte. Terwijl de patiënt sera gebaseerde studies veroorloofd hebben belangrijke inzichten in autoimmuniteit, bieden ze niet de specifieke cellulaire bron van de dysregulated cytokines gedetecteerd.
Onlangs, we een eencellige proteomic benadering om gelijktijdig controleren meerdere immuun celtypes, en sporen van hun verschillende cytokine verstoringen in de omgeving van de patiënt specifieke "pathogene" perifere bloed plasma circulerende factoren ontwikkeld. De hier beschreven werkstroom wordt gekenmerkt door het gebruik van intact perifere bloedmonsters, in tegenstelling tot geïsoleerde perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs). Perifere bloed vertegenwoordigt het meest fysiologisch desbetreffende voertuig te bestuderen van systemische immuun-gemedieerde ziekte, met inbegrip van 1) niet-mononucleaire bloedcellen vaak betrokken in de auto-immune ziekte (d.w.z., neutrofielen, bloedplaatjes), en 2) plasma factoren, zoals nucleïnezuren, immuuncomplexen en cytokines, circuleren die immuun activerend rollen hebben. Te vangen de "intrinsieke pathogene" dysregulated cytokine productie, perifeer bloed monsters worden verwerkt onmiddellijk na de loting van het bloed (T0, tijd nul), en na 6 uur incubatie bij 37 ° C (fysiologische lichaamstemperatuur) met een eiwit transport de Inhibitor van de omwenteling in het ontbreken van een exogene stimulerende aandoening (T6, tijd 6 h), om op te sporen van cytokine productie (accumulatie, T6-T0) dat bij de status van "intrinsieke" ziekte (Figuur 1 aansluiten zou). Om te studeren van dysregulated processen die weerspiegelen over of onder activering van signalering trajecten die betrokken zijn bij de immuunrespons die relevant zijn voor de ziekte, perifeer bloedmonsters zijn behandeld (6 uur incubatie bij 37 ° C met een eiwit vervoer-remmer) een exogene stimuleren van de voorwaarde dat weerspiegelt de pathogenese van de ziekte, zoals Toll-Like-Receptor (TLR) agonisten in het geval van SLE (T6 + R848, tijd 6 h met 1 µg/mL R848), op te sporen van cytokine productie die bij een reactie op nucleic zuren aansluiten zou (T0 vs. T6 vs. T6 vergelijken + R848, Figuur 1). Studeren immunomodulerende effecten van beschikbare therapeutics ex vivo, aangezien ze betrekking op de precieze immuun dysregulated processen voor specifieke patiënten hebben, worden perifeer bloedmonsters behandeld met een JAK-remmer bij de relevante therapeutische concentratie (hier, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, tijd 6 h met 5 uM ruxolitinib), aan de opsporing van wijzigingen in "intrinsieke" ziekte staat naar aanleiding van de drug (T0 vs. T6 vs. T6 + 5R, Figuur 1). Een JAK-remmer werd gekozen voor deze studie omdat JAK-remmers is gebleken dat succesvol te zijn in de behandeling van auto-immune aandoeningen zoals RA.
Om tegelijkertijd het evalueren van de processen van de dysregulated in meerdere immuun cel subsets perifeer bloedmonsters van SLE hierboven beschreven werden patiënten en gezonde controles verwerkt zoals hierboven beschreven en geanalyseerd door massale cytometry. Massa cytometry, ook bekend als Cytometry-Time-Of-Flight, biedt eencellige analyse van meer dan 40 parameters zonder problemen van spectrale overlap7,8,9. Deze techniek maakt gebruik van zeldzame aarden metalen isotopen in de vorm van oplosbare metaalionen als tags gebonden aan antilichamen, in plaats van fluorophores10. Aanvullende gegevens met betrekking tot de massa cytometry technologische platform (dat wil zeggen, tuning en kalibratie, monster overname) kunnen worden gevonden in Leipold et al. en McCarthy et al. 11 , 12 de hoge-dimensionaliteit van massale cytometry waardoor gelijktijdige meting van meerdere cytokines in aangeboren en adaptieve immuun cel subsets met eencellige granulariteit (Tabel van materialen).
Huidige conventionele klinische en laboratorium parameters zijn vaak niet gevoelige of specifiek genoeg is voor het opsporen van voortdurende ziekte-activiteit of het antwoord op de specifieke immunomodulators13, als gevolg van de noodzaak om het beter af te bakenen de onderliggende immuun wijzigingen die flare-ups rijden. Gezien de alomtegenwoordigheid van cytokine disregulatie in auto-immuunziekte, een overvloed aan behandeling benaderingen die gebruikmaken van antilichamen of kleine moleculaire remmers targeting cytokines of signalering eiwitten die betrokken zijn in de regulatie van cytokine productie hebben onlangs naar voren gekomen. In zijn elementaire vorm biedt de hier beschreven perifeer bloed analytische aanpak een platform om patiënt-specifieke dysregulated cel subsets en hun abnormale cytokine productie in auto-immune ziekten met systemische weerslag te identificeren. Deze methode zorgt voor de personalisatie van therapeutische keuzes, zoals specifieke dysregulated cytokines kunnen worden geïdentificeerd, en specifieke behandeling opties kunnen ex vivo getest te beoordelen van hun vermogen om te immunomodulate de patiënt specifieke ziekte proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Colorado meerdere institutionele Review Board (COMIRB) van de Universiteit van Colorado. Alle onderstaande beschreven procedures moeten worden uitgevoerd in een steriele weefselkweek kap, tenzij anders aangegeven, met gefilterde Pipetteer tips, en alle reagentia gefilterd.
1. bereiding van reagentia voor perifere bloed verwerking
- Bereiden ruxolitinib voorraad aliquots (10 – 15 μl/injectieflacon voor eenpersoonsgebruik) op 10 mM door verdunning van het gelyofiliseerd reagens in DMSO volgens de instructies van de fabrikant (winkel bij-80 ° C). DMSO concentraties in alle tests met inbegrip van ongestimuleerde controles minder dan 0,2% (vol/vol) houden
- Bereiden van R848 (resiquimod) voorraad aliquots (10 – 15 μl/injectieflacon voor eenpersoonsgebruik) bij 1 μg/μL door verdunning van het gelyofiliseerd reagens in steriel water als de per de instructies van de fabrikant. Winkel bij-80 ° C.
- Lipopolysaccharide (LPS) voorraad aliquots (5 μL per flacon voor slechts één keer wordt gebruikt) op 1 μg/l bereid door verdunning van het gelyofiliseerd reagens in steriel water volgens instructies van de fabrikant. Winkel bij-80 ° C.
- De cel kleuring Media (CSM) met behulp van PBS, 0,5% BSA en 0,02% NaN3voor te bereiden.
- Verwerven en de eiwit vervoer remmer (PTI) cocktail (Tabel of Materials) klaar te houden.
- Ontdooien en Verdun de ruxolitinib voorraad flacon (10 mM) 1:10 in steriele PBS (1 mM). Gereserveerd bij kamertemperatuur in een weefselkweek kap.
- Ontdooien en Verdun de R848 voorraad flacon (1 μg/µL) 1:10 in steriele PBS (0.1 μg/µL). Gereserveerd bij kamertemperatuur in een weefselkweek kap.
- Ontdooien en Verdun de LPS voorraad flacon (1 μg/µL) 1:100 in steriele PBS (0,01 μg/µL). Gereserveerd bij kamertemperatuur in een weefselkweek kap.
- Vooraf warm steriele RPMI (geen L-glutamine) in een waterbad standaard 37 ° C (voor minstens 10 min).
- Verdun de lyse/fix buffer door 1:5 in gefilterde ddH2O (werken concentratie) op de benchtop (hoeft niet te worden steriel).
Opmerking: vereist 1 mL bloed 20 mL werken concentratie van lyse/fix buffer.- Maken van lyse/fix buffer voor 5 voorwaarden voor 1 mL volbloed elke (minstens 100 mL). Aliquot 20 mL van de concentratie van de werken van lyse/fix buffer in de conische buizen 50 mL per milliliter van volbloed (Houd de lyse/fix oplossing bij 37 ° C, totdat het nodig is). De omstandigheden op de conische buisjes met lyse/fix buffer als volgt labelen: T0 (tijd nul), T6 + 5R (tijd 6 h met 5 uM ruxolitinib), T6 + R848 (tijd 6 h met 1 μg/mL R848), T6 + LPS (tijd 6 h met 0,1 μg/mL LPS), T6 (tijd 6 h).
- Label ronde onder steriele polystyreen buizen met caps en 1 mL microcentrifuge buizen met de dezelfde nomenclatuur zoals in stap 1.10.
2. stimulatie en verwerking van perifere bloed (Figuur 1)
- Plaats de gelabelde ronde onderkant polystyreen buizen uit stap 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) op een rek.
Opmerking: Al de volgende stappen worden uitgevoerd in dit soort buis tenzij anders is bepaald. Cap de buizen bij het overbrengen van tussen de weefselkweek kap en incubator te handhaven van de steriliteit. - Voeg 1 mL van 37 ° C RPMI (geen L-glutamine) toe aan elk van de buizen (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). De bloed collectie buis meerdere malen omkeren, voeg 1 mL bloed aan elke buis en Pipetteer op en neer meerdere keren meng met RPMI (verdunning met RPMI verhindert samendoen van het bloed tijdens de incubatietijd van 6 h).
- Voeg 10 μL van de 1:10 ruxolitinib T6 + 5R. Meng met een pipet P1000. Plaats het rek van buizen in de incubator bij 37 ° C en beginnen timing de incubatie (T = 0).
- De T0-monster als volgt verwerken.
- Pipetteer de volledige inhoud van de T0-buis in een gelabelde conische buis met 20 mL van 37 ° C werken concentratie lyse/fix buffer. Spoel voor het optimaliseren van herstel van de cel, de buis met werken concentratie lyse/fix buffer. Meng door het omkeren van de conische buis.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten zodat lysis en fixatie. Voer alle volgende stappen bij de benchtop na fixatie. Centrifugeer cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Giet het supernatant. Resuspendeer de cellen in de koude PBS ijs te breken van de pellet 1 mL, vul dan de conische tot een volume van 15 mL met PBS.
- Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Giet het supernatant. Herhaal de PBS wash (stappen 2.4.3–2.4.4) als pellets rood zijn. Resuspendeer de cellen in 1 mL van CSM te breken van de pellet, dan naar de gelabelde microcentrifuge buis (stap 1.11) voor het antilichaam kleuring. Neemt een 10 µL monster aan cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller of hemocytometer tellen.
Opmerking: Aangezien alle cellen op dit punt worden opgelost, is het niet nodig om een vlek van de levensvatbaarheid. - Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De bovendrijvende vloeistof, waardoor de pellet in ~ 60 µL van restvolume gecombineerd. Houd deze pellet op ijs totdat monsters van andere voorwaarden hebt voltooid verwerking.
- Bij T = 30 min, de buis rack (stap 2.3) naar de weefselkweek kap en uitvoeren van de volgende handelingen uit.
- Voeg 10 μL van de 0.1 μg/μL R848 T6 + R848. Meng met een pipet P1000.
- Voeg toe 10 μL van de 0,01 μg/μL LPS aan T6 + LPS. Meng met een pipet P1000.
- 4 μL van eiwit vervoer remmer (voorraad bij 500 X) toevoegen aan T6, T6 + 5R, en T6 + LPS (maar niet naar T6 + R848) en terug van de monsters naar de incubator tot T = 6 h. Mix grondig met een pipet P1000 elke 2 h.
Opmerking: R848 is een endoplasmic TLR-agonist en vereist bijgevolg een tijdelijke vertraging in de toevoeging van de eiwit-vervoer-remmer te voorzien in toegang tot haar doel-receptor.
- Op T = 2 h, 4 μL van eiwit vervoer remmer cocktail (voorraad bij 500 X) toevoegen aan de T6 + R848 buis. Meng alle monsters met een pipet P1000 en terug het rack naar de incubator tot T = 6 h.
- Meng de monsters met een P1000 nog een keer op T = 4 h.
- Op T = 6 h, verwerken T6, T6 + LPS T6 + R848 en T6 + 5R bloed monster buizen zoals beschreven in stap 2.4 voor de T0-monster.
- Bewaar de cel pellets in restvolume CSM-80 ° c te verwerken op een toekomstige datum. U kunt ook overgaan tot barcoding en antilichaam kleuring zonder op te slaan.
3. de Barcode van bloedcellen Lysed/vast
- Ontdooi de lysed/vaste celsteekproeven van de opslag-80 ° C langzaam op het ijs; een maximum van 20 monsters kan worden aangeduid met unieke barcodes en gebundeld met behulp van dit systeem. Verdun de 10 X barcoding perm buffer door 1:10 met PBS; het maken van genoeg buffer voor ~ 3 mL per monster.
- Vul één niet-steriele trog met de CSM en één met de 1 X barcoding perm buffer. Voeg vervolgens 1 mL van ijs koud CSM aan vers ontdooid samples, meng met een pipet en overbrengen naar de respectieve vooraf gelabelde polypropyleen cluster buizen.
- Neemt een 10 μL monster aan cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller of hemocytometer tellen. Normaliseren van de graven van de cel voor 1.5-2 x 106 cellen per monster in elke cluster buis: verwijderen en het volume van overtollige cellen boven 2 x 106 cellen negeren.
- Centrifugeer de cellen bij 600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen in 1 mL van de 1 X barcoding perm buffer met een meerkanaalspipet en centrifuge op 600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gecombineerd uit het supernatant.
- Line-up de cluster buizen op een rek in dezelfde volgorde zoals aangegeven op de barcode-sleutel, zodat het monster overeenkomt met met de barcode. Voeg toe aan alle monsters in de cluster buizen 800 μL 1 X barcoding perm buffer door meerkanaalspipet zonder te raken de pellet van de cel met de uiteinden van de Pipet (geen menging) te verminderen cel verlies. Terzijde van het rek met de cluster-buizen.
- Verwijder 20-plex Pd Barcoding Kit buis strips van-20 ° C en ontdooien bij kamertemperatuur. Voeg 100 l 1 X barcoding perm buffer, meng en breng 120 μl van de geresuspendeerde barcode mix in de overeenkomstige celsteekproeven in de cluster buizen.
- Meng door meerkanaalspipet zodat er geen kruisbesmetting tussen individueel barcoded monsters. Incubeer cluster buizen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur toe de barcodes op het etiket van de cellen.
- Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer in 1 mL van CSM.
- Centrifugeren en resuspendeer in CSM weer zoals in stap 3.8.
Opmerking: Elk monster wordt nu aangeduid met een unieke barcode en monsters zijn klaar om te worden samengevoegd. - Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en de bovendrijvende substantie gecombineerd. Met een enkele pipet en gebruik van de dezelfde tip, overdracht van alle cel pellets in ~ 70-80 μL restvolume aan één polystyreen buis. Het uiteinde van de pipet; verwijdert niet gereserveerd de één pipet met deze tip.
- Toevoegen met een meerkanaalspipet en nieuwe tips, ~ 100 μl CSM aan elke oorspronkelijke cluster buis te maximaliseren van de terugwinning van de cel. Met de één pipet met de tip dat opzij werd gezet, door alle cel pellets in ~ 100 μl restvolume te overbrengen in de dezelfde polystyreen buis.
- Het toevoegen van CSM naar boven uit de polystyreen buis (~ 3 mL). Graaf en record het nummer van de cel voor de gepoolde barcode ingesteld. Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en de bovendrijvende substantie gecombineerd. Ga verder met de monsters barcoded kleuring op dezelfde dag.
Opmerking: Het is normaal te verwachten ~ 20-30% cel verlies in het barcoding proces.
4. vlekken van Barcoded vaste Lysed/bloedcellen en voorbereiding voor analyse op massale Cytometry Instrument
Opmerking: Elke 1 X titer van kleuring van antilichaam (1 μL van antilichaam per 100 μl kleuring reactie), meestal 3-4 x 106 cellen kan vlek. Daarom, wanneer alle barcoded monsters zijn samengevoegd in één buis, de hoeveelheid antilichaam moet worden opgeschaald. Als 20 barcoded monsters bedraagt 30 x 106 cellen, en elk 1 X titer kan 3-4 x 106 cellen vlek, vereist het monster barcoded slechts een 10 X titer, in tegenstelling tot de kleuring van elk monster individueel, die zou vereisen een 20 X hoeveelheid antilichaam (1 X per individuele buis). De concentratie van het antilichaam aan celaantal moet zorgvuldig worden getitreerd voor elke individuele antilichaam cocktail (hier niet besproken).
- Vlek de cellen met behulp van antilichamen (Tabel of Materials) voor oppervlakte kleuring en cytokine inductie.
- Maken door de berekening worden toegevoegd en de boekhouding voor pipetting fout met de oppervlakte kleuring cocktail (dat wil zeggen, als de kleuring van 20 barcoded monsters van 2 x 106 cellen in elk monster, een 10 X titer vlek is vereist; voor eindvolume berekeningen, compenseren pipetting fout door het maken van een 10.5 X laatste kleurstofoplossing).
- Voeg toe 10 X waard van oppervlak vlekken van volume dat u wilt de barcoded cel pellet. Ter vermindering van verlies van de cel, met de dezelfde tip, meng en meten van de hoeveelheid oppervlak vlekken en cel pellet.
- Op basis van het volume van cellen en vlekken cocktail, CSM aan een kleuring eindvolume van 50 μl per aantal celsteekproeven (dat wil zeggen, als een set van 20 monsters, 50 μl X 20 = 1 mL) toevoegen. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Het monster iedere 15 minuten doorroeren om zelfs kleuring.
- Tijdens de oppervlakte vlek incubatie, bereiden de Perm/afwas buffer (Tabel van materialen) door verdunning 1:10 met gefilterde ddH2O. voorbereiden hoeveelheden van 2 mL voor permeabilization, en 5 mL voor wassen. Bewaren bij 4 ° C of op ijs.
- Boven uit het oppervlak vlekken van buis met CSM en centrifugeer bij 600 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. gecombineerd het supernatant. Resuspendeer de barcoded monster in 2 mL zuiver 4 ° C, 1:10 verdunning Perm/afwas buffer. Incubeer bij 4 ° C gedurende 20-30 minuten om volledig permeabilize van de cellen.
- Centrifugeer bij 600 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten en het supernatant gecombineerd.
- Voor het intracellulaire kleuring, stappen vergelijkbaar kleuring (wat betreft oppervlakte kleuring). Echter gebruiken de 4 ° C, 1:10 verdunning Perm/afwas buffer in plaats van de CSM om het totaal volume kleuring, zodat de cellen in een permeabilizing omgeving gedurende de intracellulaire kleuring blijven.
- Voeg het intracellulaire antilichaam cocktail aan het oppervlak gekleurd en permeabel cel pellet (stappen 4.1.2–4.1.17). Brengen het totaal volume naar 50 μl per aantal celsteekproeven kleuring. Incubeer gedurende 60 min bij 4 ° C. Het monster iedere 15 minuten doorroeren om ervoor te zorgen zelfs kleuring.
- Tijdens de intracellulaire kleuring, bereid de intercalatorethidium oplossing: 900 μL van gefilterde PBS + 100 μl van gefilterde 16% PFA (eindconcentratie van 1,6% PFA) + 0,2 μL van 500 uM van intercalatorethidium kleurstof (Tabel van materialen).
- Top af de cel pellet + intracellulaire antilichaam cocktail met koude 1:10 Perm/afwas buffer.
- Centrifugeer bij 600 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten, en het supernatant gecombineerd. Top af de kleuring buis met CSM. Tellen en noteer het nummer van de cel. Centrifugeer bij 600 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten, en het supernatant gecombineerd. Resuspendeer de cellen in 1 mL van de intercalatorethidium oplossing van stap 4.9. Incubeer gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur voor volledige bekomt, of overnacht bij 4 ° C (monsters in intercalatorethidium oplossing kunnen verblijf bij 4 ° C voor maximaal 1 week voordat u ze op de massale cytometry instrument).
- De cellen voor te bereiden voor de massale cytometry instrument.
- Top uit de buis met 3 mL gefilterde ddH2O en centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de cellen in 3 mL gefilterde ddH2O. Pass deze schorsing door een 100 μm filter verwijderen puin of aggregaten die potentieel het massale cytometry instrument kunnen verstoppen.
- Tellen en registreren van de cel nummer na filtratie. Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 min bij 4 ° C
- De kraal ijkoplossing (Tabel of Materials) voor te bereiden door verdunning het 1:10 in gefilterde ddH2O.
- Resuspendeer de gekleurde cellen in het vereiste volume van 1:10 kraal kalibreervloeistof voor de verwezenlijking van de concentratie van een cel ~ 1 x 106 cellen/mL verdund.
Opmerking: Voor een CyTOF1 op 45 µL/min is het aanbevolen optimum 5 x 10,5 cellen/mL; voor Helios op 30 µL/min, 7,5 x 105 cellen/mL. - Ga verder met het uitvoeren van het monster op de massale cytometry instrument9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de workflow voor de stimulatie en verwerking van de monsters van perifeer bloed, met inbegrip van de toewijzing van bloed monster aliquots, timing van de toevoeging van stimulatie agenten, eiwit transport remmer cocktail en incubatie maal totdat de lysis van de rode bloedcellen (RBC) en fixatie. De keuze van de stimulerende agenten zal afhangen van de signalering en cytokine trajecten die voor beoordeling gericht zijn. Bijvoorbeeld, in het protocol beschreven hier, worden TLR agonisten gebruikt om te evalueren meerdere celtypen aangeboren immuun sensing mechanismen. Representatieve extracellulaire (LPS, TLR4 agonist) en endoplasmic (R848, TLR7/8 agonist) agonisten werden gekozen. Andere stimulerende middelen omvatten Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) en Ionomycin (PMAIONO), die als T cel activators fungeren kan. Specifieke cytokines kunnen ook worden gebruikt als gemachtigden, samen met andere specifieke antigenen van de B- en T cel te stimuleren.
Om aan te tonen van de in dit protocol beschreven experimentele aanpak, Figuur 4 Figuur 2en Figuur 3Toon representatieve resultaten verkregen met behulp van LP's, R848, en PMAIONO als voorwaarden stimuleren. Terwijl het gebruik van PMAIONO niet in het protocol beschreven werd, de gegevens worden weergegeven in Figuur 3 en 4 van de figuur te laten zien dat verschillende (en selectieve) celtypes en cytokinen geactiveerd/veroorzaakte reactie op TLR agonisten (LP's en R848) versus een T Cell activator (PMAIONO). Gezien het feit dat 26 oppervlakte markeringen (Tabel of Materials) werden gebruikt om de afbakening van meerdere aangeboren en adaptieve immuun cel subsets, kunnen verschillende T, B, NK, monocyt en dendritische cel subsets gelijktijdig bestudeerd worden binnen één sample. Markers van immuun cel activatie zijn bovendien ook opgenomen, zoals CD86 of ICOS voor B-cellen en PD1 voor T-cellen. Een beperkte gating strategie aan te tonen de beoordelingvan CD14hi monocyten vertegenwoordiger is afgebeeld in Figuur 2. Echter, verdere gedetailleerde en uitgebreide gating van T, B, NK, monocyt, dendritische, en granulocyten cel subsets zijn te vinden in ons eerder gepubliceerde werk in O'Gorman en Hsieh et al. en O'Gorman en Kong et al. 14 , 15 bovendien unsupervised analysemethoden, met inbegrip van (en niet beperkt tot) SPADE16, visNE17, Citrus18, Phenograph19en20 van de Xshift kunnen worden gebruikt om massa cytometry gegevens (niet te evalueren hier besproken). Met behulp van CD14hi monocyten en CD4 T-cellen als vertegenwoordiger aangeboren en adaptieve immuun cel subsets, zijn cytokine inductie binnen deze celtypes is aangetoond afgebeeld in Figuur 3. Een select aantal cytokines werd gekozen om te laten zien dat R848 selectief IL-12 (p40 subeenheid induceert) en MCP1 in CD14hi monocyten terwijl LPS niet (Figuur 3). PMAIONO, een krachtige T cell activator er niet toe brengt cytokines in CD14hi monocyten (Figuur 3) maar er toe brengt interferon gamma (IFNγ) en tumornecrosefactor alfa (TNFα) in CD4 T-cellen (Figuur 4). Succesvolle techniek in perifeer bloed monster stimulatie en verwerking demonstreer patronen van cytokine inductie specifiek voor stimulerende voorwaarden en immuun deelverzamelingen, zoals wordt geïllustreerd in Figuur 3 en 4 van de figuur. Voor de volledige analyse van de 14 cytokines die hier worden beschreven in de celtypen gevangen binnen de 26 oppervlakte markers, raadpleegt O'Gorman en Hsieh et al., and O'Gorman en Kong et al. 14 , 15
Om aan te tonen hoe de in dit protocol beschreven experimentele aanpak vangt de "intrinsieke" pathogene staat voor een systemische auto-immune ziekten zoals in SLE in vergelijking met een gezonde donor, Figuur 5 illustreert de cytokine inductie (Mip1β en MCP1) in CD14hi monocyten gevonden in de zieke perifeer bloed monster enige (deel B), in de afwezigheid van een exogene stimulatie (T6 vergeleken met T0). Deze cytokines zijn "gemoduleerd/daalden" JAK remming therapie ruxolitinib (T6 + 5R t.o.v. T6) in het zieke perifeer bloed monster enige (deel B).
Figuur 1. Experimentele workflow voor stimulatie en verwerking van perifeer bloed massa cytometry p.a.. Protocol voor lysis van de RBC en fixatie van ziekte perifeer bloed monster onmiddellijk daaropvolgende collectie (T0), of na 6 uur incubatie bij 37 ° C met een eiwit vervoer-remmer (PTI) bij ontstentenis van een exogene agent (T6), of met LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848; eiwit vervoer remmer incubatie gedurende 4 uur alleen), of ruxolitinib (T6 + 5R). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Vertegenwoordiger gating strategie voor de identificatie van CD14hi monocyten. Na fixatie en lysis van de RBC vaste het individu lysed/celsteekproeven van een gezonde donor waren barcoded, gelabeld met 26 antilichamen tegen oppervlakte markeringen, permeabel en gekleurd met 14 antilichamen tegen cytokines (Tabel van materialen). De beperkte gating strategie die de identificatie van CD14hi monocyten wordt weergegeven. Van links naar rechts is ieder 2D waarnemingspunt vertegenwoordigd een subset van de bevolking uit de bovenliggende populatie thats gated (blauwe box) van de 2D plot onmiddellijk aan de linkerkant. Een uitgebreide gating strategie kan worden gevonden in O'Gorman en Hsieh et al., en O'Gorman en Kong et al. 14 , 15 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Voorbeeld van cytokine inductie in CD14hi monocyten na stimulatie met LP's, R848 en PMAIONO. Een analyse van de representatieve massa cytometry van perifeer bloed monsters van een gezonde donor op moment nul (T0), ongestimuleerde (T6), en na stimulatie met LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848), en PMAIONO (T6 + PMAIONO) wordt weergegeven. Ziet u een voorbeeld van de cytokine inductie in CD14hi monocyten; geselecteerde cytokinen met specificiteit aan de stimulerende agent gebruikt (TLR agonist vs. T cell activator) worden afgebeeld. Uitgebreide gegevens voor alle cytokine inductie over meerdere immuun cel subsets vastgesteld met dit massale cytometry antilichaam paneel kan worden gevonden in O'Gorman en Hsieh et al., en O'Gorman en Kong et al. 14 , 15 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Voorbeeld van cytokine inductie in CD4 T-cellen na stimulatie met LP's, R848 en PMAIONO. Een analyse van de representatieve massa cytometry van perifeer bloed monsters van een gezonde donor op moment nul (T0), ongestimuleerde (T6), en na stimulatie met LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848), en PMAIONO (T6 + PMAIONO) wordt weergegeven. Voorbeeld van cytokine inductie in CD4 T-cellen wordt weergegeven; geselecteerde cytokinen met specificiteit aan de stimulerende agent gebruikt (TLR agonist vs. T cell activator) worden afgebeeld. Uitgebreide gegevens voor alle cytokine inductie over meerdere immuun cel subsets vastgesteld met dit massale cytometry antilichaam paneel kan worden gevonden in O'Gorman en Hsieh et al., en O'Gorman en Kong et al. 14 , 15 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Voorbeeld van cytokine inductie in CD14hi monocyten van SLE ziekte patiënt. Een analyse van de representatieve massa cytometry van perifeer bloedmonsters van gezonde donor (A) en SLE ziekte patiënt (B) worden weergegeven. Voorbeelden van de cytokine inductie in CD14hi monocyten; cytokines geselecteerd met specificiteit naar de SLE "intrinsieke" pathogene ziekteproces (T6) (d.w.z., inductie van MIP1β en MCP1 alleen in SLE patiënt) en het effect van immunomodulator ruxolitinib (T6 + 5R) worden afgebeeld. Uitgebreide gegevens voor alle cytokine inductie over meerdere immuun cel subsets vastgesteld met dit massale cytometry antilichaam paneel kan worden gevonden in O'Gorman en Kong et al. 15 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een roman, eencellige, proteomic aanpak gelijktijdig controleren meerdere soorten van immuun cellen en hun verschillende cytokine verstoringen op te sporen in de omgeving van de patiënt specifieke "pathogene" perifere bloed plasma circulerende factoren. Deze methode maakt gebruik van perifere bloed als het analytische voertuig, en de massale cytometry als instrument voor de evaluatie van immuun cellulaire fenotypische en functionele afwijkingen. De methode is gemakkelijk van toepassing op de mens en muizen studies21, en is compatibel met andere immuun functionele analyse, zoals het opsporen van signalering afwijkingen14.
De gebruiker moet bewust van een aantal variabelen die invloed kan zijn op het succes van deze procedure. Gebaseerd op onze ervaring, moeten bloedmonsters worden verwerkt binnen 2 uur van collectie om te voorkomen dat basislijn inductie van intracellulaire cytokinen (gegevens niet worden weergegeven). Bloedmonsters moeten blijven bij kamertemperatuur (25 ° C) in afwachting van verwerking. Bloedmonsters kunnen worden genomen in beide Natrium heparine of EDTA-buizen, zonder interferentie met de beschreven test. Leven en dood cel discriminatie kan worden geëvalueerd door massale cytometry met cisplatine22. Deze evaluatie wordt echter weggelaten in het protocol beschreven uitgaande van het bloed is verwerkt onmiddellijk (of binnen 2 uur) na het verzamelen. Bovendien, zelfs als monsters worden vertraagd in verwerking, voorziet het gebrek aan cryopreservatie de weglating van leven/dood discriminatie. Wij raden echter het gebruik van cisplatine voor levensvatbaarheid discriminatie voor een studie waarin celdood invloed kan zijn op de uitkomsten van de downstream-analyse.
Daarnaast hebben we vonden dat de zorgvuldige keuze en titratie van de stimulerende agent is essentieel voor de evaluatie van gerichte immuun trajecten/cytokine inductie. Ten eerste, de keuze van de stimulerende agent moet berusten op 1) de immune trajecten willen gaan/evalueren, en 2) gerichte functionele uitlezingen (of signalering eiwitten of cytokine productie). Bijvoorbeeld, als het doel evalueren van T cel activatie en verschillende subgroepen van T cel helper (Th) en hun respectieve cytokine inductie moest, zou PMAIONO of een combinatie van anti-CD3/anti-CD28 een geschikte stimulerende voorwaarde. Als het doel evalueren monocyt deelverzameling activering moest, kan een TLR-agonist (of een combinatie daarvan) wel best. Ten tweede moet de concentratie voor elk van deze stimulerende agenten worden geoptimaliseerd voor het uitlokken van cel activatie en cytokine inductie, zonder ernstig dat de markeringen voor de oppervlakte van de cel. Gebruik van te weinig stimulerend agent zal niet leiden tot de activering van de gewenste celtypes en geen cytokine inductie zal worden waargenomen, terwijl gebruik van te veel tot buitensporige celdood leiden zal en veranderingen in de immuun cel oppervlakte markeringen zodat populaties geïdentificeerd in de ongestimuleerde voorwaarde zal niet aanwezig zijn in de gestimuleerd voorwaarde. Ten derde, de kinetiek van de stimulatie is ook een belangrijke variabele. Terwijl 6 h is eerder gepubliceerd als een optimale stimulatie tijdschema vast te leggen van maximale inductie van pro-ontsteking cytokinen in reactie op de TLR stimulatie14,23, kan een verschillende stimulatie timepoint nodig zijn voor andere agenten. Ook moet het gebruik van een therapeutische drug in vitro met de monsters van perifeer bloed ook worden getitreerd op dezelfde wijze als de stimulerende agent, terwijl veel aandacht aan concentratie en timepoint.
In dit protocol gebruiken we verse perifere bloedmonsters, zoals intracellulaire cytokine inductie (en detectie) is meer robuust en efficiënt in vergelijking met cryopreserved monsters. We beschrijven in het protocol hier het gebruik van volbloed in tegenstelling tot PBMCs, zoals de aanwezigheid van plasma circulerende factoren draagt bij aan de "intrinsieke" aard van de immuun afwijkingen aan het ziekteproces gerelateerde. Deze factoren plasma-circulerende storen stimuleren voorwaarden toegevoegd aan het perifere bloed, zoals de toevoeging van anti-IgM en anti-IgG om deel te nemen van de B-cel receptor, zoals zij zijn gebonden aan plasma circulerende antilichamen en rode bloedcellen. Daarom zorgvuldige keuze van de stimulerende voorwaarden bij het gebruik van perifere bloed cruciaal voor succesvolle experiment lezen is outs. Met behulp van perifere bloed heeft zijn voordelen (in vivo platform) en nadelen (storende plasma circulerende factoren). PBMCs bieden echter een andere set van "voor"- en "nadelen." Wanneer vers PBMCs (in tegenstelling tot volbloed) ondergaan hetzelfde proces/protocol en met stimulatie met behulp van verschillende TLR agenten, nageleefd wij hetzelfde "patroon" van cytokine inductie, zij het in een iets mindere omvang14,23. Naar aanleiding van dit protocol, het gebruik van bevroren PBMCs leidt tot een minder robuuste cytokine inductie, en dus wij zou recommanderen tegenover rechtstreeks vergelijken van resultaten van monsters verwerkt nadat cryopreservatie met die vers verwerkt.
Gelet op het voorbehoud van vers versus bevroren monsters, en de voorkeur voor het gebruik van verse monsters voor optimale datakwaliteit, is het protocol hier beschreven geschikt voor prospectieve menselijke studies waar patiënten monsters worden verzameld over een periode van maanden tot jaren. Perifeer bloedmonsters kunnen worden verwerkt zoals beschreven, en zodra ze de RBC lysis en fixatie fase bereiken, monsters kunnen worden opgeslagen in-80 ° C en gekleurd in batches later. Deze technische aanpak, vormt terwijl gunstig voor de meeste menselijke studies, ook de uitdaging van het gebruik van antilichamen die zich aan de target-epitoop na fixatie binden kunnen. De Tabel van materialen lijsten het klonen voor de respectieve antilichamen die zijn getest en het aantonen van specifieke kleuring fixatie van de post. Barcoding van meerdere monsters (n = 20) biedt de voordelen van 1) daalden van technische variabiliteit, zoals meerdere monsters zijn gekleurd samen in één buis, waardoor vergelijkingen van monsters over voorwaarden vrij consistent en betrouwbaar; 2) vermindering van de totale antilichaam gebruik (zie protocol punt 4.1); en 3) de regeling barcoding van "6 verschillende palladium isotopen/Kies 3" leidt tot uitsluiting van paren (cellen positief voor meer dan 4 palladium isotopen). Deze voordelen zijn besproken in detail in Zunder en Fick et al. 24 bovendien het barcoding proces vereist dat cellen worden vastgesteld, aangezien zij moeten worden mild permeabel voor de bekomt van de barcoding reagens (palladium isotopen)24. Worden dus live kleuring kan niet uitgevoerd volgens dit protocol. Opgemerkt moet worden dat levende cel barcoding (in tegenstelling tot de vaste cel barcoding hier beschreven) een mogelijkheid om25,26 is, maar in het protocol hier, cellen zijn vastgesteld, zodat ze kunnen worden opgeslagen en batch samen verwerkt.
Batch monster verwerking, terwijl voordeel een arbeid en efficiëntie oogpunt tijd, heeft ook zijn eigen uitdagingen. Met de batch-verwerking is er behoefte aan een zorgvuldig samengesteld normalisatie-proces. Dit proces van normalisatie kan op verschillende stappen van de werkstroom massa cytometry worden aangepakt. Eerst, de concentratie van antilichaam aan de cel nummer moet worden bewaard consistente tussen partijen. We hebben ontdekt dat een effectieve manier om dit consistent concentratie wordt bereikt door 1) voorzichtig titratie van de concentratie van antilichaam aan celaantal en 2) normalisering van het mobiele nummer van elk van de monsters die barcoded bij elkaar (dat wil zeggen1 miljoen cellen per monster, voor alle 20 barcoded monsters). Ten tweede, ter verantwoording voor instrument signaal intensiteit variabiliteit (verschillende dagen van tuning, kalibratie en signaal verval over bewerkingstijd), monsters moeten worden geresuspendeerde en geanalyseerd op de massale cytometer met een geschikte normalisatie kraal oplossing (tabel van materialen), gevolgd door bestand normalisatie na data acquisitie27 (maar vóór de debarcoding). Afzonderlijke monsters zijn debarcoded na het gehele barcoded bestand heeft zijn genormaliseerd met behulp van de hulpprogramma's beschreven in Zunder en Finck et al. 24 in de derde plaats om handmatige antilichaam kleuring technische variabiliteit te verklaren, is het raadzaam de opneming van een "anker" monster met elke barcode-set die wordt geanalyseerd voor een enkel onderzoek, dat wil zeggen, een monster dat afkomstig is uit één donor (menselijke studies) en op dezelfde manier als de andere studie monsters is verwerkt. In dit voorbeeld moet eens in voldoende hoeveelheid moet worden verdeeld in elke set van de barcode geanalyseerd voor de studie worden gegenereerd. Deze anker monsters uit elke barcode zal worden gebruikt voor het genereren van een coëfficiënt van variantie om te corrigeren voor signaal variabiliteit in verschillende steekproeven van de studie voor deze barcode (d.w.z., anker monster uit barcode 8 zal worden gebruikt om te corrigeren voor de variabiliteit in barcode 8).
Een andere belangrijke optimalisatie stap is de vergadering van het massale cytometry antilichaam panel, die relevante immuun cel subsets en cytokinen beoordelen zal. Sommige van de belangrijkste variabelen in de vergadering van de antilichaam-deelvenster bevatten de keuze van klonen (aangepakt boven), antilichaam titer voor minimale achtergrond signaal, keuze van antilichaam doelen en isotoop kanalen gebaseerd op antigeen overvloed en kanaal gevoeligheid " compensatie"van signaal spillover op basis van individuele antilichaam veel variabiliteit, isotope onzuiverheid en oxidatie. Deze optimalisatie stappen zijn elders aangepakt28 en niet binnen het toepassingsgebied van het protocol beschreven hier.
Met deze benadering van eencellige proteomic studeren immuun afwijkingen in het perifere bloedmonsters, is het mogelijk om te identificeren van abnormale fenotypes van immuun cel subsets bevolking frequentie verschillen of wijzigingen in de expressie van specifieke cel oppervlakte gegevensmarkeringen (bijvoorbeeld in markers van cel activatie). Bovendien is het ook mogelijk om te identificeren van functionele afwijkingen binnen het immuun cel subsets, dergelijke als onder of overproductie van cytokines. Tot slot, het proces waarbij het monster vergeleken onmiddellijk vaste (T0) versus vaste na 6 uur incubatie zonder een exogeen agent (T6) toont "intrinsieke" pathogene processen die tot immuun cel type en cytokine afwijkingen (T6-T0 leiden). Deze aanpak kan worden afgestemd op de studie van een verscheidenheid van systemische immuun-gemedieerde processen en de betrokkenheid van meerdere immuun cel subsets en trajecten afhankelijk van de stimulatie agent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken Aimee Pugh-Bernard voor haar intellectuele input en nuttige opmerkingen. Dit werk werd gesteund door de biomedische Research Award Boettcher Stichting Webb-Waring en getal K23-1K23AR070897 van de NIH tot Elena W.Y. Hsieh. Ze werd ook ondersteund door award aantal K12-HD000850 van het nationale Instituut van Eunice Kennedy Shriver Child Health en menselijke ontwikkeling en de Lucile Packard Foundation voor kinderen gezondheid, Stanford CTSA UL1 TR001085 en kind gezondheidsonderzoek Instituut van Stanford University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
- Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
- Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
- Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).
- Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257 (2009).
- Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
- Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
- Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
- Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
- Rahman, A., Isenberg, D. A.
- O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
- O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
- Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
- Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
- Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
- Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
- Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
- Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).
