Immunophenotype और परिधीय पूरे रक्त में Cytokine उत्पादन का एकल सेल विश्लेषण के माध्यम से मास Cytometry
Summary
यहां हम एक एकल सेल proteomic दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए प्रतिरक्षा phenotypic और कार्यात्मक (intracellular cytokine प्रेरण) परिधीय पूरे रक्त के नमूनों में परिवर्तन का मूल्यांकन, जन cytometry के माध्यम से विश्लेषण किया ।
Abstract
साइटोकिंस स्व-प्रतिरक्षित रोगों के रोगजनन में एक निर्णायक भूमिका निभाते हैं । इसलिए, cytokine स्तर की माप के लिए एक सटीक तंत्र है कि आत्म सहनशीलता और बाद में प्रतिरक्षा के टूटने के लिए नेतृत्व को समझने की कोशिश में कई अध्ययनों का ध्यान केंद्रित किया गया है । दृष्टिकोण इस प्रकार अभी तक प्रतिरक्षा प्रणाली के एक विशिष्ट पहलू के अध्ययन के आधार पर किया गया है (एक या कुछ सेल प्रकार या साइटोकिंस), और जटिल स्व-प्रतिरक्षित रोग के एक वैश्विक आकलन की पेशकश नहीं है । जबकि रोगी सीरा आधारित अध्ययन प्रतिरक्षा में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि afforded है, वे विशिष्ट सेलुलर स्रोत dysregulated साइटोकिंस का पता नहीं प्रदान करते हैं । एक व्यापक एकल सेल दृष्टिकोण कई प्रतिरक्षा सेल उपसमुच्चय में cytokine उत्पादन का मूल्यांकन करने के लिए, “आंतरिक” रोगी के संदर्भ में विशिष्ट प्लाज्मा परिचालित कारकों के भीतर, यहां वर्णित है । इस दृष्टिकोण के रोगी-विशिष्ट प्रतिरक्षा phenotype (सतह मार्कर) और समारोह (साइटोकिंस) की निगरानी में सक्षम बनाता है, या तो अपने मूल “आंतरिक रोगजनक” रोग राज्य में, या चिकित्सीय एजेंटों की उपस्थिति में (vivo या पूर्व vivoमें ) ।
Introduction
स्व-प्रतिरक्षित रोग रुग्णता और मृत्यु का एक प्रमुख कारण जनसंख्या के 3-8% को प्रभावित कर रहे हैं । संयुक्त राज्य अमेरिका में, स्व-प्रतिरक्षित विकारों युवा और मध्यम आयु वर्ग की महिलाओं (उम्र < 65 वर्ष)1,2के बीच मौत के प्रमुख कारणों में से हैं । स्व-प्रतिरक्षित विकारों विषम नैदानिक प्रस्तुति और विविध अंतर्निहित प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं की विशेषता है । विविधता के स्पेक्ट्रम में अच्छी तरह से विभिंन विकारों के पार का प्रतिनिधित्व किया है, जैसे रुमेटी गठिया में संयुक्त भागीदारी (आरए) और एकाधिक स्केलेरोसिस में स्नायविक रोग (एमएस) । हालांकि, विविधता के इस स्तर को भी एक विकार के भीतर उदाहरण है, जैसे प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष ल्यूपस (SLE): कुछ रोगियों को गुर्दे की विकृति के साथ मौजूद हो सकता है, जबकि अंय hematologic या संयुक्त भागीदारी3से ग्रस्त हैं ।
स्व-प्रतिरक्षित विकारों में अंतर्निहित immunopathogenesis नैदानिक विविधता का दर्पण है, जिसमें कई जंमजात और अनुकूली प्रतिरक्षा सेल सबसेट के ऑटो और अति-सक्रियण शामिल हैं, और सहवर्ती dysregulated cytokine उत्पादन । जबकि साइटोकिंस स्व-प्रतिरक्षित रोग के रोगजनन में एक निर्णायक भूमिका निभाते हैं, रोग के तंत्र में उनकी विशिष्ट भूमिका को समझना चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है. साइटोकिंस pleiotropy (एक cytokine विभिन्न प्रकार के सेल पर कई प्रभाव हो सकता है) की विशेषता है, अतिरेक (एकाधिक साइटोकिंस एक ही प्रभाव हो सकता है), द्वंद्व (एक cytokine विभिन्न स्थितियों के तहत समर्थक या विरोधी भड़काऊ प्रभाव हो सकता है), और प्लास्टिक (साइटोकिंस एक अपनी “मूल” एक से अलग भूमिका में ढाला जा सकता है, पर्यावरण पर निर्भर करता है)4,5,6। फलस्वरूप, जनसंख्या-स्तर के तरीके विषम सेलुलर प्रतिक्रियाओं को समान “cytokine वातावरण” में भेद नहीं सकते. इसी तरह, अध्ययन डिजाइन कि प्रतिरक्षा प्रणाली के एक विशिष्ट पहलू पर ध्यान केंद्रित (एक एकल कोशिका प्रकार या cytokine), जटिल स्व-प्रतिरक्षित रोग में शामिल सभी तत्वों का एक वैश्विक आकलन प्रदान नहीं करते. जबकि रोगी सीरा आधारित अध्ययन प्रतिरक्षा में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि afforded है, वे विशिष्ट सेलुलर स्रोत dysregulated साइटोकिंस का पता नहीं प्रदान करते हैं ।
हाल ही में, हम एक साथ एक एकल सेल proteomic दृष्टिकोण विकसित करने के लिए एक साथ कई प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार का आकलन है, और रोगी विशिष्ट “रोगजनक” परिधीय रक्त प्लाज्मा परिसंचारी कारकों के वातावरण में उनके विभिंन cytokine perturbations का पता लगाने । कार्यप्रवाह यहां वर्णित बरकरार परिधीय पूरे रक्त के नमूनों के उपयोग की विशेषता है, के रूप में अलग परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) का विरोध किया । परिधीय पूरे रक्त सबसे शारीरिक प्रासंगिक वाहन का प्रतिनिधित्व करता है प्रणालीगत प्रतिरक्षा-मध्यस्थता रोग का अध्ययन, 1 सहित) गैर mononuclear रक्त कोशिकाओं अक्सर स्व-प्रतिरक्षित रोग में शामिल (यानी, न्यूट्रोफिल, प्लेटलेट्स), और 2) प्लाज्मा परिसंचारी कारकों, जैसे न्यूक्लिक एसिड, प्रतिरक्षा परिसर, और साइटोकिंस, जो प्रतिरक्षा सक्रिय भूमिकाओं है । “आंतरिक रोगजनक” dysregulated cytokine उत्पादन पर कब्जा करने के लिए, परिधीय रक्त के नमूनों तुरंत रक्त आकर्षित (टी0, समय शून्य) के बाद संसाधित कर रहे हैं, और ३७ डिग्री सेल्सियस (शारीरिक शरीर के तापमान) के साथ 6 ज के बाद एक प्रोटीन परिवहन के साथ किसी भी exogenous उत्तेजक हालत (T6, समय 6 एच) के अभाव में अवरोधक, cytokine उत्पादन का पता लगाने के लिए (संचय, T6-टी0) कि “आंतरिक” रोग राज्य (चित्रा 1) को प्रतिबिंबित करेगा । dysregulated प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कि पर या के तहत-सक्रियण रोग के लिए प्रासंगिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में शामिल संकेत मार्ग के सक्रियकरण, परिधीय रक्त के नमूनों का इलाज कर रहे हैं (6 एच ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक प्रोटीन परिवहन अवरोधक के साथ) एक exogenous के साथ उत्तेजक हालत कि रोग रोगजनन को दर्शाता है, जैसे टोल जैसे-रिसेप्टर (TLR) एगोनिस्ट के मामले में SLE (T6 + R848, टाइम 6 एच के साथ 1 µ जी/एमएल R848), cytokine उत्पादन है कि न्यूक्लिक एसिड की प्रतिक्रिया को प्रतिबिंबित करेगा का पता लगाने के लिए (टी0 बनाम T6 बनाम T6 की तुलना + R848, चित्रा १). उपलब्ध चिकित्सकीय के इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव का अध्ययन करने के लिए पूर्व vivo, के रूप में वे विशिष्ट रोगियों के लिए सटीक प्रतिरक्षा dysregulated प्रक्रियाओं से संबंधित, परिधीय रक्त के नमूनों प्रासंगिक चिकित्सकीय पर एक JAK अवरोधक के साथ इलाज कर रहे हैं एकाग्रता (यहां, 5 उम ruxolitinib; T6 + 5R, समय 6 ज 5 उम ruxolitinib के साथ), दवा के जवाब में “आंतरिक” रोग राज्य में परिवर्तन का पता लगाने के लिए (टी0 बनाम T6 बनाम T6 + 5R, चित्रा 1) । एक JAK अवरोधक इस अध्ययन के लिए चुना गया था क्योंकि JAK अवरोधकों ऐसे आरए के रूप में स्व-प्रतिरक्षित विकारों के उपचार में सफल होने के लिए दिखाया गया है ।
एक साथ एक से अधिक प्रतिरक्षा सेल सबसेट में ऊपर वर्णित dysregulated प्रक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए, परिधीय रक्त के नमूनों SLE रोगियों और स्वस्थ नियंत्रण से ऊपर वर्णित के रूप में संसाधित किया गया था और जन cytometry द्वारा विश्लेषण. मास cytometry, भी cytometry के समय के रूप में जाना-उड़ान, वर्णक्रमीय ओवरलैप के मुद्दों के बिना ४० से अधिक मापदंडों के एकल सेल विश्लेषण प्रदान करता है7,8,9. इस तकनीक के बजाय fluorophores10के एंटीबॉडी के लिए बाध्य टैग के रूप में घुलनशील धातु आयनों के रूप में दुर्लभ पृथ्वी धातु आइसोटोप का इस्तेमाल करता है. मास cytometry तकनीकी मंच के बारे में अतिरिक्त विवरण (यानी, ट्यूनिंग और अंशांकन, नमूना अधिग्रहण) Leipold एट अल. और McCarthy एट अल में पाया जा सकता है । 11 , 12 जन cytometry की उच्च आयामी एकल कोशिका दानेदार (सामग्री की तालिका) के साथ सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा सेल सबसेट भर में एकाधिक साइटोकिंस के एक साथ माप सक्षम बनाता है ।
वर्तमान पारंपरिक नैदानिक और प्रयोगशाला पैरामीटर्स अक्सर संवेदनशील या विशिष्ट immunomodulators13के लिए चल रहे रोग गतिविधि या प्रतिक्रिया का पता लगाने के लिए पर्याप्त नहीं हैं, बेहतर अंतर्निहित प्रतिरक्षा चित्रित करने की आवश्यकता को प्रतिबिंबित परिवर्तन है कि ड्राइव भड़क अप । स्व-प्रतिरक्षित रोग में cytokine dysregulation के व्यापकता को देखते हुए, उपचार दृष्टिकोण है कि उपयोग एंटीबॉडी या छोटे आणविक अवरोधकों साइटोकिंस या संकेतन प्रोटीन cytokine उत्पादन के विनियमन में शामिल लक्ष्यीकरण के ढेर सारे हाल ही में उभरा । अपने बुनियादी प्रारूप में, परिधीय रक्त विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण यहां वर्णित एक मंच प्रदान करता है रोगी की पहचान करने के लिए विशिष्ट dysregulated सेल सबसेट और प्रणालीगत अभिव्यक्तियों के साथ स्व-प्रतिरक्षित रोग में उनके असामांय cytokine उत्पादन । यह पद्धति चिकित्सीय विकल्पों के निजीकरण के लिए अनुमति देता है के रूप में विशिष्ट dysregulated साइटोकिंस की पहचान की जा सकती है, और विशिष्ट उपचार के विकल्प उनके रोगी विशिष्ट रोग immunomodulate करने की क्षमता का आकलन करने के लिए पूर्व vivo परीक्षण किया जा सकता प्रक्रिया.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम एक उपंयास, एकल सेल, proteomic दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए एक साथ कई प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार का आकलन और रोगी विशिष्ट “रोगजनक” परिधीय रक्त प्लाज्मा परिसंचारी कारकों के वातावरण में उनके विभिंन cytokine perturb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उसे बौद्धिक इनपुट और उपयोगी टिप्पणी के लिए Aimee Pugh-बर्नार्ड शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । यह काम Boettcher फाउंडेशन वेब-Waring बायोमेडिकल रिसर्च अवार्ड और पुरस्कार संख्या K23-1K23AR070897 NIH से ऐलेना W.Y. Hsieh को समर्थन किया गया था । वह भी पुरस्कार संख्या K12 द्वारा समर्थित किया गया था-HD000850 Eunice कैनेडी श्राइवर राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास संस्थान और Lucile पैकार्ड फाउंडेशन बच्चों के स्वास्थ्य, स्टैनफोर्ड CTSA UL1 TR001085, और बाल स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए इंस्टीट्यूट ऑफ स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी ।
Materials
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
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