Én celle analyse av Immunophenotype og cytokin produksjon i eksterne fullblod via masse cytometri

Summary

Her beskriver vi en enkeltcelle proteomic tilnærming for å evaluere immun fenotypiske og funksjonell (intracellulær cytokin induksjon) endringer i eksterne hele blodprøver, som analyseres via masse cytometri.

Abstract

Cytokiner spille en sentral rolle i patogenesen av autoimmune sykdommer. Derfor har måling av cytokin nivåer vært fokus for flere studier i forsøk på å forstå nøyaktig mekanismer som fører til sammenbrudd av self-tolerance og påfølgende autoimmunitet. Tilnærminger hittil har vært basert på studier av et bestemt aspekt av immunsystemet (ett eller noen celletyper eller cytokiner), og tilbyr ikke en helhetsvurdering av komplekse autoimmun sykdom. Mens pasienten sera-baserte studier har råd viktig innsikt i autoimmunitet, gir de ikke bestemte cellulære kilden til dysregulated cytokiner oppdaget. En omfattende encellede tilnærming til evaluere cytokin produksjon i flere immun celle undergrupper, innenfor rammen av “indre” pasient-spesifikke plasma sirkulerende faktorer, er beskrevet her. Dette gir overvåking av pasient-spesifikk immun fenotypen (overflate markører) og funksjon (cytokiner), enten i sin innfødt “iboende patogene” sykdom stat, eller i nærvær av terapeutiske agenter (i vivo eller ex vivo).

Introduction

Autoimmune sykdommer er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet påvirker 3-8% av befolkningen. I USA, autoimmune sykdommer er blant de viktigste årsakene til dødsfall blant unge og middelaldrende kvinner (aldre < 65 år)^1,2. Autoimmune sykdommer er preget av heterogene kliniske presentasjonen og forskjellige underliggende immunologiske prosesser. Spekteret av heterogenitet er godt representert på tvers av ulike lidelser, som felles engasjement i revmatoid artritt (RA) og nevrologiske sykdommer i multippel sklerose (MS). Men dette nivået av heterogenitet er også eksemplifisert i en enkelt lidelse, som systemisk lupus erythematosus (SLE): noen pasienter kan presentere med nyre patologi, mens andre lider hematologic eller felles engasjement³.

Den underliggende immunopathogenesis i autoimmune sykdommer gjenspeiler den klinisk heterogeniteten, med auto – og hyper-aktivering av flere medfødte og adaptive immunsystemet celle undergrupper, og samtidig dysregulated cytokiner produksjonen. Mens cytokiner spille en sentral rolle i patogenesen av autoimmune sykdommer, forstå deres spesifikke rolle i mekanismen av sykdommen har vist seg for å være utfordrende. Cytokiner er preget av pleiotropy (en cytokin kan ha flere effekter på ulike celletyper), avskjedigelse (flere cytokiner kan ha samme effekt), dualitet (en cytokin kan ha pro – eller anti – inflammatory effekter under ulike forhold), og plastisitet (cytokiner kan støpes inn i en rolle som er forskjellig fra den “originale”, avhengig av miljøet)^4,5,6. Følgelig kan ikke befolkningsnivå metoder skille heterogene mobilnettet svar til samme “cytokin miljøet”. Tilsvarende tilbyr studie design som fokuserer på et bestemt aspekt av immunsystemet (en enkelt celle type eller cytokin), ikke en helhetsvurdering av alle elementer som er involvert i komplekse autoimmun sykdom. Mens pasienten sera-baserte studier har råd viktig innsikt i autoimmunitet, gir de ikke bestemte cellulære kilden til dysregulated cytokiner oppdaget.

Nylig har utviklet vi en enkeltcelle proteomic tilnærming for å vurdere samtidig flere immun celletyper, og oppdage deres ulike cytokin forstyrrelser i miljøet pasienten spesifikke “patogene” eksterne blodplasma sirkulerende faktorer. Arbeidsflyten beskrevet her er preget av bruk av intakt perifere hele blodprøver, i motsetning til isolerte perifert blod mononukleære celler (PBMCs). Eksterne fullblod representerer den mest fysiologisk relevante kjøretøyet for å studere systemisk immun-mediert sykdom, inkludert 1) ikke-mononukleære blodceller ofte involvert i autoimmune sykdommer (dvs., nøytrofile, blodplater) og 2) plasma sirkulerende faktorer, for eksempel nucleic syrer og immun komplekser cytokiner, som har immun aktivering roller. Å fange den “indre patogene” dysregulated cytokin produksjon, perifert blod prøver behandles umiddelbart etter blod trekningen (T0, tid null), og etter 6 h med inkubering på 37 ° C (fysiologiske kroppstemperatur) med et protein hemmer i fravær av enhver eksogene stimulerende tilstand (T6, tid 6 h), å oppdage cytokiner produksjonen (opphopning, T6-T0) som ville reflektere “indre” sykdom staten (figur 1). Å studere dysregulated prosesser som reflekterer over eller under aktivering av signalnettverk trasé involvert i immunreaksjoner relevant for sykdommen, perifert blodprøver er behandlet (6 h inkubasjon på 37 ° C med en protein transport hemmer) med et ytre stimulere tilstand som gjenspeiler sykdom patogenesen, for eksempel Toll-lignende reseptor (TLR) agonister ved SLE (T6 + R848, tid 6 h med 1 µg/mL R848), for å oppdage cytokiner produksjonen som ville reflektere svar på nucleic syrer (sammenligne T0 vs T6 vs T6 + R848, figur 1). For å studere immunmodulerende effekter av tilgjengelige therapeutics ex vivo, som de hører til presis immun dysregulated prosesser for bestemte pasienter, er perifert blodprøver behandlet med en JAK hemmer på relevante terapeutiske konsentrasjon (her, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, tid 6t med 5 uM ruxolitinib), å oppdage endringer i “indre” sykdom tilstand som svar på stoffet (T0 vs T6 vs T6 + 5R, figur 1). En JAK hemmer ble valgt for denne studien fordi JAK hemmere har vist seg å være vellykket i behandlingen av autoimmune sykdommer som RA.

For å evaluere samtidig dysregulated prosesser beskrevet ovenfor i flere immun celle undergrupper, perifert blodprøver fra SLE ble pasienter og sunn kontroller behandlet som beskrevet ovenfor og analyseres av masse cytometri. Masse cytometri, også kjent som cytometri-tid-Of-Flight tilbyr én celle analyse av over 40 parametere uten spørsmål om spectral overlapper^7,8,9. Denne teknikken bruker rare earth metall isotoper i form av løselig metall ioner som koder bundet til antistoffer, i stedet for fluorophores¹⁰. Flere detaljer om masse cytometri teknologisk plattform (dvs. tuning og kalibrering, prøven oppkjøp) finnes i Leipold et al. og McCarthy et al. ^{11 , 12} av høy-dimensjonalitet masse cytometri kan samtidig måling av flere cytokiner gjennom medfødte og adaptive immunsystemet celle undergrupper med encellede tetthet (Tabell for materiale).

Gjeldende konvensjonelle klinisk og laboratorie-parameterne er ofte ikke sensitive eller spesifikke nok til å oppdage pågående sykdommen aktiviteten eller responsen til bestemte immunomodulators¹³, reflekterer behovet for å avgrense arbeidet underliggende immun endringer som driver fakkel-ups. Gitt Gjennomtrengningskraft av cytokin feilregulering i autoimmune sykdommer, en mengde behandlingsmetoder som bruker antistoffer eller liten molekylær hemmere målretting cytokiner eller signalering proteiner involvert i regulering av cytokin produksjon har nylig dukket opp. I sin grunnleggende format gir perifert blod analytisk tilnærming beskrevet her en plattform for å identifisere pasient-spesifikke dysregulated celle undergrupper og unormale cytokin produksjon i autoimmune sykdommer med systemisk manifestasjoner. Denne metoden tillater tilpassing av terapeutiske valg som bestemte dysregulated cytokiner kan identifiseres, og spesifikk behandling alternativer kan være testet ex vivo å vurdere deres evne til å immunomodulate pasienten bestemt sykdommen prosessen.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av den Colorado flere institusjonelle Review Board (COMIRB) av University of Colorado. Alle beskrevet fremgangsmåtene nedenfor skal utføres i et sterilt vev kultur panseret ikke annet er angitt, med filtrerte pipette-spisser, og alle reagenser filtrert. 1. forberedelse av reagenser til eksterne fullblod behandling Forberede ruxolitinib lager dele (10-15 μL/hetteglass for engangsbruk) på 10 mM fortynne lyofilisert reagensen i DMSO hen…

Representative Results

Figur 1 viser arbeidsflyten for stimulering og behandling av perifer blodprøvene, inkludert tildeling av blod prøve dele, tidspunktet for tillegg av stimulering agenter, protein transport hemmer cocktail og inkubasjon ganger før den røde blodlegemer (RBC) lyse og fiksering. Valg av stimulerende agenter vil avhenge signalisering og cytokin veier som er målrettet for vurdering. For eksempel i protokollen beskrevet her, brukes TLR agonister til å evaluere …

Discussion

Her beskriver vi en roman, én celle, proteomic tilnærming til samtidig vurdere flere immun celletyper og oppdage deres ulike cytokin forstyrrelser i miljøet pasienten spesifikke “patogene” eksterne blodplasma sirkulerende faktorer. Denne metoden bruker eksterne fullblod som analytisk kjøretøy og masse cytometri som verktøyet for vurdering av immun mobilnettet fenotypiske og funksjonelle unormalt. Metoden gjelder lett menneskelige og mus studier²¹, og er kompatibel med andre immun funksjonell…

Materials

Ruxolitinib	Santa Cruz	SC-364729A	Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM
R848	Invivogen	tlrl-r848-5	Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL
LPS-EK	Invivogen	tlrl-eklps	Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL
Sterile PBS	Lonza	17-516F
Lyse/Fix Buffer	BD biosciences	558049	Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O)
BD Phosflow perm/wash buffer I	BD biosciences	557885	Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O)
RPMI	Gibco	21870-076
Sodium Azide (NaN3)	Sigma-Aldrich	S-8032	Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002
Protein Transport Inhibitor (PTI)	eBiosciences	00-4980-93	Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X
DNA Intercalator	Fluidigm	201192B	Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM
Cell Staining Media (CSM)			PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3
MaxPar Barcode Perm Buffer	Fluidigm	201057	Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X
20-plex Pd Barcode Set	Fluidigm	S0014	Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
EQ TM Four Element Calibration Beads	Fluidigm	201078	Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X
16% MeOH-free Formaldehyde Solution	Thermo	28908	Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v)
Sterile round bottom polystyrene tubes	VWR	60818-496	Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
Polypropylene cluster tubes	Light Labs	A-9001	Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
Helios CyTOF instrument	Fluidigm	Helios	All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies used for Mass Cytometry
Surface markers
CD1c	Biolegend	L161	Mass: 161
CD3	BD	UCHT1	Mass: 144
CD4	Biolegend	SK3	Mass: 174
CD7	BD	M-T701	Mass: 149
CD8	Biolegend	SK1	Mass: 142
CD11b	Fluidigm	ICRF44	Mass: 209
CD11c	BD	B-ly6	Mass: 152
CD15	BD	HI98	Mass: 115
CD14	Biolegend	M5E2	Mass: 154
CD16	eBioscience/Thermo	B73.1	Mass: 165
CD19	Santa Cruz	SJ25C1	Mass: 163
CD21	Biolegend	Bu32	Mass: 141
CD27	BD	L128	Mass: 155
CD38	Fluidigm	HIT2	Mass: 172
CD45 total	Biolegend	HI30	Mass: 89
CD45RA	Biolegend	HI100	Mass: 153
CD56	Miltenyi	REA196	Mass: 168
CD66	BD	B1.1/CD66	Mass: 113
CD86	Fluidigm	IT2.2	Mass: 150
CD123	Fluidigm	6H6	Mass: 143
CD278/ICOS	Biolegend	C398.4A	Mass: 156
CD179/PD1	Biolegend	EH12.2H7	Mass: 162
IgD	Biolegend	IA6-2	Mass: 146
IgM	Biolegend	MHM-88	Mass: 151
CXCR5	BD	RF8B2	Mass: 173
HLADR	Biolegend	L243	Mass: 167
Cytokines
IL-1α	Biolegend	364-3B3-14	Mass: 147
IL-1β	Biolegend	H1b-98	Mass: 169
IL-1RA	Santa Cruz	AS17	Mass: 157
IL-6	Biolegend	MQ2-13A5	Mass: 164
IL-8	BD	E8N1	Mass: 160
IL-12/IL-23p40	Biolegend	C8.6	Mass: 171
IL-17A	Biolegend	BL168	Mass: 148
IL23p19	eBioscience/Thermo	23dcdp	Mass: 176
MIP1β	BD	D21-1351	Mass: 158
MCP1	BD	5D3-F7	Mass: 170
IFNα	Miltenyi	LT27:295	Mass: 175
IFNγ	Biolegend	4S.B3	Mass: 165
PTEN	BD	A2B1	Mass: 159
TNFα	Biolegend	Mab11	Mass: 166
Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling  Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol.