Eencellige analyse van Immunophenotype en Cytokine productie in perifere bloed via massale Cytometry
Summary
Hier beschrijven we een eencellige proteomic aanpak om te evalueren van immuun fenotypische en functionele (intracellulaire cytokine inductie) veranderingen in het perifere bloedmonsters geanalyseerd via massale cytometry.
Abstract
Cytokines spelen een centrale rol in de pathogenese van auto-immune ziekten. Vandaar, de meting van cytokine niveaus is de focus van meerdere onderzoeken in een poging om de precieze mechanismen die tot de verdeling van self-tolerance en latere autoimmuniteit leiden begrijpen. Benaderingen tot nu toe zijn gebaseerd op de studie van een specifiek aspect van het immuunsysteem (een single of paar celtypes of cytokines), en bieden niet een algemene beoordeling van ingewikkelde auto-immuunziekte. Terwijl de patiënt sera gebaseerde studies veroorloofd hebben belangrijke inzichten in autoimmuniteit, bieden ze niet de specifieke cellulaire bron van de dysregulated cytokines gedetecteerd. Een totaalaanpak van de eencellige te evalueren van cytokine productie in meerdere immuun cel subsets, in het kader van “intrinsieke” plasma van de patiënt-specifieke factoren, circulerende wordt hier beschreven. Deze aanpak maakt controle van de patiënt-specifieke immune fenotype (oppervlakte markeringen) en functie (cytokines), beide in de native “intrinsieke pathogene” ziekte staat, of in de aanwezigheid van therapeutische agenten (in vivo of ex vivo).
Introduction
Auto-immune ziekten zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit 3-8% van de bevolking. In de Verenigde Staten, auto-immune aandoeningen behoren tot de belangrijkste doodsoorzaken onder jonge en middelbare leeftijd vrouwen (leeftijden < 65 jaar)1,2. Auto-immune aandoeningen worden gekenmerkt door heterogene Vaatwandpathologie en diverse onderliggende immunologische processen. Het spectrum van heterogeniteit is goed vertegenwoordigd in verschillende aandoeningen, zoals gezamenlijke betrokkenheid bij reumatoïde artritis (RA) en neurologische ziekte bij multiple sclerose (MS). Echter, dit niveau van heterogeniteit ook binnen een enkele stoornis, zoals systemische lupus erythematosus (SLE) wordt geïllustreerd: sommige patiënten kunnen presenteren met Renale pathologie, terwijl anderen van hematologic of gezamenlijke betrokkenheid3 last.
De onderliggende immunopathogenese in auto-immune aandoeningen komt overeen met de klinische heterogeniteit, met betrekking tot auto – en hyper-activering van meerdere aangeboren en adaptieve immuun cel subsets, en daarmee gepaard gaande dysregulated cytokine productie. Hoewel cytokines een centrale rol in de pathogenese van auto-immune ziekte spelen, heeft inzicht in hun specifieke rol in het mechanisme van de ziekte bewezen uitdagend. Cytokines worden gekenmerkt door Pleiotropie (een cytokine kan het hebben van meerdere effecten op verschillende soorten cellen), redundantie (meerdere cytokines kan hetzelfde effect hebben), dualiteit (een cytokine kan pro – of anti – inflammatory effecten onder verschillende omstandigheden hebben), en plasticiteit (cytokines kan worden gegoten in een rol die verschillend van de “originele”, afhankelijk van de omgeving)4,5,6. Bijgevolg onderscheiden niet populatieniveau methoden heterogene cellulaire reacties op de dezelfde “cytokine milieu”. Studie ontwerpen die zich richten op een specifiek aspect van het immuunsysteem (één celtype of cytokine), bieden ook niet een algemene beoordeling van alle elementen die betrokken zijn bij complexe auto-immuunziekte. Terwijl de patiënt sera gebaseerde studies veroorloofd hebben belangrijke inzichten in autoimmuniteit, bieden ze niet de specifieke cellulaire bron van de dysregulated cytokines gedetecteerd.
Onlangs, we een eencellige proteomic benadering om gelijktijdig controleren meerdere immuun celtypes, en sporen van hun verschillende cytokine verstoringen in de omgeving van de patiënt specifieke “pathogene” perifere bloed plasma circulerende factoren ontwikkeld. De hier beschreven werkstroom wordt gekenmerkt door het gebruik van intact perifere bloedmonsters, in tegenstelling tot geïsoleerde perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs). Perifere bloed vertegenwoordigt het meest fysiologisch desbetreffende voertuig te bestuderen van systemische immuun-gemedieerde ziekte, met inbegrip van 1) niet-mononucleaire bloedcellen vaak betrokken in de auto-immune ziekte (d.w.z., neutrofielen, bloedplaatjes), en 2) plasma factoren, zoals nucleïnezuren, immuuncomplexen en cytokines, circuleren die immuun activerend rollen hebben. Te vangen de “intrinsieke pathogene” dysregulated cytokine productie, perifeer bloed monsters worden verwerkt onmiddellijk na de loting van het bloed (T0, tijd nul), en na 6 uur incubatie bij 37 ° C (fysiologische lichaamstemperatuur) met een eiwit transport de Inhibitor van de omwenteling in het ontbreken van een exogene stimulerende aandoening (T6, tijd 6 h), om op te sporen van cytokine productie (accumulatie, T6-T0) dat bij de status van “intrinsieke” ziekte (Figuur 1 aansluiten zou). Om te studeren van dysregulated processen die weerspiegelen over of onder activering van signalering trajecten die betrokken zijn bij de immuunrespons die relevant zijn voor de ziekte, perifeer bloedmonsters zijn behandeld (6 uur incubatie bij 37 ° C met een eiwit vervoer-remmer) een exogene stimuleren van de voorwaarde dat weerspiegelt de pathogenese van de ziekte, zoals Toll-Like-Receptor (TLR) agonisten in het geval van SLE (T6 + R848, tijd 6 h met 1 µg/mL R848), op te sporen van cytokine productie die bij een reactie op nucleic zuren aansluiten zou (T0 vs. T6 vs. T6 vergelijken + R848, Figuur 1). Studeren immunomodulerende effecten van beschikbare therapeutics ex vivo, aangezien ze betrekking op de precieze immuun dysregulated processen voor specifieke patiënten hebben, worden perifeer bloedmonsters behandeld met een JAK-remmer bij de relevante therapeutische concentratie (hier, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, tijd 6 h met 5 uM ruxolitinib), aan de opsporing van wijzigingen in “intrinsieke” ziekte staat naar aanleiding van de drug (T0 vs. T6 vs. T6 + 5R, Figuur 1). Een JAK-remmer werd gekozen voor deze studie omdat JAK-remmers is gebleken dat succesvol te zijn in de behandeling van auto-immune aandoeningen zoals RA.
Om tegelijkertijd het evalueren van de processen van de dysregulated in meerdere immuun cel subsets perifeer bloedmonsters van SLE hierboven beschreven werden patiënten en gezonde controles verwerkt zoals hierboven beschreven en geanalyseerd door massale cytometry. Massa cytometry, ook bekend als Cytometry-Time-Of-Flight, biedt eencellige analyse van meer dan 40 parameters zonder problemen van spectrale overlap7,8,9. Deze techniek maakt gebruik van zeldzame aarden metalen isotopen in de vorm van oplosbare metaalionen als tags gebonden aan antilichamen, in plaats van fluorophores10. Aanvullende gegevens met betrekking tot de massa cytometry technologische platform (dat wil zeggen, tuning en kalibratie, monster overname) kunnen worden gevonden in Leipold et al. en McCarthy et al. 11 , 12 de hoge-dimensionaliteit van massale cytometry waardoor gelijktijdige meting van meerdere cytokines in aangeboren en adaptieve immuun cel subsets met eencellige granulariteit (Tabel van materialen).
Huidige conventionele klinische en laboratorium parameters zijn vaak niet gevoelige of specifiek genoeg is voor het opsporen van voortdurende ziekte-activiteit of het antwoord op de specifieke immunomodulators13, als gevolg van de noodzaak om het beter af te bakenen de onderliggende immuun wijzigingen die flare-ups rijden. Gezien de alomtegenwoordigheid van cytokine disregulatie in auto-immuunziekte, een overvloed aan behandeling benaderingen die gebruikmaken van antilichamen of kleine moleculaire remmers targeting cytokines of signalering eiwitten die betrokken zijn in de regulatie van cytokine productie hebben onlangs naar voren gekomen. In zijn elementaire vorm biedt de hier beschreven perifeer bloed analytische aanpak een platform om patiënt-specifieke dysregulated cel subsets en hun abnormale cytokine productie in auto-immune ziekten met systemische weerslag te identificeren. Deze methode zorgt voor de personalisatie van therapeutische keuzes, zoals specifieke dysregulated cytokines kunnen worden geïdentificeerd, en specifieke behandeling opties kunnen ex vivo getest te beoordelen van hun vermogen om te immunomodulate de patiënt specifieke ziekte proces.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een roman, eencellige, proteomic aanpak gelijktijdig controleren meerdere soorten van immuun cellen en hun verschillende cytokine verstoringen op te sporen in de omgeving van de patiënt specifieke “pathogene” perifere bloed plasma circulerende factoren. Deze methode maakt gebruik van perifere bloed als het analytische voertuig, en de massale cytometry als instrument voor de evaluatie van immuun cellulaire fenotypische en functionele afwijkingen. De methode is gemakkelijk van toepassing op de mens en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken Aimee Pugh-Bernard voor haar intellectuele input en nuttige opmerkingen. Dit werk werd gesteund door de biomedische Research Award Boettcher Stichting Webb-Waring en getal K23-1K23AR070897 van de NIH tot Elena W.Y. Hsieh. Ze werd ook ondersteund door award aantal K12-HD000850 van het nationale Instituut van Eunice Kennedy Shriver Child Health en menselijke ontwikkeling en de Lucile Packard Foundation voor kinderen gezondheid, Stanford CTSA UL1 TR001085 en kind gezondheidsonderzoek Instituut van Stanford University.
Materials
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
- Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
- Mak, A., Cheung, M. W. -. L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -. M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
- Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).
- Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257 (2009).
- Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
- Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
- Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
- Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
- Rahman, A., Isenberg, D. A. Systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).
- O’Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
- O’Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
- Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Amir, E. -. A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
- Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
- Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
- Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
- Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
- Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).
